钠尿肽受体a的激动剂在疼痛治疗中的用途的制作方法

专利名称：钠尿肽受体a的激动剂在疼痛治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医药领域。更具体地，本发明涉及钠尿肽受体激动剂，优选钠尿肽受体A的激动剂(例如B型钠尿肽或心房钠尿肽)，在疼痛治疗中的用途。
背景技术：
疼痛，是机体对损伤组织或潜在的损伤产生的一种不愉快的反应，是一种复杂的生理心理活动，也是临床上最常见的症状之一。它由痛觉和痛反应两部分组成。它包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的痛反应(躯体运动性反应和/或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩)。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应。但另一方面，某些剧烈或长期的疼痛，对机体已成为一种难以忍受的折磨。因此，镇痛是本领域研究者所面临的重要任务。众所周知，神经肽及其受体在疼痛传递和调节中发挥着重要的作用。神经肽是泛指存在于神经组织并参与神经系统功能作用的内源性活性物质，是一类特殊的信息物质。 它们的特点是含量低、活性高、作用广泛而又复杂，在体内调节多种多样的生理功能，如痛觉、睡眠、情绪、学习与记忆，甚至于神经系统本身的分化和发育都受神经肽的调节。背根神经节小神经元在接受痛刺激时会分泌其表达的P物质和降钙素基因相关肽，从而增强兴奋性突触传递(Schaible，1996，Prog Brain Res 113:423-441)。生长抑素及其受体也表达在一部分背根神经节小神经元中，激活生长抑素受体会降低炎症引起的伤害性感受(HSkfelt等，1976，Neuroscience 1 :131-136 ；Carlton 等，2001，Pain 90 233-244 ；Bar 等，2004，Neuroscience 127 :197-206)。此外，在正常情况下，甘丙肽、神经降压素和神经肽Y也都表达在背根神经节神经元中，同时这些神经肽也在脊髓背角神经元中有表达(Todd等，1994，JNeurosci 14 774-784 ;Simmons 等，1995，Neurosci Lett 187 :119-122 ;Zhang 等，1995，JNeurosci 15: 2733-2747 ;Zhang 等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94 :729-734 ;Zhang 等，1998，Ann N Y Acad Sci 863 :402-413 ;Polgar 等，1999，J Neurosci 19:2637-2646)。和 P 物质、 降钙素基因相关肽以及生长抑素一样，这些神经肽也参与调节背根神经节神经元电活动 (Zhang 等，1995，J Neurosci 15 :2733-2747 ;Xu 等，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94: 13262-13266)。值得注意的是，以上提到的这些神经肽及其受体在周围神经损伤或炎症情况下，它们在背根神经节中的表达会发生显著性的改变(Ji等，1994，J Neurosci 14 6423-6434 Ji 等，1995，Neuroscience 68 :563-576 ;Zhang 等，1995，J Neurosci 15: 2733-2747 ；Zhang等，1998，Ann N Y Acad Sci 863 :402-413 ；Xiao等，2002，ProcNatl Acad Sci USA 99 :8360-8365)，这表明它们在调节病理性疼痛方面发挥着潜在的作用。虽然本领域关于神经肽的研究已获得了上述进展，但本领域仍然迫切需要进一步研究出那些未知的神经肽和受体在背根神经节中表达，以及在外围组织炎症后其表达所发生的变化，从而开发出治疗或缓解疼痛的有效途径和方法。钠尿肽是旁分泌因子，家族中包括四个成员心房钠尿肽、B型钠尿肽和C型钠尿肽(Potter等，2009，Handb Exp Pharmacol :341-366)。B型钠尿肽也称脑钠尿肽，由心脏的心室表达和分泌。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是由心房肌细胞合成并释放的肽类激素，其主要作用是使血管平滑肌舒张和促进肾脏排钠、排水。D型钠尿肽是从一种美洲眼镜蛇中提炼出来的38个氨基酸的多肽，其具有调节心血管系统、泌尿系统、 消化系统和生殖系统的功能。目前，将钠尿肽受体(natriuretic peptide receptor, NPR)分为 A、B、C 三个亚型，其中A受体(NPR-A)和B受体(NPR-B)是鸟苷酸环化酶偶联受体，钠尿肽与A、B受体结合后，激活受体的鸟苷酸环化酶活性，通过升高细胞内cGMP发挥生理效应；C受体(NPR-C) 为非偶联受体，主要介导钠尿肽的清除。钠尿肽受体A属于鸟苷酸环化酶受体，B型钠尿肽与钠尿肽受体A结合会提高 ^fflIfirtJf^if13' ,5' -iMW. (cyclic guanosine 3' ,5' -monophosphate, cGMP) ^yjC 平(Misono，2002，Mol Cell Biochem 230 :49-60)，然后进一步活化 cGMP 依赖的蛋白激酶 (cGMP-dependent protein kinase, PKG)、离子通道以及其它效应分子(Hofmann 等，2006， Physiol Rev 86 :1_2；3)。钠尿肽受体A同时也是心房钠尿肽的受体。钠尿肽受体A目前主要被发现表达在心血管、肾脏和肾上腺中，发挥着调节血管舒张、尿钠排泄和醛固酮合成等功能(Hofmann 等，2006，Wiysiol Rev 86 :1_23)。