专利名称：修饰抗体组合物及其制备和使用方法
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以蛋白质为基础的疗法改变了用药的面貌，在各种不同的疾病间发现了各种应用。尤其是以抗体为基础的疗法，已经证明对一些疾病能有效治疗，但是在某些情况下，由于对广泛的靶点表达的毒性限制了其治疗的有效性。然而，对于任何药物，改善其靶点特异性和选择性对药物的需要和需求有极大兴趣，特别是对开发以抗体为基础的结合具有已知靶点的第二代药物。提高抗体对病变的部位靶向性可以减少全身的机制为基础的毒性，并导致更广泛的治疗应用。在小分子药物领域，战略已经发展到提供一个活性化学实体的前体药物。这些前体药物是在一中相对不活泼的(或显着减少活性)的形式供给。一旦供给，前体药物在体内代谢成为活性的化合物。这种药物前体的策略，可以对其预期靶点提供增加的药物选择性并减少不利影响。用于特异性缺氧的肿瘤细胞的药物，通过氧化还原激活的使用，利用存在于缺氧细胞中的大量还原酶将药物转化成其细胞毒素的状态，实质上是使其激活。由于在这种激活之前，前提药物是低毒性的，这显著降低了损害非癌变细胞的风险，从而降低与药物相关的副作用。本领域需要一种为以抗体为基础的疗法提供一种前体药物特性的战略需求。发明简述目前披露的规定修改和激活的抗体治疗和诊断的有用成分。激活的抗体成分，表现出更高的生物利用度和生物分布，相比传统的抗体疗法与药物前体的功能。此外，还提供使用在诊断和治疗，以及筛选和建设等组成的方法。在一方面，本发明提供了一种修饰过的抗体，包括一种抗体或一种抗体片段(AB)， 能专门与其靶点结合，能够与以中掩蔽基团耦合(MM)，其中匪对AB的耦合降低AB与其靶点的结合能力以便使耦合了匪的AB对靶点的裂解常数比没有耦合匪的AB对靶点的裂解常数至少大100倍、至少大1000倍、或者至少大10000倍。在另一方面，本发明提供了一种修饰抗体，包括一种抗体或一种抗体片段(AB)，能专门与其靶点结合，能够与以中掩蔽基团耦合(MM)，其中当使用靶点的替代物在体外进行测试时，对比没有耦合匪的AB与其靶点的结合能力，耦合了匪的AB与其靶点的结合能力至少降低90%。这种匪与AB的耦合降低AB与靶点结合能力的时间至少为12小时或至少为M小时或至少为72小时。在另一方面，修饰抗体进一步耦合到一种雷杰基团(CM)。该CM能被酶裂解，或该 CM能被一种降低药剂减少，或该CM能被光溶解。该CM能具体地至少在IxIOVS4、或至少在^10 ,或至少在IOxlO4M4S的速率下被裂解、减少或光溶解。在一个实施例中，修饰抗体的CM在MM内。在本发明提供的抗体中匪对AB的离解常数(Kd)通常比AB对靶点的Kd至少大 100倍。一般地，匪对AB的Kd低于ΙΟηΜ，或低于5nM，或低于InM。在一些实施例中，修饰抗体的MM通过与AB的抗原结合域特异性结合降低AB与其靶点结合的能力。这种结合可以是非供价的。修饰抗体的MM能在allosterically或空间上降低AB与其靶点的结合能力。在具体的实施例中，修饰抗体的匪不能含有多于50%的与AB的天然结合配体相似的氨基酸序列。在具体的实施例中，修饰抗体的AB是选自由Fab'片段、F (ab' ) 2、scFv、scAB、 dAb、单域重链抗体和单域轻链抗体构成的组中的抗体片段。在相关的实施例中，修饰抗体的AB选自表2或AB的来源是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或f igitumumab (IGFR-1抑制剂)。在一个具体的实施例中，修饰抗体不是阿伦单抗。在相关的实施例中，AB的靶点是选自表1中的靶点多构成的组。在典型的实施例中，靶点是 EGFR、TNFa、CDlIa、CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch UNotch 2、 Notch 3,Notch 4,Jagged UJagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM_I、CD44、 DLL4、或 IL4。在一个具体的实施例中，修饰抗体进一步包括一个第二 AB，其中该第二 AB的靶点是选自表1中的靶点所构成的组。在一个相关的实施例中，CM是一种用于选自表3中的酶所构成的组中酶的底物。 在具体的实施例中，CM是一种用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MTl-MMP、 组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA的底物。在这样的实施例中，其中修饰过的AB包含一种CM，AB是选自表2中的抗体所构成的组，具体地，选自西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、 tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitUmUmab(IGFR-l抑制剂)所构成的组。在一个典型的实施例中，AB不是阿伦单抗。在一个实施例中，其中修饰过的抗体包括一个AB，并与一个CM和一个匪连接。 在一个实施例中，靶点是选自表1的靶点所构成的组，或靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、CSFR、 CTLA-4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。靶点不是 CD52。修饰蛋白可进一步于一个第二裂解基团连接，能够专门被一种酶修饰。在该实施例中，该第二裂解蛋白是一种天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA、或PSA的底物。在另一个具体的实施例中，修饰抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于 AB和MM之间。或者该修饰过的抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于MM和CM之间。或者该修饰过的抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于AB和CM之间。或者该修饰过的抗体进一步包括两种连接肽，其中第一种连接肽位于AB和CM之间以及第二种连接肽位于MM和CM之间。连接肽是选自一种裂解连接肽、一种非裂解连接肽、一种分支连接肽所构成的组。在某些实施例中，修饰过的抗体进一步包含一种检测基团。在一个具体的实施例中，该检测基团是一种诊断试剂。在一个优选的实施例中，本发明所述的修饰过的抗体进一步包含一种与AB结合的试剂，在一方面，该试剂是一种治疗药物，例如一种抗肿瘤药。在这中实施例中试剂与AB 的以个碳水化合物基团结合，其中碳水化合物基团位于AB的抗原结合地区的外部。或者试剂与AB的巯基结合。本发明提供的修饰过的抗体供给一个有机体时，表现出了至少有5天的血清半衰期。本发明提供的一些修饰过的抗体的匪的共有序列是=CISPRGC1C (NZP) H(HVF) (YZT) (FZffZTZL) (YZGZTZS) (TZSZYZH)CGCISPRGCG、xCxxYQCLxxxxxx， XXQPxPPRVXX, PxPGFPYCxxxx, xxxxQxxPWPP、GxGxCYTILExxCxxxR, GxxxCYxIxExxCxxxx, GxxxCYxIxExffCxxxx,xxxCCxxYxIxxCCxxx 或 xxxxxYxILExxxxx0 在一个具体的实施例中，该共有序列专门以一个抗-VEGF抗体、一个抗-ETOR或一个抗-CTLA-4抗体结合。在一个相关的方面，本发明提供了一种激活的抗体(AA)包括一种能够特异性与其靶点结合抗体或一种抗体片段(AB)，一种与AB耦合能够抑制AB与其靶点特异性结合的掩蔽基团(MM)，一种与AB耦合能够被酶专门裂解的裂解基团(CM)。其中，对比AA处在裂解CM的足够酶活和匪不抑制AB与其靶点的特异性结合的情况，当AA不处于裂解CM的足够酶活下，MM至少降低AB与其靶点特异性结合程度的90%。在具体的实施例中，降低AB 与其靶点特异性结合的时间至少为12小时，或至少为M小时，或至少为72小时。在一个实施例中，在AA中，与耦合了匪的AB对其靶点的离解系数(Kd)比没有耦合MM的AB对其靶点的离解系数至少大100倍。在一个相关的实施例中，MM对AB的离解系数(Kd)比AB对其靶点的离解系数至少大100倍。一般地，匪对AB的离解系数低于ΙΟηΜ， 或低于5nM，或低于InM。在一些AA的实施例中，匪能与AB的抗原结合域特异性结合。在一些AA的实施例中，CM能大约至少在IxlO4M1S4,或至少hl04M4S、或至少 IOxlO4M4S的速率下被酶特异性裂解。在某些实施例中，AA中的AB是一种抗体片段，该抗体片段选自Fab'片段、一种 F(ab' ) 2片段、一种scFv、一种scAB adAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组中。在某些实施例中，AA中的AB选自表2中的抗体所构成的组。在具体的实施例中，AB是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、 tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitUmUmab(IGFR-l抑制剂)。在某些实施例中，AA的靶点选自表1中的靶点所构成的组。在具体的实施例中，靶点是 Notch 2,Notch 3,Notch 4,Jagged UJagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、 VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4
在一个具体的实施例中，AB不是阿伦单抗并且靶点不是⑶52。在某些实施例中，AA的CM是一种用于胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4，MMP_9， MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或 PSA的底物。再具体的实施例中，AA进一步与能够被一种酶特异性修饰的一种第二裂解基团(CM)耦合。在该实施例中，第二 CM是一种用于胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4， MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、 uPA或PSA的底物。在本发明的一些AA的实施例中，CM包含在匪中。在本发明的一些AA的实施例中，MM不能包含多于50%的与AB的一个天然的结合配体相似的氨基酸序列。在本发明的一些AA的实施例中，AA进一步包含一个连接肽，其特征在于连接肽位于匪和CM之间。在具体的实施例中，连接肽位于匪和CM之间。在某些实施例中，本发明提供的AA进一步包含一种检测基团或一种结合到AB的试齐LU在另一方面，本发明提供了一种激活抗体的组合物(AAC)包括两种抗体或抗体片段(ABl和AB^，每一种都能与其靶点特异性结合，至少一种能与ABl和ΑΒ2耦合能抑制 ABl和ΑΒ2与其靶点特异性结合的掩蔽基团(MM)，以及至少一种能与ABl和AB2耦合，通过激活AAC的成分能被一种酶特异性裂解的裂解基团(CM)。其中当AAC处于未裂解状态时， 匪抑制ABl和AB2与其靶点特异性结合，以及当AAC处于裂解状态时，MM不抑制ABl和AB2 与其靶点特异性结合。在一个实施例中，AAC是双特异性的，其中ABl和AB2连接位于相同靶点的同一抗原表位；或者ABl和AB2连接位于相同靶点的不同抗原表位；ABl和AB2连接位于不同靶点的不同抗原表位。在一个AAC的实施例中，CM至少以IxlO4M" 1S4速率能构被酶特异性裂解。在一个实施例中，其中AAC的ABl或AB2是一种抗体片段，该抗体片段选自一种 Fab'片段、一种F(ab' ) 2片段、一种scFv、一种scAB a dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。在一个AAC的实施例中，ABl和/或AB2选自表2中的抗体。在一个具体的实施例中，ABl和/或AB2是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、 替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitUmUmab(IGFR-l抑制剂)。