受精调节化合物和使用它们的方法

专利名称：受精调节化合物和使用它们的方法
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本发明涉及受精调节化合物和使用它们的方法。分泌型磷脂酶A2(sPU^)最早描述于动物的毒液中。在蛇的毒液中，SPLA2按重量通常是最重要的化合物并且一种蛇的毒液可包含多达15种不同的sPLA2。这些酶在毒液的毒性中起着至关重要的作用并且负责形成广泛的毒性效应如神经毒性、心脏毒性或细胞毒性效应。存在于一种毒液中的全部sPLA2并非都显示相同的酶促性质并且每一种sPLA2 具有特定的毒性模式。根据序列同源性，已在哺乳动物中克隆了许多sPLA2 (Valentin和 Lambeau,2000 ；What can venomphospholipases A(2)tell us about the functional diversity ofMammalian secreted phospholipases A(2) ？ Biochimie. 82 :815-831)。 磷脂酶A2(PLA》现为酶的大家族并且根据钙敏感性和细胞定位而被分成四组分泌型 PLA2(sPU^)、细胞PLA2(cPU^)(两者都是钙依赖性的)和两个不依赖于钙的组(iPLA2和 PAF乙酰水解酶)。当关注于分泌型PLA2时，到目前为止在小鼠中已描述了 10种不同的基因，相应于 IB-、IIA-、IIC-、IID-、IIE-、IIF-、III-、V-、X-和 XIIA_sPLA2 的组。关于比较，毒液 sPLA2 属于组I (眼镜蛇和海蛇(hydrophid snake))或组II (蝰蛇和响尾蛇)。关于酶促活性， sPLA2家族的特征在于其将质膜的外片(extracellular leaflet)的甘油-磷脂的sn_2酯水解成两种成分(脂肪酸(FA)和溶血磷脂(LysoPL))的能力。这两种化合物都具有离开质膜的能力。因为FA在膜双层的两个片层(leaflet)之间快速平衡，所以它们扩散进入细胞质并且作为第二信使控制不同的细胞信号传导途径。相反地，LysoPL在外片中积累。然而，溶血磷脂包含甘油磷酸酯极性头基和更加亲脂的脂肪酸基团(甘油上的位置1中)。取决于脂肪酸的性质，溶血磷脂将分配在质膜与水相之间并且可以以自分泌或旁分泌模式在不同的细胞外途径中用作生物活性代谢产物。研究已显示，哺乳动物SPLA2酶在许多组织和器官中广泛表达但它们在细胞生理学中的细胞作用还远未弄清(Lambeau 禾口 Gelb，2008，Biochemistry and physiology of Mammalian secretedphospholipases A2. Annu. Rev. Biochem. 77 :495-520. What canvenom phospholipase A(2)tell us about the functional diversityof Mammalian secreted phospholipases A(2) ？ Biochimie. 82 :815-831)。在雄性生殖器官中，已描述了许多不同类型的SPLA2。成熟精细胞、附睾、输精管和精囊表达 lie-、IID-、IIE-、IIF-、V-和 X_sPLA2 ；前列腺表达 IIC-、IID-、IIE-和 IIF_sPLA2(Masuda, Murakami, Matsumoto, Eguchi, Urade, Lambeau,Gelb,Ishikawa,Ishii 禾口 Kudo,2004,Localization of various secretory phospholipase A2enzymes in male reproductive organs. Biochim. Biophys. Acta. 1686 :61-76)。雄性生殖器官的不同区室 (compartment)中如此多样的sPLA2的表达的原因和它们的明确的细胞功能到目前为止还不清楚。sPLA2在附睾、精囊和前列腺中的存在可解释PLA2活性在射出的精液精浆中的存在(Kallajoki,Alanen,Nevalainen 禾口 Nevalainen,1998,Group II phospholipase A2 in human male reproductiveorgans and genital tumours· Prostate· 35。巨 Itf，sPLA2在精浆中的作用还不十分清楚由于某些SPLA2具有强抗菌活性，因此此类酶可能参与雄性生殖道(male tract)的宿主防御。然而，由雄性生殖器官的不同细胞类型释放的分泌型PLA2也可在雌性生殖道中控制精子生理学的不同关键事件如精子获能、精子能动性或顶体反应(AR)。最后，sPLA2酶促活性的强抑制剂在相同精浆中的存在(Manjunath，Soubeyrand, Chandonnet 禾口 Roberts, 1994 ；Majorproteins of bovines eminal plasma inhibit phospholipase A2.Biochem. J. 303 121-128 ；Upreti, Hall, Koppens, Oliver 禾口 Vishwanath,1999, Studies on the measurement of phospholipaseA2(PLA2)and PLA2 inhibitor activities in ram semen. AnimR印rod. ki. 56 :107-121)令人对此类酶在精浆中的存在和它们在精浆中的生理学作用更加困惑。在精细胞中，脂质代谢是精子生理学的关键。属于不同家族的磷脂酶(PL)对磷脂的修饰牵涉精子生理学的不同的至关重要的步骤(由Roldan和Shi，2007，Sperm phospholipases and acrosomalexocytosis. Front Biosci. 12 :89-104 综述)。例如， 脂质质膜组分在精子生理学中起着至关重要的作用。脂质组分在精子获能过程中改变， 并且表征该进化的主要事件是被钙激活的胆固醇的流出和碳酸氢盐的流入(Visconti， Ning, Fornes, Alvarez, Stein, Connors 禾口 Kopf，1999， Cholesterol efflux-mediated signal transduction inMammalian sperm :cholesterol release signals an increase inprotein tyrosine phosphorylation during mouse spermcapacitation. Dev. Biol. 214 :429-443) 0从而，质膜中胆固醇浓度的降低是顶体反应所必需的引发步骤。AR 也受磷脂代谢的控制例如磷脂酶C(PLC)在该胞吐事件的钙信号传导中起着至关重要的作用(0' Toole, Arnoult, Darszon, Steinhardt 禾口 Florman，2000，Ca (2+) entry through store-operated channels in mouse sperm isinitiated by egg ZP3 and drives the acrosome reaction. Mol. Biol. Cell 11:1571-1584)。关于 sPLA2，组 IIE、V 和 X 有趣地定
(Masuda, Murakami, Matsumoto, Eguchi, Urade, Lambeau, Gelb， Ishikawa，Ishii 禾口 Kudo，2004，Localization ofvarious secretory phospholipase A2 enzymes in male reproductiveorgans. Biochim. Biophys. Acta. 1686 :61-76)0虽然没有将sPLA2和AR联系在一起的数据，但几个观察结果强有力地表明，未表征的内源PLA2在胞吐事件中起着重要作用。事实上，存在关于在该胞吐事件过程中牵涉SPLA2的几个间接证据。例如，PLA2 的抑制剂如米帕林或4-溴苯酰基溴(BPB)阻断钙离子载体诱导的顶体反应(Roldan 禾口 Fragio，1993， Phospholipase A2activation and subsequent exocytosis in the Ca2+/ionophore-induced acrosome reaction of ram spermatozoa. J. Biol. Chem. 268 13962-13970 ;Llanos，Morales禾口 Riffo，1993，Studies oflysophospholipids related to the hamster sperm acrosomereaction in vitro· J· Exp· Zool· 267 :209-216)0此外，sPLA2酶促活性的两个产物(溶血磷脂和/或脂肪酸)加速或促进胞吐 (Fleming 禾口 Yanagimachi，1984， Evidence suggesting theimportance of fatty acids and the fatty acid moieties of spermmembrane phospholipids in the acrosome reaction of guinea pigspermatozoa. J. Exp. Zool. 229 :485-489 ；Llanos，Morales 禾口 Riffo,1993, Studies of lysophospholipids related to the hamster spermacrosomereaction in vitro. J. Exp. Zool. 267 :209-216)。最后，透明带诱导的顶体反应导致脂质代谢产物的同时释放(PLA2激活的暗示) (Yuan, Chen, Shi, Mao, Yu, Fang 禾口 Roldan, 2003, Zonapellucida induces activation of phospholipase A2 duringacrosomal exocytosis in guinea pig spermatozoa. Biol. Reprod. 68 :904-913)。在本说明书中，存在于精液环境中的，甚至可能位于精细胞中的不同 SPLA2在顶体中起何作用呢？该问题仍然是个有争议的问题并且仅提出了假说。例如，精子 sPLA2可以以旁分泌或外分泌方式控制精子生理学。为了更好地理解所有此类酶的具体作用，已产生关于小鼠组V(mGV)和小鼠组X(mGX)sPLA2基因的不同的遗传修饰的缺失小鼠(null mice) (Henderson, Jr.，Chi, Bollinger, Tien, Ye, Castelli, Rubtsov, Singer, Chiang, Nevalainen, Rudensky 禾口 Gelb,2007, Importance of group X—secreted phospholipase A2 in allergen-induced airway inflammation and remodelling in a mouse asthmamodel. J. Exp. Med.204 865-877 ；Satake, Diaz, Balestrieri, Lam, Kanaoka, Grusby 禾口 Arm,2004, Role of group V phospholipase A2in zymosan-induced eicosanoid generation and vascularpermeabiIity revealed by targeted gene disruption. J. Biol. Chem. 279 16488-16494)。