专利名称：一种抗肿瘤绿豆多肽及其制备方法和在癌症方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生化制药领域，公开一种生物活性肽的制备及应用，特别涉及一种抗 肿瘤及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是所有疾病中对人类威胁最大、恐惧心理最强的疾病，几乎属于“不治之症”， 人们无不谈癌色变。近来年，癌症的发病率显著提高，由于传染病的减少，癌症和心血管疾 病已上升为第一第二位的疾病。癌症严重威胁着人们的健康与生命，危害着经济建设与社 会发展。目前对肿瘤患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用，因此寻找高校、低 毒的抗肿瘤药物是目前的热点之一，而新型的多肽药物恰恰具备了这些特点，小分子多肽 广泛存在于自然界，并可通过人工方法，由于其具有相对分子量小、活性高、毒性低的特点， 在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。绿豆是豆科(Leguminosae)蝶形花科(Papilionoideas)菜豆族(Phaseoleae)豇 豆属(Vigna)中的一个种，属一年生草本自花授粉植物。绿豆在我国已有两千多年的栽培 史，资源丰富。绿豆营养丰富，主要含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、胡萝卜素、硫 胺素、核黄素和尼克酸等。具有一定的药用价值。其种子性味甘寒，内服具有清热解毒、消 暑利尿、抗炎消肿、保肝明目、止泻痢、润皮肤、降血压降胆固醇、防止动脉粥样硬化等功效。 外用可治疗创伤、烧伤、疮疖、痈疽等症。故有“食中佳品，济世长谷”之称，是极具研究价值 的生物材料。
发明内容
本发明提供一种由绿豆中提取的生物活性肽，并证实其具有抗肿瘤活性。本发明还提供了绿豆多肽的制备方法，该方法简单易行、流程可控、成本较低廉， 适用于工业化生产。本发明进一步提供了绿豆多肽在肿瘤治疗或预防中应用的证据。本发明的优点1、本发明从市售绿豆中提取生物活性肽，原料成本低廉、来源广泛。2、绿豆多肽的提取工艺简单易行、流程可控、成本较低廉，适用于工业化生产。3、绿豆多肽可直接有效地杀伤多种肿瘤细胞，尤其在肝癌细胞的抑制中具有显著 效果。说明书附图
图1是从绿豆中提取生物活性肽用于抗癌的示意图具体实施方法实施例1 绿豆生物活性肽的制备以市售绿豆为原料，粉碎后加入95%乙醇浸提过夜脱脂。过滤，挥干溶媒残渣中加 入PH值为9 11的碱液，60 80°C提取2次，每次5小时。合并上清液于60°C加入3% 的Alcalase碱性蛋白酶，然后在90°C中反应IOmin以灭活蛋白酶，离心分离上清液，用盐酸调pH 7. 0，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎成细粉，即得绿豆多肽粗提物。采用阴离子交换树脂对绿豆多肽进行初步纯化。将绿豆多肽粗提物用pH6. 0的磷 酸缓冲液配制成一定浓度的溶液，离心去除沉淀，上样于预处理过的阳离子交换树脂的层 析柱(30mmX 350mm)，先用pH6. 0的缓冲液洗柱，将未吸附的物质洗出，在用含lmol/L NaCl 的PH6. 0的缓冲液进行洗脱，在波长^Onm处检测并收集洗脱峰，冷冻干燥得到绿豆多肽。实施例2 绿豆多肽对多种癌细胞系的体外抑制作用分别采用50、100、200mg/kg绿豆多肽处理小鼠，制备含药血清，备用。用0. 25% 胰酶消化、传代各细胞。以含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，并将细胞浓度调 整至1 X IO4个/ml,向96孔培养板每孔中加入100 μ 1，于37°C，5% CO2中孵育24h,弃培养 液，加入10%过滤除菌的含药血清，37°C，5% CO2孵育48h，采用MTT法检测细胞的增殖情况。表1绿豆多肽对不同癌细胞株细胞体外增殖的影响(无±s，n = 10)
权利要求
1.一种绿豆多肽的制备方法，其特征步骤依次为(1)原材料的脱脂处理，对绿豆进行有机溶剂脱脂；(2)蛋白质的提取，采用碱提法对绿豆中的蛋白质进行提取；(3)蛋白质的水解，采用碱性蛋白酶对绿豆蛋白进行水解；(4)绿豆多肽的纯化，采用阴离子交换树脂对绿豆多肽粗提物进行分离纯化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脱脂步骤其方法为以市售绿 豆为原料，粉碎后加入95%乙醇浸提过夜脱脂，过滤，挥干溶媒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白质提取步骤其方法为向 脱脂的绿豆残渣中加入PH值为9 11的碱液，60 80°C提取2次，每次5小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白质水解步骤其方法为将 提取的滤液于60°C加入3%的Alcalase碱性蛋白酶，然后在90°C中反应IOmin以灭活蛋白 酶，离心分离上清液，用盐酸调pH7. 0，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎成细粉，即得绿豆多肽粗 提物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的多肽纯化步骤其方法为将绿 豆多肽粗提物用PH6. 0的缓冲液配制成一定浓度的溶液，离心去除沉淀，上样于预处理过 的阴离子交换树脂的层析柱(30mmX350mm)，先用pH6. 0的缓冲液洗柱，将未吸附的物质洗 出，在用含lmol/L NaCl的pH6. 0的缓冲液进行洗脱，在波长^Onm处检测并收集洗脱峰， 冷冻干燥得到绿豆多肽。
6.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防癌症药物中的应用。
7.—种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防宫颈癌药物中的应用。
8.—种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防肺癌药物中的应用。
9.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤绿豆多肽，并提供了其制备方法和用途。该发明采用乙醇脱脂、碱提、酶解的方法制备绿豆多肽粗提物，然后采用阴离子交换树脂分离的到绿豆多肽，该方法简便易行，原料来源广泛。同时提供了以活性绿豆多肽在抗肿瘤方面的应用。
文档编号A61P11/00GK102071239SQ20101051662
公开日2011年5月25日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者侯静, 刘桂霞, 孟园园, 张娜, 张 杰, 张莉, 李汝发, 杨雅楠, 梁伟力, 王晶晶, 王立昆, 薄涛, 赵会兰, 赵俊考, 赵洁, 赵燕禹, 郭庆林, 郭成红, 郭成铁, 郭瑞, 马玉飞, 高东兴 申请人:天津聚贤技术研发中心