结合b7h6的单克隆抗体及其用途的制作方法

专利名称：结合b7h6的单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体，特别是能够结合被称为B7H6的肿瘤细胞配体的单克隆抗体。本发明还涉及所述抗体的用途。背景B7 家族正和负共刺激信号在淋巴细胞活性的调节中起着关键作用，介导这些信号的分子经证明是免疫调节剂的有效目标。例如，在与抗原呈递细胞(APC)表面上的B7-1或B7-2发生相互作用时，原型T细胞共刺激分子CD28发送的信号能够促进T细胞应答T细胞受体(TcR)结合时发生的增殖和分化，而CD28的同源物细胞毒性T淋巴细胞抗原_4(CTLA_4)介导T细胞增殖和效应子功能的抑制。(参见Chambers et al. , Ann. Rev.Immunol. , 19:565-594, 2001;Egen et al. , Nature Immunol.，3:611-618，2002)。已经发现了多个与B7家族有同源性的分子(Abbas et al. , Nat.Med.，5:1345-6，1999; Coyle et al., Nat. Immunol. , 2:203-9, 2001; Carreno et al. , Annu.Rev. Immunol.，20:29-53，2002;Liang et al.，Curr. Opin. Immunol.，14:384-90，2002)，它们在淋巴细胞活化中的作用才刚刚开始获得阐述。这些新的共刺激反受体包括B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3 和 B7-H4。已知B7家族成员的表达主要局限于抗原呈递细胞。研究揭示B7家族成员是淋巴样细胞上的反受体，它们与其淋巴细胞上的相应受体相互作用从而提供对调节细胞介导的免疫反应有重要作用的正或负共刺激信号。NK 细朐和 NKd30自然杀伤(NK)细胞是活跃在免疫系统中的一个淋巴细胞亚组，代表了人类外周血中单核细胞的平均大约15%。NK细胞功能的描述最早在1971年观察到被致死辐射的小鼠能够排斥异体移植物或亲本骨髓细胞(BMC)同种异体移植(allgraft)。(参见Cudowicz and Bennett, J.Exp.Med.134:83-102, 1971;Cudowicz and Bennett,J.Exp.Med. 135:1513-1528，1971)。Cudowicz 和 Bennett 观察到被辐射的 Fl 杂交 H_2_ 杂合小鼠(A X B)能够排斥亲本H-2-纯合BMC (A或B)。在有关移植的经典理论中移植抗原被认为是同等显性遗传，后代对亲代主要组织相容性复合体(MHC)决定簇专性耐受，而以上观察却与该理论冲突(参见 Cudowicz and Bennett, J. Exp. Med. 134:83-102，1971)。造成该现象的细胞经发现是辐射抗性的，与淋巴样细胞相同，之后在1975年发现它们的特征在于具有以非限制性MHC的方式介导体外自发杀伤肿瘤的能力(参见Herberman andOrtaldo, Science, 214:24-30，1981;Ortaldo and Herberman, Annu. Rev. Immunol.2:359-394, 1984;Trinchieri, Adv. Immunol. 47:187-376，1989; Murphy etal. , J. Natl.CancerInst. 85:1475-1482，1993)。在1987年观察到有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠虽然不能发展出T和B细胞，却有正常的NK细胞功能，因此更多证据表明仅有NK细胞即可介导骨髓移植物排斥的特异性(参见 Murphy etal.，J. Exp. Med. 165:1212-1217，1987)。目前NK细胞被认为代表了先天免疫的重要部分，在对肿瘤和感染了病毒的细胞的免疫监视中发挥主要作用。但是NK细胞除非被激活，它们即使处于足够的数量也不能有效发挥其正常功能。NK细胞活性下降确实与癌症和传染病存在关联性(参见Yamazakiet al. , Oncology Reports 9:359-363, 2002;Rosenberg et al. , Cancer Research 51:5074-5079 (suppl.), 1991; Britteenden et al. , Cancer 77:1226-1243，1996;美国专利5，082，833和4，883，662)。相反正如以上提到的，NK细胞活性介导BMC同种异体移植的急性排斥。因此NK细胞活性水平似乎在与免疫有关的疾病中起着重要作用。NK细胞活性一般是由I型MHC分子与抑制性受体和活化性受体的相互作用来调节的(参见，例如 Barao and Murphy, BB&MT 9:727-741,2003)。“丢失自我(missingself) ”假说最初是基于一个观察结果，即缺乏I型MHC分子的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤 敏感(参见 Ljunggren and Karre, Immunol. Todayll: 237-244, 1990; Ohlen et al. , J.Immunol. 145:52-58, 1990)。研究人员还观察到人NK细胞能够溶解I型缺陷型EB病毒转化的 B 淋巴母细胞系(Storkus et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2361-2364,1989)。此外还发现给I型缺陷型靶细胞转染I型基因使得这些细胞能够部分或者完全抗 NK 细胞介导的溶解(参见，Storkus et al.,同前；Shimizu and DeMars, Eur.J. Immunol.，19:447-451, 1989)。而I型MHC对于免受NK细胞介导的细胞毒性并非总是必需的，被I型MHC识别不都能防止NK细胞造成的细胞溶解(Barao and Murphy,同前)。近年来，鉴定到各种I型MHC特异的抑制性受体和活化性受体以及非I型MHC特异的活化性受体。这些受体与诸如例如异基因BMT和癌症治疗的治疗手段有关(参见出处同上)。能够介导抗I型MHC缺陷或阴性靶细胞的NK细胞细胞毒作用的非I型MHC特异性活化性受体，其部分代表是被称为自然细胞毒性受体(NCRs)的一组异质的NK细胞特异性免疫球蛋白样分子(参见例如 Moretta et al. , Annu. Rev. Tmmuno1. 19:197-223, 2001;Diefenbach and Raulet, TmmunoI. Rev. , 181:170-184，2001)。在缺乏 I 型 MHC 表达的情况下(比如例如，肿瘤细胞或者感染了病毒的细胞上)，NK细胞上这些活化性受体的连接将触发对靶细胞的杀伤。这种活化性受体之一是NKp30，其在成熟的自然杀伤(NK)细胞上选择性和组成性表达，并通过特别是与⑶3的偶联发出信号(参见Barao and Murphy,同前)。NKp30所结合的靶物质-细胞配体以前未被发现。NK细胞的这种天然免疫识别系统代表了潜在的一个有力工具，可能在临床上应用于同种异体骨髓移植(BMI)、癌症疗法或其他NK细胞相关疾病的治疗(参见例如Barao andMurphy,同前)。例如，刺激或抑制NKp30的活化可能用于调节NK细胞的活性，以及治疗与NK细胞活性相关的疾病或紊乱。尤其是，通过触发NKp30增强NK细胞活性可能用于治疗以NK细胞活性不足为特征的疾病或紊乱，比如癌症和传染性疾病，而通过阻断NKp30抑制NK细胞活性能够用于治疗NK细胞介导的紊乱，比如例如BMC同种异体移植排斥。最近发现的B7家族的最新成员B7H6被鉴定为NKp30的反受体(counter-receptor),它是在成熟自然杀伤(NK)细胞上选择性表达的受体，以活化性受体参与人天然细胞毒作用(Brandt et al.，J. Exp. Med.，206 (7) : 1495-1503，2009)。B7H6 在正常人组织中未检测到，而在人肿瘤细胞上有表达。因此，本领域需要鉴定能够抑制B7H6和NKp30之间的相互作用的抗体。基于它们调节共刺激信号和免疫反应的能力，这些抗体有潜在的治疗应用。此外，能够结合B7H6蛋白的抗体在偶联了细胞毒药剂时很有用，可以用于寻靶到表达B7H6的细胞。这些和其他用途都是高度需要的。本发明提供了用于这些和其他用途的组合物和方法，对本领域技术人员来说根据本文的教导是显而易见的。发明概述本发明的一个方面提供了分离的单克隆抗体，所述抗体特异结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266)。在一个实施方案中，所述抗体与克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQID NO: 2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号 CNCM 1-4244)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266)。另一个实施方案中，所述抗体与克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266)。某些实施方案中，以上描述的抗-B7H6单克隆抗体是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。某些实施方案中，抗体将竞争结合人B7H6胞外结构域，抑制人B7H6与NKp30的相互作用。所述抑制可能是完全或部分阻断，可能使相互作用被中和或者减少。合适的抗体还包括单链抗体。其他包含在内的变化形式包括含有Fe区的抗体,其中所述Fe区具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种。在某些这类变化形式中，Fe区是单链Fc(ScFc)。结合人B7H6的单克隆抗体中每一种都适合制成包含抗体和可药用介质的组合物。这些抗体适合用在诊断试剂盒中，用于检测所述抗体的结合。另一方面，本发明提供了抗体-药物偶联物，其包含特异结合人B7H6胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266)的单克隆抗体，其中所述抗体偶联了细胞毒性试剂。某些实施方案中，抗体-药物偶联物中的抗体部分是与下述抗体竞争结合人B7H6胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266)的抗体由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。单克隆抗体可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。合适的抗体还包括单链抗体。某些变化形式中，抗体包含具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种的Fe区。在某些这类变化形式中，所述Fe区是单链Fc(ScFc)。细胞毒试剂可以是例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷基化剂、度卡霉素(duocarmycin)或者嘌呤霉素。合适的抗微管蛋白剂包括，例如海兔毒素(dolastatin)、长春碱类(vine alkaloid)、鬼曰毒素(podophyllatoxin)、紫杉烧(taxane)、衆果赤霉素baccatin)衍生物、cryptophysin、类美登醇(maytansinoid)或者 combretastatin。某些实施方案中，抗体经由连接分子与药物偶联，某些情况中所述连接分子在胞内状况下可以被切割。合适的可切割连接分子包括肽连接分子，包括那些可以通过胞内蛋白酶切割的肽连接分子。任何被包含在内的抗体-药物偶联物都适合制成包含抗体-药物偶联物和可药用介质的组合物。另一个相关方面中，本发明提供了一些方法，所述方法通过抑制人B7H6与人NKp30的相互作用来降低抗表达人B7H6的细胞的自然杀伤(NK)细胞活性。这些方法通常包括将表达人B7H6的细胞在有人NK细胞的情况下与有效量的单克隆抗体接触，所述单克隆抗体能够与以下(能够抑制人B7H6与人NKp30的相互作用的)抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体；由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。另一个相关方面中，本发明提供了一些方法，所述方法通过抑制人B7H6与人NKp30的相互作用来治疗受试对象中的骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥。这些方法通常包括将单克隆抗体以能够有效抑制NK细胞活性的量给予受试对象，从而治疗急性BMC同种异体移植排斥，所述单克隆抗体能够与以下(能够抑制人B7H6与人NKp30的相互作用的)抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242) 产生的抗体；由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。降低人NK细胞活性的方法和治疗BMC同种异体移植排斥的方法都包括这样一些实施方案，所述实施方案中的抗体是人或人源化的单克隆抗体。方法还包括其中的抗体是单链抗体的实施方案。其他相关方面中，本发明提供了利用抗体-药物偶联物来消除细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制其生长的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体-药物偶联物接触，所述偶联物包含(a)抗体，其与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQID NO: 2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体；以及(b)偶联在抗体上的细胞毒性剂。另一个相关方面提供了利用抗体-药物偶联物治疗受试对象中B7H6表达癌症的方法。所述方法通常包括将有效量抗体-药物偶联物给予受试对象，所述偶联物包含(a)抗体，其与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体；由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体；由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM1-4244)产生的抗体；由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体；以及(b)偶联在抗体上的细胞毒性剂。涵盖的实施方案中癌症是结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。其他适合治疗的B7H6表达癌症包括早幼粒细胞白血病(prohemocyticleukemia)、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病(erythroleukemia)、伯基特氏淋巴瘤(Burkittj s lymphoma)和慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia)。在消除细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制其生长的方法，和/或治疗受试对象中B7H6表达癌症的方法中，人或人源化单克隆抗体都适合作为抗体-药物偶联物中包含的抗体。也适合使用单链抗体作为所述方法中抗体-药物偶联物中包含的抗体。其他相关方面中，提供了诱导抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体接触，所述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM1-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体；其中所述接触是在有NK或⑶8+细胞的情况下进行的,所述NK或⑶8+细胞表达具有ADCC活性的Fe受体,所述抗体包含能够结合该Fe区的Fe区。