虽然目前大多数研究B型钠尿肽和钠尿肽受体A的表达和作用都是集中在心血管系统(Woodard 和 Rosado，2007，J Cell Mol Med 11 :1263-1271 ;Potter 等，2009，Handb Exp Pharmacol :341-366)，最近也有研究表明B型钠尿肽和钠尿肽受体A也在中枢神经系统也有低水平表达，并且有调节突触传递以及神经保护作用(Richard和Bourque，1996， J Neurosci 16 :7526-7532 ;Kuribayashi 等，2006，Brain Resl071:34-41;Cao 和 Yang， 2008，Prog Neurobiol 84 :234-248)。然而，本领域从未对钠尿肽和其受体(例如B型钠尿肽和钠尿肽受体A)在周围神经系统的表达和功能进行研究，也不清楚其与疼痛之间是否存在关系。综上所述，尽管目前本领域已经发现了一些在感觉信息传递中起作用的分子，然而还迫切需要研究在感觉信息传递过程中还有那些分子在起作用，以推动对感觉信息传递的了解，提出新的镇痛策略和开发新的镇痛药物。

发明内容
本发明的目的之一就是揭示周围神经cGMP上调物质(如钠尿肽受体)在制备用于缓解或治疗疼痛(尤其是慢性疼痛)的药物组合物中的用途。本发明还具体揭示了钠尿肽受体(如钠尿肽受体A)激动剂(如B型钠尿肽)在周围神经系统的表达和功能。本发明的另一目的是提供B型钠尿肽、其受体及其调节剂在疼痛治疗中的用途。在本发明的第一方面，提供了外周神经cGMP上调物质在制备用于缓解或治疗疼痛的药物组合物中的用途。在本发明的一个实施方式中，所述外周神经cGMP上调物质是钠尿肽受体激动剂。在本发明的另一个实施方式中，所述钠尿肽受体激动剂选自钠尿肽受体A的激动剂、钠尿肽受体B的激动剂和/或钠尿肽受体C的激动剂。在本发明的另一个实施方式中，所述钠尿肽受体激动剂选自天然钠尿肽、它们具有激动钠尿肽受体活性的类似物、或其组合。在本发明的另一个实施方式中，所述天然钠尿肽选自心房钠尿肽、B型钠尿肽、C 型钠尿肽、D型钠尿肽、尿扩张素、前钠尿肽、原-前钠尿肽或它们的组合。在本发明的另一个实施方式中，所述类似物选自与PEG偶联的天然钠尿肽；与血清白蛋白或其片段偶联的天然钠尿肽；天然钠尿肽的可变剪切产物；由天然钠尿肽的环状部分与氨基端和/或羧基端尾部形成的融合蛋白，优选由一种天然钠尿肽的环状部分与另一种天然钠尿肽的非环状部分组成的融合蛋白。在本发明的另一个实施方式中，所述衍生物选自；AlbuBNP、⑶_NP、ASBNP, ASBNP. 1、hBNPl-32、hBNP-OM、奈西立肽、或它们的组合。在本发明的另一个实施方式中，所述钠尿肽受体激动剂是钠尿肽受体A的激动剂。在一个优选例中，所述钠尿肽受体A是哺乳动物的钠尿肽受体A。在另一个优选例中，所述哺乳动物选自人、猩猩、猴子、犬、大鼠、小鼠、牛、马、羊或猪。在本发明的一个实施方式中，所述钠尿肽受体A的激动剂选自B型钠尿肽或心房钠尿肽。在一个优选例中，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽选自(a) SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的蛋白质或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质；(b) (a)中所限定的蛋白质的保守性变异蛋白质或其活性片段；或(c)将(a)中氨基酸序列经过1-20个，优选1_10个，更优选1_5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有激活钠尿肽受体A的活性的、由(a)衍生的蛋白质。在本发明的另一个实施方式中，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽的形式选自下组: 分离的B型钠尿肽或心房钠尿肽、其编码序列或包含其编码序列的载体或遗传工程化的宿主细胞。在本发明的另一个实施方式中，所述疼痛是自身源性疼痛。在本发明的另一个实施方式中，所述身源性疼痛选自神经病理性疼痛或伤害感受性疼痛。在一个优选例中，所述神经病理性痛选自背根神经节神经源性痛、三叉神经节神经源性痛、偏头痛或坐骨神经痛，优选为选自下组的由周围神经系统的损伤或病理改变引起的疼痛腰背痛、神经痛、纤维性肌痛、糖尿病相关的神经痛、多发性硬化相关的神经痛、 带状疱疹后神经痛以及与HIV有关联的神经病理性神经痛。在另一个优选例中，所述伤害感受性疼痛选自躯体伤害感受性疼痛或内脏伤害感受性疼痛，优选癌痛、关节炎痛、术后痛或与HIV有关联的伤害感受性疼痛。在本发明的另一个实施方式中，所述疼痛是炎性痛。在本发明的另一个实施方式中，所述炎性痛选自关节炎痛、糖尿病并发末梢神经炎性疼痛、外周组织炎性痛或内脏炎性痛。
在本发明的另一个实施方式中，所述疼痛是慢性疼痛或急性疼痛，优选所述慢性疼痛是慢性感受性疼痛或慢性神经病理性疼痛，更优选慢性感受性疼痛。在本发明的另一个实施方式中，所述慢性疼痛选自下组软组织、关节和骨疼痛各种骨关节炎、创伤后畸形性疼痛、骨骼肌疼痛、腰痛、肌筋膜疼痛综合征、头痛、烧伤后疼痛；深部组织和内脏痛 心血管疼痛、眼痛、口面部疼痛、慢性妇科疼痛、性交痛、泌尿生殖系统慢性疼痛；神经和神经根损伤性疼痛截肢后幻肢痛、周围神经性疼痛、反射性交感神经营养不良和交感神经持续痛、三叉神经痛和非典型性面部痛、神经根损伤和蛛网膜炎、带状疱疹后神经痛；中枢性疼痛脑、脊髓的血管损伤，如出血、梗塞、血管畸形；多发性硬化；外伤性脊髓损伤，脑损伤；脊髓空洞症和延髓空洞症；肿瘤；帕金森病；儿童疼痛生长痛；老年人疼痛颈椎病、 腰椎间盘突出症、腰椎滑脱所致疼痛；或癌性疼痛。在本发明的第二方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)缓解或治疗疼痛有效量的钠尿肽受体(例如钠尿肽受体A)的激动剂；(b)药学上可接受的载体。在本发明的一个实施方式中，所述钠尿肽受体A的激动剂选自B型钠尿肽或心房钠尿肽。