在一个AAC的实施例中，ABl和或AB2的靶点选自表1中的靶点所构成的组。在相关的实施例中，ABl 和或 AB2 的靶点是 EGFR、TNF α、CDlla、CSFR、CTLA-4, EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、 转铁蛋白、gp 130、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。在一个相关AAC的抗体中，CM是用于选自表3中的酶所构成的组中酶的一种底物。 在一个具体的实施例中，CM是用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MTl-MMP、 组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。在又一个具体的实施例中，AAC进一步与一个能被一种酶特异性裂解的第二裂解基团耦合并且该第二裂解基团是用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MTl-MMP、 组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。在AAC的具体实施例中，MM不包含多余50%的氨基酸片段在另一个有关AAC的实施例中，AAC进一步包括一个测试基团或进一步与一种试剂共轭。本发明提供了一种治疗和诊断主体一种疾病的方法，包括供给主体一种组合成分，包括能构专门与其靶点结合的一种抗体或一种抗体片段(AB)、能抑制特定的AB与其靶点的结合的耦合到AB的掩蔽基团(MM)、以及能够专门被酶裂解的一种耦合到AB裂解基团(CM)。其中，根据对主体的供给，对比AA处在裂解CM的足够酶活和匪不抑制AB与其靶点的特异性结合的情况，当AA不处于裂解CM的足够酶活下，MM至少降低AB与其靶点特异性结合程度的90%。在该方法中，AB选自一个Fab片段，一个F (ab) 2片段，一个scFv，一个scAB —个 dAb，一个单域重链抗体和异构单域轻链抗体。在一个具体的实施例中，症状是癌。在另一个具体的实施例中，MM不是天然的AB的结合配体。在本方法的各种实施例中，AB是选自表2中的抗体所构成的组。具体地，在一些实施例中，AB是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、 tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitUmUmab(IGFR-l抑制剂)。在本方法的各种实施例中，靶点选自表1中的靶点所构成的组中。在具体的实施例中，靶点是 EGFR、TNF α、CDlIa、CSFR、CTLA-4, EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch
2、Notch3、Notch 4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、 CD44、DLL4 或 IL4在本方法的一个非常具体的实施例中，AB不是阿仑单抗，并且靶点不是⑶52。在本方法的各种实施例中，CM是选自表3中的酶所构成的组中酶的一种底物。在具体的实施例中，CM是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4，MMP-9，MTl-MMP、组织蛋白酶、 半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA的一种底物。本发明提供了在哺乳动物主体中抑制血管生成的方法。该方法包括在治疗上供给主体所需的足量的药物成分，包括一种修饰的ΑΒ、一种ΑΑ、一种AAC或一种AACJ，其中靶点是 EGFR、TNF α、CDlIa、CSFR、CTLA-4, EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch
3、Notch4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4、 或IL4。在一个具体的实施例中，AB是西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、 英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、tremelimumab、阿德木单抗(adecatumumab)、Hu5c8、阿仓珠单抗(alemtuzumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗 (ibritumomab tiuxetan)、利要昔单抗(rituximab)、英利昔单抗(infliximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、或 figitumumab。CM 是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4，MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA的一种底物。本发明提供了在一种制备激活抗体(AA)的组合物成分的方法包括提供一种能够与其靶点特异性结合的抗体或抗体片段(AB)，一种与AB耦合能抑制AB与其靶点特异性结合的掩蔽基团(MM)，一种与AB耦合能由酶特异性裂解的裂解基团(CM)。其中与匪耦合的AB对其靶点的离解常数(Kd)比没有与匪耦合的AB对其靶点的离解常数(Kd)至少大 100 倍。在一个本方法的实施例中，AB选自或衍生自表2中的抗体所构成的组中的抗体。 在一个具体的实施例中，AB是或衍生自西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(IGFR-l 抑制剂)。在一个非常具体的实施例中，AB不是alemtuzumab并且靶点不是⑶52。在本方法的另一个实施例中，CM是选自表3中的酶构成的组中的酶的一种底物。 在一个具体的实施例中，CM是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4，MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA的一种底物。本发明提也供了一种筛选能确定一种能与抗体或抗体片段结合的掩蔽基团(MM) 肽的候选肽的方法，包括提供一种肽支架库，其中每一种肽支架包括一种跨膜蛋白，以及一种候选肽，将一种AB与库接触，确定至少一种能与AB结合的候选肽，并确定候选肽与AB 的离解系数(Kd)是否在I-IOnM之间。在本方法的各种实施例中，该库包括病毒胞或孢子。具体地在一个实施例中，该库中包括大肠杆菌，在另一个实施例中，肽支架进一步包括一种检测基团。本发明也提供了另一种筛选方法，该方法能确定具有最优的掩蔽效能的掩蔽抗体或抗体片段的掩蔽基团(MM)肽。包括提供一种包括都中AB的库，每一种都与一种候选肽结合，其中AB能与其靶点特异性结合；对每一个库成员与其靶点进行培养；对比每一个库成员与靶点结合和每一个库成员没有耦合候选肽时与靶点的亲和力。在一个具体的实施例中，最优掩蔽效能是当库成员与其靶点结合的亲和力是与没有经过修饰的AB与其靶点结合亲和力的10%时。在一方面，本发明提供的也是一种提高了生物利用度的抗体疗法，其中，当对比治疗抗体在第二组织中与其靶点的结合时，治疗抗体在一种第一组织中与其靶点结合的亲和力较低。在一个相关的方面，本发明提供的也是一种药物成分包括一种能与其靶点结合的抗体或抗体片段(AB)，一种药学上可接受的赋形剂。其中，抗体或抗体片段在第一组织中与其靶点的亲和力低于抗体或抗体片段在第二组织中与其靶点的亲和力。在一个具体的实施例中，AB与掩蔽基团(MM)耦合能将低AB与其靶点的结合，并且AB与裂解基团(耦合)能被一种酶特异性裂解。在相关的实施例中，靶点是EGFR、TNFa、CD lla、CSFR、CTLA_4、EpCAM、VEGF、CD40、 CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、⑶44、DLL4或IL4。在相关的实施例中，CM是用于半胱氨酸蛋白酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA—种底物。在相关的实施例中，抗体或抗体片段是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimUmab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab (IGFR-1抑制剂)。在一个具体的实施例中，第一组织是一种正常组织，第二组织是一种病变组织。或者第一组织是一种早期肿瘤，第二种组织是一种晚期肿瘤。第一种组织是一种良性肿瘤，第二种组织是一种恶性肿瘤。或者第一种组织和第二种组织是空间上分开的。或第一种组织是上皮组织，第二种组织是乳腺、头、颈、肺、胰腺、神经系统、肝、前列腺、泌尿生殖道或宫颈组织。在一个实施例中，在一个具体的实施例中，药剂是一种抗肿瘤药。本发明提供的也是一种用于诊断和治疗的具体的组合物成分。本发明提供的组合物包含一种半胱氨酸蛋白酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种纤溶酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种半胱天冬蛋白酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种TMPRSS-3/4激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种PSA激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种组织蛋白酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种人类中性粒细胞弹性蛋白酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种分泌酶激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种uPA激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种TMPRSS-3/4激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种 MTl-MMP激活的与掩蔽基团(MM)耦合的抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的EGFR抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的TNF α抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM) 耦合的CDlIa抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的 CSFR抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的CTLA-4抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的EpCAM抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的⑶40L抗体或抗体片段 (AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的Notchl抗体或抗体片段(AB)； 一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的Notch3抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的Jaggedl抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的Jagged2抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的cetuximab抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的vectibix抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的infliximab抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的adalimumab抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的efalizumab抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的ipilimumab抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的tremelimumab (CTLA-4单抗)抗体或抗体片段(AB)；—种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(MM)耦合的adecatumumab抗体或抗体片段(AB)；