其他相关方面，提供了诱导抗B7H6表达细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的方法。所述方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗体接触，所述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体；其中所述接触是在有补体的情况下进行的，所述抗体包含具有⑶C活性的Fe区。在诱导抗B7H6表达细胞的ADCC的方法中，和/或诱导抗B7H6表达细胞的⑶C的方法中，实施方案包括人或人源化抗体。还包括单链抗体。另一种变化形式包括Fe区，其中所述Fe区是单链Fe (scFc)。对于这两种方法，在某些实施方案中，所述B7H6表达癌症是癌细胞。癌细胞可以是例如直肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞或者慢性粒细胞白血病细胞。另一个相关方面提供了治疗B7H6表达癌症的方法。所述方法通常包括给予受试对象有效量的单克隆抗体，所述抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ IDNO: 2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCMI-4244)产生的抗体、由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM1-4245)产生的抗体；其中所述抗体包含具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种的Fe区。合适的单克隆抗体包括人抗体、人源化抗体和单链抗体。在某些变化形式中，所述Fe区是单链Fe (scFc)。可接受治疗的B7H6表达癌症包括，例如直肠、肝、宫颈、肺、胰腺或前列腺的癌症。其他合适的B7H6表达癌症包括例如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病。另一个相关方面提供了检测B7H6的细胞表达的方法，其中抗体的结合表明细胞上存在B7H6。通常所述方法包括(I)将包含待测试的人细胞的生物样品与单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCMI-4244)产生的抗体、或者由克隆编号17B1. 3)的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245产生的抗体；以及(2)检测抗体的结合和细胞是否表达B7H6，其中结合表明细胞上存在B7H6。在某些实施方案中。生物样品是完整的人细胞或待测试的细胞的膜部分。某些实施方案中，抗体被标记了可检测的标记。合适的标记包括放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记或生物发光标记。在相关方面中，本发明提供了给怀疑患有表达B7H6的癌症的受试对象进行诊断的方法。所述方法通常包括(I)给予受试对象单克隆抗体，所述单克隆抗体偶联了可检测的标记，可与以下抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266):由克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体、由克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCMI-4243)产生的抗体、由克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体、或者由克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体；以及(2)检测所述单克隆抗体在受试对象中的分布。合适的应用包括直肠、肝、宫颈、肺、胰腺或前列腺癌的诊断。另一方面中，本发明还提供了产生抗体的细胞，所述细胞选自克隆编号4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)、克隆编号9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)、克隆编号10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)、或者克隆编号17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM1-4245)。发明详述
I.概论本发明涉及抗B7H6抗体的鉴定和表征，所述抗体能够结合B7家族细胞表面蛋白的成员，特别是抗人B7H6单克隆抗体。B7H6抗体最初被认定是NKp30的反受体，NKp30多肽是在成熟自然杀伤(NK)细胞上选择表达的一种受体，并且作为活化性受体参与人天然细胞毒作用(参见美国专利申请公开2009/0220502，通过引用全部并入本文)。SEQ ID NO: I提供了示意性的编码人B7H6的核苷酸序列，SEQ ID N0:2显示了所编码的多肽。SEQ ID NO:2的B7H6多肽包含大约242个氨基酸残基的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的残基25-266)、大约18个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQ ID NO:2中的残基267-284)和大约158个氨基酸残基的胞内结构域(SEQ IDNO:2中的残基285-454)。B7H6还含有大约117个氨基酸残基的IgV结构域(SEQ ID NO:2中的残基25-141)和大约97个氨基酸残基的IgC结构域(SEQ ID NO: 2中的残基142-238)。B7H6的胞内结构域中还有几个可能的信号传导基序，包括IHM基序(SaYtpL，SEQ ID NO:2中的氨基酸残基293-298) ;SH2结合基序(YqlQ，SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基229-332)和SH3结合基序(PdaPiIPvsP, SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基418-427)。因制得抗人B7H6蛋白的小鼠单克隆抗体并鉴定出这些抗体的特性而得到本发明。由杂交瘤制备了 IgGl同种型的五种抗人B7H6的小鼠单克隆抗体。所述抗体被指定为4E5. 5、5E1. 4、9G9. 2、10E2. 9和17B1. 3。竞争检测法揭示特定抗体识别的是不同表位。NKp30Fc结合被抑制和D0MSP30的活化表明抗B7H6mAbs中的两种，即17B1. 3和4E5. 5能够部分地阻断NKp30:B7H6相互作用。这些研究将结构和功能关联起来，在实施例中有描述。各种单克隆抗体经证实可以作为生化和诊断检测中的试剂，并且具有治疗价值。因此，本发明包括那些能够以等同或类似mAbs 4E5. 5、5E1.4、9G9. 2、10E2. 9和/或17B1. 3的特异性和特性与人B7H6细胞表面蛋白结合的单克隆抗体。如文中所述，制备了小鼠抗人B7H6单克隆抗体并在竞争试验中证明它们结合不同的表位。因此，本发明的一个方面提供了能够与这些抗体竞争结合B7H6的抗体(例如和选自mAbs 4E5. 5、9G9. 2U0E2. 9 和17B1. 3的抗体结合相同B7H6表位的抗体)。此外，一些抗体被显示会影响B7H6_NKp30相互作用。相应地，一些实施方案中，本发明的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6介导的NKp30的活化。
本发明还提供了由非人抗B7H6抗体衍生的人源化抗体(例如由小鼠抗体衍生的人源化抗体)、中和抗体、人单克隆抗体以及它们的抗原结合片段。示范性的抗体片段包括F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。中和抗体结合B7H6从而使得它与NKp30的相互作用被抑制或阻断。包含在发明范围内的是竞争结合人B7H6胞外结构域的单克隆抗体，所述单克隆抗体可用于在例如急性骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥中抑制NK细胞介导的反应，其中抗体被以有效量给予从而阻断NK细胞活性和治疗BMC同种异体移植排斥。本发明的抗B7H6抗体还可用于将细胞毒性剂寻靶到B7H6表达细胞，特别是B7H6表达癌症细胞。这种抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物在给予受试对象(比如带有B7H6表达癌症的受试对象)时，对B7H6表达细胞产生临床上的有益效果。抗体通常是单独给予的，但也可以与其他治疗剂联用。在典型实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体与细胞毒性剂偶联，这样得到的抗体-药物偶联物在被细胞摄取或内在化时对B7H6表达细胞(例如B7H6表达癌症细胞)发挥细胞毒性效应或抑制细胞效应。 因此，本发明某些方面包括抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物。其中抗体部分以本文描述的相同或类似特异性和特性结合人B7H6细胞表面蛋白，药物偶联物部分作为治疗剂。抗人B7H6抗体-药物偶联物在给予带有B7H6表达癌症的受试对象时，对B7H6表达细胞发挥临床上的有益效果。一般来说，药物偶联物部分是细胞毒性剂，能够对B7H6表达细胞发挥细胞毒性效应或抑制细胞效应。对于这些抗体-药物偶联物，抗体部分识别B7H6上的一定表位。某些变化形式中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物影响B7H6-NKp30相互作用。例如，一些实施方案中，根据本发明的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物抑制NKp30的活化。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体包含具有效应子功能的Fe区用于诱导抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(⑶C)。本发明包括抗人B7H6单克隆抗体，其包含具有ADCC活性的Fe区可用于诱导ADCC。对于该用途，通常在有表达Fe受体(具有溶细胞活性)的溶细胞性免疫效应细胞的情况下，将B7H6表达细胞与有效量含有Fe区的抗人B7H6单克隆抗体接触。表达溶细胞性Fe受体(例如Fe y RIIIa或⑶16)的免疫效应细胞包括例如NK细胞以及某些⑶8+T细胞。对于抗人B7H6单克隆抗体被用于诱导CDC的实施方案，其中所述单克隆抗体包含具有CDC活性的Fe区，通常在有补体的情况下，将B7H6表达细胞与有效量含有Fe区的抗人B7H6单克隆抗体接触。可以利用本文要求的抗体和方法进行靶向杀伤的B7H6表达细胞包括例如癌症细胞，仅举数例，比如例如直肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞和慢性粒细胞白血病细胞。本发明的这些和其他方面在参考以下详细描述的情况下是显而易见的。此外，下文确认了各种参考文献，通过引用全文并入。II.定义除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有与所述方法和组合物相关领域的技术人员通常理解的相同的意义。本文中，以下术语和短语具有认定给它们的含义除非另有明确说明。
术语“一个/种(“a” “an”和“the”)”本文中包括复数指代物，除非上下文另有
明确说明。“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，无论是天然还是合成生产的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。“蛋白质”是包含一或多个多肽链的大分子。蛋白质还可能包含非肽成分，比如碳水化合物基团。产生蛋白质的细胞可以给蛋白添加碳水化合物和其他非肽取代成分，并且根据细胞类型而不同。本文中 按照蛋白质的氨基酸骨架结构对蛋白进行定义；诸如碳水化合物的取代成分一般不作限定，但可能仍然存在。“分离的多肽”是基本不含污染细胞成分的多肽，比如与自然界中多肽关联的碳水化合物、脂类或其他蛋白质性质的杂质。一般来说，分离的多肽制品含有高度纯化形式的多肽，即纯度至少大约80%、纯度至少大约90%、纯度至少大约95%、纯度大于95%，比如纯度96%,97%或98%或以上，或者纯度大于99%。显示特定蛋白制品含有分离的多肽的一个途径是通过蛋白制品在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后出现单一条带。但是术语“分离的”不排除相同多肽存在的替代物理形式，比如二聚体或备选地糖基化形式或衍生形式。术语“氨基端”和“羧基端”本文中指示多肽内的位置。上下文允许的情况下，这些术语是参照多肽中的特定序列或部分来指示接近性或相对位置的。例如，多肽内位于参照序列羧基端的特定序列是位于靠近参照序列的羧基端，但不一定是整个多肽的羧基端。术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，就结构基因而言，表达涉及结构基因转录为mRNA和mRNA翻译为一或多个多肽。本文中，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子(co-stimulatory molecules)、造血因子等，以及这些分子的合成类似物。术语“抗体”本文中是指免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的免疫球蛋白家族的多肽或其片段，所述抗原结合位点与特异抗原(例如B7H6的胞外结构域)免疫特异性结合。“抗独特型抗体”是与免疫球蛋白可变区结合的抗体。在本文语境中，抗独特型抗体与抗人B7H6单克隆抗体的可变区结合，因此抗独特型抗体模拟B7H6的表位。“抗体片段”是抗体中诸如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等的部分。无论结构如何，抗体片段结合的抗原与完整抗体识别的抗原相同。例如，抗B7H6单克隆抗体片段与B7H6的表位结合。术语“抗体”还涵盖基因改造的完整抗体或片段，比如例如嵌合抗体、人源化抗体、由重链和轻链的可变区构成的“Fv”片段、由轻链可变区构成的多肽、其中轻链和重链可变区通过连接肽相连的重组单链抗体(“scFv蛋白”)、由模拟高变区的氨基酸残基构成的最小识别单位等，以及合成的抗原结合肽和多肽。“嵌合抗体”是含有来源于啮齿动物抗体的可变结构域和补体决定区，而抗体分子的其他部分来源于人抗体的重组蛋白。“人源化抗体”是这样的重组蛋白，所述重组蛋白中非人(例如小鼠)单克隆抗体的补体决定区是从非人免疫球蛋白的重和轻可变链被转移到人可变区内的。由非人(例如小鼠)抗体构建用于人类治疗用途的人源化抗体，比如能够结合或中和人蛋白的那些人源化抗体，是本领域技术人员能力范围内的。术语“Fe片段”、“Fe区”或“Fe结构域”本文中是同义词，是指抗体中负责结合细胞上的抗体受体和补体的Clq成分的部分。Fe表示“结晶片段”，是抗体中很容易形成蛋白晶体的片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白片段可以限定免疫球蛋白的整体的大概结构。文献中原来定义Fe片段是由二硫键连接的重链铰链区、Ch2和Ch3结构域构成。但是近来该术语被应用于由Ch3、Ch2和至少部分铰链构成的单链，其中所述部分铰链足够与第二个这样的链形成二硫键连接的二聚体。有关免疫球蛋白结构和功能的综述，参见 Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc.，1987)，pp. 49-140;和Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994。