在一个优选例中，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽选自(a) SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的蛋白质或SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质；(b) (a)中所限定的蛋白质的保守性变异蛋白质或其活性片段；或(c)将(a)中氨基酸序列经过1-20个，优选1_10个，更优选1_5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有激活钠尿肽受体A的活性的、由(a)衍生的蛋白质。在另一个优选例中，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽的形式选自下组分离的B型钠尿肽或心房钠尿肽、其编码序列或包含其编码序列的载体或遗传工程化的宿主细胞。在本发明的第三方面中，提供了一种筛选可用于缓解或治疗疼痛的潜在物质的方法，所述的方法包括(1)将候选物质与背根神经节小神经元接触；(2)检测候选物质是否可激活钠尿肽受体/PKG/BKCa途径(例如钠尿肽受体A/ PKG/BKCa 途径)；若所述候选物质可激活钠尿肽受体/PKG/BKCa途径，则表明该候选物质是缓解或治疗疼痛的潜在物质。在一个优选例中，所述钠尿肽受体/PKG/BK&途径活化的检测是通过测试一个或多个选自下组的指标进行的钠尿肽受体的表达水平、电活动、钙离子水平、细胞内cGMP水平、已知钠尿肽受体A/PKG/BK。a途径的抑制剂对该候选物质作用的逆转或抑制。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1 :B型钠尿肽和钠尿肽受体A在背根神经节中的表达以及在外周组织炎症后的表达变化。
图IA 被基因芯片检测出的外周炎症后表达有显著变化的神经肽和神经肽受体的聚类分析。CFA足底注射后，18个神经肽和7个神经肽受体在腰(L) 4和L5背根神经节的表达水平显著增加，包括B型钠尿肽及其受体钠尿肽受体A ；图IB 免疫印迹分析表明与对照组相比，CFA足底注射后L4和L5背根神经节的B 型钠尿肽和钠尿肽受体A蛋白质水平也相应增加。背根神经节中B型钠尿肽蛋白质水平在外周炎症后逐渐增加，在注射第4天达到高峰。钠尿肽受体A在注射后第1天蛋白质水平开始增加，并于第2天到达高峰。以甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)用作上样内参0.05， 与正常组比较。图2 :B型钠尿肽和钠尿肽受体A在背根神经节小神经元中的表达以及在周围炎症后的表达变化。图2A 免疫组织化学染色表明B型钠尿肽免疫反应和钠尿肽受体A免疫反应主要分布在L4和L5背根神经节小神经元。CFA足底注射2天后，B型钠尿肽和钠尿肽受体A在背根神经节小神经元表达增加。被B型钠尿肽免疫染色的神经元数量大于被钠尿肽受体A 免疫染色的神经元数量。所有钠尿肽受体A阳性神经元也呈B型钠尿肽阳性。标尺50微米。图2B 正常和CFA足底注射2天后大鼠B型钠尿肽和钠尿肽受体A阳性的L4和 L5背根神经节神经元细胞大小分布。B型钠尿肽和钠尿肽受体A阳性神经元尺寸落在背根神经节小神经元的大小范围内(横截面面积< 900平方微米)。图2C 背根神经节小神经元B型钠尿肽免疫强度从正常大鼠的63. 56士0. 69 (608 个神经元)增加到CFA足底注射2天后的81. 64士0. 87 (606个神经元)。钠尿肽受体A免疫荧光强度也从正常的58. 02士0. 83(324个神经元)增加至炎症2天后的51. 14士0. 67(317 个神经元)。_p< 0.001，与正常组比较。图2D 在L4和L5背根神经节，正常和CFA足底注射2天后分别约52%和53%的 B型钠尿肽阳性神经元也染色钠尿肽受体A ；几乎所有的钠尿肽受体A阳性神经元均呈B型钠尿肽阳性。图3 =B型钠尿肽在TrkA阳性的背根神经节小神经元中的表达。图3A 双染色表明B型钠尿肽存在于TrkA阳性的大鼠背根神经节小神经元中。图;3B =B型钠尿肽存在于背根神经节CGRP阳性和IB4阳性小神经元中。比例尺 50微米。图4 钠尿肽受体A在背根神经节肽能小神经元中的表达。图4A 双染色显示钠尿肽受体A表达在含CGRP的大鼠背根神经节小神经元中。图4B 在脊髓背角浅层，钠尿肽受体A阳性纤维同时也表达CGRP。此外，钠尿肽受体A免疫反应还发现沿血管分布(箭头所指)。比例尺50微米。图5 存在谷氨酸条件下，B型钠尿肽对背根神经节小神经元兴奋性的降低作用。图5A 全细胞膜片钳记录显示成年大鼠背根神经节小神经元受去极化斜坡电流刺激(1秒的时间，峰从100至500皮安培)诱发的动作电位的放电频率在加了 100纳克/ 毫升B型钠尿肽10分钟后并没有发生明显改变，加10微摩尔谷氨酸则增加了放电频率。然而B型钠尿肽和谷氨酸一起处理(100纳克/毫升B型钠尿肽+10微摩尔谷氨酸，10分钟) 则显著地抑制了神经元兴奋性。
图5B :电流刺激引起的背根神经节小神经元动作电位的放电频率比值(加药后除以加药前)在加细胞外液(1. 13士0.06，22例)与加B型钠尿肽(100纳克/毫升； 1. 13士0. 09，14例)组间没有显著性区别(p = 0. 971)。但加10微摩尔谷氨酸后有轻微增加(1. 49士0. 14，10例，p = 0. 035)。B型钠尿肽和谷氨酸一起加很大程度上抑制了诱发的动作电位(0.08士0.05，21例，_ <0.001)。B型钠尿肽加谷氨酸导致的神经元兴奋性抑制可以被预先处理PKG抑制剂KT5823 (1. 81 + 0. 17，11例)或钾通道BKca阻滞剂 iberiotoxin(IBTX) (1. 14士0. 15，10 例)阻断。图6 鞘内注射B型钠尿肽对福尔马林诱导的急性痛的抑制作用。图6A:鞘内注射B型钠尿肽(100纳克、500纳克和2微克，先于足底注射福尔马林 10分钟)剂量依赖性地降低福尔马林诱导的两相痛反应(P < 0. 