参考文献就像每一个单独的出版物、专利或专利申请被专门及单独指出作为文献纳入本发明一样，本发明提到的所有出版物、专利和专利申请以相同的范围作为文献纳入本发明。
本发明的新特点在专门所附的权利要求中阐明。参考如下说明性实例提出的详细的描述将对本发明的特点和优点获得更好的理解。在实例中使用了本发明的原理，并有配图。图1显示了含有一种抗体(一种AB)、一种掩蔽基团(MM)、和一种裂解基团(CM) 的一种蛋白酶激活的AA。图2显示了一种典型的AA在体外的活性。图A显示了 AA不能结合、副作用可以忽略的正常组织；图B显示了病变组织，其中AA被一种特定疾病蛋白/降低允许AA结合到靶点的试剂激活并起作用。图3显示了一种生成蛋白激活的AA的过程，包括匪的筛选；CM的筛选；匪、CM和一种AB的组装；表达和纯化组装的结构；已经分析组装的结构获得在体外和体内的活性和毒性。图4提供了一种典型MMP-9裂解掩蔽抗EGF scFv的氨基酸序列。图 5 提供了 ELISA 数据，显示 MMP-9 对 MBP 激活抗-VEGFscFv AA 与 MM 306 禾口 314。样品用TEV处理以出去MBP融合的配体随后被MMP-9消化激活。图6提供了 ELISA数据，显示了依赖MMP-9的VEGF与抗VEGFscFv His结合的结构与306MM。图7提供了 ELISA数据，显示了依赖MMP-9的VEGF与抗VEGFscFv-Fc AA结合与来自HEK细胞上清液的MM306和314。图8提供了 ELISA数据，显示了依赖MMP-9的VEGF与抗VEGFscFv-Fc AA结合的结构及用蛋白A柱纯化的匪306和314。图9显示了与抗VEGF抗体结合、具有> 600nM亲和力的306匪没有有效地排除与 VEGF的结合。图10显示了抗CTLA4的轻链和重链通过SOE-PCR连接，在乂！^和VJh两个方向产生scFv结构。图11显示了用PCR增加匪克隆、CM裂解片段、GGS2连接体在抗CTLA4 scFv VhVl and VJh结构的N-末端的位点数。图12显示了一种被MMP-9激活的AA。图13显示了当CM被裂解移除匪，AB的连接被恢复。图14 一节AA激活一种蛋白酶，导致抗体结合未修改抗体难以区别。图15显示了一种包含一种具有与VEG特异性结合亲和力AB的AA被抑制，激活的 AA与具有皮摩尔亲和力的VEGF结合。图16描绘了一种包含一种具有与VEG特异性结合亲和力AB的AA抑制HUVEC增殖。图17显示了培养的肿瘤细胞表现出原位稳健地激活包含一种具有与VEG特异性结合亲和力AB的AA。图18显示一种在正常和癌患者血浆中没有活性的AA。图19显示了抗CTU^scFv与小鼠和人CTLA4的结合。图20显示了一种蛋白激活的包含一种抗体(含有一种AB)的AACJ，一种掩蔽基团(MM)，一种裂解基团(CM)，以及一种共轭试剂。基于CM的裂解和解掩蔽，共轭的AB被释放。图21显示了在标有抗VEGF的3种不同的浓度荧光团。所有三个具亲合性成熟的肽显示至少有比JS306高倍10的亲合性。图22显示了一些EGFR的亲和力成熟的过程。图23显示了 C225Fab与MM3690、MM3%4和MM3957结合的细胞亲和力测量的结合曲线。MM39M和MM3957显示了至少比MM3690高100倍亲和力。图M显示了靶点替代物分析和以亲代抗体结合程度百分比表示的平衡结合程度。图25显示了不同于uPA对照，底物SM16、KK 1203、204和1214表现出了经KLK5、 KLK7和纤溶酶裂解的阻力。图沈显示了不同于一种非优化的底物，优化的底物Plasl237、Plasl29和 Plasl254表现了经KLK5、KLK7裂解的阻力。图27图A显示了 kFv AA的活化，包括天冬酰胺内肽酶的底物AANL和PTNL随后经5mg/mL天冬酰胺内肽酶处理。图B显示了抗VEGF IgG AA的活化，包括天冬酰胺内肽酶的底物PTNL。图28显示了天冬酰胺内肽酶活化的AA中被活化的AA在每一个时间点占总AA的比例。当活化7天被纤维酶活化的AA接近活化完全时，两种被天冬酰胺内肽酶活化的AA 仅有最低限度的活化。被天冬酰胺内肽酶活化的AA长达7天是从血清中分离出来，随后注射保持掩蔽。(η = 4)。图四显示了掩蔽的单链Fv-Fc融合原抗体表现出提高了的血清半衰期。图30显示了在健康小鼠体内超过10天的scFv-Fc血药浓度。AA的浓度7天后的剂量仍维持稳定，而亲代scFv-Fc的浓度3天后降低，10天后几乎检测不到。图31显示了与亲代scFv-Fc在荷瘤小鼠体内相比，AAscFv-Fc在血清中的浓度提高并维持时间较长。在3天及3-7天和7天在血清中检测到占初始剂量较高百分比的AA。图32显示了在对荷瘤小鼠进行的多次剂量的研究中，AAscFv-Fcs维持在高浓度。 在研究过程中，AA比其亲代保持显著的高血药浓度。图33显示了与没有经匪修饰的抗体相比，AA在正常小鼠血清中维持在高水平。图34显示，由蛋白酶活化的激活抗体复合物(AAC)，包一种或多种抗体或抗体片段(在该图中，AB被称为ABD)、一种掩蔽基团(MM)和一种裂解基团(CM)，其中ABD 1和 ABD2被任意指定给第一和第二 AB。在该实施例中，MM 1和MM2分别与含有ABD 1和ABD2 域结合，作为掩蔽基团干扰靶点与一种未裂解的能进行双靶点结合的AAC结合。结合AB的靶点可以相同或不同，或相同靶点的不同结合点。在一些实施例中(图IA、ID、IF)，匪1在相反的分子上与含有ABD2的域结合，形成能够作为ABDl和ABD2的掩蔽基团的复合物。图35显示，在未裂解状态下发生交叉掩蔽的AAC，这样与两个AB结合的靶点被减弱，并且在一种裂解CM(使复合物分解)的试剂存在时，靶点的结合提高了。在该图中，ABl 禾口 AB2分别被称为ABDl禾口 ABD2。图36显示，在未裂解状态下，一种通过匪1和ABDl (ABl)共价键形成的AAC，这样， 由ABD2(AB》连接的靶点被减弱，并且在一种裂解CM(使复合物分解)的试剂存在时，靶点的结合提高了。在该图中，ABl和AB2分别被称为ABDl和ABD2。发明详述本发明提供修饰抗体组成及对治疗和诊断有用的修饰抗体组成。本发明所述的组成顾及更好的生物分布和提高了生物利用度。修饰的和激活的抗体本发明所述的修饰抗体组成包含至少一种抗体或及其抗体片段(在整个本发明中统称为AB)，能够特异性与一种靶点结合，其中AB是由一种掩蔽基团(MM)修饰的。当AB用匪修饰并在靶点存在时，对比没有用MM修饰的AB与其靶点的结合或亲代AB与其靶点的结合，AB与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。用匪修饰的AB对其靶点的离解常数可以至少是5、10、25、50、100、250、 500,1000,2500,5000,10000,50000,100000,500000,1000000,5000000,10000000, 50000000 或大于、或在 5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、 10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、 1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、 10000-10000000、100000-1000000之间，或比没有用MM修饰的AB对其靶点或亲代AB 对其靶点的Kd大100000-10000000倍。相反，用匪修饰的AB对其靶点的亲和力可以至少是 5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、 1000000、5000000、10000000、50000000 或大于、或在 5-10、10-100、10-1000、10-10000、 10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、 100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、 10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000 之间，或比没有用 MM 修饰的 AB 对其靴点或亲代AB对其靶点的亲和力低100000-10000000倍。匪对AB的离解常数(Kd) —般大于AB对其靶点的离解常数。匪对AB的离解常数可以至少是 5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000 或甚至比AB对其靶点的离解常数大10000000倍。相反，匪对AB的亲和力可以至少是5、10、25、 50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000 或甚至比 AB 对其靴点的亲和力低 10000000 倍。如本发明所述，当AB用匪修饰并在靶点存在时，对比没有用匪修饰的AB与其靶点的特异性结合或亲代AB与其靶点的特异性结合，AB与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。当对比没有用匪修饰的AB与其靶点的结合或亲代AB与其靶点的结合，当用匪修饰时，在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，AB与其靶点的结合能力可以被降低至少 50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 以及甚至 100% 至少 2,4,6,8,12，28，24，30，36，48，60，72，84，96，小时，或 5，10，15，30，45，60， 90，120，150，180 天，或 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 月或更长。匪能抑制AB与其靶点的结合。匪能与AB的抗原结合域结合从而抑制AB与其靶点的结合。MM能sterically抑制AB与其靶点的结合。MM能allosterically抑制AB与其靶点的结合。在这些实施例中，当AB被修饰即被匪耦合并在靶点存在时，AB与其靶点没有结合或基本没有结合，或当与没有经匪修饰的AB、亲代AB、或没有耦合匪的AB与其靶点的结合对比时，AB与其靶点的结合不大于0. 001%,0.01%,0. 1%U%>2%,3%,4%, 5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或 50%，，如本发明所述，当在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，至少为2、4、6、8、12、28、对、30、36、48、 60、72、84、96 小时，或 5、10、15、30、45、60、90、120、150、180 天，或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12月或更长。当一种AB被匪耦合即由匪修饰时，匪能“掩蔽”或降低、或抑制AB与其靶点的特异性结合。当一种AB被MM耦合即由MM修饰时，这种耦合或修饰能影响一种降低或抑制 AB与其靶点特异性结合能力的结构的变化。一种AB与MM耦合或用MM修饰可以用如下式子表示，按顺序从一个氨基(N)端区域到羰基(C)端区域(MM) - (AB) (AB) - (MM)(MM) -L- (AB)(AB) -L- (MM)其中MM是一种掩蔽基团，AB是一种抗体或抗体片段，L是一种连接体。在许多实施例中，可能需要插入一个或多个连接体。例如，柔性连接体，插入相应位置以便提供柔软性。在某些实施例中，匪不是一种AA的天然结合配体。匪可以是AB的一种修饰的结合配体，其中AA含有至少轻微间给亲和力和或对AB的结合亲和力的氨基酸变化。