专利名称：一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种含有双报告基因的重组腺病毒载体及其构建方法与应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的难治性疾病，能否实现恶性肿瘤的早期诊断、转移预警及疗效预测直接关系到其临床治疗的成败，亦是人类最终攻克恶性肿瘤难关的三个关键突破点。几十年来，科研工作者一直在深入研究恶性肿瘤发生发展的规律，努力探索突破此三个关键问题的有效办法。肿瘤的发生一般经历了基因突变-生物大分子改变-代谢异常-功能改变/结构改变-出现症状的过程。目前传统的影像学诊断是以大体病理学改变为基础的，只有当疾病发展到“功能改变/结构改变”这一阶段才能被发现，远远晚于分子、细胞、组织水平阶段，因此不能达到“早期诊断”的目的。分子影像学是采用影像学技术手段无创性地对活体内参与生理或病理过程的分子进行可视化检测，是在活体状态下，对细胞、分子水平的生物过程进行特征化和定量化研究的一门学科。分子成像的应用可使肿瘤的诊断水平提前至分子异常阶段，对分子水平的病变进行进·行检测，可在体内直接观察到疾病的起因、发生、发展等一系列过程，并观察疾病的基因、分子水平异常变化和特征，而不单单是疾病终末期的解剖形态和生理功能改变。磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)、活体光学成像及核素显像是分子影像学领域的三大主体技术。核素显像虽然是目前应用于临床的分子影像学技术，但是，因存在成像空间分辨率较低，对细胞有一定的辐射损伤，观察时间受放射性核素衰减的制约，不能对细胞进行长时间示踪等缺点，一定程度上限制了核素显像的应用。MRI和活体光学成像无辐射损伤，应用更为安全，在肿瘤的早期诊断和靶向治疗、干细胞的标记与活体示踪等方面应用越来越广泛。MRI具有空间时间分辨率高、可观察细胞的动态迁徙过程、对比度好、可同时获得解剖和生理信息等优点，但也具有敏感性相对不足的缺点；光学成像虽穿透深度和解剖分辨率有限，但却具实时成像、敏感性高及连续活体监测的优点。不同的成像技术各具优势与不足，多模态成像(multimodal imaging)策略,即多种成像模式的结合与优势互补，可解决单一技术和显像模式的缺陷，是分子影像学的发展方向，将进一步推动分子影像学由基础研究向临床应用转化。报告基因表达成像是分子影像学的重要成像类型之一，是将基因通过载体送到细胞内，在细胞内进行基因表达，通过标记的特异性配体或酶反应的底物和基因表达生成的受体和酶进行特异性结合达到间接反映基因表达过程的目的，可用报告基因标记靶细胞实现细胞示踪。现阶段，以腺病毒为载体的报告基因成像多是单报告基因，即利用腺病毒为载体将单一报告基因导入体内进行基因表达，因此难以同时满足活体光学及磁共振双模态成像的示踪要求。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种含有双报告基因的重组腺病毒载体及其构建方法，本发明的目的之二是将所述重组腺病毒载体在磁共振成像和活体光学成像中作为肿瘤示踪剂应用，以便实现多种成像模式的结合与优势互补。本发明所述重组腺病毒载体，含有人转铁蛋白受体基因(TFRC，在GenBank上的登录号:匪001128148)和萤火虫荧光素酶基因(Luciferase，在GenBank上的登录号JN244076)，能在真核细胞中同时表达转铁蛋白受体蛋白和荧光素酶蛋白，所述人转铁蛋白受体基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所述。本发明所述重组腺病毒载体，其含的编码转铁蛋白受体蛋白的基因在第一巨细胞病毒启动子的控制下表达，其含的编码荧光素酶蛋白的基因在第二巨细胞病毒启动子的控制下表达，所述第一巨细胞病毒启动子和第二巨细胞病毒启动子为相同的巨细胞病毒启动子(CMV)。本发明所述重组腺病毒载体，编码转铁蛋白受体蛋白的基因序列和编码荧光素酶蛋白的基因序列被分别放置在两个阅读框架内，即所述人转铁蛋白受体基因的表达读码框包含巨细胞病毒启动子(CMV)、人转铁蛋白受体基因和下游的polyA加尾信号，所述萤火虫荧光素酶基因的表达读码框包含巨细胞病毒启动子(CMV)、萤火虫荧光素酶基因和下游的polyA加尾信号。本发明所述重组腺病毒载体，其腺病毒载体为5型El区和E3区缺失的复制缺陷
