专利名称：一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体地说，涉及一种以桅子苷或桅子总环烯醚萜苷为负载药物的治疗脑部疾病的纳米粒制剂。
背景技术：
桅子具有清热、泻火、凉血、解毒的功效，中医常用于热证的治疗，是多种中药方剂的主药，如安宫牛黄、黄连解毒汤等。现代研究发现，以桅子苷(Geniposide)为代表的桅子总环烯醚萜苷是桅子的主要有效成分之一。桅子苷纯品为白色粉末，分子式=C17H24Oltl，分子量388. 366。桅子苷在水中极易溶解，溶解度为0. 18g -πιΓ1,为亲水性化合物，易溶于乙醇、 丙酮、正丁醇等极性有机溶剂，难溶于氯仿、苯、石油醚等亲脂性有机溶剂。朱晓磊等对于桅子苷及桅子总环烯醚萜苷的药理作用方面做了比较全面深入的研究，表明其在脑缺血级联反应病理过程多个环节的主要靶点，发挥清热泻火，凉血解毒之功，使邪去络通而收醒神之效，对脑缺血损伤具有较好的防治作用(朱晓磊，张娜，李澎涛等.桅子苷阻抑脑缺血损伤级联反应的作用环节探讨[J].中国中药杂志，2004，四(11) 1065-1068)。桅子苷及桅子总环烯醚萜苷对脑缺血损伤所致疾病作用已经引起了药物研究者的注意，多篇专利文献都从不同方面公开了桅子苷的生物活性，如公开号1437973、 1437974、1539444、1602893、1460483、1546507等中国发明专利申请公开说明书，都公开了桅子苷、桅子总环烯醚萜苷以及以桅子苷为主要有效成分的药物组合物在治疗脑栓塞、脑出血等疾病上的应用；公开号101385796、101361831等中国发明专利申请公开说明书，还公开了桅子苷或以桅子苷为主要有效成分的清开灵制剂在预防和治疗血管性痴呆方面的作用。桅子苷或桅子总环烯醚萜苷要发挥上述对脑部疾病的治疗作用，必须使损伤脑区获得有效的药物浓度。但由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier，简称BBB)的存在，使得经胃肠道、肌肉注射等给药途径的制剂无法使桅子苷或桅子总环烯醚萜苷在损伤脑区达到有效的药物浓度。如何使有效浓度的桅子苷或桅子总环烯醚萜苷通过血脑屏障，顺利到达脑组织内从而发挥作用，成为桅子苷或桅子总环烯醚萜苷是否能够成功开发出治疗脑部疾病新药的关键。鼻腔与颅腔在解剖生理上有着独特的联系。嗅神经上皮是中枢神经系统(CNS)与外界直接相接触的唯一组织。被鼻纤毛覆盖的嗅神经感觉神经元的轴突形成束，能够穿过筛板进入颅腔，并且与脑内嗅球的僧帽细胞和丛细胞(mitral and tufted cells)而形成突触连接，这是药物从鼻腔吸收人脑的嗅黏膜上皮通路。鼻腔给药后药物分子滞留于嗅部黏膜而易吸收进人脑脊液，因而可绕过BBB进入CNS，发挥治疗作用。由于上述嗅神经通路和嗅黏膜上皮通路的存在，使得鼻腔已成为向脑内非侵袭性输送药物的有效途径。由于桅子苷及桅子总环烯醚萜苷易溶于水，其本身穿透黏膜的能力差；如果以溶液剂形式滴鼻或喷雾入鼻腔，很容易被鼻腔中的酶降解和被鼻纤毛清除，因此，有必要开发出能够延长桅子苷及桅子总环烯醚萜苷与鼻粘膜接触的时间，提高药物穿透黏膜的能力的鼻腔给药制剂，从而提高桅子苷及桅子总环烯醚萜苷在脑组织中的浓度，减少桅子苷及桅子总环烯醚萜苷的流失。纳米粒(nanoparticles，NPs)为高分子物质组成的固态胶体粒子，通常对所携带的药物具有缓释、靶向、保护、提高疗效和降低毒副作用等特点。纳米粒的制备方法有多种， 包括乳化-溶剂挥发法、乳化-扩散法、乳化-聚合法、盐析法和超临界流体技术等。不同方法制备的纳米粒大小、类型、药物包封率等理化性质不同，对药物及载体材料的要求也不同。迄今，还没有以桅子苷或桅子总环烯醚萜苷为负载的药物的纳米粒制剂的报道。而且有研究表明，普通纳米粒，如聚乙二醇为载体的纳米粒进入胞内被溶酶体捕捉，形成内吞小泡；其在早期内体和再循环内体中的环境接近生理环境，而在晚期内体和溶酶体中pH在4 5左右。在细胞摄取后的30min，主要分布于内体溶酶体，直到Ih后发现纳米粒从内体-溶酶体逃脱进入胞浆。由于表面的屏蔽作用，使其进入内体-溶酶体之后即便是在酸性环境中，也无法发生表面电荷的改变，因此无法通过电荷吸引的方式发生内体-溶酶体的逃脱进入胞浆。针对鼻粘膜胞吞途径的脑靶向给药载体需要具有逃脱溶酶体效果来减少药物细胞内的吞噬和降解功能，从而提高药物通过血脑屏障、靶向分布于脑组织的效率。表面修饰的壳聚糖可分别与鼻腔嗅粘膜上选择性高表达的糖基受体N-乙酸氨基葡萄糖或L-岩藻糖特异结合，通过结合的特异性受体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。这种相互作用不仅导致黏附，并且使其通过不同的途径(溶酶体或非溶酶体)内化 [32]，使纳米粒表面在溶酶体内快速转化为正电荷，从而吸附带负电的内体-溶酶体膜，并从其中逃脱进入胞浆，继而进入脑脊液。