在一些实施例中，MM不包含或基本不包含同源的AB的天然结合配体。在一些实施例中，类似于 AB 的天然配体，MM 不大于 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75% 或 80%。本发明也提供了激活的抗体(AAs)其中被匪修饰的AB进一步包括一个或多个裂解基团(CM)。这中AA是表现出与AB的靶点的可激活/可转换的结合。AAs—般包括一种抗体或抗体片段(AB)、被修饰或耦合到一种掩蔽基团(MM)以及一种有修饰能力的或裂解的基团(CM)。在一些实施例中，CM包含一种作为目标蛋白酶底物的氨基酸或氨基酸序列。 在其他实施例中，CM提供一种通过还原可裂解的半胱氨酸-半胱氨酸双硫键。在又一个实施例中，CM提供一种通过光解作用激活的光解底物。在图1中是典型AA的一个原理图。如图所示，AA的部件这样排列使CM定位在一种裂解状态(或相对激活状态)并在一个靶点存在的情况，AB与办学目标结合，而在一种未裂解的状态(或相对未激活的状态)并在一个靶点存在的情况，由于AB与其靶点的结合能力由MM抑制或掩蔽，AB与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。经一种MM和一种CM修饰的AB对靶点的离解常数Kd可以至少是5、10、25、50、100、 250,500,1,000,2,500,5000,10000,50000,100000,500, 000、1000000、5000000、10000000、 50000000 或大于、或在 5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、 10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、 1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之间，或比没有经MM和CM修饰的AB对靶点的Kd 大100000-10000000倍。相反，经一种匪和一种CM修饰的AB对靶点结合的亲和力可以至少是 5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、 1000000、5000000、10000000、50000000 或大于，或在 5-10、10-100、10-1、000、10-10000、 10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、 100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、 10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000 之间，或比没有经 MM 和 CM 修饰的 AB 对靶点结合的亲和力低100000-10000000倍。如本发明所述，对比没有被匪和CM修饰的AB与其靶点的结合，当AB被匪和CM 修饰并在靶点存在而修饰试剂(如一种酶、蛋白酶、减活剂、光)不存在时，AB与其靶点的特异性结合可被降低或抑制。当对比亲代AB或没有被匪和CM修饰的AB与其靶点的结合， 在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，被MM和CM修饰的AB结合其靶点的能力被降低至少 50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 以及甚至 100%至少 2、4、6、8、12、28、M、30、36、48、60、72、84、96 小时，或 5、10、15、30、45、 60、90、120、150、180天，或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 月或更长。如本发明所使用的，术语裂解状态是指AA伴随通过蛋白质，和/或一种半胱氨酸-半胱氨酸双硫键、CM键、和/或光激活修饰CM的状态。如本发明所使用的，术语未裂解状态，是指AA不在蛋白质裂解CM的状态，和/或不在CM的胱氨酸-半胱氨酸双硫键降低的状态、和/或不在光存在的状态。如上所述，本发明所用的术语AA是指一种AA在未裂解(原始)状态及其裂解状态的两种状态。这对本领域的技术人员是明确的，在一些实施例中，由于通过蛋白质对一种CM的裂解，AA可能缺少一种匪，至少导致匪的释出(其中匪没有与通过共价键(如在半胱氨酸残基之间的双硫键)结合)。可激活的或可转换的意思是当在一种被抑制、被掩蔽或未裂解状态(即，一种第一结构)时，AA表现出一种与其靶点结合的第一水平，以及在未被抑制、未被掩蔽和/或裂解状态(即，一种第二结构)时AA表现出一种与其靶点结合的第二水平，其中与其靶点结合的第二水平大于与其靶点结合的第一水平。一般地，在能够裂解CM的裂解剂存在时靶点到达AA的AB程度比在裂解剂不存在时是大。这样，当AA处在未裂解状态时，AB与靶点的结合被抑制并且其与靶点的结合被掩蔽(即，地域结构是这样，AB不能与靶点结合)，而在裂解状态AB未被抑制或未被掩蔽其与靶点的结合。AA的CM和AB可以选择成AB代表一种相关靶点的结合基团，CM代表在一个主体内的治疗位置能与靶点共存的蛋白酶的一种底物。此外，CM是一个半胱氨酸-半胱氨酸双硫键是可裂解的，作为双硫健减少的结果。AA另外或将进一步包括一种不耐光的底物，可通过一种光源激活。这里所说的AA有特别的用途，其中，例如，能够裂解CM中的位点的蛋白酶在一个治疗位点(如病变组织，如治疗处理或诊断处理的例子)的靶点含有的组织中比未经治疗位点(如在正常组织中)的组织中处于相对高的水平，如图2的示例。这里所说的AA也有特别的用途，其中，例如，一种能够降低CM中的位点降低剂在中比在未经治疗和诊断位点的组织中处于相对较高的水平。这里所说的AA也有特别的用途，例如，像一种治疗或诊断位点的靶点含有的组织引入一种能够光解CM中的一种位点的光源，例如激光。
在一些实施例中，AA可提供降低毒性和/或不良的副作用，否则，如果AB没有被掩蔽或抑制与靶点的结合，将导致AB在未治疗位点的结合。其中，AA包含被一种易于减少双硫键的降低剂裂解的CM，AA的这种AB可以选择以利用AB的活化，其中有关的靶点出现在需要治疗的以提高了一种降低剂的水平为特征的位点，这样的环境中具有比，例如，未治疗位点的环境中更高的降低潜力。一般地，当在构象约束下，一种AA可以通过选择一种目标AB和构建AA的剩余部分进行设计以便匪为AB提供掩蔽或降低AB与其靶点测定结合。结构设计准则的采用须考虑提供这种结构特性。在某些实施例中，本发明提供了结合双靶点的AA。这种结合双靶点的AA包含两个可以结合相同或不同靶点的AB，在具体的实施例中，双靶点AA包含两个具体的抗体或抗体片段。在一个具体的实施例中，AA包含一种IL17 AB和一种IL23 AB0在其他具体的实施例中，AA 包含一种 IL 12 AB 和一种 IL23 AB,或一种 EGFR AB 和一种 VEGF AB,或一种 IGFlR AB 和一种 EGFR AB,或一种 cMET AB 和一种 IGF1RAB，或一种 EGFR AB 和一种 VEGF AB,或一种Notch受体AB和一种EGFR AB,或一种Jagged配体AB和一种EGFR AB,或一种cMET AB 和一种 VEGF AB0双靶点结合的AA可以设计成具有被一种在一个靶点组织中与一个或两个能够结合AA中的AB的靶点共存的裂解剂裂解的CM。具有多于一个对相同或不同靶点的双靶点 AB可以设计成具有多于一个CM，其中第一 CM是在一个第一靶点的组织中被一种裂解剂可裂解的。而其中的第二 CM是在一个第二靶点的组织中被一种裂解剂可裂解的，具有能够与 AA中的AB结合的一个或多个靶点。第一和第二靶点的组织在空间上可以是分开的，例如， 在有机体中的不同位点。第一和第二靶点的组织可以是暂时分开的相同组织，例如，在两个不同时间点相同的组织。例如，第一时间点是当组织是一种健康的肿瘤时，第二时间点是当组织是一种坏死的肿瘤时。为在一种被抑制的结构或未被抑制的结构中的靶点的结合提供了在一个所需的动态范围表现出可转换表形的AA。动态范围一般是指一种比例，具有从(a)在第一套条件下的参数的最大可检测水平到(b)在第二套条件下的参数的最小可检测值。例如，在关于 AA的描述中，动态范围是是指从(a)在能裂解AA的CM的蛋白酶存在下靶点与AA结合的最大可检测水平到(b)在该蛋白酶不存在时靶点与AA结合的最小可检测水平。AA的动态范围可以以AA裂解剂治疗(例如，酶)的平衡裂解常数与AA裂解剂治疗(例如，酶)的平衡裂解常数的比例进行计算。AA的动态分为越大，其可转换表形越好。动态范围数值相对较高的AA(例如，大于1)表现出更好的转换表型，以便在裂解AA的CM的裂解剂(例如，酶) 存在时比裂解剂不存在时使靶点蛋白与AA的结合在更大的范围发生(例如，显著地发生)。AA可以多种结构形式提供。有关AA的典型的结构式在下文提供。专门设想在AA 中的AB、匪和CM从N到C端的顺序被占据。也专门设想CM和匪可能在氨基酸序列中重叠，例如，CM包含在MM中。例如，可以下面的式子代表AA，按顺序从一个氨基(N)端区域到羰基(C)端区域(MM) - (CM) - (AB)(AB) - (CM) - (MM)其中MM是一种掩蔽基团，CM是一种裂解基团，以及AB是一种抗体及其片段。应该指出，尽管MM和CA在上面的结构式中是不同的组件显示的，在本发明所有典型的实施例中(包括结构式)设想匪和CM中的氨基酸序列可以重叠，例如，这样CM可以被全部或部分地包含在MM中。此外，上述结构式为位于AA部件的N端或C端提供了额外的氨基酸序列。在许多实施例中，可能希望插入一个或多个连接体，如柔性连接体，到AA的结构中以便在一个或多个MM-CM结点、CM-AB结点或其两者提供柔性。例如，AB、匪和/或CM可能不含足够数量的残基(如617、％1~、4印、4811，特别是617和^^，尤其是617)以提供所需的柔性。因此，这种AA结构的可转换表型可以从一个或多个氨基酸的引入受益以便提供一种柔性的连接体。此外，如下文所示，其中AA作为一种构象约束结构而提供，一种柔性连接体可以被切实可行地插入以便在为未裂解的AA中易于形成并维持一个环状结构。例如，在某些实施例中，一种AA包括下面的结构式中的一种(其中，在N到C端方向或C到N端方向，下式代表一种氨基酸序列)(MM) -L1- (CM) - (AB)(MM) - (CM) -L1- (AB)(MM) -L1- (CM) -L2- (AB)CyCIo [L1- (MM) -L2- (CM) -L3- (AB)]其中匪、CM及AB如上文所定义；其中LpLdPL3各自独立及可选则存在或不存在、 是相同或不同的连接体，包括至少一种柔性氨基酸(如GIy)，其中出现cyclo位置，由于在 AA中一对半胱氨酸之间存在双硫健AA是一种环状结构的形式。此外，上式可能在AA基元的 N端或C端提供了额外的氨基酸序列。应该认识到，在式CyCIo [L1- (MM) -L2- (CM) -L3- (AB)] 中，负责提供硫键的半胱氨酸可能置于AA中兼顾一个或两个尾端，从而当AA处于一个双硫健结构中时产生一个套索或欧米茄结构(这样处于构象约束状态)。尾端的氨基酸序列为 AA提供了额外的特性，如与靶点的受体结合使AA易于定位、提高AA的血清半衰期，等等。 靶向基团(例如，出现在靶点组织中的一个细胞受体的配体)和血清半衰期延长基团(如， 多呆与血清蛋白结合的多态，如免疫球蛋白(例如IgG))或血清白蛋白(如人血清白蛋白 HSA)。经过修饰并激活的抗体的基元。(a)抗体或抗体片段(统称为AB)根据本发明，AB针对任何可能使用的抗原或半抗原。本发明中使用的AB针对任何行列式，例如，肿瘤、细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、组织相容性，差异化和其他细胞膜抗原、病原体表面抗原、毒素、酶、过敏原、药物、细胞内靶点、任何生物活性分子。此外，可能使用相对于不同抗原行列式的AB结合体。如本发明所使用的，AB是能结合特别是特异性与相关的靶点，特别是相关蛋白质靶点结合的全尺寸的抗体或包含一种抗原结合域的抗体片段。在图1中提供了 AA的一种原理图。在这样的实施例中，AB可以是但不限于一种可变或高度可变的抗体的轻链和/或重链(Uh)的区域、可变片段(Fv)、Fab'片段、F(ab' ) 2片段、Fab片段、单链抗体(scAb)、 单链可变域(scFv)、互补决定域(⑶R)、域抗体(dAbs)、BHH或BNAR类型的单域重链免疫球蛋白、单域轻链免疫球蛋白、或其他本领域已知的含有一种能与靶点蛋白或在靶点蛋白上的抗原表位结合的AB的多态。在进一步的实施例中，AB可以是含有多于一种AB的嵌合体或杂交组合体，例如一种第一 AB和一种第二 AB，这样，每一个AB能与相同或不同的靶点结合。