001，分别对应100纳克、 500纳克和2微克B型钠尿肽；与注射盐水组比较，AN0VA, 7例鼠/组)。图6B =B型钠尿肽诱导的抗伤害性作用可以被鞘内预先注射(先于鞘内注射B型钠尿肽10分钟)PKG抑制剂KT5823(500纳克)或钾通道BKca阻滞剂iberiotoxin (IBTX) (500纳克)阻断(第一相:p = 0.038和0.048，第二相=P = 0. 003和0. 037，为共同给予 B型钠尿肽和KT5823或IBTX，与B型钠尿肽单独给比较，7例鼠/组)，而采用ATP敏感钾通道阻滞剂格列苯脲(Glib) (50微克)不能阻断B型钠尿肽的作用。福尔马林的致痛行为不能被KT5823、IBTX或Glib单独处理影响(7例鼠/组)。*p < 0. 05，和盐水组比；#p < 0. 05、##p < 0.01，与B型钠尿肽单独给比较。图7 鞘内注射B型钠尿肽对CFA诱导的慢性炎性痛的抑制作用。图7A:在大鼠左后爪足底注射CFA两天后，鞘内注射B型钠尿肽O微克)大大增加了辐射热试验的缩爪潜伏期ΓΡ < 0. 001，AN0VA,与注射盐水组比较，7例鼠/组)。图7B CFA足底注射2天和4天后，鞘内注射B型钠尿肽增加了热刺激缩爪潜伏期。 数据采自B型钠尿肽注射120分钟点。(P < 0. 001、= 0. 039和0. 211，对应为B型钠尿肽在CFA注射后第2、4和7天，与注射盐水组比较，7例鼠/组)。鞘内注射KT5823则阻碍了自身热痛觉恢复。数据采自KT5823注射120分钟点。(P = 0. 056、< 0. 001和< 0. 001，对应为KT5823在CFA注射后第2、4和7天，与注射盐水组比较，7例鼠/组)。*p < 0. 05和 ***p < 0. 001，与盐水组比较。
具体实施例方式发明人经过长期而深入的研究发现钠尿肽受体(例如钠尿肽受体A)的激动剂 (例如B型钠尿肽)可通过激活钠尿肽受体介导的钠尿肽受体/PKG/BK。a途径降低疼痛，从而可用于镇痛(尤其是炎性痛或慢性疼痛)。由此，发明人提供了一种缓解和/或治疗疼痛的新策略和新药物类型。在此基础上发明人完成了本发明。以发明人关于B型钠尿肽和钠尿肽受体A的研究为例，在此项研究中，发明人利用基因芯片和免疫分析发现B型钠尿肽和钠尿肽受体A的在背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)中表达，并且在完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant，CFA)足底注射诱导的大鼠炎性痛模型中表达增加。免疫组织化学结果显示B型钠尿肽表达在神经生长因子受体(tyrosine kinase receptor A, TrkA)阳性背根神经节小神经元中，其中包括大多数降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide, CGRP)阳性小神经元和IB4(isolectin B4)阳性小神经元。而钠尿肽受体A则仅存在于CGRP阳性小神经元中。外源性应用B型钠尿肽会降低背根神经节小神经元兴奋性，其作用主要是通过开放大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+_activated K+channel，zBKCa)而实现。此外，鞘内注射B型钠尿肽能显著地抑制因脚掌注射福尔马林引起的痛行为和CFA诱导大鼠热痛觉过敏。如果鞘内预先给予cGMP依赖的蛋白激酶(cGMP-cbpendent protein kinase, PKG)抑制剂KT5823或钾通道BKea阻滞剂iberiotoxin则阻断了 B型钠尿肽介导的镇痛作用。因此，B型钠尿肽通过其突触前受体钠尿肽受体A反向调节了痛觉传递。这表明在伤害性感觉神经通路中，激活B型钠尿肽/钠尿肽受体A是治疗或缓解疼痛的潜在策略。发明人的研究还进一步表明了体内激活钠尿肽受体/cGMP/PKG/BKCa途径，可缓解对象的疼痛，因此使用合适的激动剂选择性激活伤害性传入神经元钠尿肽受体介导的信号通路可以进一步作为治疗或缓解疼痛的潜在策略。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成” 属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。疼痛及其分类如本文所用，术语“疼痛”是指机体对损伤组织或潜在的损伤产生的一种不愉快的反应，是一种复杂的生理心理活动，也是临床上最常见的症状之一。疼痛可分为身源性 (somatogenic)疼痛和心因性(psychogenic)疼痛。身源性疼痛又可分感受性疼痛(如伤害感受性疼痛，nociceptive pain)与神经病理性疼痛(Neuropathic Pai) 0疼痛根据其发生和持续的时间和进程可分为急性疼痛和慢性疼痛，慢性疼痛也包括慢性感受性疼痛或慢性神经病理性疼痛。神经病理性疼痛是由于中枢或周围神经系统的损伤或病理改变引起，包括但不限于腰背痛(lower back pain)、神经痛(neuralgia)、纤维性肌痛(Fibromyalgia)、糖尿病相关的神经痛(diabetic neuropathic pain, DNP)、多发性硬化相关的神经痛(pain associated with multiple sclerosis)、带状疱疹后神经痛(PHN)和HIV有关联的(神经病理性)神经痛(HIVNP)等。伤害感受器性疼痛是由于人体内的伤害感受器受到机械、热、化学刺激或损伤引起，可分为躯体伤害感受器性疼痛和内脏伤害感受器性疼痛，包括但不限于癌痛 (cancer-related pain)、关节炎痛(arthritic pain)、术后痛(post-operative pain)禾口 HIV有关联的(伤害感受器性)神经痛(HIVNP)等。其中，神经痛(neuralgia)包括但不限于三叉神經痛(Trigeminal neuralgia)、坐骨神经痛(sciatic neuralgia)等。