新的抑癌基因unc5d及其编码蛋白的新应用的制作方法

专利名称：新的抑癌基因unc5d及其编码蛋白的新应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白的新应用，具体地说，本发明涉及UNCro作为一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白的应用。
背景技术：
UNC5D属于UNC5受体家族成员。UNC5受体家族在1997年被报到是神经生长因子netrin-1的受体，该家族中除UNCOT外，其它成员还包括UNC5A、UNC5B、UNC5C。而UNCOT在UNC5家族中是发现最晚的。Netrin-1及其受体最初是被发现在神经经系统发育中起重要作用，因其能够调控神经纤维的定向迁移。近年来，Netrin-1及其受体在肿瘤发生中的作用越来越受到重视。Netrin-1及UNC5家族中的UNC5A、UNC5B和UNC5C在肿瘤发生发展中的作用都相继有了报道。目前关于UNCro基因的肿瘤生物学功能仍未有任何报道。

发明内容
本发明的一个目的在于研究UNCro在肿瘤特别是肾癌中的表达特点和其表达调控的机制、研究UNCro的新功能并提供UNCro的新应用。在本发明中，所述UNCro包括UNCro基因或UNCro蛋白等。所述UNCOT蛋白为如SEQ ID N0.2所 示氨基酸序列组成的蛋白，或在SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与SEQ ID N0.2所示氨基酸序列组成的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。所述UNCro基因为编码本发明的UNCro蛋白的多核苷酸序列，优选为编码SEQID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列，或者除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可以包括非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非编码序列等。其中优选的UNCro基因为SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列，其为在GenBank的登记号为匪080872.2的基因。或者，更优选的UNCro基因为一种分离的核苷酸序列，其只包含编码UNCro蛋白序列，例如SEQ ID N0.1所示的编码序列:第329 3190位核苷酸序列。本领域普通技术人员已知，本发明的UNCro基因的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO:1所示的编码序列，也可以由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核苷酸的编码序列。本发明研究了 UNCro在人类多种正常组织中的表达情况，及在多种组织来源的肿瘤细胞系、配对的肾癌和癌旁组织中的表达特点，发现UNCro在多种组织来源的肿瘤细胞系中表达下调或缺失，其在肾癌组织中的表达明显低于癌旁组织。本发明还进一步通过免疫组化实验，证实UNCro蛋白在肾癌组织中表达下调。本发明通过分析临床信息资料，发现UNCro在肾癌组织中的表达下调程度与肾癌的Fuhrman分级呈相关性。本发明进一步揭示了 UNCro表达下调的机制，发现染色体上的杂合性缺失(LOH)及UNCro基因启动子区CpG岛的甲基化是导致UNCro在多种肿瘤细胞系及肾癌组织中表达下调的重要机制。本发明通过实验证实:在UNCro表达下调或缺失的肾癌细胞系(786-0及A498)中恢复UNCro的表达，可抑制肿瘤细胞增殖、细胞迁移和肿瘤细胞的克隆形成率。通过分析肾癌细胞系786-0表达UNCro前后细胞周期的变化，发现UNCro抑制细胞增殖是通过减缓G2/M的释放实现的。本发明通过在人胚肾细胞(HEK293T)中过表达UNCOT发现，UNC5D可以诱导HEK293T的凋亡，通过western blot证实UNCro所诱导的凋亡是caspase依赖的。根据以上结果，可认为UNCro是一个抑癌基因，并可作为癌症的临床诊断和/或预后判断的辅助指标，而且UNCro基因或UNCro蛋白在治疗和/或抑制肿瘤中具有重要应用价值。根据本发明的实验研究发现，本发明提供了 UNCro基因或其编码的蛋白(UNCOT蛋白)在制备治疗癌症的药物中的应用。可将本发明的UNCro序列利用任何已知的转导、转化或转染的方法施用于患病个体的肿瘤部位，在UNCro表达下调或缺失的肿瘤细胞系及癌组织中恢复UNCro的表达，通过抑制细胞周期进程从而抑制细胞生长，抑制肿瘤细胞增殖、细胞迁移或肿瘤细胞的克隆形成率，可以用于治疗癌症。根据本发明的实验研究发现，本发明还提供了检测UNCro基因或其编码的蛋白的试剂在制备用于癌症的辅助诊断和/或预后判断的组合物中的应用。可将所述的UNCro作为癌症诊断和/或预后判断的一个新指标，通过检测样品中UNCro的表达或表达水平，从而为癌症的辅助诊断和/或预后判断提供新的依据。可以利用本领域已知的任何方法检测本发明的UNCro在核酸水平的表达，也可在蛋白质水平检测本发明UNCro的表达水平。所述检测UNCro基因或其编码的蛋白的试剂包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物、或抗UNCro蛋白的抗体等。本发明的UNCro基因或UNCro蛋白均可以通过常规方法获得。例如，UNC5D基因的多核苷酸序列可以依据标准的PCR扩增技术将cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，并选取合适的寡核苷酸引物扩增得到。这样得到的核苷酸可以克隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可以通过标准DNA合成技术得到。本发明的UNCro蛋白可用各种已知的方法通过转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法诱导启动子，然后继续培养，培养完成后，回收和纯化本发明的UNCro蛋白。本发明中，作为重组UNCro蛋白，可带有或未带有标签。本发明的检测UNCro基因或UNCro蛋白的试剂也可通过本领域普通技术人员已知的各种方法来制备。具体而言,所述癌症为肾癌。本发明还提供了 UNCro基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖、抑制肿瘤细胞的克隆形成、和/或肿瘤细胞迁移中的应用。本发明通过实验证实，UNCro基因或其编码的蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖、抑制肿瘤细胞的克隆形成并能抑制肿瘤细胞迁移。具体而言，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞迁移为纤粘连蛋白诱导的肾癌细胞的迁移。根据本发明的具体实施方案，本发明所述的UNCro在具体应用时，可以是包含于载体中。所述载体可以为真核表达载体或病毒，优选为腺病毒。例如，在本发明的一个具体实施方案中，是通过腺病毒Ad-UNCOT而明显抑制肿瘤细胞的增殖或迁移。另一方面，本发明还提供了一种用于治疗癌症、抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的迁移、抑制肿瘤细胞的成瘤性、 和/或诱导细胞凋亡的药物组合物，该药物组合物含有:UNC5D基因和/或其编码的蛋白，以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。具体地，本领域的技术人员可根据其所掌握的现有技术知识选用适当的药用赋形剂或药用载体，例如可以包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合等。所述药物组合物可以采用适当的制剂形式并通过适当的给药途径来施用，这些对于本领域的技术人员而言在其知识范围内无需创造性劳动就可确定最佳的方式。根据本发明的具体实施方案，所述癌症为肾癌，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。另一方面，本发明还提供了一种用于癌症特别是肾癌诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有用于检测UNCro基因或其编码的蛋白的试剂，例如:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗体等。综上所述，本发明研究发现UNCro是一种新的潜在抑癌基因，特别是在肾癌的发生、发展过程中具有重要作用。