此夕卜，在C57BL/6品系小鼠中，mGIIA_sPLA2是天然断裂的(Kennedy, Payette, Mudgett, Vadas, Pruzanski, Kwan, Tang, Rancourt 禾口 Cromlish, 1995, A natural disruption of thesecretory group II phospholipase A2 gene in inbred mouse strains. J. Biol. Chem. 270 :22378-22385)。到目前为止在所有这些品系中未描述主要雄性生殖缺陷，从而这些转基因小鼠品系未提供关于这3种酶在精子生理学中的明确作用的任何指示或信息，所述作用有待通过更专门的实验来进行分析。不同sPLA2(可能用作冗余的酶)的存在可解释表型的不存在。除了它们水解磷脂的能力外，SPLA2还是不同类型的膜受体的配体。到目前为止， 已使用蛇毒液sPLA2作为配体表征了两种不同的受体骨骼肌中的M-受体和神经元中的 N-受体。sPLA2对这些受体的亲和力非常高，并且一些蛇sPLA2以低于IOpicoM的亲和力结合这两种受体。一些哺乳动物sPLA2也以非常高的亲和力结合这些受体。然而，仍然未理解此类结合在细胞生理学背景中的生理学关联性。有趣地，M-型受体属于C型凝集素超家族糖结合蛋白。已知凝集素在精子生理学中起着特殊作用，因为精子顶体反应依赖于ZP3(已知在精子-卵母细胞结合事件中至关重要的糖蛋白)的物种特异性碳水化合物部分。受精是生殖的必需步骤并且在一些情况下必须得到改善。受精的促进或改善可用于例如动物品种的繁殖，特别是在用于改良牛、绵羊或山羊品种的辅助繁殖技术(ART)过程中。可在体内或体外，特别是在辅助繁殖技术(ART)过程中进行哺乳动物不育症，特别是人不育症的治疗。哺乳动物的辅助繁殖技术特别地基于精子与卵母细胞的混合，所述精子与卵母细胞通过融合产生胚胎。随后将胚胎转移至雌性生殖道中。与收获的卵母细胞的数目相比较， 获得胚胎的成功率为50% (获得的关于人IVF的数据，France 2005)。在将胚胎转移至子宫中后，成功率大大降低并且只有十分之一转移的胚胎导致出生。因此，需要通过提高有活力的胚胎的产率来提高终受精率。
此外，受精调节和特别地辅助繁殖技术与增加的出生缺陷的风险相关。本发明的目的之一是，提供化合物和其衍生物以及它们用于下列的用途用于治疗不育症，或用于促进或改善受精(特别是在辅助繁殖技术过程中)，从而允许获得提高的精子成熟和提高的受精率以及促进胚胎发生，特别是有活力的胚胎发生并且不呈现遗传异
常ο本发明的另一个目的是，提供化合物和其衍生物以及它们用于阻止受精的用途。另一个目的是，提供用于促进和/或改善受精，或阻止受精的药物组合物。本发明的另一个目的是，提供用于治疗不育症或用于促进或改善受精的方法。本发明的另一个目的是，提供选择精子的方法。本发明的另一个目的是，提供诊断哺乳动物的不育症的方法。本发明的另一个目的是，提供避孕方法。本发明涉及易于调节受精的分泌型磷脂酶A2 (sPLA2)和/或所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其用于制造抗不育药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物或避孕药。本发明因下列而产生指出SPLA2本身或其代谢产物允许靶向无效精子 (inefficient spermatozoa)(就受精而言)从而可能弃去它们，而对有效精子(efficient spermatozoa)无负面影响的出人意料的功能，sPLA2本身或其代谢产物的所述功能参与精子顶体反应(AR)，甚至在卵母细胞不存在的情况下以及在正常AR发生之前亦如此。因此，sPLA2本身或其代谢产物的处理在卵母细胞不存在的情况下在精子的特定群体中，特别是在无效精子中触发早期AR，即靶向的AR，从而允许从无效精子中选择有效精子。AR是当精子与卵子的包被层(coating layer)(其为卵子的透明带)结合时在精子的顶体中发生的反应。AR为胞吐事件，其允许释放局部破坏透明带蛋白质所需的酶。关于术语“代谢产物”，其应当理解为通过用SPLA2水解sn-2酯甘油-磷脂而形成的产物。通过水解sn-2酯甘油-磷脂而产生的代谢产物可以是花生四烯酸、肉豆蔻脑酸、 棕榈油酸、sapienic acid、油酸、亚油酸、α -亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油或溶血憐月旨酸(Iysophosphatidate)。术语“调节”意指调整或改变至一定的比例；或调控或刺激。丰艮据 Cambridge Advanced Learner ‘ s Dictionary,(第 3 片反，Cambridge University Press)，术语“受精”意指“通过将卵子或种子与雄性细胞结合，使其开始发育成新的幼小动物或植物”。因此，本说明书中的术语“受精”意指，籍以将哺乳动物的卵细胞与精子结合的过程，即从将精子与卵母细胞放在相同培养基中至在植入之前回收多细胞胚胎的过程，包括将卵与精子融合，和获得处于“两细胞”期的胚胎。因此，表述“调节受精”意指，可增加哺乳动物中的受精-与健康哺乳动物的受精相比较，或-与所述哺乳动物的自己的受精水平相比较，即哺乳动物的产率已得到增加。
受精的增加可利用IVF测试例如实施例7中使用的测试(L. Fraser, (1993) In vitro capacitation and fertilization, Methodsin Enzymology，第 225 卷中白勺第 239-263页)来显示。在本说明书的其余部分，术语精子(spermatozoa)、精子(spermatozoon)和精子 (sperm)可独立地使用并且具有相同的意义。人的不育症和从而哺乳动物的不育症(特别是在妇女中)(也称为不孕症)通常定义为，在尝试1年后不能获得怀孕。因此，本发明的有利方面之一是提供治疗不育症，从而帮助哺乳动物怀孕的药物。在该情况下，受精的调节是受精的增加。关于“促进受精的药物”，其应当理解为在其中受精为不可能的情况下使得能够受精的药物。因此，本发明的另一个有利方面是提供能够获得有活力的胚胎(即获得接近健康哺乳动物的受精水平的哺乳动物(特别是人)的受精水平)的药物。在该情况下，受精的调节也是受精的增加。关于“改善受精的药物”，其应当理解为能够加强、提高、增加或促进受精的药物。 因此，本发明的另一个有利方面是提供能够获得比健康哺乳动物的受精水平更高的哺乳动物的受精水平的药物。在该情况下，受精的调节也是受精的增加。关于“促进有活力的胚胎发生的药物”，其应当理解为不仅能够促进受精而且还导致有活力的胚胎(至少由2个细胞构成)的药物。关于“改善有活力的胚胎发生的药物”，其应当理解为不仅能够改善受精而且还导致一个或多个有活力的胚胎(至少由2个细胞构成)，并且有利地允许获得能够发育成健康哺乳动物的健康新生哺乳动物的药物。有活力的胚胎定义为具有在植入前达到胚细胞期和在植入后达到新生期的正常发育的胚胎(Methods in enzymology，第 255 卷)。必需指出，受精的调节涉及-人群体，其中受精率得到增加，-人个体，其中使得受精成为可能，-或动物，其中繁殖的增加需要增加(例如但不限于动物的数目、肉比率(meat ratio)、肉的质量、奶产量……)。表述“受精的调节”也意指，可减少或甚至抑制哺乳动物的受精。“避孕药”应当理解为，能够缩减、降低、减少或甚至阻止或终止受精以导致节育 (birth controlling)白勺 1^·。为了调节受精，必须指出，所使用的SPLA2必须是有活性的，即能够水解质膜的外片的 sn-2 酯甘油-磷脂(Singer 等人 Q002nnterfacial Kinetic and Binding Properties of the Complete Setof Human and Mouse Groups I, II, V, X, and XII SecretedPhospholipases A2, Journal of Biological Chemistry,277,48535-48549)。在有利的实施方案中，本发明涉及易于增加所述受精的分泌型磷脂酶A2(sPLA2) 和/或如上定义的所述SPLA2产生的至少一种代谢产物用于制造抗不育症药物、或促进或改善受精的药物或促进或改善有活力的胚胎发生的药物的用途。因此，在该实施方案中，受精的调节是受精的增加。
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在有利的实施方案中，本发明涉及分泌型磷脂酶A2(sPU^)和/或如上定义的所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其在辅助繁殖技术(ART)过程中用于经历体外受精(IVF)、配子输卵管内植入法(GIFT)、精子卵浆内注射法(ICSI)或治疗性供者人工授精(TDI)的雌性哺乳动物。辅助繁殖技术(ART)包括其中操作卵子和精子的所有生育力治疗。通常，ART方法包括从哺乳动物的卵巢或雌性生殖道手术取出卵子，在实验室中将它们与精子组合，然后将它们转移至哺乳动物体内或将它们捐赠给另一个哺乳动物。ART的实例包括-体外受精(IVF)，其包括，通过在液体介质中让精子使卵细胞受精，然后将受精卵转移进入哺乳动物的雌性生殖道来在子宫外利用精子使哺乳动物的卵细胞受精，-配子输卵管内植入法(GIFT)，其中在经阴道取出卵子后，使用腹腔镜检查术 (Iaparoscopy)将精子与卵子的混合物直接置入哺乳动物的输卵管，-精子卵浆内注射(ICSI)，其中使用显微操作针将单个精子小心地注射进入卵子的中心，-治疗性供者人工授精(TDI)，其中进行使用供者精子的人工授精或更常见地供者授精。在优选实施方案中，本发明涉及易于调节受精的分泌型磷脂酶A2(sPU^)和所述 SPLA2产生的至少一种代谢产物用于制造抗不育症药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物或避孕药的用途。在优选实施方案中，本发明涉及易于调节受精的分泌型磷脂酶A2(sPLA2)用于制造抗不育症药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物或避孕药的用途。在优选实施方案中，本发明涉及易于调节受精的所述SPLA2产生的至少一种代谢产物用于制造抗不育症药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物或避孕药的用途。在有利的实施方案中，上文中使用的SPLA2呈现下列性质水解一种或多种甘油-磷脂的sn-2酯，且对阴离子型和两性离子型甘油-磷脂的比活性为约1 μ mol/分钟/ mg至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg。酶的“比活性”是每毫克酶在给定的条件下在一段时间内通过底物与酶的反应形成的产物的量，从而为酶持续合成能力(processivity)的量度。SPLA2以多种甘油-磷脂作为底物并且sPLA对甘油-磷脂的比活性可如Singer等人(Interfacial Kinetic and Binding Properties ofthe Complete Set of Human and Mouse Groups I, II, V, X,and XIISecreted Phospholipases A2,Journal of Biological Chemistry，第 277 卷，No. 50，Issue of December 13，pp. 48535 48549,2002)中所述进行测定。如上文中论述的，在精细胞中，脂质代谢是精子生理学的关键。属于不同家族的磷脂酶(PL)对磷脂的修饰参与精子生理学的不同的至关重要的步骤。表述“阴离子型磷脂”代表例如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油。