发明内容
本发明的目的是提供一种以桅子苷或桅子总环烯醚萜苷为负载的药物的纳米粒制剂，该制剂通过鼻腔给药，能够有效地提高桅子苷或桅子总环烯醚萜苷在脑部组织中的浓度，与经胃肠道、肌肉注射等给药途径的桅子苷或桅子总环烯醚萜苷制剂相比，给药量小，疗效更加确切，病人的顺应性好。本发明的另一个目的是提供一种以桅子苷或桅子总环烯醚萜苷为负载的药物、具有溶酶体逃逸效果的纳米粒制剂；与普通纳米粒制剂相比，该溶酶体逃逸型纳米粒制剂能够显著提高药物在脑组织中的浓度。为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案一种治疗脑部疾病的鼻腔给药纳米粒制剂，负载的药物是桅子苷或桅子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80 中的一种，各原料的重量份为桅子苷或桅子总环烯醚萜苷10 250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1 30mg 重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50 300mg重量份，聚乙烯醇200 500mg重量份；所述纳米粒制剂通过下述方法制备桅子苷或桅子总环烯醚萜苷以及选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种溶于水中作为内水相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂作为有机相，聚乙烯醇溶于水中作为外水相；将内水相和有机相混合，在冰浴中超声制成初乳；将初乳立即注入到外水相中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳注入到含有聚乙烯醇的水溶液中，继续搅拌使有机溶剂完全挥发，低温离心，收集沉淀，加入冻干保护剂甘露醇，冷冻干燥，即得。本发明优选桅子苷含量不少于25%的桅子总环烯醚萜苷。所述桅子总环烯醚萜苷可以通过如下方法制备取桅子粗粉，加6 8倍水煎煮3次，每次30 90分钟，滤过，合并煎煮液，浓缩至每Iml相当Ig药材的稠膏状，加入乙醇至含醇量40 70%，放置M小时，取上清液，回收乙醇，再浓缩至每Iml相当2g药材的稠膏，加入乙醇至含醇量70 80%，放置M小时， 滤过，滤液浓缩至60°C相对密度为1. 05 1. 10的清膏，喷雾干燥，即得。构成内水相时，所述乳化剂优选的是氢化蓖麻油，浓度为5 15g/L。所述有机相中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度优选为20 30g/L。所述外水相中，聚乙烯醇的浓度优选为10 15g/L。构成有机相的所述有机溶剂优选的是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂，更优选的是二氯甲烷。超声制备初乳和复乳时，优选的超声条件是超声功率200 400W，超声时间2 4分钟。上述方法制备的纳米粒的表面电位在各个不同pH条件下始终为负，其进入内体-溶酶体之后即便是在酸性环境中，也无法发生表面电荷的改变并以电荷吸引的方式发生内体-溶酶体的逃脱进入胞浆。壳聚糖能够与鼻腔嗅粘膜上选择性高表达的糖基受体 N-乙酸氨基葡萄糖或L-岩藻糖特异结合，通过结合的特异性受体把生物信号传达给细胞进行胞吞或胞饮。因此，本发明还提供一种壳聚糖修饰的纳米粒制剂，所述载体还包括壳聚糖，在各原料中壳聚糖占100 200mg重量份；在制备上述纳米粒制剂时，壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水作为外水相。