专利名称：一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，属于分子药物学、分子医学和疾病防治领域。
背景技术：
基因治疗为治疗基因缺陷引起的疾病提供了新型解决方案，几种重大疾病的基因治疗最近获得成功，标志着基因治疗取得了重大突破，因而被kience杂志评为2009年十大科学进展之一 [Alberts B. Science, 2009, 326 (5960) :pl589]。成功的案例就包括应用重组腺相关病毒(rAAV)基因药物成功治愈Leber’ s先天性黑内障的临床研究。基于病毒载体的基因药物的制剂学研究是一个相对较新的领域，迄今很少见到一些系统的研究以解决病毒载体基因药物的制剂处方优化和稳定性问题。虽然可以从疫苗和重组蛋白产品的处方中获得启发，但基于病毒载体的基因药物毕竟与疫苗和重组蛋白药物有本质的区别，现有研究结果也表明病毒载体基因药物的制剂处方和稳定性是制剂研究人员面临的一个新挑战。长期以来，大家一致认为rAAV基因药物具有无致病性、低免疫原性、能介导外源基因长期表达和宿主范围广泛等优点，是最有发展前景的基因治疗载体。我们的前期研究表明，经纯化的rAAV基因药物立即在-80°C条件下储存，3个月其体内外转导效率无明显变化[许瑞安.Med Sci Monit, 2005 ；11 :BR305-308] 但rAAV基因药物在人体应用前必需更换为对人体无害，且可以在冷藏或室温条件下稳定存放并方便运输的溶剂。将rAAV基因药物的溶剂更换为实验室常用的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)后在_80°C或_20°C条件下储存，每解冻一次转导滴度都下降20%以上；在4°C条件下储存一天转导滴度即下降10%左右。所以合适溶剂的选择是保证rAAV基因药物长期稳定保存的关键。最大限度地减少贮存过程中rAAV基因药物发生显著的生化变化，确保rAAV基因药物在人体应用时具有足够的生物学活性，是其制剂学开发面临的重大挑战。贮存条件必须服从药品的市场化要求，如运输和储存阶段不需要苛刻的冷冻保存，在病人使用前的室温条件不会造成生物活性的迅速下降等。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，该制剂在室温条件不会造成生物活性的迅速下降，且不需要冷冻保存。为了达到上述目的，本发明的技术方案是—种以重组腺相关病毒为载体的基因(rAAV)治疗药物的制剂处方，在该制剂中除含有rAAV基因治疗药物(购于美国宾州大学)外，还加入以下赋形剂组分防止容器吸附的保护剂人血白蛋白(购于上海莱士血液制品股份有限公司)，维持溶液PH在中性范围的缓冲对枸橼酸和枸橼酸钠(购于南京化学试剂厂)，防止rAAV基因载体之间发生聚合的表面活性剂聚醚F-68 (Pluronic F-68)(购于德国巴斯夫公司)。所述药物的基因组滴度(vg)为108-1014vg。所述制剂剂型为注射剂、冻干粉针或溶液剂中的一种。所述的制剂为注射剂或溶液剂，且溶煤为纯水或注射用水时，处方中加入赋形剂组分的量为每Iml注射用水中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠10_50mg，枸橼酸 0. 1-1. Omg,聚醚 F-68 0. 001-0. lmg。所述的处方中优选加入赋形剂组分的量为每Iml注射用水中加入人血白蛋白 2. 5mg，枸橼酸钠 30mg，枸橼酸 0. 6mg,聚醚 F-680. OOlmgo所述的制剂为冻干粉针时，处方中加入赋形剂组分的量为每制剂单位(即每支注射液)中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠10-50mg，枸橼酸0. 1-1. Omg，聚醚F-68 0. 001-0. lmg，甘露醇 50-500mg。所述的处方中优选加入赋形剂组分的量为每单位制剂中加入人血白蛋白 2. 5mg，枸橼酸钠30mg,枸橼酸0. 