型病毒。本发明所述重组腺病毒载体的构建方法，依次为以下步骤:(I)用PCR方法扩增 人转铁蛋白受体基因；(2)将步骤(I)扩增的人转铁蛋白受体基因片段插入到含有萤火虫荧光素酶基因片段的穿梭载体pShuttle-CMV-Luciferase上，获得重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase,并进行测序分析；(3)将验证正确后的重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase连接到骨架载体pAdeno上，得到重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase ； (4)对所述重组腺病毒质粒进行XhoI酶切鉴定；(5)用人胚肾细胞系HEK293细胞包装所述重组腺病毒质粒，获得重组腺病毒载体 Ad-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。将本发明将所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染人结直肠癌肿瘤细胞L0V0，于裸鼠腹股沟区皮下接种被重组腺病毒感染的人结直肠癌肿瘤细胞L0V0，建立人结直肠癌皮下异种移植瘤模型。将所述异种移植瘤模型磁共振成像和光学成像，在高场强的MR图像中可以清晰地显示出肿瘤及其与周边组织关系的解剖结构信息，尤其是肿瘤向外周侵袭的低信号改变，在光学图像中，肿瘤病灶从接种被重组腺病毒感染的人结直肠癌肿瘤细胞LOVO第I天开始，就可以观察到明显的细胞团发光信号(见图11-图13)。实验表明，可将本发明所述重组腺病毒载体在磁共振和光学双模态成像中作为肿瘤示踪剂应用。本发明具有以下有益效果:1、由于本发明所述重组腺病毒载体含有人转铁蛋白受体基因和萤火虫荧光素酶基因(双报告基因)，当用基因工程方法将重组腺病毒载体导入动物体或人体后，转铁蛋白受体基因的表达引起细胞上转铁蛋白受体增多，因而靶细胞的磁共振成像效果更好，萤火虫荧光素酶基因表达的荧光素酶可在几分钟内产生发光现象，通过相应的光学设备可捕捉这种荧光实现生物发光成像，因而便于实现多种成像模式的结合与优势互补，在早期更好地示踪肿瘤的发生发展过程，有利于肿瘤的发生发展机制研究，有利于肿瘤的早期诊断及疗效监测。2、由于本发明所述重组腺病毒载体中编码转铁蛋白受体蛋白的基因在第一巨细胞病毒启动子的控制下表达，编码荧光素酶蛋白的基因在第二巨细胞病毒启动子的控制下表达，且编码序列被放置在两个阅读框架内，因而能独立表达各自的蛋白产物，且转染效率闻。3、由于本发明所述重组腺病毒载体中的腺病毒载体是El区和E3区缺失的复制缺陷型病毒，因而病毒基因最大量的减少，增加了生物安全性，同时使插入的外源基因增大，提高了载体的适应性和稳定性。
图1 重组穿梭载体 pShuttle-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的结构不意图。图2是本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的结构示意图。图3是人转铁蛋白受体基因(TFRC)的PCR产物的I %琼脂糖凝胶电泳结果图，图中M为Ikb DNAladder ；1为人转铁蛋白受体基因(TFRC)。图4是琼脂糖凝胶电泳SfiI酶切鉴定重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase 的结果图，图中，M 为 Ikb DNAladder ;1_4 中:阳性克隆,2.3kb/3.4kb ;阴性克隆只得到3.4kb 一条带。图5是琼脂糖凝胶电泳XhoI酶切鉴定本发明所述重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的结果图，图中，M 为 Ikb DNAladder ;1 与 2 均为阳性克隆，由以下 7 个条带组成:14kb,ll.7kb，3.lkb，2.66kb，2.47kb，l.45kb，0.6kb ；3 为错误克隆。图6是不含TFRC的腺病毒空载体pAdeno-CMV-Luciferase XhoI酶切鉴定结果，其中M为Ikb DNA ladder ;I为阴性克隆，由以下6个条带组成:14kb，11.8kb，4.0kb，2.47kb，
1.45kb, 0.6kbo图7是琼脂糖凝胶电泳鉴定本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的 PCR 共扩增结果图，图中，M 为 Ikb DNA ladder ;1 为目的基因病毒，约 2.3kb (Ad-CMV-TFRC-CMV-Luc i f erase 为模板)，2 为阳性对照，约 2.3k (TFRC原始cDNA质粒为模板)，3为阴性对照(pAdeno-CMV-Luciferase为模板)。图8是以GFP (绿色荧光蛋白)为标记，观察对照腺病毒Ad-GFP感染肿瘤细胞36小时后荧光显微镜观测到的荧光表达情况图。图9是用本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染肿瘤细胞后用WesternBlot定量检测转铁蛋白受体过表达情况的凝胶结果图,其中Blank为未感染的空白对照组，Ad-GFP为对照腺病毒感染的阴性对照组，Ad-TFRC-Luciferase为阳性重组腺病毒感染的实验组。