本发明优选的一种壳聚糖修饰的纳米粒制剂，负载的药物是桅子苷，载体是聚乳酸-羟基乙酸共聚物和壳聚糖，乳化剂是聚乙烯醇、氢化蓖麻油，各原料的重量配比为桅子苷或桅子总环烯醚萜苷10 250mg，氢化蓖麻油1 30mg，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50 300mg，聚乙烯醇200 500mg，壳聚糖100 200mg ；所述纳米粒制剂通过下述方法制备(1)桅子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中桅子苷的浓度为30g/L，乳化剂的浓度为10g/L ；(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L ；(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L ；(4)将所述内水相和有机相按照体积比为内水相有机相=1 5 10混合，在冰浴中200 400W超声2 4分钟制成初乳；(5)将所述初乳立即注入到外水相中，所述外水相与有机相的体积比为外水相 有机相=5 10 1 ；在冰浴中200 400W超声2 4分钟制成复乳；(6)将所述复乳注入到0. 5% g/L的聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4°C下IOOOOr · HiirT1离心lOmin，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；(7)加入所述沉淀重量8%的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。上述优选的壳聚糖修饰的纳米粒平均粒径为(204. 32士2. 36)nm, Zeta电位为 (5. 13士0. 72)mV，包封率和载药量分别为(75. 68士 1. 15) %和(9. 87士0.27)% ；其在蒸馏水、PH值为5. O 9. 2的缓冲液中Mh内稳定，冻干纳米粒在4°C放置6个月稳定性良好。本发明所述纳米粒制剂优选装入鼻用吸入装置制成喷雾剂应用。本发明所述纳米粒制剂用于治疗的脑部疾病是指脑出血及其后遗症、脑栓塞及其后遗症、血管性痴呆和疱疹病毒病毒性脑炎。下面通过实验例对本发明作具体说明。本发明采用复乳-溶剂挥发法制备所述纳米粒，以包封率、粒径为评价指标，考察了各工艺因素对制剂质量的影响，利用中心优化设计对处方进行优化。实验例1壳聚糖修饰的纳米粒的制备工艺研究1. 1壳聚糖修饰的纳米粒制备工艺设计采用复乳-溶剂挥发法，以桅子苷水溶液为内水相，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)溶于二氯甲烷作为有机相，两相混合，在冰浴中超声形成初乳；将初乳立即注入到含有壳聚糖(⑶)的一定浓度聚乙烯醇(PVA)水溶液中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳在磁力搅拌(IOOOOr .min-1)下注入到大量0. 5%PVA(w/v)水溶液中，继续搅拌4h使二氯甲烷完全挥发，离心(IOOOOr .mirTSlOmimfC )，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀，冷冻干燥即得所述壳聚糖修饰的纳米粒(CS-PLGA-NPs)。同法制得不含壳聚糖(⑶)的纳米粒(PLGA-NPs)。1. 2测定方法的建立收集并合并纳米粒制备离心后的上清液和两次水洗涤液于IOOmL棕色瓶中，加水至刻度，摇勻。精确吸取2mL，加甲醇稀释至10mL，按色谱条件测定上清液中的桅子苷含量， 按以下公式计算纳米粒的包封率(EE)。EE(% )=(投药量-游离药量)/投药量X 100%精密称取冻干纳米粒10mg，加入ImL 二甲基亚砜，超声使纳米粒完全溶解，离心 (IOOOOr · mirT1，15min)，按色谱条件测定上清液中桅子苷含量，按以下公式计算纳米粒的载药量(LE)。LE(% )=称取的纳米粒内包封的药物量/称取的纳米粒总质量X 100%色谱条件TSK-GEL，0DS-100S(4. 6匪X 150匪，5 μ m)；流动相乙腈-水 (15 85)；流速=LOmL ‘ mirT1 ；检测波长:238nm ；柱温:25°C ；进样量 20 μ L01. 2. 2液相色谱系统的可行性验证按“1. 1”方法分别制备空白纳米粒和载药纳米粒，分别溶解于二甲基亚砜，按色谱条件测定，色谱图见
图1。空白纳米粒中无干扰桅子苷测定的物质，表明该色谱系统适用于桅子苷包封率的测定。1.2. 3方法回收率精确称取空白纳米粒若干份，每份10mg，依次加入0. ImL桅子苷标准溶液配成高、 中、低三个浓度的样品，按色谱条件测定上清液中的桅子苷含量。测量值与真实值之比即为回收率，结果见表1。回收率符合方法学的要求。表1回收率实验结果(n = 3)栀子苷加入量(μ幻测定值(Pg)