本文中，术语Fe包括天然存在序列的变体。术语“单链Fe”、“单链Fe结构域”和“scFc”本文中是同义词，是指包含两个通过柔性连接分子连接起来的Fe结构域单体的多肽融合,其中两个Fe单体能够二聚化形成可以结合Fe受体的功能性二聚体Fe结构域。单链Fe多肽在名为“Single Chain Fe, Methodsof Making, and Methods of Treatment” 的国际 PCT 专利申请公开号 WO 08/0131242 中有更详细的描述，其公开内容通过引用全部并入本文。 术语“具有ADCC活性的Fe区”本文中是指Fe结构域，所述Fe结构域能够通过结合表达Fe受体的溶细胞性免疫效应细胞(例如NK细胞或CD8+T细胞)上的溶细胞性Fe受体(例如Fe Y RIII a )而介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。术语“补体”是指正常血清中这样一些成分的总称，所述成分与结合在抗原上的抗体一起展现出溶解细胞的能力。补体由一组协调作用并按顺序发挥效应的血清蛋白构成。术语“经典补体途径”和“经典补体系统”本文中是同义词，是指特定的补体活化途径。经典途径的开始需要抗原-抗体复合体，途径包括被命名为Cl到C9的9个主要蛋白成分的顺序活化。活化过程的几个步骤中，产物是催化后续步骤的酶。这种级联方式使得通过较小的初始信号即可放大和活化大量补体。术语“具有⑶C活性的Fe区”本文中是指能够通过结合Clq补体成分蛋白和经典补体系统的活化来介导补体依赖性细胞毒作用(CDC)的Fe结构域。术语“试剂”本文中意味着元素、化合物或其他分子实体，包括例如药学、治疗或药理化合物。试剂可以是天然或合成的或者它们的组合。“治疗剂”是单独或者与另一种试剂(例如前药转换酶与前药组合)联用时对细胞或组织(例如对表达B7H6的细胞或组织，比如B7H6表达癌细胞)发挥(例如有益的)治疗效果的试剂。本发明的某些方面中，“治疗齐U”是与抗体偶联形成有治疗用途的偶联物的试剂。治疗剂的例子包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏的试剂或染料，以及放射性同位素。一些变化形式中，与抗体偶联的治疗剂是发挥细胞毒性或细胞抑制性效应的试剂。在谈及试剂对细胞的影响时，“细胞毒效应”表示对细胞的杀伤。“抑制细胞效应”意味着对细胞增殖的抑制。“细胞毒性剂”意味着试剂对细胞有细胞毒效应或抑制细胞效应，从而将细胞群中的细胞分别消除或抑制其生长。“可检测标记”是可以与抗体部分偶联形成诊断使用的分子的分子或原子。可检测标记的例子包括螯合剂、光敏剂、放射性同位素、荧光剂、顺磁离子或其他标记物部分。术语“亲和标签”本文中是指多肽区段，所述多肽区段可以附着到第二多肽上协助第二多肽的纯化或检测，或者给第二多肽提供附着到底物上的位点。理论上，有抗体或其他特异结合剂可供使用的任何肽或蛋白都可以作为亲和标签。亲和标签包括多组氨酸串、蛋白 A (Nilsson et al. , EMBO J. 4:1075, 1985;Nilsson et al. , MethodsEnzymoI. 198:3，1991)、谷胱甘妝 S 转移酶(Smith and Johnson, Gene 67:31，1988)、Glu-Glu 亲和标签(Grussenmeyer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952，1985)、P 物质(substance P)、FLAG 妝(Hopp et al. , Biotechnology 6:1204，1988)、链霉亲和素结合肽或其他抗原表位或结合结构域。一般可参见Ford et al. , Protein Expression andPurification2:95, 1991。编码亲和标签的DNA分子可以从商家购买(例如PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ)。“裸抗体”与抗体片段不同，是完整的未偶联治疗剂的抗体。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，比如嵌合和人源化抗体。术语“单克隆抗体”是指来源于单一细胞克隆(包括真核或原核细胞克隆或者噬菌体克隆)的抗体，而不是说它的制备方法。因此，术语“单克隆抗体”本文中不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。 “免疫偶联物”是抗体与治疗剂或可检测标记的偶联物。术语“表位”是指能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的表面分子群，比如氨基酸或糖侧链构成，并且一般有特异的三维结构特征以及特异的电荷特性。更具体地说，术语“B7H6表位”本文中是指B7H6多肽中在动物里具有抗原或免疫原活性的部分，所述动物优选是哺乳动物，最优选是小鼠或人。具有免疫原活性的表位是B7H6多肽中在动物里引发抗体反应的部分。具有抗原活性的表位是B7H6多肽中抗体可以特异免疫反应性地结合的部分，所述结合可以通过任何本领域已知方法，例如免疫检测来确定。抗原表位不需要一定是免疫原性的。“非连续表位”是由B7H6蛋白一级序列中至少两个分开的区域形成的构象表位。构象表位在有变性溶剂的情况下，失去特异结合的能力(例如在Western印迹分析中)。“NK细胞活性”本文中是指NK细胞溶细胞活性。有许多本领域技术人员熟知的检验方法可以检测和/或监测这种活性，包括但不限于本文提供的实施例中描述的检验方法。本文中，短语“B7H6和NKp30的相互作用”是指功能性B7H6受体与NK细胞上的NKp30之间直接的物理相互作用(例如结合)和/或间接的相互作用，造成B7H6受体和/或NKp30得到刺激以及相关联的胞内信号传导。本文中，术语“封闭抗体”是指干扰(即抑制)B7H6和NKp30的相互作用的抗体，和/或通过例如溶细胞活性可以测量到的干扰B7H6激发NK细胞活性的能力的抗体。抑制不必是完全彻底的，可以是“部分”的，即活性相对对照或标准发生下降或减少。短语“以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱”本文中，是指(至少部分)涉及表达B7H6的病理细胞的任何疾病或紊乱。这类病理细胞包括，例如某些肿瘤细胞。相应地，典型的以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱是某些癌症。正如本文将进一步描述的，这类疾病或紊乱特别适合靶向B7H6表达细胞的某些治疗方法。术语“NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱”和“与NKp30表达细胞活性提高相关的疾病或紊乱”在本文中作为同义词使用，是指其病理至少部分地由NKp30表达细胞的溶细胞活性介导的任何疾病或紊乱。某些变化形式中，NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱是“NK细胞介导的疾病或紊乱”，其病理至少部分地由NK细胞溶细胞活性介导。这类疾病或紊乱的一个例子是骨髓细胞(BMC)同种异体移植物急性排斥。正如本文将进一步描述的，这类疾病或紊乱特别适合抑制NK细胞活性的某些治疗方法。术语“有效量”在如本文所述通过给予受试对象封闭抗B7H6抗体从而对NKp30表达细胞介导的疾病或紊乱进行治疗的语境中，或者在如本文所述通过给予受试对象抗B7H6抗体或抗体-药物偶联物从而对以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱进行治疗的语境中，是指所述分子的量足够抑制疾病或紊乱在受试对象中的发生或者足够缓解一或多个临床或诊断症状。按照本发明的方法在“有效治疗方案”中用有效量的抗原进行给药。术语“有效治疗方案”是指用于给药的试剂的量和剂量频率的组合，所述组合足以实现对疾病或紊乱的治疗或预防。由于常规分析方法的不精确，可以理解聚合物的分子量和长度都是大概值。当这类值被表达为“大约” X或“大概” X，所述X值应理解为精确至土 10%。III. B7H6蛋白的杭体
本发明一个方面提供了特异结合人B7H6表位(例如，结合SEQ ID N0:2中氨基酸残基25-266给出的氨基酸序列中的某个多肽区段)的抗人B7H6单克隆抗体。某些变化形式中，提供的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6-NKp30相互作用。抑制不必是对B7H6-NKp30相互作用的完全阻断，而可以是活性相对对照或标准下降或减少。某些实施方案中，根据本发明的单克隆抗人B7H6抗体能够与选自4E5. 5(保藏号CNCM
1-4242)、9G9. 2 (保藏号 CNCM 1-4243)、10E2. 9 (保藏号 CNCM 1-4244)或 17B1.3(保藏号CNCM 1-4245)的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6。这四种杂交瘤于2009年11月18 日以 Institut National De La Santeet De La Recherche Medicale (INSERM)的名义保藏在 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM, InstitutPasteur;Paris, France)。鉴定到五种小鼠抗人B7H6单克隆抗体并进行了表征，本文中有描述。通过本文公开的竞争结合分析法显示，对这些抗体的表征表明这些单克隆抗体中的某些识别的是B7H6蛋白上的不同表位。对抗体的表征还显示其中的两种抗体至少部分地阻断B7H6-NKp30相
互作用。表位归类(Epitope binning)可用于鉴定落在本发明范围内的抗体。表位归类是指利用竞争结合试验鉴定能够或者不能同时结合B7H6蛋白的抗体对，从而鉴定出与蛋白上相同或重叠的表位相结合的抗体对。表位归类试验提供了证据表明，存在着抗原性有差异的表位。还需要进一步的数据来将所述表位鉴定为或“作图”至B7H6蛋白分子中的特定氨基酸序列或位置。可以评估任何成对抗体或片段竞争结合的情况。例如，使用合适的检测剂可以将来自任何来源的抗体或结合片段的结合特异性与本文公开的单克隆抗体的结合特异性进行比较。可以用“分离的抗体”或细胞培养物上清进行表位归类。通常，对第一轮克隆上清进行归类来指导对有待进一步开发的克隆的选择。被比较的抗体应当是基本同质的抗原结合结构域。对于“双特异性”或“双功能”抗体的情况，两个不同结合位点的结合特异性需要独立地评价或归类。本发明的抗体可以通过本领域任何已知方法检验其特异结合。许多不同的竞争结合分析形式可以用于表位归类。可以使用的免疫分析法包括，但不限于利用诸如Western印迹、放射免疫分析、ELISA、“夹心”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀试验、凝胶扩散沉淀试验、免疫放射分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析和补体结合分析的技术的竞争检验系统。这类检验方法是本领域常规的公知方法(参见例如Ausubel et al.，eds, 1994CurrentProtocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & sons, Inc. , New York)。此夕卜，可以进行诸如 Antibodies, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, EdHarlow and David Lane, 1988中描述的那些常规交叉阻断分析方法。B丨八CORiW": (GEHealthcare, Piscaataway, NJ)只是常规用于单克隆抗体表位归类分组的表面等离子共振分析形式中的一种。其他参考文献，例如The Epitope Mapping Protocols, Methods inMolecular Biology, Vol. 66, Glenn Morris ed. Humana Press, 1996 描述了可以用于结合抗体的替代方法，所述方法预期可以提供关于抗体与B7H6配体结合特异性的可比信息。在使用BIAC0RE 系统时，用可溶性、天然或重组抗原进行表位归类试验。表位归类研究可以在BIAC0RE1000 系统(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上进行。BIAlogUC v. I. 2软件可用于设计操作方法。例如，为了 bin培育的抗B7H6的小鼠单克隆抗体，可以将多克 隆山羊抗小鼠 IgG Fe 抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)共价固定到mAC’ORI汍CM5传感芯片上，用于将测试系列中的第一单克隆抗体结合(捕获)到芯片上。然后使用多克隆IgG Fe片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)封闭芯片上未被占据的Fe结合位点。随后，注射B7H6蛋白并允许其与捕获的第一单克隆抗体特异结合。BIACORL A仪器测量结合到传感芯片上的蛋白质量，可以验证每轮中第一抗体和B7H6抗原都结合了。第一抗体和抗原都结合到芯片后，注射可溶性的第二抗体，允许其结合到预先结合好的抗原上。如果第二单克隆抗体能够与第一单克隆抗体同时结合B7H6抗原，BIACORE 可以检测到它的结合。而如果第二单克隆抗体不能与第一单克隆抗体一起结合B7H6抗原，则不会检测到另外的结合。测试每个单克隆抗体抗自身的情况作为阴性对照，从而确立背景(无结合)信号。还可以利用无标记竞争性ELISA形式(LFC-ELISA)对抗体归类。这种方法是 Nagata et al. , J. Immunol. Methods 292:141-155，2004 中描述的，使用的是生物素化B7H6。在对培育的抗B7H6的小鼠单克隆抗体进行归类的例子中，用稀释在ELISAB (PBS, 0. l%Tween 20，1%BSA)中的 I y g/mL 的山羊抗小鼠 IgG Fe-y 特异抗体(JacksonImmunoResearch)以100 y L/孔包被微量滴定板。该包被抗体在室温下结合3小时后,将每种含有mAb的条件培养基在ELISAB中稀释得到大概0. 5 u g/mL的mAb浓度，并允许其与包被了山羊抗小鼠IgG的培养板于4° C过夜结合(mAb#l)。与此平行，第二组条件培养基(mAb#2)在聚苯乙烯试管中在ELISA B里稀释至大概0. 5 y g / mL mAb,与50ng/mL生物素化的B7H6抗原混合，4° C过夜温育。mAb#l与包被抗体温育后，培养板用无关抗体进行封闭直至培养板上未被占据的结合位点饱和。向培养板中加入mAb#2-生物素-B7H6混合物，允许进行结合。作为分析中的(非竞争)对照，向含有固定化mAb#l的孔中直接(未经与mAb#2的预温育)加入50ng/mL生物素化的B7H6。在与生物素化B7H6_mAb#2复合体温育后，以0. 5 ii g/mL向培养板中加入链霉亲和素-HRP (Pierce，Rockford, 111.)。培养板用TMB底物(BioFX Laboratories, Owings Mills, Md.)显影，各个孔在450nm处的吸光度用培养板阅读仪(Molecular Devices SPECTRAMAX 340, Sunnyvale, Calif.)测量。如果 mAb#l 和mAb#2结合的表位不同，生物素-B7H6-mAb#2复合体会结合到培养板上，导致高的吸光度读数。如果mAb#l和mAb#2结合的表位相同，生物素_B7H6_MAb#2复合体不会与培养板结合，因此得到低的吸光度读数。在一些实施方案中，本发明的抗人B7H6单克隆抗体能够抑制B7H6与人NKp30的相互作用；所述抗体可用于例如抑制与B7H6和NKp30的相互作用有关的细胞或其他生理事件(包括例如B7H6-和/或NKp30介导的胞内信号传导)和相关的效应子功能(例如NKp30介导的溶细胞活性)。针对B7H6的抗体可以利用例如B7H6表达载体的产物或者分离自天然来源的B7H6作为抗原来获得。特别有用的抗人B7H6单克隆抗体与B7H6特异结合。