表述“两性离子型磷脂”代表例如磷酯酰胆碱、鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺。因此，从约1 μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/分钟/mg，只有部分存在于精子中的甘油-磷脂被水解，从而导致精子能够产生比非处理的精子的受精率更高的受精率。低于1 μ mol/分钟/mg，比活性太低以至于不能获得磷脂的水解，从而sPLA2不能参与精子生理学的所述至关重要的步骤。高于50 μ mol/分钟/mg，比活性太高，导致存在于精子中的甘油-磷脂的太高水平的水解，从而破坏精细胞。优选，在本发明中，“sPLA2的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约 1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg”是针对1、2、3、4或5种甘油-磷脂的，更优选是针对1、2或3种甘油-磷脂的。特别地，“ SPLA2的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约1 μ mol/分钟 /mg至约25 μ mol/分钟/mg”是针对一种甘油-磷脂的。 更特别地，“SPLA2的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg,特别地约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg”是针对两种甘油-磷脂的。在该实施方案中，SPLA2的比活性可以对于第一甘油-磷脂为约1至约50ο μ ml/ 分钟/mg，并且对于第二甘油-磷脂为约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg，但其还可以对于两种甘油-磷脂均为约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg，或对于两种甘油-磷脂均为约1至约50 μ mol/分钟/mg。特别地，“ SPLA2的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约1 μ mol/分钟 /mg至约25 μ mol/分钟/mg”是针对3种甘油-磷脂的。在该实施方案中，SPLA2的比活性可以为-对于3种甘油-磷脂，约1μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/分钟/mg,-对于1种甘油-磷脂，约1μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/分钟/mg并且对于其他2种甘油-磷脂，约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg，或-对于2种甘油-磷脂，约1μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/分钟/mg并且对于第三甘油-磷脂约ι μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg或，其还可以对于3种甘油-磷脂都是约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg。在有利的实施方案中，上文中使用的SPLA2是哺乳动物来源的蛋白质，特别地选自组IIA、IIF、III、V或X sPLA2，更特别地小鼠GX或人GV或人GX，或为原核生物来源例如细菌来源、植物来源或为其他来源包括例如动物的毒液，特别地选自节肢动物或蛇的毒液，更特别地选自蜜蜂属的种(Apis spp)、太攀蛇属的种(Oxyuranus spp)和大蒲蛇属的种 (Daboia spp.)的毒液的蛋白质，或其作为重组蛋白产生的同源蛋白。“哺乳动物来源”意指胎生的脊椎动物(哺乳动物)的种类。将哺乳动物分成2个亚类，原兽亚纲(ftOtotheria)和兽亚纲(Theria)，其包括胎生有袋类动物和有胎盘哺乳动物。大多数哺乳动物，包括6个最大的目，属于有胎盘哺乳动物组。3个最大的目按降序为啮齿目(Rodentia)(小鼠、大鼠和其他小型啮齿哺乳动物(gnawing Mammal))、翼手目(Chiroptera)(蝙蝠)和駒形目(Soricomorpha)(鼯鼠句 (shrews)、鼹科和沟齿句属)。紧接着的3个最大的目包括食肉目(Carnivor a)(狗、猫、鼬鼠、熊、海豹和其亲缘动物)、鲸偶蹄目(Cetartiodactyla)(包括偶蹄带蹄哺乳动物和鲸)和人类所属的灵长目(Primates)。“原核生物来源”意指缺乏细胞核(核)或任何其他膜结合的细胞器的一组生物。原核生物被分成两个域细菌和古细菌。植物来源的实例可见于(但不限于)Mansfeld J, UIbrich-HofmannR. (2007) Secretory phospholipase A2_alpha from Arabidopsisthaliana:functional parameters and substrate preference. ChemPhys Lipids. 150 :156-66 禾口 Fujikawa R, Fujikawa Y, Iijima N, Esaka M. (2005) Molecular cloning, expression, andcharacterization of secretory phospholipase A2 in tobacco. Lipids. 40 :901-8 中。在本说明书中，必须指出，术语“GX”和“GV”分别指来自组X和V的SPLA2。来自组I、II、V 和 X 的 sPLA2 定义于 Singer 等人 QnterfacialKinetic and Binding Properties of the Complete Set of Human andMouse Groups I, II, V, X, and XII Secreted Phospholipases A2,Journal of Biological Chemistry,第277卷，No. 50, Issue ofDecember 13，pp. 4853548549，2002)中。来自组III 的 sPLA2 定义于 Sato H, Kato R, Isogai Y, Saka G, Ohtsuki Μ, Taketomi Y,Yamamoto K,Tsutsumi K,Yamada J,MasudaS,Ishikawa Y,Ishii Τ,Kobayashi Τ, Ikeda K, Taguchi R, Hatakeyama S, Hara S, Kudo I, Itabe H, Murakami M. (2008) 禾口 Mounier CM, Wendum D, Greenspan E, Flejou JF, Rosenberg Dff, Lambeau G. (2008) Distinct expression pattern of the full setof secreted Phospholipases A2 in human colorectaladenocarcinomas :sPLA2-III as a biomarker candidate. Br J Cancer. 98 :587-95 中。对组III分泌型磷脂酶A2转基因小鼠的分析显示，该酶潜在参与血浆脂蛋白修饰、巨噬细胞泡沫细胞形成和动脉粥样硬化。J Biol Chem. 283 :33483-97。还可将上文中定义的各种来源的SPLA2的有活性的sPLA2同种型用于本发明。存在几种类型的动物毒液，特别地-神经毒素类，其作用于受害者的神经系统，引起兴奋(痉挛、呕吐、惊厥)或抑郁 (瘫痪、呼吸或心脏抑制或停止)，-血毒素类，其通常通过阻止或引起血液凝固或破坏红细胞或白细胞的酸或毒素破坏受害者的组织。毒液通常包含两种类型，但一种类型占优势。酶是动物毒液中的另一种重要成分。节肢动物是属于节肢动物门(Wiylum Arthropoda)的动物，包括昆虫、蜘蛛、甲壳类动物等。许多主要的动物种类包括有毒物种，包括各种昆虫、鱼、蜥蜴、蝎子、蛇和蜘蛛。蜜蜂属的种(Apis spp)是来自蜜蜂科(Apidae)的昆虫。太攀蛇属的种(Oxyuranus spp)是发现于澳大利亚的眼镜蛇科(Elapidae)的蛇。大蒲蛇属的种(Daboia spp.)是来自特别地发现于东南亚的蝰蛇科(Viperidae) 的蛇。在有利的实施方案中，上文中定义的SPLA2纯化自不同的生物。
在另一个优选实施方案中，使用未经纯化的SPLA2。与动物毒液来源的SPLA2相比较，来自哺乳动物、细菌或植物来源的SPLA2是优选的(用于增加受精)，但经修饰的动物毒液的sPLA2也可用于增加受精。在有利的实施方案中，由上文中定义的SPLA2水解的甘油-磷脂选自1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕榈酰基_2_油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(POPS)。上文中定义的甘油-磷脂为精子膜的组分，其比例在受试者之间可以不同。在另一个有利的实施方案中，上文中定义的SPLA2针对POPC的比活性为约1至约 25 μ mol/分钟/mg,特别地约5至约15 μ mol/分钟/mg,更特别地约5至约10 μ mol/分钟 /mg,特别地为约7 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPG的比活性为1至50 μ mol/分钟/mg，特别地约10至约 40 μ mol/分钟/mg,更特别地约25至约35 μ mol/分钟/mg,特别地为30 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPS的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约10至约40 μ mol/分钟/mg,更特别地约15至约25 μ mol/分钟/mg,特别地约20 μ mol/分钟/ mg。