专利名称：含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，特别涉及一种含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白及制备方法与应用。
背景技术：
糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤后第三大非传染性疾病，世界卫生组织(WHO) 预测2030年全世界糖尿病患者将超过3. 6亿，其中II型糖尿病占90%以上。II型糖尿病是非胰岛素依赖型糖尿病，是一种发病率逐年升高的常见病。胰高血糖素样肽-I (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)类似物及其衍生物在II 型糖尿病治疗中表现出广阔前景。在小肠黏膜的L细胞内，胰高血糖素原酶解产生无生物活性的GLP-I (1-37)，GLP-I (1-37)进一步水解切除N-端的6个氨基酸，成为GLP-I (7-37)， 其中一部分C-端的一个氨基酸被分解，且末端被酰胺化为GLP-I (7-36) NH2。GLP-I (7-36) NH2和GLP-I (7-37)在体内具有相同的生理功能。GLP-I诱导多种生物学效应，GLP-I作用于胰腺，促进胰岛素分泌，促进胰岛β细胞的增殖分化，抑制β细胞的凋亡，增强外周胰岛素敏感组织对胰岛素的敏感性，抑制高血糖素的分泌；GLP-1作用于中枢神经系统，抑制摄食中枢活性，减低食欲；GLP-1作用于胃肠道，抑制胃肠排空，控制胃酸分泌；GLP-1作用于心脏，抑制心肌细胞的凋亡，保护心脏；GLP-1作用于血管，可以舒张血管、降低血压，保护内皮细胞。II型糖尿病患者中，其肠促胰岛素效应受损，餐后GLP-I分泌减少，因此GLP-I及其类似物可作为治疗II型糖尿病的一个重要的靶点。GLP-I的显著特征是葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖风险，而低血糖危险常见于胰岛素治疗中。但是，GLP-I应用于临床面临着巨大问题，人体自身产生的GLP-I在体内很不稳定，很快被二肽基肽酶-IV (DPP-IV)所清除，半衰期非常短，约为I 2min，即必须持续静脉滴注或者持续皮下注射才能产生疗效，这严重限制了其在临床治疗上的应用。人血清白蛋白(HAS)是血浆中含量最多的蛋白质，浓度约为600μΜ，占血浆总蛋白的40% -60%。它也是人体血浆中主要的药物运输蛋白，在人体内的半衰期可达19 天。与人血清白蛋白结合能有效的改善某些肽分子和蛋白药物代谢动力学特性，延长其半衰期。因此，如将GLP-I与血清白蛋白亲和结合序列融合，该融合蛋白与血清白蛋白亲和结合，可以达到缓释的目的，并且不易被肾脏清除，从而延长GLP-I血浆半衰期。申请号为 200810028614. 5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供了一种融合多肽，其中的血清白蛋白结合肽可为LPHSHRAHSLPP，连接体为FNPRGA、FNPRGS, FNPRGP、FNPRPP、FNPRPA。但是此发明所提供的GLP-I融合多肽在糖尿病动物模型db/db小鼠中的降糖试验表明，其降糖效果仍有提闻的空间。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白。本发明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法。本发明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白， 其氨基酸序列如下所示LPHSHRAHSLPP FNPKTPX ;其中LPHSHRAHSLPP是与血浆白蛋白亲和结合序列；FNPKTP为连接体，是体内特异性蛋白酶识别位点；X 为 GLP-I (7-37)，X 的序列为H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG37 ；编码所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白的核苷酸序列如下所示CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC ；所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法，优选包含以下步骤将如下所示的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到的重组载体置于宿主细胞中进行表达，纯化得到；核苷酸序列为CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC。所述的表达载体优选为原核表达载体，特别优选为pMFH质粒载体；所述的重组载体优选为pMFH-GLP-1 Der重组载体，其通过包含以下步骤的制备方法得到通过设计引物进行PCR，使得上述的核苷酸序列的5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，得到带有EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点的序列A ;接着将EcoRI 和BamHI双酶切后的序列A和EcoRI和BamHI双酶切后的pMFH载体连接，得到pMFH_GLP_l Der重组载体。