抗体如果表现出以下两个特性中的至少一个，即可认为是特异结合(I)抗体以阈值水平的结合活性与B7H6结合，和(2)抗体和B7H6的相关多肽不发生显著交叉反应。对于第一个特点，抗体如果与B7H6多肽、肽或表位以IO6M.1或以上的结合亲和 力(Ka),优选IO7IT1或以上,更优选IO8IT1或以上,最优选IO9IT1或以上的结合亲和力结合，它们是特异结合的。抗体的结合亲和力可以由本领域普通技术人员通过例如Scatchardanalysis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660，1949)很容易地确定。对于第二个特点，如果例如利用标准的Western印迹分析，抗体可以检测到B7H6，但不能检测到目前已知的多肽，就可以说抗体与相关多肽分子不发生显著交叉反应。已知的相关多肽的例子包括已知的B7家族成员。抗人B7H6单克隆抗体可以利用带有B7H6抗原表位的肽和多肽来生产。带有抗原表位的肽和多肽通常含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中包含的至少9个，或者15到大约30个氨基酸的序列。但是，包含更大一部分发明所述氨基酸序列的肽或多肽也可以用于诱导能与B7H6结合的抗体，所述肽或多肽含有30到50个氨基酸，或者是最多并且包括B7H6多肽的整个氨基酸序列的任何长度。希望选择的所述带有表位的肽的氨基酸序列能够实现在水溶剂中的较大溶解度(即序列包括相对亲水的残基，而一般避免疏水残基)。此外，含有脯氨酸残基的氨基酸序列也是有利抗体制备的。B7H6中的潜在抗原位点可以利用比如LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI)中 PROTEAN 程序(3. 14 版本)执行的 Jameson-Wolf 方法(Jameson andWolf (CABI0S4:181, 1988)进行鉴定。该分析中可以使用缺省参数。Jameson-Wolf方法通过联合6个主要的蛋白结构预测子程序来预测潜在的抗原决定簇。例如，首先可以利用Hopp-Woods方法(参见Hopp et al.，Proc. Nat’I Acad. Sci.USA 78:3824, 1981)鉴定代表局部亲水性最高的区域的氨基酸序列(参数7个残基的平均值)。第二步，可以利用 Emini 的方法(参见 Emini et al. , J. Virology 55:836，1985)计算表面概率(参数表面决策阈值(0. 6)=1)。第三,可以利用Karplus-Schultz方法(Karplusand Schultz, Naturwissenschaften 72:212, 1985)预测主链柔性(参数:柔性阈值(0. 2) =1)。在分析的第四和第五步,利用 Chou-Fasman (参见Chou, “Prediction of ProteinStructural Classes from Amino Acid Composition, ” in Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation 549-586(Fasman, ed. , PlenumPress 1990))和 Garnier-Robson(参见 Garnier et al. , J. Mol. Biol. 120:97, 1978)的方法对数据实行二级结构预测(Chou-Fasman参数构象表格=64个蛋白质；a区阈值=103; ^区阈值=105;Garnier-Robson参数a和0决策常数=0)。在第6个子程序中，结合柔性参数和亲水性/溶剂可及性因子来确定表面外形数值，指定为“抗原性指数”。最后，对抗原性指数运用峰加宽函数，所述函数通过增加对应峰值的20、40、60或80%使主要表面峰加宽从而计算表面区域相对内部区域的移动所产生的附加自由能。但这种计算通常不会应用在任何位于螺旋区内的主要峰，因为螺旋区倾向于有较低的柔性。产生单克隆抗体的方法是公知的。例如针对特定抗原的啮齿单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得(参见例如Kohler et al. , Nature256:495, 1975; Coliganet al. (eds. ), Current Protocols in Immunology, Vol. 12. 5. 1-2. 6. 7 (John Wiley &Sons 1991) [ “Coligan，，]; Picksley et al. , “Production of monoclonal antibodiesagainst proteins expressed in E.coli，，，in DNA Cloning2:Expression Systems, 2ndEdition 93 (Glover et al. , eds. , Oxford University Press 1995)。某些变化形式中，获取单克隆抗体是通过用包含B7H6基因产物(例如包含SEQ ID NO: 2中残基25-266或者由其组成的多肽)的组合物注射小鼠、取血清样品验证有抗体产生、移取脾获得B淋巴细胞、将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤、克隆杂交瘤、挑选能够产生针对抗原的抗体 的阳性克隆、培养产生针对抗原的抗体的克隆并从杂交瘤培养物中分离抗体。抗人B7H6单克隆抗体也可以是人单克隆抗体，或者来源于人单克隆抗体的抗体。可以从转基因小鼠获得人单克隆抗体，所述小鼠经过基因改造能够在应答抗原攻击时产生特异人抗体。在该项技术中，人重链和轻链基因座中的元件被导入由胚胎干细胞系衍生的小鼠株中，后者含有被定向破坏了的内源重链和轻链基因座。转基因小鼠可以合成针对人抗原的特异性人抗体，并且小鼠可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤。例如Greenet al. , Nature Genet. 7:13, 1994;Lonberg et al. , Nature 368:856，1994;和 Taylor etal.，Int. Immun. 6:579, 1994中描述了由转基因小鼠获得人抗体的方法。产生或者挑选单克隆抗体的替代技术包括，例如体外将淋巴细胞与B7H6蛋白或肽进行接触和从噬菌体或类似载体中的抗体展示文库中挑选抗体(例如，通过利用固定化或标记的B7H6蛋白或肽)。制备和筛选这类抗体展示文库的技术是本领域已知的(参见例如美国专利 5，580，717,5, 885，793,5, 969，108 和 6，040，136)。单克隆抗体可以通过多种成熟技术从细胞培养物中得以分离和纯化。这类分离技术包括例如，用蛋白A Sepharose进行的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析(参见例如 Coligan at pages 2. 7. 1-2. 7. 12 和 pages 2. 9. 1-2. 9. 3;Baineset al. , “Purification of Immunoglobulin G(IgG),，，in Methods in MolecularBiology (Vol. 10)79-104(The Humana Press,Inc. 1992))。单克隆抗体的氨基酸序列通过采用重组DNA技术可以有所不同。因此，可以重新设计抗体以得到所需的特点。经过改造的抗体相对其未改造形式可以带来例如改善的稳定性和/或治疗效力。可能的变化有很多，从只改变一个或少量几个氨基酸到例如可变区或恒定区的完全重新设计。通常为了提高或改变诸如补体结合、与膜的相互作用以及其他效应子功能的特性，要对恒定区进行改变。一般来说，要在可变区内进行改变以便提高抗原结合特性、提高可变区稳定性或减少免疫原性的危险。也可以采用噬菌体展示技术。参见例如 Huse et al. , Science 246:1275-1281，1989; Ladner et al.,美国专利 5，571，698。在一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体是包含完整(整个)抗体的抗原结合结构域的抗体片段。这类抗体片段可以通过例如对抗体进行蛋白水解获得。可以通过常规方法用胰蛋白酶或木瓜酶对完整抗体消化来获得抗体片段。作为一个实例，抗体片段的产生可以用胰蛋白酶对抗体进行酶法切割从而得到表示为？(&13’)2的55片段。该片段可以进一步用巯基还原剂切割产生3. 5S Fab’单价片段。任选地，进行切割反应时可以使用硫氢基(切割二硫键产生的)的封闭基团。作为替代方法，利用胰蛋白酶进行的酶法切割可以直接产生两个单价Fab片段和F。片段。这些方法在例如授予Goldenberg的美国专利 4，331，647;Nisonoff et al. , Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960;Porter, Biochem.J. 73:119，1959;Edelman et al. , in Methods in Enzymology(Vol. I)422(Academic Press1967);以及 Coligan(2. 8. 1-2. 8. 10 和 2. 10. -2. 10. 4 页)中有描述。还可以使用其他抗体切割方法，比如将重链分开形成单价轻链-重链片段；片段的进一步切割；或者其他酶学、化学或者基因技术，只要片段能够与完整抗体所识别的抗原
彡口口 例如，Fv片段包含VdP八链的关联。这种关联可以是非共价的，正如Inbar et al. ,Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 69:2659，1972描述的。或者，可变链可以通过分子内二硫键或者化学物质(比如戍二醒)的交联连接在一起(参见例如Sandhu, Crit. Rev.Biotech.12:437， 1992)。Fv片段可能包含通过连接肽连接的Vh和\链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)的制备是通过构建结构基因，所述结构基因包含通过寡核苷酸连接在一起的编码Vh和\结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，后者随后被导入宿主细胞，比如大肠杆菌。重组宿主细胞合成单个多肽链，其带有衔接两个V结构域的连接肽。例如Whitlowet al. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97，1991 描述过制备 scFvs的方法(还可以参见Bird et al. , Science 242:423，1988;授予Ladner等的美国专利
4,946, 778; Pack et al. , Bio / Technology 11:1271，1993 和 Sandhu,同前)。作为一个实例，scFv可以通过筛选scFvs文库(例如scFvs展不文库)中与B7H6 (例如，固定化的或者带标记的B7H6蛋白或肽)的特异结合来获得。另一种形式的抗体片段是代表单个互补决定区(OTR)的肽。⑶R肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体CDR的基因来获得。这类基因是通过例如利用聚合酶链式反应制备的，从而可以由抗体产生细胞的RNA来合成可变区(参见例如Larrick etal. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991;Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,，，in Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application 166 (Ritter et al. , eds. , CambridgeUniversity Pressl995);以及Ward et al. ,“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies,，，in Monoclonal Antibodies!Principles and Applications 137 (Birch etal. , eds. , ffiley-Liss, Inc. 1995))。备选地，抗人B7H6单克隆抗体可以是来源于非人抗B7H6抗体的“人源化”单克隆抗体。人源化单克隆抗体是通过将非人(例如，小鼠)免疫球蛋白重和轻可变链的非人互补决定区转移到人可变结构域中产生的。然后将非人抗体框架区内的人抗体典型残基取代。使用人源化单克隆抗体避免了小鼠恒定区相关的潜在问题。克隆小鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术在例如Orlandi et al. , Proc. Nat' I Acad. Sci. USA86:3833，1989中有描述。制备人源化单克隆抗体的技术由例如Jones et al. , Nature321:522, 1986;Carter et al. , Proc. Nat1 I Acad. Sci. USA 89:4285, 1992;Sandhu, Crit.Rev. Biotech. 12: 437, 1992 ; Singer et al. , J. Immun. 150 : 2844, 1993 ; Sudhir (ed.),Antibody Engineering Protocols(Humana Press,Inc. 1995);Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies,，，in Protein Engineering:Principles and Practice399-434(Cleland et al. , eds. , John Wiley & Sons, Inc. 1996);以及授予Queen等的美国专利5，693，762描述过。某些变化形式中，抗人B7H6单克隆抗体包含Fe区，所述Fe区包含免疫球蛋白(Ig)重链的Ch2和Ch3结构域，并且一般还含有部分Ig铰链区。IgG的非常有利的属性中的两个是Fe引起的召集效应子功能和较长的血清半寿期。对抗体附着其上的靶细胞的杀伤能力来源于经由Fe分别与Fe受体和补体蛋白Clq的结合引起的免疫效应途径(ADCC)和补体途径(CDC)的活化。结合是由主要位于铰链区下半部和CH2结构域上半部的残基介导的(参见例如 Wines et al. , J. Tmmuno1. 164:5313, 2000;ffoof and Burton, Nature Reviews4:1, 2004)。IgG表现出来的较长血清半寿期是由Ch2和Ch3结构域内的氨基酸与新生儿Fe受体一FcRn之间的pH依赖性相互作用介导的(参见例如Getie and Ward, Immunology Today 18:592, 1997;Petkova et al.，Int. Immunol. 18:1759，2006)。相应地，在包含Fe区的抗人B7H6单克隆抗体的某些实施方案中，所述Fe区具有ADCC和/或CDC活性。这类抗体对于介导杀伤表达B7H6的靶细胞，例如癌细胞或病毒感染细胞尤其有用。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体包含的Fe区缺少一或多种效应子功能(例如，缺乏ADCC和/或CDC活性)。获得缺少效应子功能或者效应子功能极大地降低的Fe区可以通过例如给天然Fe区序列引入一或多个氨基酸取代，从而使得Fe区与溶胞性Fe受体和/或Clq补体蛋白不能结合或者结合极大地降低。有多种经过改造的缺少效应子功能或者效应子功能极大降低的Fe区是本领域已知的。特别合适的缺少效应子功能或者效应子功能极大降低的Fe区包括例如美国专利申请公开2009/0220502中描述的Fe区变体。某些包含Fe区的实施方案中，所述Fe区是单链Fc(ScFc),其包含两个通过柔性连接分子相连的Fe结构域单体,这样两个Fe单体能够二聚化形成有功能的二聚Fe结构域。例如，在包含scFc的抗人B7H6单克隆抗体的一些变化形式中，抗体包含与scFc部分融合的单链Fv(scFv)，其中所述scFv部分特异结合B7H6。单链Fe多肽，包括含有scFc和另一个抗原结合结构域(例如scFv)的融合多肽在名为“Single Chain Fe, Methods ofMaking, and Methods of Treatment” 的国际 PCT 专利申请 WO 08/0131242 中有进一步描述，该专利申请的公开内容通过引用全部并入本文。此外，本发明的抗人B7H6单克隆抗体或抗体片段可以利用本领域和本文描述的方法进行PEG化。抗人B7H6单克隆抗体可以偶联上可检测标记从而形成抗B7H6免疫偶联物。合适的可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶态金。制成和检测这类带有可检测标记的免疫偶联物的方法是本领域技术人员熟知的，下文有更详细描述。可检测标记可以是能够通过放射自显影检测的放射性同位素。对于本发明的目的尤其有用的同位素是3h、125i、131i、35s和14C0抗B7H6免疫偶联物还可以用荧光化合物标记。通过将免疫偶联物暴露于合适波长的光并检测产生的荧光可以证实荧光标记抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。备选地，抗B7H6免疫偶联物可以通过给抗体偶联上化学发光化合物而带上可检测标记。通过检测化学反应过程中出现发光现象可以证实带化学发光物标签的免疫偶联物的存在。化学发光标记化合物的例子包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。类似地，可以利用生物发光化合物来标记本发明的抗B7H6免疫偶联物。生物发光是可见于生物系统的一类化学发光现象，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可以通过检测发光现象来确认。可用于标记的生物发光化合物包括虫萤光素、虫萤光素酶和水母发光蛋白。