在一些实施例中，AB是双特异性的抗体或其片段。设计成与两种不同的抗原结合。在一些实施例中，存在一种在激活形式的第一匪和CM和/或第二匪和CM分别与第一 AB和第~■ AB 耦合。AB的起源可以是一种天然存在的抗体或抗体片段、一种非天然存在的抗体或抗体片段、一种合成的抗体或抗体片段、一种混合抗体或抗体片段、或一种工程抗体或抗体片段。该抗体可以是一种人源化抗体或抗体片段。在某些实施例中，AA含有不止一种AB。在一些实施例中，AB可以衍生自双特异性抗体或抗体片段。在其他抗体中，AA可以是工程合成的以便纳入到衍生在两种不同抗体或抗体片段的AB中。在这种实施例中，AB可以设计成与两种不同的靶点、两种不同的抗体、 或两种同一靶点上的不同抗原表位结合。一种含有多个AB且能与多于一种靶点位点结合的AB通常设计成与一种靶点或多个目标靶点上的不同的结合位点结合，这样，一种AA的第一 AB的结合基本不干扰该AA的第二 AB与靶点的结合。含有多个AB的AA可以进一步包括多个AB-MM单元，它们可以选择性地被额外的CM分开，这样，由于暴露于一种修饰剂，AB 与其靶点的特异性结合不再受到抑制，或是“解掩蔽的”。在一些实施例中，把抗体片段用于源允许靶点位点在一种提高的速率下渗透。IgG 免疫球蛋白的Fab'片段由抗体与胃蛋白酶[导致一种二价片段(Fab1U]或木瓜蛋白酶 [导致 2 个一价片段(2Fab)]裂解获得。Parham, 1983, J. Immunol. 131 :2895-2902 ；Lamoyi and Nisonoff，1983，J. Immunol. Meth. 56 :235-243。二价(Fab1) 2 片段可以分裂通过一种或几种双硫键的缓和减少产生单价Fab'片段。Fab和(Fab1) 2片段比一个完整抗体小，但仍含有一个AB，所以当用作AB时可以更容易地渗透到靶点的位点或组织。在某些实施例中，因为许多这样的片段不能跨过胎盘屏障，这可提供在体内传递的一种优势。结果，使用本发明的这种实施例，AA可以在孕妇体内位点(如肿瘤)传递而避免胎儿的暴露。为一种给定的靶点生成一种抗体(或其片段)的方法为本专业所熟知。抗体和抗体片段的结构、一种抗体的轻链和重链(VHand Vl)的可变域、Fv、F(ab' )2、Fab片段、单链抗体(scAb)、单链可变域(scFv)、互补决定域(CDR)和域抗体(dAb)都是所熟知的。生成具有所需的靶点抗原的一种抗原结合域的多肽的方法为本专业所熟知。修饰抗体或抗体片段与额外的多态耦合的方法为本专业所熟知。例如，肽如MM、CM 或连接体可以经过耦合以修饰抗体形成本发明中的修饰AB和AA。如在图3的原理图中描述的，使用标准方法可以开发并生产含有蛋白酶激活的AB的AA。该抗体或抗体片段(统称为AB)能与一种蛋白质靶点特异性结合。本发明中的一种 AB 与其靶点在裂解系数不大于 1000nM、100nM、50nM、10nM、5nM、lnM、500pM、400pM、 350ρΜ、300ρΜ、250ρΜ、200ρΜ、150ρΜ、100ρΜ、50ρΜ、25ρΜ、10ρΜ、5ρΜ、1ρΜ、0· 5ρΜ 或 0.IpM 时特
异性结合。有关AB的靶点的典型类型包括，但不一定限于，细胞表面受体和分泌的集合蛋白 (例如、生长因子)、水溶性酶、结构蛋白(例如，胶原蛋白、纤维连接蛋白)等。在一些实施例中，本发明预期的AA是那些具有能连接一种胞外靶点、通常是一种胞外蛋白靶点。在其他实施例中，AA可以设计成细胞吸收以及设计成在细胞内可转换的在典型的实施例中，没有任何方式的限制，AB是用于表一中的任何靶点的一种结合配体。在具体的典型实施例中，AB是一种用于EGFR、TNFa、CD lla、CSFR、CTLA_4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、Jagged 2、CD52、MUC1、 IGF1R、铁传递蛋白、gpl30、VCAM-I、⑶44、DLL4或L4的结合配体。在一个具体的实施例中， AB不是CD52的结合配体。在典型的实施例中，没有任何方式的限制，AB的典型来源列于表2中。在具体的典型实施例中，本发明中AB的来源是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、 托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitUmUmab(IGFR-l抑制剂)。在一个具体的实施例中，AB的来源不是阿仑单抗或不是Campath 。表1:典型靶点
权利要求
1.一种修饰抗体包括一种抗体或一种抗体片段(AB)，能够特异性的结合其靶点，与一种掩蔽基团(MM)耦合，其中，匪的耦合降低了 AB与其靶点结合的能力，这样，耦合了匪的AB对其靶点的离解常数(Kd)比没有耦合匪的AB对其靶点的Kd至少大100倍。
2.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述耦合了匪的AB对其靶点的Kd 比没有耦合匪的AB对其靶点的Kd至少大1000倍。
3.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述耦合了匪的AB对其靶点的Kd 比没有耦合匪的AB对其靶点的Kd至少大10000倍。
4.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于在靶点存在情况下，当使用靶点置换分析法进行体外测试时，对比没有耦合匪的AB与其靶点的结合能力，耦合了匪的AB与其靶点的结合能力至少降低90%。
5.根据权利要求4所述的修饰抗体，其特征在于所述匪与AB耦合降低AB与其靶点结合的能力至少12小时。
6.根据权利要求4所述的修饰抗体，其特征在于所述匪与AB耦合降低AB与其靶点结合的能力至少M小时。
7.根据权利要求4所述的修饰抗体，其特征在于所述匪与AB耦合降低AB与其靶点结合的能力至少72小时。
8.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述MM对AB的离解常数(Kd)至少比AB对其靶点的Kd大100倍。
9.根据权利要求8所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于ΙΟηΜ。
10.根据权利要求8所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于5nM。
11.根据权利要求8所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于InM。
12.根据权利要求1所述的修饰抗体，还与一种可裂解基团(CM)耦合。
13.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以被一种酶裂解。
14.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以被一种还原剂还原。
15.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以被光溶解。
16.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述匪可以特异性结合到AB的抗原结合域。
17.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述MM与抗原结合域的结合是非共价的。
18.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述MM从同分异构空间位阻上减低AB与其靶点结合的能力。
19.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述MM从空间位阻上减低AB与其靶点结合的能力。
20.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以在至少约IxIO4M1S''1 的速率下被一种酶特异性裂解。
21.根据权利要求12所述的AB，其特征在于所述CM可以在至少^clO4M4S的速率下被一种酶特异性裂解。
22.根据权利要求20所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以在至少IOxlO4M4S的速率下被一种酶特异性裂解。
23.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述抗体片段选自一种Fab'片段、 一种F(ab' ) 2片段、一种scFv、一种scAB a dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。
24.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述AB选自表2中的抗体所构成的组。
25.根据权利要求M所述的修饰抗体，其特征在于所述AB不是阿伦单抗。
26.根据权利要求M所述的修饰抗体，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、 英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
27.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
28.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点不是CD52。
29.根据权利要求27所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFα、⑶1 la、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jagged 1、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
30.根据权利要求1所述的修饰抗体，还包括一种第二AB，其特征在于所述第二 AB的靶点选自表1中靶点所构成的组。
31.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM位于MM内。
32.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是用于选自由表3中的酶所构成的组中的酶的一种底物。
33.根据权利要求32所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是用于天冬酰胺内肽酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
34.根据权利要求32所述的修饰抗体，其特征在于所述AB选自表2中的抗体所构成的组。
35.根据权利要求32所述的修饰抗体，其特征在于所述AB不是阿伦单抗。
36.根据权利要求34所述的修饰抗体，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、 英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
37.根据权利要求32所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
38.根据权利要求37所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点不是CD52。
39.根据权利要求37所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
40.根据权利要求12所述的修饰抗体，进一步耦合到第二裂解基团(CM)，能够被一种酶特异性修饰。
41.根据权利要求40所述的修饰抗体，其特征在于所述第二CM是一种用于天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9，MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的底物。
42.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于相对于AB的天然结合配体，所述MM 不含有多于50%的氨基酸序列的相似性。
43.根据权利要求1所述的修饰抗体，还包含一种连接肽，其特征在于所述连接肽位于AB和MM之间。
44.根据权利要求1所述的修饰抗体，还包含一种连接肽，其特征在于所述连接肽位于匪和CM之间。