回收率(％)
RSD(%)
40 80 160
38 77 153
95.0 96.3 95.6
1.25 1.02 0.951. 3中心优化设计1. 3. 1单因素实验1. 3. 1. 1初乳制备中乳化剂的影响固定内水相为0.5mL桅子苷水溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为5mLPLGA 的二氯甲烷溶液(质量浓度为20g/L)；外水相为25mL含PVA的水溶液(质量浓度为 10g/L)；初乳超声200WXaiiin ；复乳超声200WXaiiin。分别向内水相中加入乳化剂吐温-80(Tween-80) ,PEG-400，氢化蓖麻油，泊洛沙姆-188 ；有机相中加入乳化剂Span-80，考察加入乳化剂的种类和浓度对纳米粒包封率的影响，结果见表2。表2初乳制备中乳化剂对包封率和粒径的影响(n = 3)
乳化剂
种类
浓度(g/M
包封率(％)
平均粒径(n m)
无021.62±0.12201 士 3.3Span-801023.30±0.24683±3.7Twccn-801069.92±0.28235±4.1PEG-4001045.44±0.13578士 3.8氢化蓖麻汕1075.62土 0.14203士 0.22泊洛沙姆-1881029.52±0.09451±0.19实验发现不加入乳化剂无法形成稳定的初乳，纳米粒不能有效地包裹药物，导致包封率极低；有机相中加入乳化剂Span-80可形成淡黄色的初乳，但放置1 aiiin后很快分层；内水相中加入乳化剂氢化蓖麻油或吐温-80后纳米粒的包封率明显提高，中等浓度可形成稳定的白色初乳，因此制备初乳时，内水相需加入氢化蓖麻油或吐温-80为乳化剂， 表2结果显示氢化蓖麻油的效果更好。接着考察了不同浓度氢化蓖麻油对纳米粒的包封率和粒径的影响，结果见表3。表3不同浓度氢化蓖麻油对纳米粒的包封率和粒径的影响(n = 3)
氢化蓖麻汕(g/L)
包封率(％)
平均粒径(n m)
5 10 15
71.00±0.27 75.62士 0.14 74.48士 0.18
209士 0.16 203土 0.22 212 土 0.13 从表3可知，氢化蓖麻油的浓度在5 15g/L时，对纳米粒的包封率和粒径的影响无显著影响。
8
1. 3. 1. 2内水相与有机相体积比的影响固定内水相为0. 5mL桅子苷的氢化蓖麻油(10g/L)溶液(质量浓度为30g/L)；有机相为PLGA的二氯甲烷溶液(质量为20g/L)；外水相为PVA水溶液(质量浓度为5g/L)； 有机相与外水相的体积比(Ο/ffe)为1 5 ；初乳超声200WXanin;复乳超声200WXanin， 考察内水相与有机相的体积比(Wi/Ο)对纳米粒包封率和粒径的影响，结果见表4，当固定桅子苷与PLGA的质量，即二者比例时，内水相与有机相的体积比对纳米粒的包封率无明显影响。表4内水相与有机相的体积比(Wi/Ο)对纳米粒包封率和粒径的影响(n = 3)
权利要求
1.一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂，其特征在于负载的药物是桅子苷或桅子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种，各原料的重量份为桅子苷或桅子总环烯醚萜苷10 250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1 30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50 300mg重量份，聚乙烯醇200 500mg重量份；所述纳米粒制剂通过下述方法制备桅子苷或桅子总环烯醚萜苷以及选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种溶于水中作为内水相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂作为有机相，聚乙烯醇溶于水中作为外水相；将内水相和有机相混合，在冰浴中超声制成初乳；将初乳立即注入到外水相中，在冰浴中超声制成复乳；将复乳注入到含有聚乙烯醇的水溶液中，继续搅拌使有机溶剂完全挥发， 低温离心，收集沉淀，加入冻干保护剂甘露醇，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于桅子总环烯醚萜苷中桅子苷的含量不少于25%。