备选地，抗B7H6免疫偶联物可以通过将抗人B7H6单克隆抗体连接到酶上而带上可检测的标记。当抗B7H6-酶偶联物在有合适底物的情况下温育时，酶部分与底物反应产生可以通过例如分光光度法、荧光测定或目测手段来检测的化学部分。可以用来可检测地标记多特异性免疫偶联物的酶的例子包括3 -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。本领域技术人员知道其他可用于本发明的合适标记。标记物部分与抗人B7H6单克隆抗体的结合可以利用本领域的已知标准技术来实现。这方面的典型方法学在Kennedyet al.，Clin. Chim. Acta 70: 1，1976 ; Schurs et al. , Clin. Chim. Acta 81: 1，1977; Shihet al. ,Intr I J. Cancer 46:1101，1990;Stein et al.，Cancer Res. 50:1330，1990;和Coligan(同前)中有描述。此外，使用偶联有抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素的抗人B7H6单克隆抗体可以进一步提高免疫化学检测的便利性和多能性(参见例如Wilchek etal. (eds.), ‘‘Avidin-Biotin Technology, Methods In Enzymology (Vol. 184) (AcademicPress 1990);Bayer et al. , “Immunochemical Applications of Avidin-BiotinTechnology, ” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson，ed.，TheHumana Press, Inc. 1992))。实施免疫分析的方法已经成熟(参见例如Cook and Self，“MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays，，，in Monoclonal Antibodies:Production，Engineering，and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman，eds.，CambridgeUniversity Press 1995);Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in theAdvancement of Immunoassay Technology, ”in Monoclonal Antibodies:Principles andApplications 107-120 (Birch and Lennox, eds. , Wiley-Lissj Inc. 1995);Diamandis, Immunoassay (Academic Press,Inc.1996))。IV.抗人B7H6单克降抗体-葯物偶联物本发明另一方面提供了抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物。“抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物”本文中是指偶联有治疗剂的抗人B7H6单克隆抗体(如Section III中的描述，同前)。这类抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物在被给予受试对象时，一般是单独给予但也可以与其他治疗剂联用，对B7H6表达细胞能够产生临床上的有益效果，所述受试对象是例如患有B7H6表达性癌症的个体。在典型实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被偶联了细胞毒性剂，从而使得所得到的抗体-药物偶联物在被B7H6表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)摄取或内化时，对所述细胞能够发挥细胞毒或抑制细胞效应。尤其适合与抗体偶联的部分是化学治疗剂、前药转换酶、放射性同位素或化合物，或者毒素。例如，可以给抗人B7H6单克隆抗体偶联上细胞毒性剂，比如化学治疗剂(参见下文)或毒素(例如，抑制细胞性的或者杀细胞性的试剂，比如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。下文提供了适合与抗人B7H6单克隆抗体偶联的其他试剂的例子。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被偶联了前药转换酶。所述前药转换酶可以利用已知方法通过重组融合到抗体上或者以化学方法偶联到抗体。示范性的前药转换酶是羧肽酶G2、P -葡糖苷酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、^ -内酰胺酶、P -半乳糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
将治疗剂与蛋白(特别是抗体)偶联的方法是已知的(参见例如Arnonet al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy,，，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (ReisfeId et al. eds. , AlanR. Liss, Inc.，1985) ; Hellstrom et al. , “Antibodies For Drug Delivery,，，inControlled Drug Delivery(Robinson et al.eds. , Marcel Deiker, Inc. , 2nded. 1987);Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview,，，in Monoclonal Antibodies ' 84:Biological And Clinical Applications(Pinchera et al. eds. , 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of theTherapeutic Use ofRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy, ” in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al. eds. , AcademicPress, 1985);和 Thorpe et al. , 1982, Immunol. Rev. 62:119-58。还可参见例如 PCT 公开W089/12624)。某些变化形式中，按照本文描述的方法，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被B7H6表达细胞内化并累积，所述抗体-药物偶联物即在这些细胞中发挥治疗效果(例如，细胞毒性或者抑制细胞效应)。确定累积和累积速率的方法可以在例如名为“DrugConjugates and Their Use for Treating Cancer, an Autoimmune Disease or anInfectious Disease” 的 WO 2004/010957 中找到。在典型实施方案中，当使用偶联有治疗剂(例如，药物或前药转换酶)的抗人B7H6单克隆抗体时，优选试剂在被待治疗的B7H6表达细胞(例如，B7H6表达性癌症的细胞)内化时有活性。其他实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物不被内化，而药物能够通过结合到细胞膜上发挥治疗效果(例如，消除B7H6表达细胞或者抑制其生长)。为了使治疗剂在B7H6-表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)以外的活性最小化，治疗剂的偶联方式通常使得它活性下降，除非被从抗体上切割下来(例如，通过水解或切割试剂)。这类实施方案中，治疗剂通过可切割的连接分子附着到抗体上，所述连接分子对B7H6表达细胞的胞内环境中的切割敏感，但对胞外环境基本不敏感，这样在被B7H6表达细胞内化时，偶联物即被(例如，在内体，或者例如借助PH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境或者质膜微囊中)从抗体上切割下来)(参见下文IV(A)部分)。此外，某些实施方案中，抗体-药物偶联物包含的治疗剂相对质膜带有电荷，从而进一步降低试剂在被细胞内化后穿过质膜的能力。本文中，“带电荷的试剂”意味着试剂(a)是极化的，所述试剂的一个区域相对质膜带有电荷，或者(b)相对质膜带有净电荷。A.连接分子一般来说，B7H6抗体-药物偶联物包含位于治疗剂和抗人B7H6单克隆抗体之间的连接分子区。正如上文指出的，在某些实施方案中，连接分子在胞内条件下可以被切割，连接分子在胞内环境中的切割使治疗剂被从抗体上释放。例如，在一些实施方案中，所述连接分子可以被存在于胞内环境(例如处于溶酶体或内体或质膜微囊内)的切割剂切割。连接分子可以是例如肽连接分子，可以被胞内肽酶或蛋白酶，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶切割。一般来说，肽连接分子是至少两个氨基酸长，或者至少三个氨基酸长。切割剂可以包括cath印sins B和D以及胞质素 (plasmin)，这三者已知可以水解二肽药物衍生物，导致有活性的药物在靶细胞内被释放(参见例如 Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123,1999)。最典型的是可以被B7H6表达细胞中存在的酶切割的肽连接分子。例如，可以使用能够被在癌变组织中高度表达的巯基依赖性蛋白酶cathepsin-B切割的肽连接分子(例如Phe-Leu或者Gly-Phe-Leu-Gly连接分子)。其他这类连接分子在例如美国专利6，214，345中有描述。特定实施方案中，可以被胞内蛋白酶切割的肽连接分子是Val-Cit (缬氨酸-瓜氨酸)连接分子或者Phe-Lys (苯丙氨酸-赖氨酸)连接分子(参见例如美国专利6，214，345，该专利描述了带有Val-Cit连接分子的多柔比星(doxorubicin)的合成)。利用胞内蛋白水解来释放治疗剂的一个优点是试剂在偶联状态时通常是弱化的，偶联物的血清稳定性一般较高。在其他实施方案中，可切割的连接分子是pH敏感的，即对在某个pH值的水解敏感。一般来说，对PH敏感的连接分子在酸性条件下可被水解。例如，可以使用在溶酶体中可被水解的酸不稳定连接分子(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等等)(参见例如美国专利5，122，368,5, 824，805,5, 622，929;Dubowchikand Walker,Pharm. Therapeutics 83:67-123，1999;Nevi I Ie et al. , Biol.Chem. 264:14653-14661，1989)。这类连接分子在中性pH条件(比如血液中的条件)下相对稳定，但在pH 5. 5或5. 0 (溶酶体的大概pH)以下时不稳定。在某些实施方案中，可水解的连接分子是硫醚连接分子(比如，例如通过酰腙键附着到治疗剂上的硫醚(参见例如美国专利 5,622,929))。还有一些实施方案中，连接分子在还原条件下是可切割的(例如，二硫化物连接分子)。多种二硫化物连接分子是本领域已知的，包括例如可以利用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-硫代吡啶)丙酸酯)、SH)B(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-硫代吡啶)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-羰氧基-a -甲基-a-(2-硫代吡啶)甲苯)、SPDB、以及SMPT形成的那些二硫化物连接分子(参见例如 Thorpe et al. , Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al. , InImmunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagety and Therapy of Cancer(C.W. Vogel ed. , Oxford U. Press, 1987。还可见美国专利 4，880，935)。再有一些变化形式中，连接分子是丙二酸连接分子(Johnson et al. , AnticancerRes. 15:1387-93，1995)、马来酰亚胺苯甲酰连接分子(Lau et al.，Bioorg-Med-Chem. 3:1299-1304, 1995)、或者 3’ -N-酰胺类似物(Lau et al.，Bioorg-Med-Chem. 3:1305-12，1995)