45.根据权利要求12所述的修饰抗体，还包含一种连接肽，其特征在于所述连接肽位于AB和CM之间。
46.根据权利要求12所述的修饰抗体，还包含两种连接肽，其特征在于所述第一连接肽在AB和CM之间，而第二连接肽位于匪和CM之间。
47.根据权利要求43所述的修饰抗体，其特征在于所述链接体选自一种可裂解链接体、一种非可裂解链接体和一种分支链接体所构成的组。
48.根据权利要求44所述的修饰抗体，其特征在于所述链接体选自一种可裂解链接体、一种非可裂解链接体和一种分支链接体所构成的组。
49.根据权利要求45所述的修饰抗体，其特征在于所述链接体选自一种可裂解链接体、一种非可裂解链接体和一种分支链接体所构成的组。
50.根据权利要求46所述的修饰抗体，其特征在于所述链接体选自一种可裂解链接体、一种非可裂解链接体和一种分支链接体所构成的组。
51.根据权利要求1所述的修饰抗体，还包含一种可检测基团。
52.根据权利要求47所述的修饰抗体，还包含一种能够与AB耦合、能够被一种酶特异性修饰的可裂解基团(CM)。
53.根据权利要求47所述的修饰抗体，其特征在于所述可检测基团是一种诊断试剂。
54.根据权利要求1所述的修饰抗体，还包含一种与AB共轭的试剂。
55.根据权利要求M所述的修饰抗体，其特征在于所述试剂是一种治疗剂。
56.根据权利要求M所述的修饰抗体，还包含一种能够与AB耦合、能够被特异性裂解的可裂解基团(CM)
57.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述试剂是一种抗肿瘤药剂。
58.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述抗体或抗体片段选自表2中的抗体所构成的组。
59.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述AB不是阿仑单抗。
60.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述抗体或抗体片段是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或f igitumumab (IGFR-1抑制剂)。
61.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点选自表中的靶点所构成的组。
62.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点不是CD52。
63.根据权利要求61所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
64.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是选自表3中的酶所构成的组中的酶的一种底物。
65.根据权利要求64所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是选自天冬酰胺内肽酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA、或PSA的底物。
66.根据权利要求56所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是可以通过光解作用裂解的。
67.根据权利要求M所述的修饰抗体，其特征在于所述试剂是与一个AB的碳水化合物基团共轭的。
68.根据权利要求67所述的修饰抗体，其特征在于所述碳水化合物基团位于AB的抗原结合域外。
69.根据权利要求M所述的修饰抗体，其特征在于所述试剂与AB的巯基共轭。
70.根据权利要求12所述的修饰抗体，其特征在于为一种有机体给药时，所述组合物的血清半衰期至少在5天。
71.根据权利要求1所述的修饰抗体，其特征在于所述匪的共有序列是CISPRGC、 C(N/P)H(HVF) (Y/T) (F/ff/T/L) (Y/G/T/S) (T/S/Y/H)CGCISPRGCG、xCxxYQCLxxxxxx, XXQPxPPRVXX、PxPGFPYCxxxx, xxxxQxxPWPP、GxGxCYTILExxCxxxR、GxxxCYxIxExxCxxxx, GxxxCYxIxExffCxxxx >xxxCCxxYxIxxCCxxx 或 xxxxxYxILExxxxx。
72.根据权利要求57所述的修饰抗体，其特征在于所述共有序列是用于特异性连接到一种抗VEGF抗体、一种抗ETOR抗体、或一种抗CTLA-4抗体。
73.—种修饰抗体包括一种抗体或抗体片段(AB)，能够与其靶点特异性结合，与一种掩蔽基团(MM))耦合，其特征在于当使用靶点的替代物在体外进行测试时，对比没有耦合匪的AB与其靶点的结合能力，耦合了匪的AB与其靶点的结合能力至少降低90%。
74.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述AB与其靶点的结合时间至少降低12小时。
75.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述AB与其靶点的结合时间至少降低24小时。
76.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述AB与其靶点结合的时间至少降低72小时。
77.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述耦合了匪的AB对其靶点的离解常数(Kd)比没有耦合匪的AB对其靶点的Kd至少大100倍。
78.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述MM对AB的离解常数(Kd)比 AB对其靶点的Kd至少大100倍。
79.根据权利要求78所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于ΙΟηΜ。
80.根据权利要求78所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于5nM。
81.根据权利要求78所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd约为InM。
82.根据权利要求78所述的修饰抗体，还包含在AA与MM之间一种链接体。
83.根据权利要求82所述的修饰抗体，其特征在于所述链接体包含一种可裂解基团 (CM) ο
84.根据权利要求78所述的修饰抗体，其特征在于所述匪可以特异性连接到AB的抗原结合域。
85.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以在至少IXIO4M1S''1的速率下被一种酶特异性裂解。
86.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以在至少^10 的速率下被一种酶特异性裂解。
87.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以在至少的速率下被一种酶特异性裂解。
88.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以被一种还原剂裂解。
89.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM可以被光解作用裂解。
90.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述抗体片段选自一种Fab'片段、一种F(ab' )2片段、一种scFv、一种scAB a dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。
91.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述AB选自表2中的抗体所构成的组。
92.根据权利要求91所述的修饰抗体，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、 英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
93.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
94.根据权利要求93所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
95.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述AB不是阿伦单抗。
96.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于所述靶点不是CD52。
97.根据权利要求83所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是用于选自表3的酶所构成的组中的酶的一种底物。
98.根据权利要求97所述的修饰抗体，其特征在于所述CM是用于天冬酰胺内肽酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
99.根据权利要求83所述的修饰抗体，进一步耦合到一种第二裂解基团(CM)，可以被一种酶特异性修饰。
100.根据权利要求99所述的修饰抗体，其特征在于所述第二CM是用于天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9，MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
101.根据权利要求73所述的修饰抗体，其特征在于相对于AB的天然结合受体，MM不含有多于50%的氨基酸序列的相似性。
102.根据权利要求73所述的修饰抗体，还包含一种可检测基团。
103.根据权利要求73所述的修饰抗体，还包含一种与AB共轭的试剂。
104.一种可激活抗体(AA)包括(a)一种抗体或抗体片段(AB)，可以特异性结合其靶点；(b)一种能耦合到AB的掩蔽基团(MM)，能够抑制AB特异性结合其靶点；以及，(c)一种耦合到AB的可裂解基团(CM)，能够被一种酶特异性裂解；其特征在于与AA 处在裂解CM的足够酶活和匪不抑制AB特异性结合其靶点的的情况相比，当AA不处于裂解CM的足够酶活下，MM至少降低AB与其靶点特异性结合程度的90%。
105.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述AB与其靶点结合的时间降低至少 12小时。
106.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述AB与其靶点结合的时间降低至少 24小时。
107.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述AB与其靶点结合的时间降低至少 72小时。
108.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述耦合了匪和CM的AB对其靶点的离解系数(Kd)比没有耦合匪和CM的AB对其靶点的离解系数至少大100倍。
109.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述匪对AB的离解常数(Kd)约为InM。
110.根据权利要求109所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于ΙΟηΜ。
111.根据权利要求109所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd低于5nM。
112.根据权利要求109所述的修饰抗体，其特征在于所述匪对AB的Kd约为InM。
113.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述匪可以特异性的结合到AB的抗原结合域上。
114.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述CM可以在至少IXIO4M1S''1的速率下被一种酶特异性裂解。
115.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述CM可以在至少&104Μ''1S的速率下被一种酶特异性还原。