sPLA2 针对 POPG, POPS 和 POPC 的比活性可见于 Singer 等人(Interfacial Kinetic and Binding Properties of the Complete Setof Human and Mouse Groups I, II, V, X, and XII SecretedPhospholipases A2, Journal of Biological Chemistry,第 277 卷，No. 50，Issue of December 13，pp. 48535-48549，2002)中。在另一个有利的实施方案中，上文中定义的sPLA2以约0. 2nM至约200nM，优选约 0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM， 更优选约20nM至约200nM，特别地约200nM的浓度使用。如实施例5 (a和b)以及图2A和2C中显示的，在卵母细胞不存在的情况下，SPLA2 以极低的剂量例如0. 2nM(对于mGX)(图2B)在获能的和未获能的精子上触发AR。已实现AR的精子称为经顶体反应的精子。经顶体反应的精子从而不能参与受精过程，因为它们不能穿过透明带。精子获能是精子成熟(或活化)的过程；在没有获能的情况下，精子不能使卵子受 Ib ο因此，本发明的有利方面是从无效获能或根本没有获能的精子选择已有效获能或成熟的精子。低于0. 2nM, sPLA2 不再触发 AR。高于200nM，AR不再增加。必须指出，IOOnM浓度的sPLA2等于lmg/L的sPLA2。因此，本发明的另一个有利方面是SPLA2能够调节精子生理学的关键事件。还必需指出的是，如实施例3中所描述的，内源mGX在AR过程中也被精子释放。因此，在其中mGX用于触发AR，从而调节受精的情况下，上文中定义的浓度相应于内源mGX和外源mGX。内源mGX浓度低于0. InM，这意味着在更高的浓度例如上文中引述的浓度下，内源浓度与所使用的外源SPLA2相比较是不显著的。
浓度0. 2nM表示低于50%的内源sPLA2和高于50%的外源sPLA2。在有利的实施方案中，上文中以0. 2nM至低于2nM的浓度使用的sPLA2由内源 sPLA2和外源sPLA2组成。在有利的实施方案中，上文中以2nM至200nM的浓度使用的sPLA2由外源sPLA2 组成，内源sPLA2的量无足轻重。在有利的实施方案中，本发明涉及上文中定义的SPLA2的用途，其中所述受精，特别是体外卵母细胞受精，得到增加，产率高于40%。对于获自OFl雄性的精子，在第M小时获得的2细胞胚胎期的比率是剂量依赖性的并且从45% (对于对照精子)增加至65% (对于以200nM mGX处理的精子)。实施例8和图5A显示利用OFl小鼠品系(无生育力问题的品系)获得的关于IVF 的结果。对于获自C57B1/6小鼠(已知具有生育力问题的小鼠品系)的精子，在第M小时获得的2细胞胚胎期的比率是剂量依赖性的并且从8. 2% (对于对照精子)增加至19.9% (对于用200nM的mGX处理的精子)。因此，在C57B1/6品系中，对于mGX处理的精子，与未处理的精子相比较，受精率(评定为在第M小时获得的2细胞胎的比率)增加142%。因此，通过使用本发明的SPLA2，在两个不同的品系中，不仅精子的成熟得到改善， 而且受精和有活力的胚胎发生也得到改善。在有利的实施方案中，本发明涉及分泌型磷脂酶和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其中所述至少一种代谢产物选自脂肪酸或溶血磷脂，特别地选自花生四烯酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、sapienic acid、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油或溶血磷脂酸。在有利的实施方案中，本发明涉及分泌型磷脂酶和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其中所述代谢产物为花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱。在有利的实施方案中，本发明涉及由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途， 其中所述代谢产物为花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱。在有利的实施方案中，本发明涉及分泌型磷脂酶和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其中所述代谢产物的浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约 50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ Μ。在有利的实施方案中，本发明涉及上文中定义的易于阻止所述受精的分泌型磷脂酶A2(sPLA2)用于制造避孕药的用途。关于表述“阻止受精”，其应当理解为受精的不存在。“避孕药”意指导致受精不存在的药物。在有利的实施方案中，上文中定义的SPLA2呈现下列性质水解一种或多种甘油-磷脂的sn-2酯，且对阴离子型和两性离子型磷脂的比活性高于约25 μ mol/分钟/mg， 特别地高于约50 μ mol/分钟/mg。因此，在该实施方案中，SPLA2的比活性必须与针对增加受精所描述的比活性不同，从而所使用的sPLA2阻止哺乳动物的受精。优选，在本发明中，“高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于约50 μ mol/分钟/ mg的SPLA2的比活性”是针对1、2、3、4或5种甘油-磷脂的，更优选是针对1、2或3种甘油-磷脂的。特别地，“高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于约50 μ mol/分钟/mg的sPLA2的比活性”是针对1种甘油-磷脂的。更特别地，“高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于约50 μ mol/分钟/mg的sPLA2 的比活性”是针对2种甘油-磷脂的。在该实施方案中，SPLA2的比活性可以对于第一甘油-磷脂高于约50 μ mol/分钟 /mg,并且对于第二甘油-磷脂高于约25 μ mol/分钟/mg，但其还可以针对两种甘油-磷脂都高于约25 μ mol/分钟/mg，或对于两种甘油-磷脂都高于约50 μ mol/分钟/mg。特别地，“高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于约50 μ mol/分钟/mg的sPLA2的比活性”是针对3种甘油-磷脂的。在该实施方案中，SPLA2的比活性可以为-针对3种甘油-磷脂，都高于约50μ mol/分钟/mg，或-针对第一甘油-磷脂高于约50μ mol/分钟/mg并且针对其他两种甘油-磷脂高于25 μ mol/分钟/mg,或-针对2种甘油-磷脂高于约50μ mol/分钟/mg，并且对于第3甘油-磷脂高于约25 μ mol/分钟/mg或，其也可以针对3种甘油-磷脂，都高于25 μ mol/分钟/mg。必须指出，在其中用于获得增加的受精的一种sPLA2针对甘油-磷脂的比活性为约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg的情况下，用于阻止受精所需的sPLA2针对相同甘油-磷脂的比活性必须高于约25 μ mol/分钟/mg。在其中用于获得增加的受精的针对甘油-磷脂的比活性为约1 μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/分钟/mg的情况下，用于阻止受精所需的针对相同甘油-磷脂的比活性必须高于约50 μ mol/分钟/mg。在有利的实施方案中，由上文中定义的SPLA2水解的甘油-磷脂选自1_棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕榈酰基_2_油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(POPS)。在有利的实施方案中，SPLA2针对POPC的比活性高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于或等于30 μ mol/分钟/mg。与sPLA2针对POPG和/或POPS的比活性相比较，sPLA2针对POPC的比活性对于阻止所述受精而言是最重要的。例如，具有下列比活性(如Rouault等人2006BiOChemiStry 2006，45，5800 中测定的)P0PC :59 μ M/分钟/mg，POPG :471 μ M/分钟/mg 禾口 POPS :23 μ M/ 分钟/mg 的毒性盾尖吻蛇(taipan)重组 sPLA2 0S2 (如“Lambeau G, Barhanin J, Schweitz H, Qar J, Lazdunski Μ. (1989)Identification and properties of very high affinity brainmembrane-binding sites for a neurotoxic phospholipase from thetaipan venom. J Biol Chem. 264 :11503-10中描述的)减少有活力的2细胞胚胎的数目，同时增加死亡胚胎的数目(如图6中所显示的)。在有利的实施方案中，上文中定义的SPLA2针对POPC的比活性高于约25 μ mol/ 分钟/mg，特别地30 μ mol/分钟/mg，和/或SPLA2针对POPG的比活性高于约50 μ mol/分钟/mg，特别地高于
15250ymol/^vlt/mg,和/或SPLA2针对POPS的比活性高于约50 μ mo 1/分钟/mg，特别地高于在另一个优选实施方案中，以约0. 2nM至约200nM，优选约0. 2nM至约20nM，更优选0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM，更优选约20nM至约200nM， 特别地约200nM的浓度使用上文中定义的sPLA2。在有利的实施方案中，用于阻止受精的SPLA2是动物毒液来源(特别地选自节肢动物或蛇的毒液，更特别地蜜蜂属的种(Apis spp)、太攀蛇属的种(Oxyuranus spp)和大蒲蛇属的种(Daboia spp.)的毒液)的sPLA2，或其作为重组蛋白质产生的同源蛋白质。在另一个方面，本发明涉及包含与药学上可接受的媒介物结合的上文中定义的 sPLA2 (作为活性物质)的药物组合物。在该实施方案中，取决于SPLA2的剂量，药物组合物能够增加或减少(或阻止)受