O一般来说，连接分子对胞外环境基本不敏感。本文中，就连接分子而言的“对胞外环境基本不敏感”意味着抗 体-药物偶联物样品中不超过大约20%，普遍来说不超过等于15%，更普遍来说不超过大约10%，甚至更普遍来说不超过大约5%，不超过大约3%，或者不超过大约1%的连接分子，在所述抗体-药物偶联物处于胞外环境(例如，在血浆中)时被切害I]。要确定连接分子对胞外环境是否基本不敏感可以通过例如将血浆分别与(a)抗体-药物偶联物(“抗体-药物偶联物样品”)和(b)等摩尔量的未偶联抗体或治疗剂(“对照样品”)温育预先确定的一段时间(例如2、4、8、16或24小时)，然后将通过例如高效液相层析测量到的抗体-药物偶联物样品中存在的未偶联抗体或治疗剂与对照样品存在的进行比较。—些变化形式中,连接分子能够促进细胞内化。某些实施方案中，当连接分子与治疗剂偶联(即，位于抗体-药物偶联物的连接分子-治疗剂部分之中)时，细胞内化得以增强。而其他实施方案中，当连接分子与治疗剂和抗B7H6抗体均偶联(即，位于抗体-药物偶联物之中)时，细胞内化得以增强。可以用于本发明的组合物和方法的多种连接分子在例如名为“Drug Conjugatesand Their Use for Treating Cancer, an Autoimmune Disease or an InfectiousDisease” 的 WO 2004/010957 中有描述。B.治疗剂按照本发明，能够对B7H6表达细胞发挥治疗效果的任何试剂可以作为与抗人B7H6单克隆抗体进行偶联的治疗剂。某些实施方案中，比如治疗B7H6表达性癌症，治疗剂是细胞毒性剂。有用的细胞毒性剂种类包括，例如抗微管蛋白剂、auristatins、DNA小沟结合齐U、DNA复制抑制剂、烷基化剂(例如，钼络合物，比如顺钼、单(钼)、双(钼)以及三核钼络合物和卡钼)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、duocarmycins、依托泊式(etoposides)、氟化嘌卩密唳剂、离子载体、lexitropsins、nitrosoureas、普拉汀诺(platinols)、预形成化合物(pre-forming compounds)、嘌呤拮抗剂、嘌呤霉素、放疗增敏齐U、类固醇、紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。具体细胞毒性剂包括例如，雄激素\安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、白消安(busulfan)、丁胱亚磺酰亚胺(buthionine sulfoximine)、喜树喊(camptothecin)、卡钼、卡莫司汀(carmustine (BSNU) )、CC-1065 (Li et al. , CancerRes. 42:999-1004, 1982)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺钼、秋水仙喊(colchicine)、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞喃唳阿拉伯糖苷、细胞松弛素B、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(以前称为放线菌素)、道诺霉素(daunorubicin)、decarbazine、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、依托泊甙磷酸酯(VP-16)、5_氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异磷酰胺、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(Iomustine)(CCNU)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、6_巯基嘌呤、氨甲蝶呤、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素C、米托蒽醌(mitoxantrone)、硝基咪唑、太平洋紫杉醇、普卡霉素(plicamycin)、普鲁节肼(procarbizine)、链脲霉素(streptozotocin)、替尼泊苷(tenoposide, VM-26)、6_硫鸟嘌呤、硫ΤΕΡΑ、拓扑特肯(topotecan)、长春碱(vinblastine)、长春新喊(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine)。特别合适的细胞毒性剂包括例如，海兔毒素(例如auristatin E、AFP、MMAF,MMAE)、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类和lexitropsins)、倍癌霉素(duocarmycins) >紫杉醇(例如太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇)、嘌呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)，拓扑特肯、吗啉-多柔比星、根霉菌素(rhizoxin)、cyanomorpholino-多柔比星、棘霉素(echinomycin)、combretastatin、纺锤菌素(netropsin)、埃博霉素 A 和 B、雌莫司汀(estramustine)、cryptophysins、西马多丁(cemadotin)、美登类化合物(maytansinoids)、discodermolide、eleutherobin 以及米托蒽醌。某些实施方案中，细胞毒性剂是常规的化疗剂，比如例如多柔比星、太平洋紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、氨甲蝶呤、丝裂霉素C或依托泊甙。此外，诸如CC-1065类似物、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、海兔毒素10的类似物、根霉菌素和沙海 葵毒素(palytoxin)的强力试剂可以与抗B7H6表达抗体连接。在特定变化形式中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是auristatin E (现有技术中又称为海兔毒素10)或其衍生物。一般来说,auristatin E衍生物是例如auristatinE和酮酸之间形成的酯。例如，auristatin E可以分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戍酸反应产生AEB和AEVB。其他典型的auristatin衍生物包括AFP (二甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脑氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-p-苯二胺)、MMAF (dovaline-缴氨酸-海兔异亮氨酸-dolaproine-苯丙氨酸)和MAE ( —甲基auristatin E)。Auristatin E及其衍生物的合成和结构在美国专利申请公开20030083263;国际专利公开 WO 2002/088172 和 W02004/010957;以及美国专利 6，884，869,6, 323，315,6, 239，104、6，034，065,5, 780，588,5, 665，860,5, 663，149,5, 635，483,5, 599，902,5, 554，725、5，530，097,5, 521，284,5, 504，191,5, 410，024,5, 138，036,5, 076，973,4, 986，988、4，978，744,4, 879，278,4, 816，444 和 4，486，414 中有描述。其他变化形式中，细胞毒性剂是DNA小沟结合剂(参见例如美国专利6，130，237)。例如，在某些实施方案中，所述小沟结合剂是CBI化合物。其他实施方案中，小沟结合剂是烯二炔(例如，卡奇霉素)。某些实施方案中，抗体-药物偶联物包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的例子包括，例如紫杉醇(例如Taxol (太平洋紫杉醇)、Taxotere (多烯紫杉醇))、T67 (Tularik)、长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨)和海兔毒素(例如，auristatin E、AFP、MMAF, MMAE, AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白剂包括，例如浆果赤霉素(baccatin)衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A和B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱和秋水仙胺、雌氮芥、cryptophysins、西马多丁、美登类化合物、combretastatins、discodermolide 和 eleutherobin。在一些实施方案中，细胞毒性剂是另一组抗微管蛋白剂-美登类化合物。例如，在特定实施方案中，美登类化合物是美登素或DM-I (ImmunoGen, Inc.;还可参见 Chari et al. , Cancer Res. 52:127-131，1992)。其他实施方案中，细胞毒性剂是抗代谢物。所述抗代谢物可以是例如嘌呤拮抗剂(例如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酹酸酯(mycophenolate mofetil))、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，氨甲蝶呤)、无环鸟苷、丙氧鸟苷(gangcyclovir)、叠氮胸苷(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韦林(ribavirin)、叠氮胸苷(azidothymidine)、胞卩密唳阿拉伯糖苷、金刚烧胺(amantadine)、二脱氧尿苷、碘脱氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或三氟胸苷。C.抗B7H6抗体-药物偶联物的 形成抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的制备可以通过本领域技术人员已知的任何技术来完成。简单来说，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物包含抗人B7H6单克隆抗体、药物以及任选的将药物和抗体连接在一起的连接分子。有多种不同反应可用于将药物共价连接到抗体上。这经常是通过抗体分子的氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基)、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧基、半胱氨酸的巯基以及芳香族氨基酸的各种部分的反应实现的。最常用的非特异性共价连接方法之一是将化合物的羧基(或氨基)与抗体的氨基(或羧基)连接的碳化二亚胺反应。此外，双功能试剂，比如二醛或亚氨酸酯也曾被用于连接化合物的氨基和抗体分子的氨基。还可用于药物与抗体连接的是席夫碱反应(Schiff base reaction)。该方法包括将含有乙二醇或羟基的药物进行过碘酸氧化，然后将这样形成的醛与抗体分子反应。通过与抗体分子的氨基形成席夫碱而发生连接。异硫氰酸酯也可以作为将药物与抗体共价连接的偶联剂。其他技术是本领域技术人员已知，也在本发明的范围内。这类技术的非限制性实施例在例如，美国专利5，665，358,5, 643，573和5，556，623中有描述。在一些实施方案中，作为连接分子的前体的中间体在合适的条件下与药物进行反应。某些实施方案中，活性基团被用于药物和/或中间体。药物和中间体之间的反应产物，或者药物衍生物随后与抗人B7H6单克隆抗体在合适的条件下反应。D.细胞毒或者抑制细胞活性的检验方法某些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物包含偶联了细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体，从而所述抗体-药物偶联物对B7H6表达细胞(例如，B7H6表达癌细胞)能够发挥细胞毒或细胞抑制效应。可以用于检测抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的细胞毒效应或细胞抑制效应的B7H6表达细胞可以是培养细胞系，比如例如下文表5中列举的那些。抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物一经证实能够对B7H6表达细胞发挥细胞毒或细胞抑制作用，即可在合适的动物模型中验证其治疗价值。在优选实施方案中，包含细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被用于治疗B7H6表达性癌症。下文V(B)部分和实施例X中描述了可以用于评估发明所述抗体-药物偶联物的治疗效果的多种癌症的示范性动物模型。确定试剂对细胞是否有细胞毒或细胞抑制效应的方法一般是本领域已知的。这类方法的说明性例子在下文有描述。证实对B7H6表达细胞有任何这类效果即表明抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物能够用于治疗或防止那些其病理至少部分是由B7H6表达细胞的异常生长或活化介导的疾病或紊乱，比如例如B7H6表达性癌症。为了确定抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物是否对B7H6表达细胞有细胞抑制效应，可以利用胸腺嘧啶核苷掺入法。例如，可以将96孔板上密度为5000细胞/孔的B7H6表达细胞培养72小时，在72小时时间段的最后8小时与0. 5 μ Ci的3H-胸腺嘧啶核苷接触，并在有和没有抗体-药物偶联物的情况下测量3H-胸腺嘧啶核苷掺入细胞的情况。
为了确定细胞毒性，可以测量坏死或细胞凋亡(程序化细胞死亡)。坏死通常伴有细胞质膜通透性提高、细胞肿胀和细胞质膜的破裂。细胞凋亡的特征通常在于膜起泡、细胞质凝聚和内源核酸内切酶的活化。细胞活性的测量可以通过确定细胞摄取染料，比如中性红、台盼蓝或者AhnnarBIueiH' (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH)的情况。还可参见例如 Pageet al.,Intl. J. of Oncology 3:473-476,1993。在这类分析法中，细胞温育在含有染料的培养基中，将细胞洗涤，经分光光度术测量存留的染料，反映细胞所摄取的染料。蛋白结合染料磺酰罗丹明B(SRB)也可以用于测量细胞毒性(Skehan et al.，J. Nat' I CancerInst. 82:1107-12，1990)。备选地，诸如MTT等四氮唑盐(tetrazolium salt)被用于通过仅检测活细胞进行的定量比色试验来分析哺乳动物细胞的存活和增殖(参见例如Mosmann, J. Immunol.Methods 65:55-63， 1983)。细胞凋亡可以通过测量例如DNA片段化来进行定量。DNA片段化的体外定量确定 有商业光度测定方法可供使用。这类分析法的例子，包括TUNEL (检测被片段化的DNA中掺入带标记核苷酸的情况)和基于ELISA的分析法,在Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)中有描述。细胞凋亡还可以通过测量细胞中的形态变化来确定。例如，和对于坏死一样，通过测量某些染料的摄取可以确定细胞质膜完整性的丧失(例如，荧光染料，比如例如吖啶橙或溴化乙锭)。测量凋亡细胞数量的方法已由Dukeand Cohen, Current Protocols InImmunology (Coligan et al. eds. , 1992, pp. 3. 17. 1-3. 17. 16)描述过。还可以用 DNA 染料(例如，吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)将细胞标记，观察细胞中染色质凝聚和沿内核膜着边的情况。其他可以测量用于确定凋亡的形态变化包括例如细胞质浓缩、膜起泡增加和细胞皱缩。附着的和“浮动”的培养物区域内都可以测量是否存在凋亡细胞。例如，两种区域的采集可以通过移去上清、对附着细胞进行胰蛋白酶解、离心洗涤步骤(例如，10分钟，2000rpm)后将制品合并以及检测凋亡(例如，通过测量DNA片段化)(参见例如Piazza etal. , Cancer Research 55:3110-16，1995)。V.使用方法A.总论本发明另一方面提供了调控NKp30表达细胞，包括例如自然杀伤(NK)细胞和T细胞(例如CD8+T细胞)的活性(例如溶细胞活性)的方法。这类方法包括例如与NKp30表达细胞活性提高相关的疾病或紊乱的治疗方法。