疼痛根据其发生和持续的时间和进程可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛是一群随损伤或各种急症等明显刺激因素迅速发生的复杂而不愉快的感受、知觉和情感上的体验，伴有自主的、心理的和行为的反应，其包括手术后、创伤后疼痛、烧伤和各种内外科急症，例如心梗，急性胰腺炎，胆绞痛，肾绞痛，急性阑尾炎、病理性骨折，急性肠梗阻患者出现急性疼痛等。急性疼痛的治疗方法包括病房开展自控镇痛 (PCA)，将局麻药和/或阿片类药于硬膜外腔输注等。在机理或动物试验中常采用甲醛法、 热板法等模型或方法造成动物的急性疼痛，并立即给予待测药物，以观察待测药物对急性疼痛的缓解作用。慢性疼痛是是指疼痛持续较长时间(如超过数周 1个月)，超过一般急性病的进展，或者超过伤口愈合的合理时间，或与引起持续疼痛的慢性病理过程有关，或者经过数月或数年的间隔时间疼痛复发。在机理或动物试验中常采用完全弗氏佐剂等诱导造成动物的慢性疼痛，并在诱导数日乃至数周后给予待测药物，以观察待测药物对慢性疼痛的缓解作用。慢性疼痛的病程长、病因复杂；中枢和外周神经系统的不同结构和功能的异常； 自主神经系统和情绪的变化；以及社会适应能力、生活或/和工作能力的降低；精神、家庭多方面的心理障碍的特点，决定了康复治疗手段对于慢性疼痛治疗的重要意义。慢性疼痛不缓解，会从心理上、生理上给患者造成不良影响；不能缓解的疼痛将延迟患者的恢复，延长住院日期，给患者和家属增加负担，加大医疗保险费用，使之丧失工作、 家庭、尊严，引起抑郁、焦虑、自杀，使心理残废的群体扩大。不仅如此，还增加了社会的不安定因素。相比较而言，现在一般认为急性疼痛是疾病的一个症状，而慢性疼痛是一类疾病。慢性疼痛包括但不限于①软组织、关节和骨疼痛各种骨关节炎、创伤后畸形性疼痛、骨骼肌疼痛、腰痛、肌筋膜疼痛综合征、头痛、烧伤后疼痛。②深部组织和内脏痛心血管疼痛、眼痛、口面部疼痛、慢性妇科疼痛、性交痛、泌尿生殖系统慢性疼痛。③神经和神经根损伤性疼痛截肢后幻肢痛、周围神经性疼痛、反射性交感神经营养不良和交感神经持续痛、三叉神经痛和非典型性面部痛、神经根损伤和蛛网膜炎、带状疱疹后神经痛。④中枢性疼痛脑、脊髓的血管损伤，如出血、梗塞、血管畸形；多发性硬化；外伤性脊髓损伤，脑损伤；脊髓空洞症和延髓空洞症；肿瘤；帕金森病。⑤儿童疼痛生长痛。⑥老年人疼痛各种颈椎病、腰椎间盘突出症、腰椎滑脱等所致疼痛。⑦癌性疼痛。目前，慢性疼痛治疗的主要方法有①慢性疼痛的药物治疗法，如使用阿片类药物，非阿片类药物，肾上腺皮质激素，解痉药和维生素类药物，神经安定药，局部麻醉药，神经破坏药等；②慢性疼痛的神经与局部阻滞法，如硬膜外阻滞疗法，蛛网膜下腔阻滞疗法，三叉神经阻滞疗法，颞颂关节阻滞疗法，肩胛上神经阻滞疗法，椎旁神经根阻滞疗法，坐骨神经阻滞疗法，星状神经节阻滞疗法等；③慢性疼痛的神经外科治疗法，如神经后根切断术，低位脑神经切断术和脑神经的经皮热凝固术，硬脊膜内脊神经根切断术，硬脊膜外神经根切断术，选择性后根根丝切断术，经皮脊神经根毁损术，经皮中央分支神经切断术；④CT 引导下脑立体定向外科毁损术，如三叉神经毁损术，经皮椎间盘切吸术，晚期顽固性癌痛神经毁损术，脑垂体破坏镇痛，手术戒毒；⑤刺激疗法，如经皮神经电刺激，脊髓电刺激， 脑刺激法缓解疼痛；⑥慢性疼痛的心理治疗，如安慰剂和安慰剂效应，放松和生物反馈，认知一行为方法，催眠止痛，行为治疗；⑦慢性疼痛的物理治疗，如超声波、超短波、微波、激光、表面加热和冷却、红外偏振光等疗法缓解疼痛；推拿与按摩缓解疼痛；运动训练和运动限度缓解疼痛；⑧癌性疼痛的处理；⑨其他方法，如介入性射频热凝术，A-肉毒毒素注射治疗慢性疼痛，癌性痛的放疗、化疗、内分泌疗法，针灸疗法，小针刀疗法，患者自控镇痛疗法(PCA)等。虽然本领域中已知疼痛治疗和控制的各种方法，但是本领域中仍然迫切需要开发出有效针对疼痛(尤其是慢性疼痛)的有效药物。周围神经系统cGMP上调物质和钠尿肽警体的激活剂如本文所用，术语“周围神经系统cGMP上调物质”是指施用后可使得周围神经系统中的cGMP水平上升，从而达到缓解或治疗疼痛的效果的活性物质。本发明中的周闱神经系统cGMP上调物质优诜为钠尿肽警体激活剂。如本文所用，术语“钠尿肽受体激活剂”是指可通过与钠尿肽受体结合或通过其它方式激活钠尿肽受体，由此进一步激活钠尿肽受体/cGMP/PKG/BK。a途径，从而达到缓解或治疗疼痛的效果的活性物质。所述术语中包括钠尿肽受体A的激活剂、钠尿肽受体B的激活剂、钠尿肽受体C的激活剂或它们的组合。可用于本文中的钠尿肽受体激动剂包括但不限于天然钠尿肽、它们具有激动钠尿肽受体活性的类似物(或衍生物)、和/或其组合。术语“天然钠尿肽”是指天然存在的钠尿肽或它们的前体，包括但不限于心房钠尿肽、B型钠尿肽、C型钠尿肽(例如如SEQ ID NO 3所示)、D型钠尿肽(例如如SEQ ID NO :4所示)、尿扩张素、前钠尿肽或原-前钠尿肽。优选所述天然钠尿肽来自人、犬、鼠、 马、牛或羊等哺乳动物。术语“具有激动钠尿肽受体活性的类似物”是指衍生自钠尿肽受体的天然激动剂，且可与钠尿肽受体结合，并进一步激活钠尿肽受体/cGMP/PKG/BK。a途径，从而达到缓解或治疗疼痛的效果的活性物质，例如，天然钠尿肽的氨基酸序列被删除、截断、插入、取代、 替换、延长和其他蛋白融合等的类似物，该类似物仍然保留天然钠尿肽生物学活性。优选的，该类似物包含一个天然的或人工的钠尿肽受体结合功能域，且保留部分或全部结合钠尿肽的活性。适用于本发明的许多钠尿肽的类似物包含钠尿肽环状部分，例如由ANP、BNP, CNP 或DNP各自序列中的两个半胱氨酸之间的二硫键连接形成的环状结构(如人BNP CyslO 和Cys26由二硫键连接而形成的环状结构)。虽然有些类似物的此环也会包含一些不同于天然钠尿肽的氨基酸残基的取代、删除、和/或插入，只要这些氨基酸的取代、删除、和/ 或插入并不会减弱该类似物与天然钠尿肽相同的生物学活性，则该类似物等同于天然钠尿月太。