ρ； Ib ο药物组合物可以以多种盖仑制剂的形式，特别地以固体形式例如粉剂，或半固体形式例如乳膏剂或凝胶，或液体形式例如洗剂或溶液存在。药物组合物可以以粉剂形式或溶液形式体外施用至其中进行精子的受精、获能或分选的介质以增加受精，或以阴道胶冻剂(凝胶)、膜、海绵或泡沫形式体外施用以减少受 Ib ο为了促进受精的用途，可以以约0. 2μ g/ml至约20μ g/ml，优选约0. 2μ g/ml至约 10 μ g/ml，更优选约1 μ g/ml至约5 μ g/ml，特别地2 μ g/ml的精子温育介质使用易于增加所述受精的sPLA2 (例如mGX)。对于避孕的用途，可以以约0. 5 μ g/ml至约50μ g/ml，优选约0. 5 μ g/ml至约 20 μ g/ml，更优选约1 μ g/ml至约10 μ g/ml，特别地5 μ g/ml的阴道凝胶剂或泡沫使用易于减少所述受精的sPLA2 (例如0S2)。在有利的实施方案中，本发明涉及上文中定义的药物组合物的用途，其中所述 sPLA2是纯化的哺乳动物来源的蛋白质，特别地选自组IIA、IIF、III、V或X sPLA2,更特别地小鼠GX或人GV或人GX，或是原核生物来源例如细菌来源、植物来源或其他来源(包括例如动物的毒液，特别地选自节肢动物或蛇的毒液，更特别地蜜蜂属的种(Apisspp)、太攀蛇属的种(Oxyuranus spp)和大蒲蛇属的种(Daboia spp.)的毒液)的蛋白质，或其作为重组蛋白质产生的同源蛋白质。在另一个方面，本发明涉及上文中定义的SPLA2，其用于治疗不育症或用于促进或改善受精或用于在辅助繁殖技术(ART)过程中促进或改善哺乳动物，特别是经历体外受精(IVF)、配子输卵管内植入法(GIFT)、精子卵浆内注射法(ICSI)或治疗性供者人工授精 (TDI)的雌性哺乳动物的有活力的胚胎发生。在另一个方面，本发明涉及上文中定义的SPLA2，其用于哺乳动物的避孕。在另一个方面，本发明涉及体外选择精子的方法，其包括下列步骤a.用0. 5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为100万个细胞/ml的精子以获得获能的精子，b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与具有上文中定义的比活性的sPLA2 (浓度为约0. 2nM至约200nM，优选约0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM，更优选约20nM至约200nM，特别地为约200nM) 和/或上文中定义的sPLA的代谢产物(浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约 50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ Μ) 一起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.在洗涤和离心后分离未经顶体反应的精子并且弃去经顶体反应的精子。步骤a.是使精子获能所必需的。必须使用具有约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约1 μ mol/分钟/mg至约 25 μ mol/分钟/mg的针对一种或多种甘油-磷脂的比活性的sPLA2进行步骤b中的温育。获能的精子与SPLA2 —起的温育时间可为约0. 1分钟至约2小时，优选约1分钟至约1小时，优选约1分钟至约30分钟，更优选约5至约15分钟，特别地约10分钟。10分钟相应于允许获得最大顶体反应的动力学参数。高于2小时，DNA将被片段化，从而具有缺陷。低于0. 1分钟，温育时间太短以至不能触发顶体反应。获能的精子与sPLA的代谢产物一起的温育时间可为约0. 1分钟至约2小时，优选约1分钟至约1小时，优选约15分钟至约1小时，更优选约30至约45分钟，特别地为约45分钟。45分钟的时间相应于允许获得最大顶体反应的动力学参数。获能的精子与SPLA2和sPLA的代谢产物一起的温育时间可为约0. 1分钟至约2小时，更优选约1分钟至约1小时，更优选约15分钟至约1小时，更优选约30至约45分钟， 特别地为约45分钟。当将精子与卵母细胞混合(对应于受精过程)(图7)时，也可引入SPLA2代谢产物。SPLA2代谢产物存在于受精介质中，直至第一次精子洗涤G小时)。在步骤b开始时，即在精子获能后且在与SPLA2和/或sPLA的代谢产物一起温育之前，获能的精子包括质量有效的精子与质量有缺陷的精子(特别地具有片段化的DNA和改变的质膜脂质组成)的混合物。已观察到，当精子DNA的质量很低时，精子膜中的磷脂特别是POPS增加，因此可通过温育步骤除去所述磷脂，从而导致提高的精子质量。步骤c.消除有缺陷的经顶体反应的精子，导致获得具有高质量的浓缩精子。本发明的另一个有利方面是，所述混合物与SPLA2的温育引起有缺陷的精子水解，从而导致有效精子的选择，所述有效精子可特别地进一步用于ART，以提高受精率、有活力的胚胎比率，从而减少出生缺陷的风险。在另一个方面，本发明涉及体外受精的方法，其包括下列步骤a.用0. 5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为100万个细胞/ml的精子，以获得获能的精子，b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与具有如上定义的比活性的 sPLA2 (浓度为约0. 2nM至约200nM，优选约0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约 2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM，更优选约20nM至约200nM，特别地为约200nM)和 /或如上定义的sPLA的代谢产物(浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约50 μ Μ,更优选约ΙμΜ至约10 μ Μ，特别地为约10 μ Μ) —起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.在洗涤和离心后，以50000/ml的浓度将所述未经顶体反应的精子与先前收集的20至100个卵母细胞接触。步骤a和b与上文中定义的导致改善成熟精子的方法相似。步骤c在于将成熟的且未经顶体反应的精子与卵母细胞接触，从而以更好的比率和改善的胚胎发生进行受精。因此，本发明可治疗男性不育症。事实上，在雄性不育的情况下，精子的处理导致有效精子的选择，从而可能使处理的精子富集有成熟的精子，所述成熟的精子可引入雌性人生物以进行受精和胚胎发生或与先前收集的卵母细胞接触以进行体外受精和胚胎发生，从而获得有活力且健康的胚胎。在有利的实施方案中，上文中定义的方法增加受精率。获能的精子与SPLA2和/或sPLA的代谢产物的温育允许弃去大部分有缺陷的精子，从而提高受精率，和从而增加在受精步骤后获得的有活力且健康的胚胎的数目。在另一个方面，本发明涉及预测哺乳动物的生育力的方法，其包括下列步骤a.用0. 5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为100万个细胞/ml的精子以获得获能的精子。b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与具有上文中定义的比活性的 sPLA2 (浓度为约0. 2nM至约200nM，优选约0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM，更优选约20nM至约200nM，特别地为约200nM 的浓度)和/或如上定义的sPLA的代谢产物(浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M 至约50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ M的浓度)一起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.测定经顶体反应的精子的量，并且将其与用对照哺乳动物获得的经顶体反应的精子的量相比较，d.如果步骤C.中测定的经顶体反应的精子的量高于用所述对照哺乳动物获得的量，那么预测该哺乳动物是不育的。步骤a和b与上文中定义的方法相似。如已论述的，获能的精子包括质量有效的精子和质量有缺陷的精子(其特别地具有片段化的DNA和改变的质膜脂质组成)的混合物。因此，在其中哺乳动物是不育的情况下，有缺陷的精子的水平高于对照，从而用易于增加所述受精的sPLA2和/或sPLA的代谢产物处理精子，导致与对照相比，更大量的经顶体反应的精子。在另一个方面，本发明涉及避孕的方法，包括将哺乳动物的精子与具有如上定义的比活性的sPLA2接触的步骤。比活性与上文中针对受精定义的相同。可以例如通过含有SPLA2的凝胶、膜，泡沫或海绵的阴道施用来进行避孕。附图概述

图1显示，mGX在顶体反应过程中被释放，从而定位在精子的顶体中
18
A.在不同的获能时间(第0、45和90分钟)上，以及在获能的最后30分钟期间存在钙离子载体A23187的情况下在第90分钟，在含有2%牛血清白蛋白(BSA)的获能介质中用时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)测量mGX。A23187在获能介质中使mGX水平增加2倍。χ-轴相应于获能的时间(从左柱至右柱，第0、45和90分钟以及在A23187存在的情况下第90分钟)。y-轴相应于mGX浓度(ng)。B.使用放射性标记的大肠杆菌膜作为底物，测量SPLA2活性。在可变的获能持续时间后将精子经历离心，并且在第0、45和90分钟以及在获能的最后30分钟期间存在钙离子载体A23187的情况下在第90分钟测量精子沉淀物和上清液中的sPLA2活性。χ-轴表示获能的时间0、45、90分钟、90分钟+在最后30分钟期间的A23187 (针对上清液的前4个黑色柱)0,45,90分钟、90分钟+在最后30分钟期间的A23187 (针对沉淀的后4个黑色柱)；y-轴表示DPM中的总活性。图2显示，SPLA2为顶体反应的有效激活剂A.属于3个不同组(组IIA、组V和组X)的3种不同的sPLA2触发顶体反应。将精子与200nM sPLA2 —起温育10分钟，随后固定，用考马斯蓝染色。每张载玻片计数至少 200个精子。χ-轴从左柱至右柱表示对照、mGIIA、mGV、mGX。y_轴表示经顶体反应(AR)的精子的百分比。B. SPLA2-激活的顶体反应的剂量-反应曲线。mGIIA( ·)和mGX(〇)sPLA2。将数据表示为sPLA2-诱导的顶体反应(在从总AR减去自发AR后获得的)的百分比(作为范围为0. 2nM至500nM的sPLA2浓度的函数)。mGX是AR的高度有效的激活剂，因为低至 0. 2nM的剂量诱导15%的AR。χ-轴表示 sPLA2 浓度(nM)。y-轴表示获得的高于自发AR的经顶体反应(AR)的精子的百分比。C. mGX能够触发非获能的精子(10分钟)和获能的精子(55和90分钟)的顶体反应。将精子与2% BSA—起在5% CO2室中于37°C下温育。在获能的第10、55和90分钟上，将sPLA2触发的顶体反应与自发顶体反应相比较。χ-轴从左至右表示第1柱在mGX不存在的情况下温育10分钟的非获能的精子。第2柱与mGX —起温育10分钟的非获能的精子。第3柱在mGX不存在的情况下温育55分钟的获能的精子。第4柱与mGX —起温育55分钟的获能的精子。第5柱在mGX不存在的情况下温育90分钟的获能的精子。第6柱与mGX —起温育90分钟的获能的精子。y_轴表示经顶体反应(AR)的精子的百分比。图3显示，mGX的酶促活性是触发顶体反应所必需的。