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM1-4242) ; (ii)克隆9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243) ; (iii)克隆10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和(iv)克隆17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)。特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)的杂交瘤产生的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体用于干扰B7H6和NKp30的相互作用。用于这类实施方案，方法包括在有NKp30表达细胞的情况下，将表达功能性B7H6的细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体或者其他能够干扰B7H6和NKp30的相互作用的试剂进行接触。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体,所述杂交瘤是(i)克隆4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)或者(ii)克隆17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM1-4245)。在特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)和(ii)的杂交瘤产生的抗体。这类方法可以在体外、离体或体内实施。某些优选变化形式中，NKp30表达细胞是NK细胞，调节NK细胞活性的用途或方法是为了例如治疗与NK细胞活性提高相关的疾病或紊乱。其他变化形式中，NKp30表达细胞是NKp30表达T细胞(例如⑶8+T细胞)，调节NKp30表达T细胞活性的用途或方法是为了例如治疗与NKp30表达T细胞活性提高相关的疾病或紊乱。某些T细胞(包括⑶8+T细胞)已被证实能够表达NKp30 (参见例如 Srivastava and Srivastava, Leuk. Res. 30:37-46, 2006) 正如以上提及的，在某些变化形式中，本发明的抗体是用于治疗与NK细胞活性相关的疾病或紊乱。例如，在一些实施方案中，使用所述抗体的方法包括将能够干扰B7H6和NKp30的相互作用的有效量抗人B7H6单克隆抗体给予患有或者有风险发展出NK细胞介导的疾病或紊乱(例如，NK细胞介导的同种异体移植排斥，比如，例如NK细胞介导的骨髓细 胞(BMC)同种异体移植排斥)的患者。包含在本发明中的是用于抑制NK细胞介导的骨髓同种异体移植排斥的方法，所述方法包括使用抗人B7H6单克隆抗体。骨髓移植(BMT)已成为治疗各种血液科恶性疾病的一种被认可的疗法。但是同种异体BMT的效力受到某些障碍的限制，比如例如移植物被排斥。充分的证据表明NK细胞是进行骨髓同种异体移植物植入的障碍，NK细胞单独即可介导小鼠中BMC排斥的特异性(参见例如Murphy et al.，J.Exp. Med. 165:1212-1217，1987;Murphy et al. , J. Exp. Med. 166:1499-1509，1987;Murphyet al., J. Tmmunol.144:3305-3311, 1990;Murphy et al. , Eur. J. Tmmunol. 20:1729-1734,1990;Murphy et al.，Immunol. Rev. 181:279-289，2001)。临床上，在接受了 HLA 配型不合BMTs (T细胞被去除，但未经细胞减灭调节)的SCID患者中观察到的同种异体移植阻力是供体NK细胞的高活性造成的(参见O’Reilly et al. , Vox. Sang. 51:81-86, 1986) 相应地，在BMT过程中可以使用本文描述的抗体来抑制NK细胞抗同种异体移植物的溶细胞活性，从而治疗或防止BMC同种异体移植排斥，所述抗体抗B7H6胞外结构域并且能够抑制B7H6和NKp30的相互作用。还有一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或者补体依赖性细胞毒作用(CDC)，用于比如例如治疗以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱。例如，在一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达癌细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。抗体疗法在癌症的治疗中特别成功，因为某些肿瘤会展示独特的抗原、种系特异性抗体或者相对正常细胞抗原的量过多。试验证据显示相对正常组织，许多来源于肿瘤的细胞系高度表达B7H6，所述来源于肿瘤的细胞系包括来源于直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的细胞系，以及那些来源于各种血癌，比如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病的细胞系。这一证据表明B7H6是新的肿瘤特异性或者肿瘤相关性抗原，并且抗人B7H6单克隆抗体可以作为抗肿瘤治疗剂。与单克隆抗体疗法相关的一个机制是抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在ADCC中，单克隆抗体与靶细胞(例如，癌细胞)结合，表达单克隆抗体受体的特异效应细胞(例如，NK细胞、CD8+T细胞、单核细胞、粒细胞)与单克隆抗体/靶细胞复合体结合，造成靶细胞死亡。相应地，在一些实施方案中，包含具有效应子功能的Fe区的抗人B7H6单克隆抗体被用于诱发抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)或者补体依赖性细胞毒作用(⑶C)。诱发ADCC的方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体包含具备ADCC活性的Fe区。该接触步骤是在有溶细胞免疫效应细胞的情况下进行的，所述免疫效应细胞表达具备溶细胞活性的Fe受体。表达溶细胞性Fe受体(例如，Fe Y RIIIa或⑶16)的免疫效应细胞包括例如NK细胞和某些⑶8+T细胞。诱发CDC的方法通常包括将B7H6表达细胞与有效量的抗人B7H6单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体包含具备CDC活性的Fe区。该接触步骤是在有补体的情况下进行的。可以利用所述方法进行靶向杀伤的B7H6表达细胞包括例如癌细胞，比如象结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞和慢性粒细胞白血病细胞等等。合适的抗体包括能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242) ； (ii)克隆9G9. 2的杂交瘤(保藏号 CNCM 1-4243) ; (iii)克隆 10E2. 9 的杂交瘤(保藏号 CNCM 1-4244);和(iv)克隆 17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)。在一些实施方案中，抗体能够与由选自以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6。特定变化形式中，抗体是嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体。相关实施方案中，如本文所述的包含具有效应子功能的Fe区的抗人B7H6单克隆抗体被用于治疗受试对象的B7H6表达性癌症。这类方法通常包括将有效量的抗人B7H6单克隆抗体给予受试对象，所述单克隆抗体包含具有ADCC活性和/或CDC活性的Fe区。特别适合利用这类方法进行治疗的B7H6表达性癌症包括，例如直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或者前列腺癌，以及血癌，比如例如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤或慢性粒细胞白血病。还有一些实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物(参见上文IV部分)被用于将治疗剂递送到B7H6表达细胞，药剂在此发挥治疗效果。这类方法对于以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱的治疗尤其有用。在某些使用抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的优选变化形式中，所述治疗剂是对B7H6表达细胞，比如B7H6表达癌细胞发挥细胞毒或者抑制细胞效应的细胞毒性剂。正如上文指出的，试验证据显示相对正常组织，许多来源于肿瘤的细胞系高度表达B7H6，所述来源于肿瘤的细胞系包括来源于直肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌的细胞系，以及那些来源于各种血癌，比如早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤和慢性粒细胞白血病的细胞系。这一证据表明B7H6是新的肿瘤特异性或者肿瘤相关性抗原，可以用于给在癌症治疗中有治疗效果的试剂，特别是可以消除肿瘤细胞或者抑制其生长的细胞毒性剂导靶。相应地，在一些实施方案中，包含偶联了细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物被用于治疗B7H6表达性癌症。合适的抗体-药物偶联物包括那些含有能够与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体，所述杂交瘤是(i)克隆4E5. 5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242) ; (ii)克隆9G9. 2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243) ; (iii)克隆10E2. 9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和(iv)克隆17B1. 3的杂交瘤(保藏号CNCM1-4245)。在一些实施方案中，抗体-药物偶联物包含能够与由选自以上(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体竞争结合B7H6的抗体。特定变化形式中，抗体-药物偶联物包含嵌合或人源化抗体，其来源于由选自以上(i)-(iv)或者(ii)-(iii)的杂交瘤产生的抗体。在本文描述的治疗方法的每个实施方案中，抗人B7H6单克隆抗体或者抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物的递送方式与要治疗的疾病或紊乱的处置相关的传统方法一致。按照本文的公开内容，将有效量的抗体或抗体-药物偶联物给予需要这类治疗的受试对象，并且给药时间和条件足以防止或治疗所述疾病或紊乱。被给予本文描述的抗人B7H6单克隆抗体或者抗体-药物偶联物的受试对象包括有高于正常的发展出疾病或紊乱的风险的患者，以及已经表现出疾病或紊乱的患者，其中所述疾病或紊乱是NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征。某些实施方案中，受试对象还未受到疾病或紊乱的困扰，用途是进行筛选或诊断。其他一些实施方案中，受试对象已被诊断患有需要所述治疗的疾病或紊乱。此外，在治疗过程中可以监测受试对象是否有疾病或紊乱的任何变化(例如疾病或紊乱的临床症状是否增加或减少)。在预防性应用中，将药物组合物(药物)以足够消除疾病或减少疾病风险或者延迟发病的量给予患者，所述患者是对特定疾病易感或者通过其他方式有患病风险。在治疗应用中，将所述组合物以足够治愈或至少部分地遏制疾病及其并发症症状的量给予患者，所述患者是被怀疑或者已经受到这类疾病的困扰。足够实现以上目的的量是指对于治疗来说或者预防来说有效的剂量或用量。在预防和治疗方案中，通常是将抗体或抗体-药物偶联物以多个剂量给药直至已经达到足够的反应(例如激发合适的NK细胞活性或抑制不当的NK细胞活性)。一般来说，要对反应进行监测，如果期望的反应开始消退可以给予多次剂量。
对于本发明的这样的变化形式，所述变化形式中受试对象还未受到那些NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征的疾病或紊乱的困扰，用途是诊断或者筛选风险提高的受试对象，可以从受试对象中取生物样品，与来自正常或健康个体的生物样品或者预先确定的基础水平进行比较。在受试对象样品中检测到高于来自正常和健康个体的相当生物样品或者基础水平可以确定患癌症的风险。检测本发明所述抗体组合物的方法在V. C部分进行了描述。本发明的组合物和方法可以用于在骨髓移植后的不同时间或者被给予抗癌症药物或治疗后的不同时间，在来自受试对象的生物样品中监测治疗进展。在来自受试对象的生物样品中检测到的B7H6水平作为治疗前水平(Tl)，并与来自相同个体的第二次取的生物样品的治疗后水平(T2)进行比较。B7H6水平升高通常表明疾病的进展，B7H6降低表明疾病的消退。为了鉴定按照本发明的方法进行筛选或治疗的受试患者，可以采用获得认可的筛选方法来确定与特定疾病或紊乱相关的风险因素，所述疾病或紊乱是由NKp30表达细胞介导的或者以存在B7H6表达细胞为特征；或者确定受试对象中鉴定到的已有紊乱的状态。这类方法可以包括，例如确定个体是否有亲戚已被诊断患有特定疾病。筛选方法还可以包括，例如常规工作来确定已知有遗传性组成的特定疾病的家族状况(例如，就BMT而言，临床研究显示某些HLA-C等位基因的存在与BM同种异体移植排斥风险增加有相关性(参见Scott et al. ,Blood 92:4864-4871，1998)，而且已知多种癌症有一定的遗传性组成)。癌症的遗传性组成包括，例如多个基因中的转化性突变(例如Ras、Raf、EGFR、cMet和其他)；某些HLA和杀伤细胞抑制性受体(KIR)分子，或者这样一些机制的存在与否，所述机制是癌症细胞能够通过它直接或者间接地调节对诸如NK细胞和T细胞的细胞的免疫抑制(参见例如 Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Tmmunol. 7:329-339, 2007; Boyton andAltmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007)。为了这个目的,可以常规地使用核苷酸探针来鉴定携带与特定目标疾病相关的遗传标记物的个体。此外，有大量已知的免疫学方法可用于鉴定具体疾病的标记物。例如，有各种本领域公知的采用单克隆抗体探针来检测与特定种类相关的抗原的ELISA免疫检测法可供使用。通过已知的患者症状学、年龄因素、相关风险因素等可以实现筛选。这些方法使得临床医师可以常规地选择需要利用本文描述的方法进行治疗的患者。与这些方法相对应，调节NK细胞活性可以作为独立的治疗流程，或者作为其他治疗的复查、附加或协同治疗方案。B.癌症治疗I.癌症的类型
正如本文描述并经研究证实的，B7H6抗体可以被用于通过活化ADCC或⑶C途径直接杀伤B7H6表达细胞，所述途径的活化经由Fe与Fe受体和补体蛋白Clq的结合。还有一些变化形式中，包含偶联在抗人B7H6单克隆抗体上的细胞毒性剂的抗人B7H6单克隆抗体-药物偶联物可以被用于给B7H6表达癌细胞递送细胞毒性剂，细胞毒性剂在此通过消除癌细胞或者抑制其生长而发挥治疗效果。下表4列举了本发明所述治疗方法适用的一些癌症，主要按照目标部位排列。表4:示范性癌症类型列表
权利要求
1.分离的单克隆抗体，所述抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243); c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)。