图10是用本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染肿瘤细胞后用Western Blot定量检测转铁蛋白 受体过表达情况的统计分析结果(柱状图)，其中Blank为未感染的空白对照组，Ad-GFP为对照腺病毒感染的阴性对照组，Ad-TFRC-Luc为阳性重组腺病毒感染的实验组。图11是用本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染肿瘤细胞并构建结直肠癌肿瘤动物模型的磁共振成像图，MR成像T2序列可见明显低信号病灶。图12是用本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染肿瘤细胞并构建结直肠癌肿瘤动物模型的磁共振成像图，MR成像T2*序列可见明显低信号病灶。图13是用本发明所述重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染肿瘤细胞并构建结直肠癌肿瘤动物模型进行光学成像，光学成像可见小鼠腹股沟区病灶发光信号。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明所述重组腺病毒载体及其构建方法与应用作进一步说明。实施例1:重组腺病毒载体的构建
1、材料和方法1.1目的基因、载体质粒、细胞人转铁蛋白受体基因(TFRC)的原始cDNA质粒:GeneCopoeia, USA ;穿梭载体pShuttle-CMV-Luciferase和化学感受态细胞DH5a菌株:上海汉恒公司；骨架载体pAdenoviral Vector (简称 pAdeno):Qbiogene, USA ;人胚肾细胞系 HEK293 细胞:中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。1.2 试剂所用限制性内切酶均购自New England Biolabs公司；T4DNA Iigase为晶美生物公司的 MBI (Fermentas)产品；CIP 酶(Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal)购自promega公司；pfx DNA ploymerase购自invitrogen公司；质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒(柱离心型)、DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)均购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司；Ikb DNA ladder购自鼎国生物公司；DNA Marker DL2000为大连宝生物的TAKARA产品；DMEM、胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；真核转染试剂Lipofectamine2000 脂质体为 GIBCO BRL 产品；CsC12 购自 Sigma 公司。1.3 仪器PCR扩增仪:Applied Biosystems公司；电泳仪:北京六一仪器厂；台式多功能高速冷冻离心机^ppendorf AG ;恒温水浴锅，倒置生物显微镜，研究级倒置荧光显微镜及图像分析系统:北京赛多利斯仪器系统有限公司；二氧化碳培养箱:美国Thermo公司。1.4引物设计与引物合成以GenBank中已发表的人转铁蛋白受体基因(TFRC)的cDNA序列为模板，借助计算机引物设计软件Primer Premier 5设计2条引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)引物序列如下:TFRC-Sfi1-F:AAAAGGCCGCTGCGGCCACCATGATGGATCAAGCTATFRC-Sfi1-R:AAAAGGCCTGTTTGGCCTTAAAACTCATTGTCAATG1.5PCR扩增人转铁蛋白受体基因(TFRC)
以人转铁蛋白受体基因(TFRC)的原始cDNA质粒为模板，用高保真酶(pfx DNAploymerase)扩增TFRC基因片段。在EP管中依次加入以下反应物:10Xpfx AmplificationBuffer5 u L>50mM MgS04 I u I> pfx DNA ploymerase(invitrogen,2.5U/u L) 0.6 u I>dNTP (each 10 u M) 1.5 u 1、TFRC-F-BamHI (10 uM)l.5u 1、TFRC-R-EcoRI (10 uM)l.5u 1、模板1.0iU、加ddH20至50iil反应体系中进行反应；反应条件:95°C、5min ;95°C、30s，65°C、30s，72°C、lmin，10 个循环;95°C、30s，55°C、30s，72°C、lmin，20 个循环；72°C延伸 IOmin,置4°C冰箱保存。