比如，在 Schoenfelda 等发表的文章〃 Mutations in B—type natriuretic peptide mediating receptor-Α selectivity, “ FEBS Letters 414 (1997) 263—267 披露了一些 BNP的变异体，这些变异体能更特异地结合钠尿肽受体A。(U. S. Patent 6, 525,022 and U. S. Patent 6，028, 055)。在专利W02006076471A2中披露该钠尿肽环含有一个或多个保守性取代，但仍保留了该环的促尿钠排泄的活性。专利W02006076471A2中披露了被删除了部分氨基酸从而被缩短了的该环仍然保留了相关生物学活性。W02006076471A2中披露了 BNP 的第14位的赖氨酸被甘氨酸或者精氨酸取代后的包含人BNP CyslO和Cyd6之间的环状结构的类似多肽仍然保留了天然钠尿肽的生物学活性。W02006076471A2中披露了改变了或删除了 BNP第19位至22位的丝氨酸的环状结构的类似多肽仍然保留了钠尿肽的生物学活性。专利W02006076471A2中披露的拥有钠尿肽的生物学活性的钠尿肽的类似物同样适用于本发明。此外，适用于本发明的钠尿肽环及其类似物可以包含一个氨基端和/或羧基端尾部，如人BNP第1至9位氨基酸和第27位至32位氨基酸，DNP的C末端由15个氨基酸组成的线性序列。尾部是并不会改变钠尿肽环的生物学活性的单链的氨基酸或多肽。类似物中的尾部的氨基酸序列可以被其他氨基酸取代、删除、和/或插入，只要没有改变天然序列的相关的生物学活性，该类似物等同于天然钠尿肽。这些尾部基于天然序列，可以有1至多个氨基酸的截短。比如氨基端尾部可选自以下人BNP的氨基酸片段8-9，7-9，6-9，8-9，7-9， 6-9，5-9，4-9，3-9，2-9，和1_9 ；上述的任何人BNP的氨基酸片段中的1个或多个赖氨酸残基可被甘氨酸残基或精氨酸残基取代。类似的，羧基端尾部可选自以下人BNP的氨基酸片段:27-28，27-29，27-30，27-31和27-32 ；；上述的任何人BNP的氨基酸片段中的1个或多个赖氨酸残基可被甘氨酸残基或精氨酸残基取代。适用于本发明的钠尿肽类似物还包括了由天然钠尿肽的环状部分与其他蛋白或多肽的融合，融合蛋白仍然保留激动钠尿肽受体的生物学活性，优选由一种天然钠尿肽的环状部分与另一种天然钠尿肽的非环状部分组成的融合蛋白。例如Ondrej Lisy等 (Journal of the American College of Cardiology Vol. 52, No. 1,2008 JACC Vol. 52, No. 1，2008 (1)，2008 :60-8)中所记载的由CNP的22个氨基酸与DNP的15个线性C末端氨基酸序列组成的融合蛋白。除上述类似物外，许多在先技术所披露的类似物也适用于本发明。例如美国专利5，114，923，披露了拥有钠尿排泄功能的多肽为R' -Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp -Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2,其中 R ‘选自(H) ；GIy- ；Ser-Gly-； Gly-Ser-Gly-；Gln-Gly-Ser-Gly- ；Val-Gln-Gly-Ser-Gly- ；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-； Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly ；Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly ； Ser-Pro-Lys-Met -Val-Gln-Gly-Ser-Gly-；和 R3-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser_Gly-，其中 R3 为位置1-99的人蛋白的102个氨基酸序列或羧基端部分，和R2是(0H)，NH2, NHR'或其中的修饰部分是独立的低烷基(Ch)或 R2 是 Lys ；Lys-Val ；Lys-Val-Leu ；Lys-Val-Leu-Arg ； Lys-Val-Leu-Arg-Arg ；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His ；或者氨基化合物(NH2，NHR1 或NR‘修饰部分")。U. S.专利4，904，763中披露的钠尿肽类似物也适用于本发明，例如，X_Cys PheGIy Arg Lys Met Asp Arg He Ser Ser Ser Ser GIy Leu GIy Cys Lys VaI Leu Arg ArgHis-OH, 其中 X 是 H，H-Gly-Ser-Gly-或 H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly.U. S.专利4，904，763披露了钠尿肽类似物也适用于本发明，例如，X-Cys-Phe-Gly -Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Y,(其中 2 个半胱氨酸由二硫键连接)，其中 X 为 H 或 H-Asp-Ser. -Gly-,和 Y 为 Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr-OH,-Asn-Val-Leu-Arg-Arg-OH,-Asn-Val-Leu-Arg-Tyr-OH,-Asn-Val-Leu-Arg-OH,-Asn-Val-Le u-OH 或Asn-kr-Phe-Arg-Tyr-OH，或其盐的衍生物。另一组适用于本发明的类似物披露于 W08912069。另一组适用于本发明的钠尿肽类似物披露于U. S.