6mg,聚醚F-68 0. OOlmg,甘露醇IOOmgo本发明的有益效果为本发明筛选并优化的rAAV基因药物注射剂处方中含有保护剂人白蛋白，缓冲对柠檬酸和柠檬酸钠，表面活性剂聚醚F-68。冻干粉针的处方中除含有上述成分外，还含有甘露醇。该制剂处方解决了 rAAV基因药物在冷藏保存条件下长期维持生物活性的目的，在室温条件不会造成生物活性的迅速下降，且不需要冷冻保存。应用该处方的rAAV基因药物在冷藏条件储存，有效期可长达1年。常温(10-30°C )保存 1天，生物学活性下降不超过10%。可应用于rAAV基因药物的临床使用产品，为基于rAAV 载体的基因药物的临床研究和市场开发提供了保障。
图1是本发明在-80°C冻存的rAAV基因药物再融化后生物学活性的变化情况。人白蛋白，缓冲对柠檬酸和柠檬酸钠，表面活性剂聚醚F-68的加入可显著降低冻融过程对生物学活性的破坏。图2是本发明在-20°C冻存的rAAV基因药物再融化后生物学活性的变化情况。人白蛋白，缓冲对柠檬酸和柠檬酸钠，表面活性剂聚醚F-68的加入可显著降低冻融过程对生物学活性的破坏。图3是本发明在4°C保存下的rAAV基因药物生物学活性的变化情况。人白蛋白， 缓冲对柠檬酸和柠檬酸钠，表面活性剂聚醚F-68的加入可显著降低储存过程中生物学活性的降低。图4是本发明在室温保存下的rAAV基因药物生物学活性的变化情况。
具体实施例方式实施例1rAAV基因药物原液的制备为便于测定rAAV基因药物的转导滴度(生物学活性)，本实施例药物的转基因为萤火虫荧光素酶(Fluc)基因(购于Promega公司)。本实施例所使用的rAAV基因治疗载体的制备方法为采用无辅助病毒参与的多质粒共转染法制备，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒(如H22、H23、H24、H25、H26、 H27、H28、H29、pXX6等)(购于美国宾州大学)共转染293细胞(购于美国模式菌种收集中心(ATCC))，60-72小时后收获重组病毒，经氯化铯梯度离心纯化后备用。所述的辅助质粒采用AAV辅助质粒(H22、、H23、H24、H25、H26、H27、H28、H29)和腺病毒辅助质粒(pXX6) 均购自美国宾州大学。具体步骤为①在一次性50-ml聚苯乙烯管里混合如下材料90 μ g pXX6辅助质粒，30μ g rAAV载体质粒，30μ g H22辅助质粒，0.細1 2. 5M CaCl2，加去离子纯化水至4ml。②加入細1 2XHEPES缓冲盐溶液于步骤①得到的混合物中，上下颠倒3次混合， 在室温孵育1-5分钟。③漩涡振荡步骤②得到的混合物5秒钟，逐滴加入培养有293细胞的15cm的细胞平板上，每板滴加2mL。旋转平板使均分散。④三质粒共转染后的293细胞继续培养60-72小时后收获。冻融法破碎细胞，经硫酸铵沉淀，氯化铯梯度离心等常规方法纯化，得到rAAV基因药物的原液rAAV2/Fluc，-80°C 储存备用。将H22辅助质粒更换为H21、H23、H24、H25、H26、H27、H28、H29，同法制备不同血清型 rAAV 基因药物的原液 rAAVl/Fluc、rAAV3/Fluc、rAAV4/Fluc、rAAV5/Fluc、rAAV6/Fluc、 rAAV7/Fluc、rAAV8/Fluc、rAAV9/Fluc, _80°C储存备用。实施例2rAAV基因药物转导滴度(生物学活性)测定①取293细胞在6孔细胞培养板培养，细胞密度为IO5/孔。②取rAAV基因药物经适当稀释，加入步骤①的细胞培养板中，每孔rAAV基因药物的加入量为IO6基因组滴度(Vg)。③采用碧云天厂生产的荧光素酶报告基因检测试剂盒测定rAAV基因药物rAAV/ Fluc的转导滴度，以每孔内Fluc的表达量(pg)计算。实施例3取实施例1中制备的rAAV基因药物的原液，经超滤置换溶剂，分别得到表1内的制剂。以实验室常用PBS缓冲液(pH 7. 4)为对照溶剂。表1为rAAV基因药物稳定性研究制剂的配制表，其中 PBS 缓冲液的配制=Na2HPO4 · 12H20 3. 