将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳结果并拍照，用DNA胶回收纯化试剂盒回收TFRC条带。获得约2.3kb的片段，与预期大小一致，见图3。1.6连接上述PCR回收产物至穿梭载体pShutt le-CMV-Luc if erase上将上述PCR回收片段和穿梭载体pShutt le-CMV-Luc if erase用SfiI酶切处理，然后用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化至化学感受态细胞DH5a菌株中，涂布到卡那抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到卡那抗性液体培养基中，摇床中370C 300rpm震荡培养过夜(12小时)，小提质粒(威格拉斯质粒小/中量提取纯化试剂盒，具体步骤参照试剂盒使用说明)，得到重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。
1.7 重组穿梭载体 pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase 的鉴定用SfiI酶切进行鉴定，酶切鉴定体系及反应条件如下:
重组穿梭载体DNAI^il
IOxBufferl[j,l
IOxBSAI^il
SfiI (NEB,20 U/^il)0.3(^1
ddH20补齐至I Opl
总体积10(^1
37°C1-2 小时经酶切鉴定，其产物与预期大小一致，见图4。选取酶切鉴定正确的克隆进行测序，从上、下游两端及中间分别进行核苷酸全序列分析，其结果经生物信息学分析及BLAST软件分析，以验证重组穿梭载体的正确性。分析结果表明，TFRC核苷酸序列与GeneBank序列完全一致，成功地获得了重组穿梭载体pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase。1.8将验证正确的重组穿梭载体pShutt le-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase连接到骨架载体pAdeno载体上，得到重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase用1-CeuI+1-SceI双酶切处理骨架载体pAdeno和重组穿梭载体pShuttle-CMV-TFRC-CMV-Luciferase,然后用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化至化学感受态细胞DH5a菌株中，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中培养过夜(12小时)，小提质粒，得到重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。
1.9对重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase进行XhoI酶切鉴定酶
切鉴定的反应条件如下:
重组腺病毒质粒DNA1(^1
IOxBufferl[j,l
IOxBSAI^il XhoI (NEB,20 U/^iL)0.3(^1
ddH20补齐至I Opl
总体积IO^il
37°C1-2 小时XhoI 酶切结果见图 5，可以切出 14kb，11.7kb，3.lkb，2.66kb，2.47kb，1.45kb，
0.6kb7个条带，与预期相符，表明重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase构建成功。1.10 包装重组腺病毒质粒 pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase为确保重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase被复制和包装的效
率，质粒大提后首先用PacI限制性内切酶进行线性化酶切，反应体系如下
pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase5[j,g
IOxBuffer5.0[j,l
PacI (NEB,20 U/^il)1(^1
ddH20补齐至 50(^1
总体积50.0(^1