所述的含有胰高血糖素样肽-I的GLP-I融合蛋白是由大肠杆菌表达系统重组表达产生的，所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)；所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白用于制备治疗非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症的药物；所述的非胰岛素依赖型糖尿病和各种状况优选为II型糖尿病、糖耐量受损、肥胖、代谢综合征，更优选为II型糖尿病。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明所提供的GLP-I融合蛋白，其中的血清白蛋白结合肽为 LPHSHRAHSLPP,其连接体为FNPKTP，完整氨基酸序列为LPHSHRAHSLPPFNPKTPHAEGTF TSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG。在糖尿病动物模型db/db小鼠中的试验表明，申请号为200810028614. 5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供的 GLP-I融合多肽(连接体分别为FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠体内持续药效为8小时左右，本发明所提供的含胰高血糖素样肽-I的融合蛋白化学性质稳定，不易被体内的DPP-IV 降解，持续药效达到12小时以上，从而克服了必须持续静脉滴注或者持续皮下注射GLP-I 才能产生疗效的缺陷。(2)申请号为200810028614. 5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供的GLP-I融合多肽(连接体分别为FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠体内8小时内的降糖百分比才达到27. 31%。而本发明所提供的GLP-I融合蛋白12小时内的降糖百分比达到34. 3%，24小时内的降糖百分比仍达到24. 83%，体内持续降糖药效达到12小时以上。因而，无论是口服糖耐量实验(OGTT)，还是即时降糖实验，本发明所提供的 GLP-I融合蛋白的降糖效果均具有显著优势。所以本发明所提供的GLP-I融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。同时，本发明所提供的含胰高血糖素样肽-I的融合蛋白作为有效成分治疗II型糖尿时，既有显著的降糖效果，12小时内的降糖百分比达到34. 3%, 24小时内的降糖百分比达到24. 83%，又具有很长的血浆半衰期(12小时以上)。(3)药效学结果表明，经过长期注射本发明所提供的含胰高血糖素样肽-I的融合蛋白，能显著提高糖耐受性，刺激胰岛素的分泌，保护胰岛β细胞，延缓糖尿病病程的发展。因而本发明所提供的GLP-I融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。
图I是pMFH质粒载体图谱图。图2是pMFH-GLP-lDer融合蛋白质粒图谱图。图3是pMFH-GLP-lDer融合蛋白重组质粒的酶切鉴定图；其中泳道M是DNA Marker ;泳道I是pMFH-GLP-lDer重组载体经EcoRI和BamHI双酶
切结果；泳道2是pMFH质粒经EcoRI和BamHI双酶切结果。图4是GLP-I融合蛋白HPLC制备图谱图。图5是GLP-I融合蛋白纯度分析图。图6是GLP-I融合蛋白质谱鉴定图。图7是GLP-I融合蛋白在体内稳定性结果图。图8是db/db小鼠注射GLP-I融合蛋白后降糖百分比图。图9是db/db小鼠连续给药一周后给药口服糖耐量结果图。图10是db/db小鼠连续给药六周后给药口服糖耐量结果图。图11是db/db小鼠连续给药七月后不给药口服糖耐量结果图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I构建含有编码胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白(简称为GLP-I融合蛋白)序列的重组质粒。
(1)编码GLP-1融合蛋白的核苷酸序列的PCR及酶切根据GLP-1融合蛋白的结构特点，采用大肠杆菌的密码子的偏好性设计引物，弓丨 物由上海生物工程有限公司商业化合成。引物序列如下上游引物1(UP1) :5，-GCGC |GAA TTC| GAT CCG CTG CCG CAT AGCCAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG-3’上游引物2(UP2) :5，-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG AAG ACGCCG CAC GCT GAA GGT ACC-3’下游引物(DP):5’ -TCATCCGCCAAAACAGCCAAG-3’ ；采用重叠延伸PCR方法，以质粒pMFH-GLP-1 (7-37)(该质粒已在申请号为 “201010221511. 8”、名称为“利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法”的发明专 利申请中公开)为模板，扩增GLP-1融合蛋白cDNA序列。以pMFH-GLP-1质粒为模板，UP2 和DP为引物，进行第一次PCR扩增，然后再以第一次PCR扩增产物为模板，使用UP1和DP 引物进行全长片段的扩增，得到如下序列的PCR产物GCGC |GAATTC| GATCCGCTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGA CGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCT TGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC |TAA| TAA |GGATCC| TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTT TTGGCGGATGA。|GAATTC|为EcoRI酶切位点，GATCCG为甲酸酶解位点，|GGATCC |为BamHI酶 切位点。PCR反应体系为