868mg, NaH2PO4 · 2H20 0. 395mg， NaC16.8mg，溶解于Iml注射用水中。当然处方中加入赋形剂组分的量可以为如下范围内的任意值均能实现本发明的目的每Iml注射用水中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠 10-50mg,枸橼酸 0. 1-1. Omg,聚醚 F-68 0. 001-0. lmg。实施例4取实施例3得到的制剂，分别经0. 2 μ m滤器无菌过滤2次。按照实施例2所述方法测定转导滴度。结果见表2，表2为无菌过滤过程rAAV基因药物生物活性的损失表。由表2可得以PBS为溶剂，rAAV基因药物在无菌过滤的过程中就明显发生了生物活性的损失，特别是在低浓度时下降趋势更明显。但加入白蛋白和聚醚F-68后可以降低其生物活性损失的趋势。枸橼酸缓冲体系也有助于避免rAAV基因药物在无菌过滤的过程中的活性损失。 第3-1号处方优于第3-2号处方。
实施例5取实施例3得到的制剂，分别经_80°C和-20°C冷冻，融化后按照实施例2所述方法测定转导滴度。结果见图1和图2。图1为_80°C冷冻过程对活性的影响图；图2为-20°C 冷冻过程对活性的影响图；由图可知，以PBS为溶剂的rAAV基因药物在经过_80°C和_20°C 冷融后，生物学活性降低超过20%。白蛋白和聚醚F-68加入后可以降低rAAV基因药物因冷冻融化引起的生物活性损失。第3-1和3-2号制剂效果更好，冷冻融化一次几乎无明显生物活性的变化。实施例6取实施例3得到的制剂，分别在4°C和室温放置，按照实施例2所述方法测定不同时间的转导滴度。结果见图3和图4。图3为4°C保存条件下稳定性结果图；图4为室温保存条件下稳定性结果图。由图可知，在4°C保存条件下，以PBS为溶剂的rAAV基因药物的生物学活性在1个月内降低50%左右。白蛋白和聚醚F-68加入后可以降低其生物学活性下降趋势。第3-1和3-2号制剂在1年内生物学活性可维持在90%以上。在室温放置时，第3-1号制剂生物学活性在2天内可维持在90%以上，第3-2号制剂在1天内可维持在90%以上，之后生物学活性逐日下降。提示按此处方制备的rAAV基因药物从冷藏条件取出后，可以在室温条件放置1天，方便了病人的应用。同时也提示在室温条件下1天内完成rAAV基因药物的分包装过程对药品稳定性无影响。实施例7取实施例1 得到的 rAAVl/Fluc、rAAV3/F]uc、rAAV4/Fluc、rAAV5/Fluc、rAAV6/ Flue、rAAV7/Fluc、rAAV8/Fluc、rAAV9/Fluc原液，按照第3-1号制剂处方分别配制成主药含量为1014Vg/ml的注射液，及主药含量为109Vg/ml的溶液剂。冷藏条件)保存，按照实施例2所述方法测定不同时间的转导滴度。结果所有样品在1年的观察期内其转导滴度均维持在90%以上，说明第3-1号制剂处方对不同血清型的rAAV基因药物均适用。实施例8取实施例1 得到的 rAAVl/Fluc、rAAV3/F]uc、rAAV4/F]uc、rAAV5/Fluc、rAAV6/ Flue、rAAV7/Fluc、rAAV8/Fluc、rAAV9/Fluc原液，按照第3-1号制剂处方分别配制成主药含量为1013Vg/ml的注射液，及主药含量为109Vg/ml的溶液剂。冷藏条件)保存，按照实施例2所述方法测定不同时间的转导滴度。结果所有样品在1年的观察期内其转导滴度均维持在90%以上，说明第3-1号制剂处方对不同血清型的rAAV基因药物均适用。实施例9按照第3-1号制剂处方配制注射用溶剂，在处方中另外加入甘露醇，每制剂单位 (即每支注射液)中含人血白蛋白2. 5mg，枸橼酸钠30mg，枸橼酸0. 6mg，聚醚F-680. OOlmg, 甘露醇lOOmg。当然处方中加入赋形剂组分的量可以为如下范围内的任意值均能实现本发明的目的每制剂单位(即每支注射液)中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠10-50mg，枸橼酸 0. 