A. mGX的催化位点的突变(H48Q)消除了其触发精子顶体反应的能力(□)。与对照mGX ( ·)相比较，ftO-mGX (mGX的无活性酶原)也不能触发精子的顶体反应(Δ )。χ-轴表示sPLA2的浓度(ηΜ)。y-轴表示由SPLA2诱导的AR的％。B.特异性sPLA2抑制剂LY329722阻断mGX触发顶体反应的能力。与mGX抑制剂 LY329722—起短暂温育10分钟的获能的精子的AR比率(左边白色柱)与未处理的精子的 AR比率(黑色柱)相似，这显示LY329722本身不改变AR。在另一方面1 μ M Ly329722阻断由200nM mGX诱导的AR (右边白色柱对灰色柱)。χ-轴从左柱至右柱表示黑色柱未处理的精子。白色柱精子+LY329722。灰色柱精子+mGX (200nM)。白色柱精子 +mGX QOOnM)+LY329722。y-轴表示经顶体反应的精子的％。C.除去外部钙(n = 3)或在浴液中加入2mM Ni2+(η = 3)阻断mGX触发顶体反应的能力。 χ-轴从左柱至右柱表示黑色柱未处理的精子。灰色柱精子+mGX (200nM)左边白色柱精子+mGX QOOnM)，无Ca++。右边白色柱精子+mGX QOOnM)，具有2mM Ni2+.y-轴表示经顶体反应的精子的％。图4显示在受精后第M小时卵母细胞到达的不同时期的照片(从左至右)-“未受精的卵”(UF)相应于具有一个极体的卵母细胞-“两细胞胚胎”相应胚胎的正常发育-“死亡的胚胎”相应于呈现2个极体但无细胞分裂的或呈现多次且不受控制的分裂的卵母细胞。图5显示，外源mGX促进精子的受精，从而允许更好的胚胎发育。A.用来自OFl雄性的精子(黑色柱，η = 13)和用200nM mGX处理的精子(白色柱，η = 13)实现的IVF的产率。在与卵母细胞混合之前，使精子在M16-2% BSA中获能35 分钟。在第35分钟，将精细胞与对照介质或200nM mGX于M16培养基中温育10分钟。对于每一个实验(η = 13个不同的雄性)，所使用的卵母细胞的数目为20至58个卵母细胞。χ-轴从左至右的柱组表示第一组未受精的(UF)精子(黑色柱)、用mGX QOOnM)处理的精子(白色柱)。第二组2细胞胚胎精子(黑色柱)、用mGX QOOnM)处理的精子(白色柱)。第三组死亡的胚胎精子(黑色柱)、用mGX QOOnM)处理的精子(白色柱)。
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y_轴表示到达相应时期的卵母细胞的％。B. mGX的外源效应被sPLA2抑制剂LY329722阻断。用来自OFl雄性的精子(黑色柱，η = 6)、用1 μ M sPLA2抑制剂LY 329722处理的精子(深灰色柱)、用200nM mGX处理的精子(浅灰色柱)和用与1 μ MLY329722预温育的200nM mGX处理的精子(白色柱)获得的IVF的产率。对于每一个实验(n = 6个不同的雄性)，所使用的卵母细胞的数目为20 至58个卵母细胞。χ-轴从左至右的柱组表示第一组未受精的(UF)精子(黑色柱)、用LY329722 (1 μ M)处理的精子(深灰色柱)、用 mGX(200nM)处理的精子(浅灰色柱)以及用LY329722 (1 μ M)和mGXQOOnM)的混合物处理的精子(白色柱)。第二组2细胞胚胎精子(黑色柱)、用LY329722(lyM)处理的精子(深灰色柱)、用 mGX(200nM)处理的精子(浅灰色柱)以及用LY329722 (1 μ Μ)和mGXQOOnM)的混合物处理的精子(白色柱)。第三组死亡的胚胎精子(黑色柱)、用LY329722(lyM)处理的精子(深灰色柱)、用 mGX(200nM)处理的精子(浅灰色柱)以及用LY329722 (1 μ M)和mGXQOOnM)的混合物处理的精子(白色柱)。y_轴表示到达相应时期的卵母细胞的％。在与卵母细胞混合之前，使精子在M16_2% BSA中获能35分钟。在第35分钟， 将精细胞与对照介质或200nM mGX于M16培养基中一起温育10分钟。处理后，通过离心和洗涤除去药物，以除去未结合的药物和在SPLA2温育过程中产生的脂质代谢产物。对照精子在获能的第35分钟经历相同的洗涤方案。在洗涤药物后，剩余的药物浓度估计为InM。为了确认该浓度的sPLA2对精子-卵母细胞的融合不诱导人为效应(Riffo， Μ. S.禾口 Μ· Parraga. 1997. Role of phospholipase A2in Mammalian sperm-egg fusion development of hamster oolemmafusibility by lysophosphatidylcholine.J. Exp. Zool. 279 :81-88),我们进行对照IVF实验，其中将精子和卵母细胞与InM mGX —起温育未观察到差异(数据未显示)。图6显示，盾尖吻蛇毒性sPLA2 0S2抑制IVF。用来自OFl雄性的精子(黑色柱)、用20nM 0S2处理的精子(灰色柱)、用200nM 0S2处理的精子(白色柱)实现的IVF的产率。对于每一个实验(n = 8个不同的雄性)， 所使用的卵母细胞的数目为20至60个卵母细胞。χ-轴从左至右的柱组表示第一组未受精的(UF)精子(黑色柱)、用0S2(20nM)处理的精子(灰色柱)、用 0S2(200nM)处理的精子(白色柱)。第二组1期(一个细胞或受精的细胞)精子(黑色柱)、用0S2(20nM)处理的精子(灰色柱)、用0S2 (200nM)处理的精子(白色柱)。第三组2细胞胚胎精子(黑色柱)、用0S2 (20nM)处理的精子(灰色柱)、用0S2 (200nM) 处理的精子(白色柱)。第四组死亡胚胎精子(黑色柱)、用0S2(20nM)处理的精子(灰色柱)、用0S2 QOOnM) 处理的精子(白色柱)。y_轴表示到达相应时期的卵母细胞的％。图7显示通过使用sPLA2 (mGX)或花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱产生的受精的改
業
口 ο200nM的sPLA2或10 μ M浓度的其代谢产物改善受精的结果。在45分钟的获能过程中或在配子混合后在4小时的受精过程中，引入花生四烯酸(AA)和溶血磷脂酰胆碱 (LPC，来自卵子)。X-轴从左至右对照、mGX(200nM) ,LPC-AA(10 μ Μ)(在获能过程中)、LPC_AA(在受精过程中)。Y-轴受精后第M小时2细胞胚胎的百分比。图8显示在用LY329722阻断内源mGX sPLA2后用1 μ M的溶血磷脂酰胆碱LPC拯
救受精。用特异性SPLA2抑制剂(LY329722)阻断在获能期间发生的自发顶体反应过程中释放的内源mGX sPLA2减少了受精结果。该减少通过在获能过程中加入浓度为1 μ M的LPC 得到拯救。X-轴从左至右对照、LY329722 (2 μ Μ), LY329722 (2 μ Μ) +LPC(IyM)(在获能过程中).Y-轴在受精后第M小时2细胞胚胎的百分比实施例实施例1 顶体反应测定使来自附睾尾的精细胞在Μ2培养基中游泳，进行10分钟。随后，必要时，将精子与不同的sPLA2 —起在Μ16培养基中于37°C下温育10分钟。将细胞转移入PBS溶液中，随后用 4% PFA溶液固定2分钟。用IOOmM乙酸铵洗涤精子2分钟，将其湿润地置于(wet-mounted) 载玻片上，并且使其风干。然后用水漂洗载玻片，用考马斯蓝(0. 22%)染色2分钟，最后用水漂洗。立即计数载玻片，给至少150个精细胞评分。实施例2 电子显微镜在室温下用2.5%的在0. IM 二甲基胂酸盐缓冲液pH 7. 4中的戊二醛固定精细胞2小时。随后用缓冲液洗涤细胞，在4°C下用的在相同缓冲液中的四氧化锇进行后固定1小时。在用水充分洗涤后，在4°C下用0. 5%醋酸双氧铀(uranile acetate)pH 4 染色细胞过夜。随后通过梯度酒精(30% -60% -90% -100% -100% -100% )使细胞脱水，用1/1印on/醇100%的混合物渗透1小时，之后在3小时的过程中进行数次新鲜 epon (Flukka)浸浴。最后，离心细胞，将其浸入新鲜Epon中，在60°C下聚合3天。用超薄
22切片机(Leica)切取细胞沉淀物的超薄切片。用4%的醋酸双氧铀和的柠檬酸铅对切片进行后染色，然后在80kV下于电子显微镜(JEOL 1200EX)中进行观察。结果sPLA2诱导形态学上正常的顶体反应用电子显微镜(EM)确认SPLA2诱导形态学上正常的顶体反应是重要的。籍以评估顶体反应是正常的形态学标准相对有限第一，外顶体膜应当呈现囊泡化，第二，质膜应当与外顶体膜融合并且在顶体的基部呈现特征性双发夹形状(Green，D. P. (1978) The induction ofthe acrosome reaction in guinea-pig sperm by the divalent metalcation ionophore A23187. J. Cell Sci. , 32 137-51. :137-151)。对于这些实验，使用未获能的精子以减少自发AR的贡献，使用200nM sPLA2以获得最大的sPLA2-诱导的AR。将精子与mGX sPLA2或钙离子载体A23187 —起温育10分钟， 然后固定。在A23187存在的情况下，如上文中描述的，根据3个形态学标准，所有经顶体反应的精子呈现完全的AR。在sPLA2存在的情况下，观察到AR的极早期如顶体基质的空腔化。基于形态学标准，具有完全SPLA2-诱导的AR的精子也被评估为正常的。该结果表明，SPLA2-诱导的AR呈现正常的形态学特征但具有比利用钙离子载体 A23187观察到的动力学更慢的动力学。实施例3 精细胞中mGX SPLA2的检测使来自4个mGX SPLA2小鼠的附睾尾的精细胞在37°C于2. 5ml M2培养基中游泳 15分钟。随后将500 μ 1精细胞的等分在4.5ml M16培养基(含有2 %无脂肪酸的BSA) 中进行稀释，在37°C下再温育0、45和90分钟。在一些测定中，在温育的前60分钟后加入 A23187 Ca2+离子载体(5 μ M)，随后将精细胞再温育30分钟。在温育后，以1，200rpm离心沉降精细胞8分钟，将上清液和细胞沉淀于液氮中快速冷冻，于-80°C下贮存。在粗制细胞上清液和细胞沉淀(在重悬浮于500 μ 1含有蛋白酶抑制剂混合物(完全抑制剂组， Roche Biochemicals)的Μ16培养基中并且用Branson 350Sonifier细胞破碎器裂解后) 中分析mGXsPLA2蛋白表达和酶促活性。如所描述的(具有较小的改进)(Eerola，L. I.， Surrel, F. , Nevalainen, T. J. , Gelb, M. H. , Lambeau, G.禾口 Laine, V. J. (2006) Analysis of expression of secretedphospholipases A2 in mouse tissues at protein and mRNA levels. Biochim. Biophys. Acta.，1761 :745-756)，进行 mGX sPLA2 的时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)。简而言之，将1至5μ 1蛋白质样品稀释在100 μ 1的Delfia测定缓冲液 (Tris-HCl 缓冲的 NaCl 溶液，ρΗ 7. 8，含有 NaN3、BSA、牛 γ 球蛋白、Tween 40、DTPA 和惰性红色染料，PerkinElmer ffallac, Turku, Finland)中，加入至 mGX sPLA2 IgG-包被的微量滴定孔(先前已用 TR-FIA 洗涤液(IOmM Tris-HCl, ρΗ 7. 8，含有 0. 9% NaCUO. 04% NaN3 和0. 02% Tween 20)洗涤2次)中。在200转/分钟的恒定振荡的条件下在室温下温育 30分钟后，用TR-FIA洗涤液洗涤孔4次，用100 μ 1 Eu-标记的mGX IgG示踪剂(0. 5 μ g/ ml，稀释于Delfia测定缓冲液中)温育，然后如上再洗涤4次。洗涤后，向孔中加入100 μ 1 Delfia增强液(enhancement solution)，在室温下在200转/分钟的振荡条件下温育5 分钟，然后在不振荡的条件下温育10分钟。使用Wallac Envision Perkin Elmer板读数器和用于DELFIA测定的最优化的光学组件测量时间分辨荧光。使用放射性标记的大肠杆菌膜作为底物，测量 sPLA2 的酶促活性(Rouault, M.，LeCalvez, C.，Boilard, E.，Surrel,