专利申请.20030109430， 其结构式为 R ‘ -Cys-Phe-Gly-Arg-Arg/Lys-Leu/Met-Asp-Arg-Ile-Lys-Met-Gly/ Ser-Ser-Leu/Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-R2,其中 Rl 选自下(H) ；GIy- ；Ser-Gly- ；Asp/ Lys/Gly-Ser-Gly- ；Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- ；Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/ Lys/Gly-Ser-Gly- ；Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- ；Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly ；Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/ Gln-Asp/Lys/Gly-Ser-Gly- ；Ser-Pro-Lys-Thr/Met-Met/Val-Arg/His/Gln-Asp/Lys/ Gly-Ser-Gly-；或猪、犬或人BNP天然序列的上游部分一个10至109氨基酸序列；R2是 (0H)，NH2，or NR' R"其中R' and R"为独立的低烷基(此处为，1-4C)或者为Asn/Lys ； Asn/Lys-Val ；Asn/Lys-Val-Leu ；Asn/Lys-Val-Leu-Arg ；Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys ； Asn/Lys-Val-Leu-Arg-Arg/Lys-Tyr/His ；或者氨基化合物(NH2 或 NR' R〃)，其中假如结构式为 R' -Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Leu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys -R2 和 Rl 为 Asp4er-Gly-，R2 不能为 Asn-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr.还有一组类似物披露于U. S.专利申请20020086843，其结构式为X-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-H is-0H[其中2个半胱氨酸残基桥连]其中X为H，H-Gly-Ser-Gly-，或Hler-Pro-Lys-Met -Val-Gln-Gly-Ser-Gly-.可用于本发明中的衍生物还可包括(但不限于)天然钠尿肽的活性片段，如它们的环状部分；与PEG偶联的天然钠尿肽、其衍生物或它们的活性片段；与载体蛋白(例如血清白蛋白或其片段)偶联的天然钠尿肽；天然钠尿肽的可变剪切产物，等等。优选所述衍生物选自；AlbuBNP、CD-NP, ASBNP, ASBNP. 1、hBNPl-32、hBNP-054、奈西立肽、或它们的组合。术语“AlbuBNP”是指1 5拷贝的人BNP (1-32)序列与成熟血清白蛋白的N末端形成的融合蛋白，例如 Wei Wang 等(Pharmaceutical Research, Vol. 21，No. 11,2004 2105-2111)中所记载的 BNP-HAS 和 BNP (2x) /HAS。术语“CD-NP”是指C型钠尿肽或其活性片段或与D型钠尿肽或其活性片段形成的融合蛋白，优选所述活性片段是所述钠尿肽的环状部分，例如Ondrej Lisy等(Journal of the American College of Cardiology Vol. 52, No.1,2008 JACC Vol. 52, No.1,2008(1), 2008 :60-8)中所记载的由CNP的22个氨基酸与DNP的15个线性C末端氨基酸序列组成的融合蛋白。术语“可变剪切产物”是指通过可变RNA剪切(alternative RNA splicing)后产生的钠尿肽功能性可变剪切体，例如Shuchong Pana等(Proc Natl Acad Sci U S A. 2009， 7 ； 106 (27) :11282-7. Epub 2009 年 6 月 18 日)中所记载的 ASBNP、ASBNPl。术语“与PEG偶联的天然钠尿肽、其衍生物或它们的活性片段”是指由天然钠尿肽或其衍生物与聚乙二醇(PEG)分子偶联形成的活性分子，该偶联可发生在天然钠尿肽或其衍生物的N端、C端或链中(如BNP1-32的第3位K)，例如Cataliotti A等CTrends Cardiovasc Med. 2007 年 1 月；17(1) :10_4)中所记载的 C0NJ-hBNP-021，Cataliotti A 等 (Circulation, 2008 年 10 月 21 ； 118 (17) 1729-36. Epub 2008 年 10 月 6 日)中所记载的 hBNP-054,以及W0/2006/076471中所记载的PEG化的钠尿肽。本发明的钠尿肽衍生物可为例如,0(3^^01) ^νΛΤ^^^ΒΜΡ
权利要求