37°C3-4 小时然后用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为:a.每个转染孔取重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 5 U g,用300 u I的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。b.取10 ill的Lipof ectamine2000脂质体用300 U I的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。c.将上述a、b步骤的产物混合，室温避光放置30min。然后将混合物加入到人胚肾细胞系J1EK293细胞中。观察细胞病变(CPE)，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒，反复冻融三次后，取上清进行 下一代扩增或于-80°C保存备用。1.11 重组腺病毒载体 Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase 的鉴定取10 ii I重组腺病毒载体做如下处理:Virus10 U I
Priteinase K (lOmg/ml) 2 U IddH2038 U I配成50 u I反应体系，50°C水浴lh，100°C煮沸5min，以上述反应产物为模板，分别以 TFRC-Sfi1-F 和 TFRC-Sfi1-R 为引物做 PCR 反应。PCR 引物:TFRC-Sfi1-F:AAAAGGCCGCTGCGGCCACCATGATGGATCAAGCTAGTFRC-Sfi1-R:AAAAGGCCTGTTTGGCCTTAAAACTCATTGTCAATGPCR 反应体系为取模板 DNA lul, Primer F lul, Primer R I u I, IOXTaqBuffer 5u I, dNTP (IOuM) I u I, Taq 0.5u I, ddH20 40.5 u I,反应终体积 50u 10 PCR 反应条件:94°C 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 2.5min 循环 30 次；最后 72°C延伸 10min，4°C保存。将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳结果并拍照，并用DNA胶回收纯化试剂盒回收TFRC条带。可见约2.3kb处有带，与TFRC片段相符，证实为携带TFRC基因的重组腺`病毒载体，见图7。表明成功获得重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。1.12重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的滴度测定将收集的人胚肾细胞系HEK293细胞铺于2块96孔板中，每孔100 yl (IO4个细胞)。重组腺病毒载体的稀释:在96孔板的A-H排各加入100 u I标记为从IO6开始8个连续梯度稀释的重组腺病毒载体液。用同样的重组腺病毒载体储存液进行第二组的稀释。加样完毕后，将培养板置于37°C、CO2孵箱中培养10天，再读板分析，计数CPE个数。阴性对照为100 ill含5% FBS的DMEM的人胚肾细胞系HEK293细胞。用TCID50法计算病毒的滴度，测定其滴度为l.eXKTPFU/ml，能满足下一步肿瘤早期示踪的实验研究。实施例2:重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase对人结直肠癌肿瘤细胞LOVO的感染及表达实验人结直肠癌肿瘤细胞LOVO来自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心，对照Ad-GFP腺病毒来自上海汉恒公司(GFP表示绿色荧光蛋白)。步骤如下:(I)将人结直肠癌肿瘤细胞LOVO按I X IO6每孔接种至6孔板，继续培养24小时，感染前更换培养液；(2)分别加入实施例1制备得到的重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase及对照Ad-GFP腺病毒感染人结直肠癌肿瘤细胞LOVO，按照I X IO1Vml滴度，即每孔细胞加A5u I重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase或对照Ad-GFP腺病毒液；(3)对照组的腺病毒Ad-GFP在感染36小时后，观察到绿色荧光蛋白表达效果，见图8，从而间接反映了阳性组的重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase对肿瘤细胞的感染后表达效果。(4) Western Blot定量检测转铁蛋白受体过表达情况,检测结果见图9、图10。从图9、图10可见，实验组相对于对照组TFR蛋白表达水平增高，有统计学意义。实施例3:重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase的体内肿瘤示踪实验1.1 仪器活体突光影像系统:IVIS, Caliper公司；7.0T micro-MR成像系统:德国Bruker公司。1.2实验动物