116.根据权利要求104所述的ΑΑ，其特征在于所述CM可以在至少IOXIO4M1S的速率下被一种酶特异性还原。
117.根据权利要求104所述的ΑΑ，其特征在于所述抗体片段选自一种Fab'片段、一种F(ab' ) 2片段、一种scFv、一种scAB a dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。
118.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述AB选自表2中的抗体所构成的组。
119.根据权利要求118所述的AA，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
120.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
121.根据权利要求120所述的AA，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶lla、CSFR、 CTLA-4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
122.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述AB不是阿伦单抗。
123.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述靶点不是CD52。
124.根据权利要求104所述的AA，其特征在于所述CM是用于选自表3的酶所构成的组中的酶的一种底物。
125.根据权利要求IM所述的AA，其特征在于所述CM是用于天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9，MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
126.根据权利要求104所述的ΑΑ，进一步耦合到一种第二裂解基团(CM)，能够被一种酶特异性裂解。
127.根据权利要求1 所述的AA，其特征在于所述第二CM是用于天冬酰胺内肽酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
128.根据权利要求104所述的ΑΑ，其特征在于所述CM位于匪内。
129.根据权利要求104所述的ΑΑ，其特征在于相对于AB的天然结合配体，所述匪不含有多于50%的氨基酸序列的相似性。
130.根据权利要求104所述的ΑΑ，还包含一种连接肽，其特征在于所述连接肽位于 MM和CM之间。
131.根据权利要求104所述的ΑΑ，还包含一种连接肽，其特征在于所述该连接肽位于 AB禾口 CM之间。
132.根据权利要求104所述的AA还包含一种可检测基团。
133.根据权利要求104所述的ΑΑ，还包含一种与AB共轭的试剂。
134.一种可激活的抗体复合物(AAC)包括(a)两种抗体或抗体片段(ABl和AB2)，每一种都能与其靶点特异性结合；(b)至少一种能与ABl或AB2耦合的掩蔽基团(MM)，能抑制ABl和AB2与其靶点的特异性结合；以及(c)至少一种能与ABl或AB2耦合的裂解基团，可以被一种酶通过激活AAC的组合物而特异性裂解。其特征在于，当AAC处于未裂解状态时，匪抑制ABl和AB2与其靶点的特异性结合，而当AAC处于裂解状态时，匪不抑制ABl和AB2与其靶点的特异性结合。
135.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述复合物是双特异性抗体。
136.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和AB2连接在同一靶点的相同抗原表位。
137.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和AB2连接在不同靶点的相同抗原表位。
138.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和AB2连接在不同靶点的不同抗原表位。
139.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述CM可以在约至少IxlO4M4S"1 速率被一种酶特异性裂解。
140.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述抗体片段选自一种Fab'片段、一种F(ab' )2片段、一种scFv、一种scAB a dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。
141.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和/或AB2选自表2中的抗体所构成的组。
142.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和/或AB2是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab (CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或f igitumumab (IGFR-1抑制剂)。
143.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
144.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和/或AB2是EGFR、 TNFa、CDlla、CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF、CD40、CD20、Notch UNotch 2, Notch 3, Notch 4、Jagged 1、Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
145.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述ABl和AB2能够分别与EGFR 和VEGF、一种Notch受体和EGFR、一种Jagged配体和EGFR或cMET和VEGF结合。
146.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述CM是用于选自表3中的酶所构成的组中的酶的一种底物。
147.根据权利要求134所述的组合物，其特征在于所述CM是用于天冬酰胺内肽酶、 纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
148.根据权利要求134所述的组合物，进一步耦合到第二裂解基团(ΜΜ)，能够被一种酶特异性裂解。
149.根据权利要求148所述的组合物，其特征在于所述第二CM是用于天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、ΜΜΡ-9，MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
150.根据权利要求134所述的组成，其特征在于相对于AB的天然结合受体，所述MM 不含有多于50%的氨基酸序列的相似性。
151.根据权利要求134所述的组成，还包含一种可检测基团。
152.根据权利要求134所述的组合物，还包含一种与AB共轭的试剂。
153.—种主体病症的治疗或诊断方法包括供给该主体的一种组合物成分包括(a)一种抗体或抗体片段(AB)，能够与其靶点特异性结合。(b)一种与AB耦合的掩蔽基团(MM)，能够抑制AB与其靶点的特异性结合，以及(c)一种与AB耦合的可裂解基团(CM)能够被一种酶特异性裂解；其特征在于基于对主体的给药，对比AA处在裂解CM的足够酶活和匪不抑制AB与其靶点的特异性结合的情况，当AA不处于裂解CM的足够酶活下，匪至少降低AB与其靶点特异性结合程度的90%。
154.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述AB选自一种Fab'片段、一种 F(ab' ) 2片段、一种scFv、一种scABa dAb、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。
155.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述疾病是癌。
156.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述MM不是天然的AB结合配体。
157.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述AB选自表2中的抗体所构成的组。
158.根据权利要求157所述的方法，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、 Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
159.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述靶点选自表1中的靶点所构成的组。
160.根据权利要求159所述的方法，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
161.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述AB不是阿仑单抗。
162.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述靶点不是CD52。
163.据权利要求153所述的方法，其特征在于所述CM是用于选自表3中的酶所构成的组中的酶的一种底物。
164.根据权利要求163所述的方法，其特征在于所述CM是用于天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA、或PSA的一种底物。
165.—种在哺乳动物主体中抑制血管生成的方法，所述方法包括供给主体治疗所需足够量的权利要求12所述的一种药剂组合物。
166.根据权利要求165所述的方法，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUCl、IGF1R、转铁蛋白、gp 130、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
167.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述AB是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、 Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或 f igitumumab (IGFR-1 抑制剂)。
168.根据权利要求153所述的方法，其特征在于所述CM是天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、 TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、 β -分泌酶、uPA、或PSA的一种底物。
169.—种制备可激活的抗体(AA)组合物的方法包括(a)提供一种能够与靶点特异性结合的抗体或抗体片段(AB)。(b)将一种掩蔽基团(MM)与AB耦合，能够抑制AB与其靶点的特异性结合。以及，(c)将一种可裂解基团(CM)与AB耦合，能够被一种酶特异性裂解，其特征在于所述耦合了匪的AB对其靶点的离解常数(Kd)比没有耦合匪的AB对其靶点的Kd 倍。
170.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述AB是或是衍生于选自表2中的抗体所构成的组中的抗体。
171.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述AB是或是衍生于西妥昔单抗、 帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、 阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或f igitumumab (IGFR-1抑制剂)。
172.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述AB不是阿仑单抗。