23F., Singer, A. , Ghomashchi, F. , Bezzine, S. , Scarzello, S. , Bollinger, J. , Gelb, Μ. H.禾口 Lambeau,G. (2007)Recombinant production and properties of binding of thefull set of mouse secreted Phospholipases A2 to the mouse M-typereceptor. Biochemistry., 46 :1647-1662)。简而言之，将5至50 μ 1细胞裂解物或上清液在300 μ 1 sPLA2活性缓冲液(0. IM Tris pH8. O, IOmM CaCl2 和 0. 1 % 牛血清白蛋白，含有 100，OOODPM 的[3H]油酸盐-放射性标记的大肠杆菌膜)中温育60分钟。通过加入300 μ 1终止缓冲液(0. IM EDTA PH 8.0和0. 的不合脂肪酸的牛血清白蛋白)终止反应；以10，OOOg离心混合物5分钟， 计数含有释放的[3H]油酸盐的上清液。结果将时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)用于研究该酶在成熟精细胞中的存在。该技术是高度灵敏的并且允许消除非特异性内源荧光。我们定量了 mGX在未获能和获能的精子中以及在上清培养基中的存在。图IA显示，特定mGX荧光在获能过程中在上清培养基中增加。在钙离子载体Α23187 (AR的强诱导物)存在的情况下，特定荧光的水平加倍。同时，活性在精细胞中降低。我们在获能过程中还测量了精细胞中和周围温育介质(上清液)中的总sPLA2酶促活性(图1Β)。我们发现，在上清液中sPLA2的酶促活性以与通过TRFIA测量的mGX特异性荧光相似的方式升高。这些结果显示，mGX是细胞机器的活性组分并且在顶体反应过程中被释放在上清液培养基中。实施例4 重组SPLA2的产生如先前所描述的(Rouault, M. ，Le Calvez, C. ，Boilard, E. ，Surrel, F. ，Singer, A. , Ghomashchi, F. , Bezzine, S. , Scarzello, S. , Bollinger, J. , Gelb, Μ. H 禾口 Lambeau,
G.(2007)Recombinantproduction and properties of binding of the full set of mousesecreted phospholipase A2 to the mouse M—type receptor. Biochemistry. ,46 1647-1662)产生重组小鼠sPLA2组IIA、IID、IIE、V和X以及H48Q突变型mGX sPLA2。如对于成熟mGX sPLA2那样，使用pAB3载体产生I^ro-mGX sPLA2，在所述载体中符合读框地插入编码ftx)-mGX的全长cDNA与AGST蛋白和因子)(a切割位点(其可通过使用因子)(a 蛋白酶从 Pro-mGX sPLA2 除去)(Rouault，Μ.，Le Calvez, C.，Boilard, Ε.，Surrel, F.， Singer, Α. , Ghomashchi, F. , Bezzine, S. , Scarzello, S. , Bollinger, J. , Gelb, Μ. H.禾口 Lambeau,G. (2007)Recombinant production and properties of binding of the fullset of mouse secreted phospholipase A2 to the mouse M-typereceptor. Biochemistry., 46 :1647-1662)。实施例5 :sPLA2对顶体反应的效应已评估了 sPLA2对顶体反应(AR)的效应。这一点特别重要，因为内源PLA2在AR 过程中的作用存在几个争议(参见Roldan，E. R.和Q. X. Shi. 2007. Sperm phospholipases and acrosomal exocytosis. Front Biosci. 12 :89-104. :89-104 综述的禾口弓|言)。然而，至Ij 目前为止，未曾测试过不同哺乳动物SPLA2触发AR(当在培养基中加入时)的能力。已测试了已知存在于包围精细胞的生物学液体中的几种SPLA2。a) sPLA2能够在未获能的精子上触发AR。mGIIA和mGX以及mGV(以较低的程度)能够在未获能的精子上触发AR(图2A)。AR的比率从20% (相应于自发经顶体反应的精子)增加至60% (在200nM活性sPLA2存在的情况下)。为了更好地表征此类化合物触发AR的潜能，产生mGX和mGIIA的剂量-反应曲线(图2B)。已将AR的“触发率”(相应于扣除自发AR的总比率)作图。mGXsPLA2是高度有效的AR激活剂，因为低至0. 2nM的浓度诱导高于AR的基础自发水平的约20%的AR。mGIIA 也是非常有效的AR激活剂，因为2nM的酶诱导约20%的AR。从而mGIIA和mGX sPLA2能够在未获能的精子上诱导AR。重要地，应注意，将sPLA2浓度从20nM增加至200nM不显著增加经顶体反应的精子的比率。一小部分精子似乎抗拒sPLA2-诱导的AR(图2B)。b) SPLA2也能够在获能的精子上触发AR。使精子在37°C、5% CO2培养箱中在2%的于M16培养基中的BSA中获能。在第45 分钟和第80分钟，将200nM mGX引入获能介质中并且在10分钟后固定精子。将在sPLA2 存在的情况下观察到的经顶体反应的精子的比率与在获能介质中获能阳或90分钟的对照精子相比较(图2C)。在SPLA2存在的情况下，与对照条件相比较，在所有获能持续时间下， 经顶体反应的精子的总比率增加。此外，自发AR与总比率之间的差异(相应于SPLA2-诱导的部分)在整个获能进程中大致稳定在第10、55和90分钟分别为约39%、约36%和约 35%。重要地注意到，约20%的一小部分精子抗拒自发AR或sPLA2-诱导的AR (即使在高水平自发AR存在的情况下)。实施例6 :sPLA2的作用模式的确定必需确定SPLA2的哪个作用模式(酶促或通过受体的激活)参与sPLA2_诱导的 AR0首先，测试突变的mGX (置换酶口袋中的一个氨基酸，H48Q)。图3显示，突变的mGX不能触发未获能的精子的AR(图3A)。随后测试ftO-mGX，无活性的前体分子。在200nM的浓度上，pro-mGX也不能在未获能的精子上触发AR (图3A)。特异性sPLA2抑制剂LY329722在1 μ M的剂量上阻断mGX触发顶体反应的能力 (图 3 。这些结果表明，酶促活性在SPLA2诱导的AR中起着关键作用。sPLA2是钙依赖性酶，并且在钙不存在的情况下(Lambeau和Gelb，2008) 或在抑制性二价阳离子如Ni2+存在的情况下(Yu，B. Ζ.，J. Rogers, G. R. Nicol， K. H. Theopold, K. Seshadri, S. Vishweshwara 禾口 Μ· K. Jain. 1998. Catalytic significance of the specificity ofdivalent cations as KS*and kcat^cofactors for secretedphospholipase A2. Biochemistry. 37:12576-12587)完全失活。从精子培养基中除去钙，与在培养基中具有2mM Ca2+的对照实验相反，以200nM温育10分钟的SPLA2不能诱导AR(图3C)。在培养基中存在2mM Ni2+的情况下获得相同的结果(图3C)。数十年来，已知SPLA2的下游激活获得的代谢产物(其为溶血磷脂和不饱和脂肪酸)激活 AR(Meizel,S.禾口 K. 0. Turner. 1983. Stimulation of an exocytotic event, the hamster sperm acrosomereaction, by cis—unsaturated fatty acids. FEBS Lett.161 315-318 ;Fleming,A. D.禾口R. Yanagimachi. 1984. Evidencesuggesting the importance of fatty acids and the fatty acidmoieties of sperm membrane phospholipids in theacrosomereaction of guinea pig spermatozoa. J. Exp. Zool. 229 :485-489)。根据进行的研究可知，由sPLA2的代谢产物诱导的AR需要i)对于溶血磷脂和不饱和脂肪酸，分别1或 4小时的温育，ii)约100 μ M的非常高的代谢产物浓度，iii)对于脂肪酸的活化，获能的精子。因为亚纳摩尔浓度的mGX在10分钟的温育中促进AR，所以我们在与先前测试不同的并且更接近SPLA2实验的条件下重新测试溶血磷脂和不饱和脂肪酸在获能过程中45 分钟期间或在配子混合后4小时将精子与约10 μ M的更低浓度的溶血磷脂和不饱和脂肪酸 (LPC和花生四烯酸)一起温育。在这些条件下，花生四烯酸(脂肪酸)和LPC (溶血磷脂)模拟mGXsPLA2 (图7)。实施例7 体外受精(IVF)方案使通过人工研磨OFl雄性小鼠的附睾尾获得的精细胞在M2培养基中游泳10分钟。随后，将精细胞转移至含有2% BSA(牛血清白蛋白)的M16培养基中并且温育35分钟以进行获能。离心后，将细胞转移入M16培养基中，并且必要时，与20或200nM mGX sPLA2 — 起温育10分钟。将精细胞离心(1200rpm，5分钟)，重悬浮于M16培养基以除去mGX sPLA2, 然后用于体外受精实验。全部实验在37°C下进行。在收集前用7. 5单位的PMSG(孕马血清促性腺激素)和7. 5单位的hCG (人绒毛膜促性腺激素)同步化成熟OFl雌性(6周龄)，然后收集卵子。使用标准方案进行IVF。将卵子与约IO4个精细胞一起温育，在4小时的温育后洗去未结合的精子。受精后M小时，将2细胞胚胎期(图4)评定为成功受精的指标(图5 和6)。实施例8 利用用SPLA2处理10分钟的精子进行的IVF用在2% BSA中获能35分钟，随后用20或200nM mGX处理10分钟的精子实现体外受精(IVF)。在将处理的精子引入卵母细胞之前，洗涤精子，离心以除去sPLA2，从而避免 sPLA2对精子-卵母细胞的融合的人为影响(Riffo和Par raga，1997)。对于以200nM处理的精子，IVF介质中的sPLA2污染物低于InM。a)完整顶体精子的数目的评估在200nM mGX下，70%至80%的精子失去它们的顶体。b)用正常和经处理的精子计算IVF比率基于在第M小时达到2细胞胚胎期的卵母细胞的数目，计算用正常和经处理的精子产生的IVF的比率。在mGX sPLA2存在的情况下，IVF比率以剂量依赖性方式增加。平均IVF比率从对照条件下的44. 0士8. 9%增加至65. 4士5. 6%的利用用200nM sPLA2处理的精子实现的IVF(n = 13只不同的雄性)。已同时进行对照和sPLA2实验，并且使用配对t检验的统计分析显示，差异在统计学上是高度显著的(p = 0. 0002)(图5A)。实施例9 由来自动物毒液的SPLA2诱导的避孕除了使用上文中定义的易于阻止所述受精的sPLA2(而非上文中定义的易于增加所述受精的s PLA2)外，所使用的方案与实施例7中的相同。在20nM和200nM下，盾尖吻蛇毒性sPLA2 0S2抑制IVF0 (图6)。