2.权利要求I所述的抗体，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
3.权利要求I所述的抗体，其中所述抗体是选自下述的小鼠抗体a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体或其抗原结合片段；b)由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体或其抗原结合片段； c)由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM1-4244)产生的抗体或其抗原结合片段；和d)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM1-4245)产生的抗体或其抗原结合片段。
4.权利要求I的抗体，是人源化抗体，所述人源化抗体来源于选自下述的抗体 a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体； b)由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体； c)由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；和 d)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。
5.权利要求I所述的抗体，其中所述抗体与(a)或(d)的抗体竞争结合人B7H6胞外结构域，并能抑制人B7H6与人NKp30的相互作用。
6.权利要求1、4和5中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
7.权利要求1、2、4和5中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含的Fe区具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种。
8.权利要求7所述的抗体,其中所述Fe区是单链Fe(scFc)。
9.诊断试剂盒，其包含 权利要求1-8中任一项所述的抗体；和 检测所述抗体的结合的装置。
10.组合物，其包含 权利要求1-8中任一项所述的抗体；和 可药用载体。
11.抗体-药物偶联物，其包含 单克隆抗体，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243); c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)；其中所述抗体偶联了细胞毒性剂。
12.权利要求11所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体选自小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
13.权利要求11所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体是人源化抗体，所述人源化抗体来源于选自下述的抗体 a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体； b)由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体； c)由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；和 d)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。
14.权利要求11或13的抗体-药物偶联物，其中所述抗体是单链抗体。
15.权利要求11或13所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体包含的Fe区具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种。
16.权利要求15所述的抗体-药物偶联物，其中所述Fe区是单链Fc(ScFc)。
17.权利要求11-16之一所述的抗体-药物偶联物，其中所述细胞毒性剂选自抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷基化剂、度卡霉素或者嘌呤霉素。
18.权利要求17所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗微管蛋白剂选自海兔毒素、长春碱类、鬼白毒素、紫杉烧、衆果赤霉素衍生物、cryptophysin、类美登醇和combretastatin。
19.权利要求11-16之一所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体经由连接分子偶联了细胞毒性剂。
20.权利要求19所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接分子在胞内条件下是可切割的。
21.权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其中可切割性连接分子是能被胞内蛋白酶切割的连接肽。
22.组合物，其包含 权利要求11-20中任一项所述的抗体-药物偶联物；和 可药用载体。
23.降低人自然杀伤(NK)细胞抗表达人B7H6的细胞的活性的方法，所述方法包括 将表达人B7H6的细胞，在有人NK细胞的情况下，与有效量单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242);和 b)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 其中所述抗体抑制人B7H6与人NKp30的相互作用。
24.治疗受试对象中骨髓细胞(BMC)同种异体移植排斥的方法，包括 将单克隆抗体以有效抑制NK细胞活性的量给予受试对象，从而治疗急性BMC同种异体移植排斥，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242);和 b)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)；其中所述抗体抑制人B7H6与人NKp30的相互作用。
25.权利要求23或24的方法，其中所述抗体是人或人源化单克隆抗体。
26.权利要求23或24所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体，所述人源化抗体来源于选自下述的抗体 a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体；和 b)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。
27.权利要求23或24所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
28.消除包含B7H6表达细胞的细胞群中的B7H6表达细胞或者抑制所述B7H6表达细胞生长的方法，所述方法包括 将有效量抗体-药物偶联物与所述B7H6表达细胞接触，其中所述抗体-药物偶联物包含的单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ IDNO:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 并且其中所述抗体偶联了细胞毒性剂。
29.治疗受试对象中B7H6表达性癌症的方法，所述方法包括 将有效量抗体-药物偶联物给予受试对象，其中所述抗体-药物偶联物包含的单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID N0:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 并且其中所述抗体偶联了细胞毒性剂。
30.权利要求29所述的方法，其中所述B7H6表达性癌症是结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或者前列腺癌。
31.权利要求29所述的方法，其中所述B7H6表达性癌症是早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤、慢性粒细胞白血病或急性淋巴母细胞白血病。
32.权利要求28-31中任一项的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
33.权利要求28-31中任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体，所述人源化抗体来源于选自下述的抗体 a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体； b)由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体； c)由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；和 d)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。
34.权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
35.诱发抗B7H6表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的方法，所述方法包括 将所述B7H6表达细胞与有效量单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 其中所述接触是在有NK细胞的情况下或者有表达具有ADCC活性的Fe受体的CD8+T细胞的情况下进行的，并且其中所述抗体包含能够结合所述Fe受体的Fe区。
36.诱发抗B7H6表达细胞的补体依赖性细胞毒作用(⑶C)的方法，所述方法包括 将所述B7H6表达细胞与有效量单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 其中所述接触是在有补体的情况下进行的，并且其中所述抗体包含具有CDC活性的Fe区。
37.治疗受试对象中B7H6表达性癌症的方法，所述方法包括 将有效量单克隆抗体给予受试对象，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)； 其中所述抗体包含的Fe区具有ADCC活性和⑶C活性中的至少一种。
38.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述抗体是人或人源化抗体。
39.权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体，所述人源化抗体来源于选自下述的抗体 a)由克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)产生的抗体； b)由克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)产生的抗体； c)由克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244)产生的抗体；和 d)由克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)产生的抗体。
40.权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
41.权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述Fe区是单链Fe(scFc)。
42.权利要求35或36所述的方法，其中所述B7H6表达细胞是癌细胞。
43.权利要求42所述的方法，其中所述癌细胞是结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞或前列腺癌细胞。
44.权利要求42所述的方法，其中所述癌细胞是早幼粒细胞白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、T细胞淋巴瘤细胞、单核细胞淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞、慢性粒细胞白血病细胞或急性淋巴母细胞白血病细胞。
45.权利要求37所述的方法，其中所述B7H6表达性癌症是结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
46.权利要求37所述的方法，其中所述B7H6表达性癌症是早幼粒细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、单核细胞淋巴瘤、红白血病、伯基特氏淋巴瘤、慢性粒细胞白血病或急性淋巴母细胞白血病。
47.检测B7H6细胞表达的方法，所述方法包括 (1)将包含待检人细胞的生物样品与单克隆抗体接触，所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243)； c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245);和 (2)检测所述抗体的结合情况，其中所述抗体的结合表明细胞上存在B7H6，从而检测了细胞是否表达B7H6。
48.权利要求47所述的方法，其中所述生物样品包含完整的人细胞。
49.权利要求47的方法，其中所述生物样品包含待检细胞的膜部分。
50.权利要求47-49中任一项所述的方法，其中抗体标记了选自放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记和生物发光标记的可检测标记。
51.给怀疑患有表达B7H6的癌症的受试对象进行诊断的方法，包括 (1)将偶联了可检测标记的单克隆抗体给予所述受试对象，其中所述单克隆抗体与选自下述的杂交瘤产生的抗体竞争结合人B7H6的胞外结构域(SEQ ID NO:2中的氨基酸残基25-266): a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242)； b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243); c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245);以及 (2)检测抗体在所述受试对象内的分布。
52.权利要求51所述的方法，其中所述癌症是结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
53.选自下述的抗体生成细胞 a)克隆编号4E5.5的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4242); b)克隆编号9G9.2的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4243); c)克隆编号10E2.9的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4244);和 d)克隆编号17B1.3的杂交瘤(保藏号CNCM 1-4245)。
全文摘要
本发明公开了与B7家族成员B7H6特异结合的单克隆抗体，包括能够抑制B7H6和NKp30相互作用的抗体。还公开了抗B7H6抗体-药物偶联物，其包含偶联了治疗剂的抗人B7H6单克隆抗体。所述抗B7H6抗体和抗体-药物偶联物可用于有抗B7H6表达细胞的治疗效果的方法中，还可用于检测B7H6或B7H6表达细胞的诊断方法中。
文档编号A61K39/395GK102741290SQ201080063065
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月8日 优先权日2009年12月9日
发明者E.维维尔, M.佩雷斯, M.巴拉廷 申请人:国家健康和医学研究院