1-1. Omg,聚醚 F-68 0. 001-0. Img,甘露醇 50_500mg。取实施例1 得到的 rAAVl/Fluc、rAAV2/F]uc、rAAV3/Fluc、rAAV4/Fluc、rAAV5/ Flue、rAAV6/Fluc、rAAV7/Fluc、rAAV8/Fluc、rAAV9/F]uc 原液，分别配制成主药含量为 1014vg/ml的注射液。按照常规冻干工艺冷冻干燥，得到冻干粉针。室温条件保存，按照实施例2所述方法测定不同时间的转导滴度。结果所有样品在冻干过程中损失生物学活性约50%。以冻干完成后的生物学活性记为100%，在1年的观察期内其转导滴度均维持在90% 以上。说明冻干过程会造成不同血清型的rAAV基因药物的生物学活性损失，但冻干后的制剂在室温条件下可稳定保存。表 权利要求
1.一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，在该制剂中除含有 rAAV基因治疗药物外，其特征在于还加入以下赋形剂组分防止容器吸附的保护剂人血白蛋白，维持溶液PH在中性范围的缓冲对枸橼酸和枸橼酸钠，防止rAAV基因载体之间发生聚合的表面活性剂聚醚F-68。
2.如权利要求1所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，其特征在于所述药物的基因组滴度(vg)为108-1014vg。
3.如权利要求1所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，其特征在于所述制剂剂型为注射剂、冻干粉针或溶液剂中的一种。
4.如权利要求3所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方， 其特征在于所述的制剂为注射剂或溶液剂，且溶煤为纯水或注射用水时，处方中加入赋形剂组分的量为每Iml注射用水中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠10_50mg，枸橼酸 0. 1-1. Omg,聚醚 F-680. 001-0. lmg。
5.如权利要求4所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，其特征在于所述的处方中加入赋形剂组分的量为每Iml注射用水中加入人血白蛋白2. 5mg, 枸橼酸钠30mg，枸橼酸0. 6mg,聚醚F-680. OOlmgo
6.如权利要求3所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，其特征在于所述的制剂为冻干粉针时，处方中加入赋形剂组分的量为每制剂单位中加入人血白蛋白0. 5-5mg，枸橼酸钠10-50mg，枸橼酸0. 1-1. Omg，聚醚F-68 0. 001-0. lmg，甘露醇 50-500mgo
7.如权利要求6所述的一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，其特征在于所述的处方中加入赋形剂组分的量为每制剂单位中加入人血白蛋白2. 5mg，枸橼酸钠30mg，枸橼酸0. 6mg,聚醚F-680. OOlmg,甘露醇lOOmg。
全文摘要
本发明公开了一种以重组腺相关病毒为载体的基因治疗药物的制剂处方，在该制剂中除含有rAAV基因治疗药物外，还加入以下赋形剂组分防止容器吸附的保护剂人血白蛋白，维持溶液pH在中性范围的缓冲对枸橼酸和枸橼酸钠，防止rAAV基因载体之间发生聚合的表面活性剂聚醚F-68。本发明制剂在室温条件不会造成生物活性的迅速下降，且不需要冷冻保存。
文档编号A61K47/12GK102205132SQ20111012340
公开日2011年10月5日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刁勇, 许瑞安 申请人:华侨大学