模板(pMFH-GLP-1 质粒) 3.6 ^il 2xGC buffer I25.0 ^il
UP1 (10 pmol)或 UP2 (10 pmol) 2.0 fil DP (10 pmol)4.0 fil
dNTP Mixture5.0 fil
TransTaq HiFi DNA polymerase 1.0 fil Milli Q 水9.4 0
总体积50 piPCR反应条件
95 °C预变性4min95 °C变性 61 °C退火 72 °C延伸循环数 72 °C延伸
30 s 30 s 30 s 30
10 minPCR扩增之后，回收PCR产物(操作见PCR清洁试剂盒说明书)。对PCR产物进行
酶切，酶切反应体系如下
GLP-I融合蛋白 10 X Buffer H EcoRI BamHI MillQ 水
1.5pg
5.0μ
2.0μ
2.0μ
补至50酶切反应条件先30°C水浴2h,再37°C水浴2h。接着采用商业化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit对酶切产物进行纯化。(2) pMFH表达载体的双酶切及重组质粒的连接pMFH 表达载体(Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides. US 7390639B2 中已经详细公开了该载体的构建过程)含有大肠杆菌编码依赖RNA聚合酶转录单位的T7启动子；且具有融合表达系统的运载蛋白片段MFH，在MFH的C末端含有6 XHis标签，便于融合蛋白的纯化(如图I所示)，其
酶切体系如下
pMFH质粒 IOXBufferH EcoRI BamHI MillQ 水
2.0 pg
5.0μ
2.0μ
2.0μ 补至60 μ 酶切反应条件先30°C水浴2h,再37°C水浴2h。接着采用商业化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit对目的DNA片段进行纯化。取经EcoRI和BamHI双酶后的pMFH 质粒载体和步骤(I)制备的双酶切后的编码GLP-I融合蛋白基因序列进行连接，连接体系
为
pMFH20 ng
GLP-I衍生物PCR产物60 ng
10 X ligation Buffer2.0 μ
Τ4 DNA 连接酶1.0 μ
MillQ 水up to 20 μ 连接反应条件16°C连接16 20h。最终获得含有编码GLP-I融合蛋白序列的重组质粒pMFH-GLP-lDer (如图2所示)。(3) pMFH-GLP-lDer 转化大肠杆菌 DH5 α将构建好的重组质粒转化至感受态大肠杆菌DH5 α (宝生物(大连)生物工程有限公司)中，冰浴30min，升温至42°C水浴中，维持90s，立即转移至冰浴中，静置2min。加入Iml LB培养液，置37°C恒温振荡(IOOrpm)培养45min，取100 μ I转化后的菌液均匀地涂布于含有100μ g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，37°C恒温放置至液体被平板完全吸收后，37°C倒置培养12 16h至长出明显菌落。筛选出Amp抗性的单克隆菌落。通过对阳性克隆EcoRI和BamHI的双酶切以及琼脂糖凝胶电泳鉴定(如图3所示)，结果表明GLP-I 融合蛋白的cDNA序列已定向插入表达载体pMFH中。对已鉴定的重组质粒进行DNA测序， 确证获得了含pMFH-GLP-lDer的重组菌。GLP-I融合蛋白核酸序列如下CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC。实施例2 pMFH-GLP-Ι融合蛋白发酵表达抽提重组质粒pMFH-GLP-lDer，进一步转化到大肠杆菌BL21 (DE3)(宝生物(大连)生物工程有限公司)，得到基因工程表达菌。通过摇瓶培养逐级放大，在5L发酵罐中培养发酵GLP-I融合蛋白表达菌。所用的培养基为2YT培养基，配方为胰蛋白胨16g/L，乳糖10g/L，NaCl 5g/L;用NaOH调pH至7.0，发酵罐内灭菌，灭菌条件为121°C，20min。发酵培养条件如下接种量为体积百分比1% ;培养温度为37°C ;装液量为体积百分比80% ； 氨苄青霉素(Amp)浓度为100mg/L。培养至对数生长中后期，添加O. 6mM IPTG，诱导时间为 6h,放罐后12000rpm离心30min收集菌体。实施例3 :分离纯化获得GLP-I融合蛋白(I)将发酵菌体离心收集，用裂解液重悬，裂解液配方为配方为50mmol/ LNaH2PO4,300mmoI/L NaCLUOmmoI/L 咪唑(imidazole)，用 NaOH 调 pH 到 8. O。采用超声破碎仪(DF-6P3C型超声细胞破碎仪，宁波新芝科器研究)在冰浴中破碎菌体，开5s，停5s，工作20min。IOOOOrpm, 4°C, 30min,离心破碎菌体,收集上清。(2)将步骤(I)中收集的上清进行 Ni-NTA Agarose (nickel-charged resin, QIAGEN)亲和柱纯化，用含IOmM咪唑的裂解液洗除杂蛋白后，再用含250mM咪唑的裂解液 (除咪唑浓度不同，其他成分同前述裂解液)洗脱目的蛋白。