173.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述靶点不是CD52。
174.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述CM是用于选自表3中的酶所构成的组中的酶的一种底物。
175.根据权利要求166所述的方法，其特征在于所述CM是天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、 TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、 β -分泌酶、uPA或PSA的一种底物。
176.—种筛选候选肽以便识别一种能够与抗体或抗体片段结合的掩蔽基团的方法包括(a)提供一种肽支架库，其特征在于所述每一种肽支架包括 (i) 一种跨膜蛋白(TM)；以及(ii) 一种候选肽；(b)将AB与所述库接触；(c)确定至少一种能够与AB结合的候选肽；以及，(d)确定候选蛋白对AB的离解常数(Kd)是否在I-IOnM之间。
177.根据权利要求176所述的方法，其特征在于所述库中包含病毒、细胞或孢子
178.根据权利要求176所述的方法，其特征在于所述库中包括大肠杆菌。
179.根据权利要求176所述的方法，其特征在于所述肽支架进一步包含一种检测基团。
180.一种筛选候选肽以便确定一种能够掩蔽一种抗体或抗体片段(AB)具有最优的掩蔽效能的掩蔽基团(MM)肽的方法包括(a)提供一种包含多种AB的库，每一种都耦合到一种候选肽，其特征在于所述AB能与靶点特异性结合。(b)借助靶点孵化每一种库成员。并且，(c)对每种库成员对靶点结合的亲和力和没有耦合候选肽的AB对其靶点结合的亲和力进行对比。
181.根据权利要求180所述的方法中的步骤c，其特征在于对比未修饰AB对其靶点的结合亲和力，最优的结合效能是当库成员对其靶点的结合亲和力是10%。
182.根据权利要求180所述的方法，其特征在于所述的AB是相同的。
183.一种提高生物利用率的抗体疗法，其特征在于所述在第一组织中抗体疗法对其靶点结合的亲和力低于在第而组织中抗体疗法对其靶点结合的亲和力。
184.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUCl、IGF1R、转铁蛋白、gp 130、VCAM-I、CD44、DLL4 或 IL4。
185.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述第一组织是正常组织，而第二组织病变组织。
186.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述第一组织是早期肿瘤，而第二组织是晚期肿瘤。
187.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述第一组织是良性肿瘤而第二组织是恶性肿瘤。
188.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述第一组织和第二组织在空间上是分开的。
189.根据权利要求183所述的方法，其特征在于所述第一组织是上皮组织而第二组织是乳腺、头、颈、肺、胰腺、神经系统、肝、前列腺、泌尿生殖道或宫颈组织。
190.根据权利要求183所述的疗法进一步与一种药剂耦合。
191.根据权利要求183所述的疗法，其特征在于所述药剂是一种抗肿瘤药剂。
192.一种药物组合物包括(a)一种抗体或抗体片段(AB)，能够与其靶点特异性结合；并且，(b)一种药学上可接受的赋形剂；其特征在于所述第一组织中抗体或抗体片段对靶点的亲和力低于第二组织中抗体或抗体片段对靶点的亲和力。
193.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织中的亲和力比第二组织中的亲和力低10 1000倍。
194.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述AB耦合到一种能降低AB与其靶点的结合的掩蔽基团(CM)，并耦合到一种可以被酶特异性裂解的可裂解基团(CM)。
195.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述靶点是EGFR、TNFa、⑶11a、 CSFR、CTLA-4、EpCAM、VEGF, CD40、CD20、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、Jaggedl、 Jagged 2、CD52、MUC1、IGF1R、转铁蛋白、gpl30、VCAM-I、CD44、DLL4、或 IL4。
196.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织是正常组织而第二组织是病变组织。
197.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织是早期肿瘤而第二组织是晚期肿瘤。
198.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织是良性肿瘤而第二组织是恶性肿瘤。
199.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织和第二组织在空间上是分开的。
200.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述第一组织是上皮组织而第二组织是乳腺、头、颈、肺、胰腺、神经系统、肝、前列腺、泌尿生殖道或宫颈组织。
201.根据权利要求194所述的组合物，其特征在于所述CM是天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9, MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β -分泌酶、uPA、或PSA的一种底物。
202.根据权利要求192所述的组合物，其特征在于所述抗体或抗体片段是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(CTLA-4单抗)、阿德木单抗、Hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(IGFR-l抑制剂)。
203.根据权利要求192所述的组合物，还包括一种连接到AB的试剂。
204.根据权利要求203所述的组合物，其特征在于所述试剂是一种抗肿瘤药剂。
205.一种包括一种天冬酰胺肽链内切酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
206.一种包括一种纤溶酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
207.一种包括一种半胱天冬蛋白酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
208.一种包括一种TMPRS S-3/4激活抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
209.一种包括一种PSA激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
210.一种包括一种组织蛋白酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
211.—种包括一种人类中性粒细胞弹性蛋白酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团 (MM)的抗体片段(AB)的组合物。
212.—种包括一种分泌酶激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
213.—种包括一种uPA激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
214.—种包括一种TMPRSS-3/4激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
215.—种包括一种MTl-MMP激活的抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
216.—种包括一种可激活的EGFR抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
217.—种包括一种可激活的TNF α抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
218.—种包括一种激活的⑶Ila抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
219.—种包括一个可激活的CSFR抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
220.一种包括一个可激活的CTLA-4抗体或连接到一种掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
221.—种包括一个可激活的EpCAM抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
222.—种包括一个可激活的⑶40L抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
223.—种包括一个可激活的Notchl抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
224.—种包括一个可激活的Notch3抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
225.—种包括一个可激活的Jaggedl抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
226.—种包括一个可激活的Jagged2抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
227.—种包括一个可激活的西妥昔单抗抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
228.—种包括一个可激活的帕尼单抗抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB)的组合物。
229.—种包括一个可激活的英夫利昔单抗抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
230.一种包括一个可激活的阿达木单抗抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
231.—种包括一个可激活的依法珠单抗抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
232.—种包括一个可激活的伊匹单抗的抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段(AB) 的组合物。
233.—种包括一个可激活的tremelimumab的抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
234.—种包括一个可激活的阿德木单抗的抗体或连接到掩蔽基团(MM)的抗体片段 (AB)的组合物。
全文摘要
本发明提供了含有由掩蔽基团(MM)修饰的抗体或抗体片段(AB)的抗体的修饰抗体。这些修饰抗体可以进一步耦合到一个可裂解基团(CM)，产生激活的抗体(AAS)，其中CM是能够被裂解、还原、光解，或以其他方式修饰。AAs可以表现出激活状态，使AB更易于到达靶点，例如，在能够裂解、还原或光解CM的药剂存在条件下，通过CM的裂解、还原或光解去除MM。本发明还提供了这种修饰抗体和激活抗体的制备和应用方法。
文档编号A61K39/395GK102482347SQ201080011779
公开日2012年5月30日 申请日期2010年1月12日 优先权日2009年1月12日
发明者F·格鲁克, J·W·威斯特, J·萨格特, K·卡姆斯, N·E·斯坦格莉安奥, P·H·贝塞特, P·道格尔迪 申请人:希托马克斯医疗有限责任公司