权利要求
1.易于调节受精的分泌型磷脂酶A2(spy^)和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物用于制造抗不育症药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物或避孕药的用途。
2.权利要求1的分泌型磷脂酶A2(sPU^)和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，所述分泌型磷脂酶A2(sPU^)和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物易于增加所述受精，用于制造抗不育症药物，或促进或改善受精的药物，或促进或改善有活力的胚胎发生的药物。
3.权利要求2的分泌型磷脂酶A2(sPLA2)和/或由所述SPLA2产生的至少一种代谢产物的用途，其在辅助繁殖技术(ART)过程中用于经历体外受精(IVF)、配子输卵管内植入法 (GIFT)、精子卵浆内注射法(ICSI)或治疗性供者人工授精(TDI)的雌性哺乳动物。
4.权利要求2或3的用途，其中sPLA2具有水解一种或多种甘油-磷脂的sn-2酯的性质，且对阴离子型和两性离子型甘油-磷脂的比活性为约1 μ mol/分钟/mg至约50 μ mol/ 分钟/mg,特别地约1 μ mol/分钟/mg至约25 μ mol/分钟/mg。
5.权利要求4的用途，其中所述sPLA2是哺乳动物来源的蛋白质，特别地选自组IIA、 IIF、III、V或X sPLA2，更特别地为小鼠GX或人GV或人GX ；或为原核生物来源例如细菌来源、植物来源或其他来源的蛋白质，所述其他来源包括例如动物的毒液，特别地选自节肢动物或蛇的毒液，更特别地蜜蜂属的种(Apis spp)、太攀蛇属的种(Oxyuranus spp)和大蒲蛇属的种(Daboia spp.)的毒液；或其作为重组蛋白质产生的同源蛋白质。
6.权利要求2至5的任一项的用途，其中所述甘油-磷脂选自1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕榈酰基_2_油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(POPS)。
7.权利要求6的用途，其中sPLA2针对POPG的比活性为约1至50μ mol/分钟/mg， 特别地约10至约40 μ mol/分钟/mg，更特别地约25至约35 μ mol/分钟/mg，特别地为约 30 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPC的比活性为约1至约25 μ mol/分钟/mg，特别地约5至约 15 μ mol/分钟/mg,更特别地约5至约10 μ mol/分钟/mg,特别地约7 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPS的比活性为约1至约50 μ mol/分钟/mg，特别地约10至约 40 μ mol/分钟/mg,更特别地约15至约25 μ mol/分钟/mg,特别地约20 μ mol/分钟/mg。
8.权利要求1至6的任一项的用途，其中所述sPLA2的浓度为约0.2nM至约200nM，优选约0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约 20nM,更优选约20nM至约200nM，特别地约200nM。
9.权利要求2至5的任一项的用途，其中所述至少一种代谢产物选自脂肪酸或溶血磷脂，特别地选自花生四烯酸、肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、sapienic acid、油酸、亚油酸、α -亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰基肌醇、溶血磷脂酰甘油或溶血磷脂酸。
10.权利要求9的用途，其中所述代谢产物的浓度为约0.1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M 至约50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地约10 μ Μ。
11.权利要求1的分泌型磷脂酶A2(spy^)的用途，所述分泌型磷脂酶A2(sPU^)易于阻止所述受精，用于制造避孕药。
12.权利要求11的用途，其中sPLA2具有水解一种或多种甘油-磷脂的sn-2酯的性质，且对阴离子型和两性离子型甘油-磷脂的比活性高于约25 μ mol/分钟/mg，特别地高于约 50 μ mo 1/ 分钟 /mg。
13.权利要求11或12的用途，其中所述甘油-磷脂选自1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、1-棕榈酰基_2_油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(POPS)。
14.权利要求13的用途，其中针对POPC的比活性高于约25μ mol/分钟/mg，特别地高于或等于30 μ mol/分钟/mg。
15.权利要求13或114的用途，其中针对POPC的比活性高于约25μ mol/分钟/mg，特别地30 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPG的比活性高于约50 μ mol/分钟/mg,特别地高于250 μ mol/分钟/mg,和/或sPLA2针对POPS的比活性高于约50 μ mol/分钟/mg, 特别地高于250 μ mol/分钟/mg。
16.药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物结合的、作为活性物质的权利要求1 中定义的sPLA2。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述SPLA2是纯化的哺乳动物来源的蛋白质，特别地选自组IIA、IIF、III、V或X sPLA2，更特别地小鼠GX或人GV或人GX ；或纯化的原核生物来源例如细菌来源、植物来源或其他来源的蛋白质，所述其他来源包括例如动物的毒液， 特别地选自节肢动物或蛇的毒液，更特别地蜜蜂属的种、太攀蛇属的种和大蒲蛇属的种的毒液；或其作为重组蛋白质产生的同源蛋白质。
18.权利要求1至10中定义的SPLA2，其用于治疗不育症或用于促进或改善受精或用于促进或改善雌性哺乳动物的有活力的胚胎发生，特别是在辅助繁殖技术(ART)过程中经历体外受精(IVF)、配子输卵管内植入法(GIFT)、精子卵浆内注射法(ICSI)或治疗性供者人工授精(TDI)的哺乳动物的有活力的胚胎发生。
19.权利要求1或11中定义的sPLA2，其用于哺乳动物的避孕。
20.体外选择精子的方法，其包括下列步骤a.用0.5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为 100万个细胞/ml的精子以获得获能的精子，b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与浓度为约0.2nM至约200nM，优选约 0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM， 更优选约20nM至约200nM，特别地约200nM的具有权利要求7中定义的比活性的sPLA2和 /或浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ M的权利要求9中定义的SPLA的代谢产物一起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.在洗涤和离心后分离未经顶体反应的精子并且弃去经顶体反应的精子。
21.体外受精的方法，其包括下列步骤a.用0.5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为 100万个细胞/ml的精子，以获得获能的精子，b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与浓度为约0.2nM至约200nM，优选约 0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM，更优选约20nM至约200nM，特别地约200nM的具有权利要求7中定义的比活性的sPLA2和 /或浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ M的权利要求9中定义的SPLA的代谢产物一起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.在洗涤和离心后，以、50000/ml的浓度将所述未经顶体反应的精子与先前收集的20 至100个卵母细胞接触。
22.预测哺乳动物的生育力的方法，其包括下列步骤a.用0.5-2%牛血清白蛋白(BSA)或结合胆固醇的任何化合物处理先前收集的浓度为 100万个细胞/ml的精子以获得获能的精子，b.将浓度为100万个细胞/ml的获能的精子与浓度为约0.2nM至约200nM，优选约 0. 2nM至约20nM，更优选约0. 2至2nM，更优选约2nM至约200nM，更优选约2nM至约20nM， 更优选约20nM至约200nM，特别地为约200nM的具有权利要求7中定义的比活力的sPLA2 和/或浓度为约0. 1 μ M至约50 μ Μ,优选约1 μ M至约50 μ Μ,更优选约1 μ M至约10 μ Μ,特别地为约10 μ M的权利要求9中定义的SPLA的代谢产物一起温育，以获得经顶体反应的精子和未经顶体反应的精子的混合物，c.测定经顶体反应的精子的量，并且将其与利用对照哺乳动物获得的经顶体反应的精子的量相比较，d.如果步骤C.中测定的经顶体反应的精子的量高于用所述对照哺乳动物获得的量， 那么预测哺乳动物是不育的。
23.避孕的方法，其包括将哺乳动物的精子与具有权利要求14中定义的比活性的 sPLA2接触的步骤。
全文摘要
本发明涉及受精调节化合物和使用它们的方法。
文档编号A61P15/18GK102427825SQ201080021546
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者C·阿诺尔特, G·拉姆比尤, M·德瓦德 申请人:国家科研中心, 约瑟夫·傅立叶大学