3.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于构成内水相时，所述乳化剂为氢化蓖麻油，浓度为5 15g/L。
4.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于所述有机相中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20 30g/L。
5.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于所述外水相中聚乙烯醇的浓度为 10 15g/L。
6.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于所述有机溶剂是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂。
7.根据权利要求1所述的纳米粒制剂，其特征在于超声制备初乳和复乳时，超声功率为200 400W，超声时间为2 4分钟。
8.根据权利要求1至7任一权利要求所述的纳米粒制剂，其特征在于所述载体还包括壳聚糖，在各原料中壳聚糖占100 200mg重量份；在制备所述纳米粒制剂时，壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水作为外水相。
9.根据权利要求8所述的纳米粒制剂，其特征在于负载的药物是桅子苷，载体是聚乳酸-羟基乙酸共聚物和壳聚糖，乳化剂是聚乙烯醇、氢化蓖麻油，各原料的重量份为桅子苷10 250mg重量份，氢化蓖麻油1 30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物 50 300mg重量份，聚乙烯醇200 500mg重量份；壳聚糖100 200mg重量份；所述纳米粒制剂通过下述方法制备(1)桅子苷和氢化蓖麻油溶于水中作为内水相，其中桅子苷的浓度为30g/L，氢化蓖麻油的浓度为10g/L ；(2)聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷作为有机相，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为20g/L ；(3)聚乙烯醇和壳聚糖溶于水中作为外水相，其中聚乙烯醇的浓度为10g/L，壳聚糖的浓度为4g/L ；(4)将所述内水相和有机相按照体积比为内水相有机相=1 5 10混合，在冰浴中200 400W超声2 4分钟制成初乳；(5)将所述初乳立即注入到外水相中，所述外水相与有机相的体积比为外水相有机相=5 10 1 ；在冰浴中200 400W超声2 4分钟制成复乳；(6)将所述复乳注入到0.5%g/L聚乙烯醇水溶液中，继续搅拌4小时，使二氯甲烷完全挥发，4°C下IOOOOr · HiirT1离心lOmin，蒸馏水洗涤三次，收集沉淀；(7)加入所述沉淀重量8%的甘露醇作为冻干保护剂，冷冻干燥，即得。
10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或9所述的纳米粒制剂，其特征在于所述纳米粒制剂装入鼻用吸入装置制成喷雾剂。
全文摘要
本发明公开了一种治疗脑部疾病的纳米粒制剂，其负载的药物是栀子苷或栀子总环烯醚萜苷，载体包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳化剂是聚乙烯醇和选自氢化蓖麻油或吐温-80中的一种，各原料的重量份为栀子苷或栀子总环烯醚萜苷10～250mg重量份，吐温-80或氢化蓖麻油1～30mg重量份，聚乳酸-羟基乙酸共聚物50～300mg重量份，聚乙烯醇200～500mg重量份。本发明还公开了一种壳聚糖修饰的、以栀子苷或栀子总环烯醚萜苷为负载药物的纳米粒制剂。上述纳米粒制剂通过复乳-溶剂挥发法制备。本发明所述制剂通过鼻腔给药，能够有效地提高栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在脑部组织中的浓度，与经胃肠道、肌肉注射等给药途径的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷制剂相比，给药量小，病人顺应性好。
文档编号A61K36/744GK102283812SQ201010202208
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者万娜, 张海燕, 杨军宣, 杨明, 汪建民, 芦乾 申请人:江西中医学院