1.外周神经cGMP上调物质在制备用于缓解或治疗疼痛的药物组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外周神经cGMP上调物质是钠尿肽受体激动剂。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钠尿肽受体激动剂选自钠尿肽受体A 的激动剂、钠尿肽受体B的激动剂和/或钠尿肽受体C的激动剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述钠尿肽受体激动剂选自天然钠尿肽、 它们具有激动钠尿肽受体活性的类似物、或其组合。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述天然钠尿肽选自心房钠尿肽、B型钠尿肽、C型钠尿肽、D型钠尿肽、尿扩张素、前钠尿肽、原-前钠尿肽或它们的组合。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述类似物选自与PEG偶联的天然钠尿肽；与血清白蛋白或其片段偶联的天然钠尿肽；天然钠尿肽的可变剪切产物；由天然钠尿肽的环状部分与氨基端和/或羧基端尾部形成的融合蛋白，优选由一种天然钠尿肽的环状部分与另一种天然钠尿肽的非环状部分组成的融合蛋白。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述衍生物选自；AlbuBNP、⑶-NP、ASBNP、 ASBNP. 1、hBNPl-32、hBNP-OM、奈西立肽、或它们的组合。
8.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述钠尿肽受体激动剂是钠尿肽受体A的激动剂。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述钠尿肽受体A的激动剂选自B型钠尿肽或心房钠尿肽。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽的形式选自下组分离的B型钠尿肽或心房钠尿肽、其编码序列或包含其编码序列的载体或遗传工程化的宿主细胞。
11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述B型钠尿肽或心房钠尿肽选自(a)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蛋白质或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白质；(b)(a)中所限定的蛋白质的保守性变异蛋白质或其活性片段；或(c)将(a)中氨基酸序列经过1-20个，优选1-10个，更优选1-5个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且具有激活钠尿肽受体A的活性的、由(a)衍生的蛋白质。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疼痛是自身源性疼痛或炎性痛。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述自身源性疼痛选自神经病理性疼痛或伤害感受性疼痛。
14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述炎性痛选自关节炎痛、糖尿病并发末梢神经炎性疼痛、外周组织炎性痛或内脏炎性痛。
15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疼痛是慢性疼痛或急性疼痛。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述慢性疼痛是慢性感受性疼痛或慢性神经病理性疼痛。
17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述慢性疼痛选自下组软组织、关节和骨疼痛各种骨关节炎、创伤后畸形性疼痛、骨骼肌疼痛、腰痛、肌筋膜疼痛综合征、头痛、烧伤后疼痛；深部组织和内脏痛心血管疼痛、眼痛、口面部疼痛、慢性妇科疼痛、性交痛、泌尿生殖系统慢性疼痛；神经和神经根损伤性疼痛截肢后幻肢痛、周围神经性疼痛、反射性交感神经营养不良和交感神经持续痛、三叉神经痛和非典型性面部痛、神经根损伤和蛛网膜炎、带状疱疹后神经痛；中枢性疼痛脑、脊髓的血管损伤，如出血、梗塞、血管畸形；多发性硬化；外伤性脊髓损伤，脑损伤；脊髓空洞症和延髓空洞症；肿瘤；帕金森病；儿童疼痛 生长痛；老年人疼痛颈椎病、腰椎间盘突出症、腰椎滑脱所致疼痛；或癌性疼痛。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)缓解或治疗疼痛有效量的钠尿肽受体激动剂；(b)药学上可接受的载体。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述钠尿肽受体激动剂选自钠尿肽受体 A的激动剂、钠尿肽受体B的激动剂和/或钠尿肽受体C的激动剂
20.如权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述钠尿肽受体A的激动剂选自 B型钠尿肽或心房钠尿肽。
21.—种筛选可用于缓解或治疗疼痛的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将候选物质与背根神经节小神经元接触；(2)检测候选物质是否可激活钠尿肽受体/PKG/BK&途径；若所述候选物质可激活钠尿肽受体/PKG/BK。a途径，则表明该候选物质是缓解或治疗疼痛的潜在物质。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述钠尿肽受体/PKG/BK。a途径是钠尿肽受体A/PKG/BKea途径。
全文摘要
本发明中提供了钠尿肽受体的激动剂在疼痛治疗中的用途。具体而言，本发明涉及钠尿肽受体的激动剂在制备用于缓解或治疗疼痛的药物组合物中的用途，所述激动剂优选为B型钠尿肽或心房钠尿肽。本发明还涉及包含钠尿肽受体A的激动剂的药物组合物，以及筛选可用于缓解或治疗疼痛的潜在物质的方法。本发明首次揭示了钠尿肽受体A介导的钠尿肽受体A/PKG/BKCa途径与疼痛之间的关系，提供了可通过调节该途径的活化而治疗、缓解或改善疼痛的药物、方法和途径。
文档编号A61K38/22GK102370985SQ20101025778
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月11日 优先权日2010年8月11日
发明者刘兴君, 张方雄, 张旭, 鲍岚 申请人:中国科学院上海生命科学研究院