BALB/c裸小鼠，4_5周龄，体重15_18g，15只，购自成都达硕实验动物技术有限公司，在四川大学动物实验中心SPF(无特定病原体)级环境饲养间饲养。所有实验操作程序均经过实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准。1.3实验方法用实施例1构建成功的重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase，以MOI=50的最佳感染复数感染人结直肠癌肿瘤细胞L0V0，于裸鼠腹股沟区皮下接种被重组腺病毒感染的人结直肠癌肿瘤细胞L0V0(1X IO7/只)，建立人结直肠癌皮下异种移植瘤模型。被重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染的人结直肠癌肿瘤细胞LOVO通过腺病毒载体中的双报告基因能够过表达转铁蛋白受体和荧光素酶，分别通过转铁蛋白受体与Tf-USPIO即转铁蛋白-超微超顺磁性氧化铁纳米颗粒结合(受体与配体的结合形式)、荧光素酶与荧光素结合(酶与底物的结合形式)的方式同步在MR和光学双模态下无创活体成像，连续动态监测15天，其成像见图11-图13。如图11、图12所示，在高场强的MR图像中可以清晰地显示出肿瘤及其与周边组织关系的解剖结构信息，尤其是肿瘤向外周侵袭的低信号改变。如图13所示，在光学图像中肿瘤病灶从接种被重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase感染的人结直肠癌肿瘤细胞LOVO第I天开始，就可以观察到明显的细胞团发光信号。实验结果表明，将本发明所述双报告基因重组腺病毒载体作为示踪剂应用于磁共振和光学双模态成像，能将这两种成像模式结合并优势互补，在早期更好地示踪肿瘤的发生发展过程，有利于研究肿瘤的发生发展机制，有利于肿瘤的早期诊断及疗效监测 。
权利要求
1.一种重组腺病毒载体，其特征在于它含有人转铁蛋白受体基因和萤火虫荧光素酶基因，能在真核细胞中同时表达转铁蛋白受体蛋白和荧光素酶蛋白，所述人转铁蛋白受体基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所述。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于编码转铁蛋白受体蛋白的基因在第一巨细胞病毒启动子的控制下表达，编码荧光素酶蛋白的基因在第二巨细胞病毒启动子的控制下表达，所述第一巨细胞病毒启动子和第二巨细胞病毒启动子为相同的巨细胞病毒启动子。
3.据权利要求1或2所述的重组腺病毒载体，其特征在于编码转铁蛋白受体蛋白的基因序列和编码荧光素酶蛋白的基因序列被分别放置在两个阅读框架内，所述人转铁蛋白受体基因的表达读码框包含巨细胞病毒启动子、人转铁蛋白受体基因和下游的PolyA加尾信号；所述萤火虫荧光素酶基因的表达读码框包含巨细胞病毒启动子、萤火虫荧光素酶基因和下游的polyA加尾信号。
4.一种重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于依次为以下步骤: (I)用PCR方法扩增人转铁蛋白受体基因；(2)将步骤(I)扩增的人转铁蛋白受体基因片段插入到含有萤火虫荧光素酶基因片段的穿梭载体pShutt le-CMV-Luc if erase上，获得重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase,并进行测序分析；(3)将验证正确后的重组穿梭载体pShutt Ie-CMV-TFRC-CMV-Luc if erase连接到骨架载体pAdeno上,得到重组腺病毒质粒PAdeno-CMV-TFRC-CMV-Luciferase ； (4)对所述重组腺病毒质粒进行XhoI酶切鉴定；(5)用人胚肾细胞系HEK293细胞包装所述重组腺病毒质粒，获得重组腺病毒载体Ad-CMV-TFRC-CMV-Luciferase。
5.权利要求1至3中任一权利要求所述重组腺病毒载体在磁共振和光学双模态成像中作为肿瘤示踪剂的应用。
全文摘要
一种重组腺病毒载体，含有人转铁蛋白受体基因和萤火虫荧光素酶基因，能在真核细胞中同时表达转铁蛋白受体蛋白和荧光素酶蛋白。其构建方法，其特征在于依次为以下步骤(1)用PCR方法扩增人转铁蛋白受体基因；(2)将步骤(1)扩增的人转铁蛋白受体基因片段插入到含有萤火虫荧光素酶基因片段的穿梭载体上，获得重组穿梭载体，并进行测序分析；(3)将验证正确后的重组穿梭载体连接到骨架载体上，得到重组腺病毒质粒；(4)对所述重组腺病毒质粒进行XhoI酶切鉴定；(5)用人胚肾细胞系HEK293细胞包装所述重组腺病毒质粒，获得重组腺病毒载体。实验表明，所述重组腺病毒载体可在磁共振和光学双模态成像中作为肿瘤示踪剂应用。
文档编号A61K49/06GK103160539SQ201210108130
公开日2013年6月19日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者郜发宝, 王一帆, 刘婷 申请人:郜发宝