(3)甲酸水解(2)中目的蛋白，以去除目的蛋白上的His标签。反应条件如下按 30mg目的蛋白/ml甲酸溶液计算，甲酸溶液的浓度为体积百分比50%，水解温度为45°C，恒温振荡48小时，得到水解产物。(4)将水解产物进行Ni-NTA Agarose亲和柱纯化，收集GLP-I融合蛋白组分(即上样穿透峰部分)。(5)将步骤(4)得到GLP-I融合蛋白通过悬蒸浓缩仪进行浓缩后，利用高效液相色谱(HPLC)进一步的精制纯化。HPLC仪为半制备的Agilent 1100系列，C18柱(Agilent) 规格为21. 2*250mm，7 μ m。浓缩后的样品通过0. 45 μ m RC滤膜过滤后进样，每次进样体积为1ml，流动相为含体积百分比0. 1%三氟乙酸(TFA)的超纯H2O以及含体积百分比0. 1% TFA的乙腈(ACN)，检测波长为280nm。出峰时间为17. 5min,收集此峰组分。HPLC制备条
8件为
权利要求
1.一种含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如下所示LPHSHRAHSLPP FNPKTPX ；其中X 为 GLP-I(7-37)；FNPKTP为连接体；X 的氨基酸序列为H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG37。
2.根据权利要求I所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白，其特征在于编码所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白的核苷酸序列如下所示CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。
3.权利要求I或2所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法， 其特征在于包含以下步骤将如下所示的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到的重组载体置于宿主细胞中进行表达，纯化得到含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白；核苷酸序列为CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。
4.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法， 其特征在于所述的表达载体为原核表达载体。
5.根据权利要求4所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法， 其特征在于所述的原核表达载体为PMHl载体。
6.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法， 其特征在于所述的重组载体为pMFH-GLP-1 Der重组载体，其通过包含以下步骤的制备方法得到通过设计引物进行PCR，使得权利要求4所述的核苷酸序列的5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，得到带有EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点的序列A ； 接着将EcoRI和BamHI双酶切后的序列A和EcoRI和BamHI双酶切后的pMFH载体连接，得到pMFH-GLP-1 Der重组载体。
7.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-I或其衍生物的融合蛋白的制备方法， 其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
8.权利要求I或2所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白的应用，其特征在于所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白用于制备治疗和/或预防非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症的药物。
9.根据权利要求8所述的含有胰高血糖素样肽-I的融合蛋白的应用，其特征在于所述的非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症为II型糖尿病、糖耐量受损、肥胖、代谢综合征。
全文摘要
本发明公开了一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过基因工程的方法，突变已知序列的一个氨基酸，得到编码本发明所述的融合蛋白的核苷酸序列；接着将该核苷酸序列克隆入表达载体中，通过表达、纯化，得到本发明所述的融合蛋白。本发明所提供的含有GLP-1的融合蛋白使GLP-1的生理作用具有更好的稳定性和持续性，而且，药效学结果表明，该融合蛋白具有显著的降低血糖效果。另外，经过长期注射本发明所提供的融合蛋白，能显著提高糖耐受性，刺激胰岛素的分泌，保护胰岛β细胞，延缓糖尿病病程的发展。因而本发明所提供的GLP-1融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。
文档编号A61K38/26GK102585015SQ201210007118
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者冉艳红, 周天鸿, 李弘剑, 王从峰, 苏正定 申请人:暨南大学