图1A显示PCR检测UNCro在人的16种正常组织的表达情况，从图中可见，UNC5D在人的脑、肾、前列腺、睾丸、小肠及结肠组织中均检测到了较强的表达。图1B显示PCR检测UNCro在多种组织来源的肿瘤细胞系中的表达情况，从图中可见，UNCro的表达在多种组织来源的肿瘤细胞系中普遍呈下调趋势。UNCro在非恶性的人胚肾细胞系J1EK293中有很强的表达。图1C显示本发明通过在线软件预测到UNCro基因启动子区的存在CpG岛，本发明设计的MSP弓丨物及BGS引物的位置已在图中标出。图1D (左图片)显示通过MS-PCR检测的13种细胞系中UNCro启动子区CpG岛的甲基化情况，UNCro启动子区的CpG岛在多数肿瘤细胞系中呈甲基化状态，人胚肾细胞系HEK293则呈非甲基化状态；图1D (右图片)显示通过甲基化测序技术进一步证实在MS-PCR检测阳性的几种细胞系中UNCro启动子区的CpG岛确实呈甲基化状态，而HEK293细胞确实呈非甲基化状态。图1E显示用去甲基化药物5-aza处理UNCOT低表达或表达阴性的786-0、Hela,SW480、SW620及A549五种细胞系，然后检测UNCOT的表达情况，可见在用5_aza处理一定时间后，UNC5D的表达均上调。通过甲基化测序进一步证实UNCro启动子区的CpG岛已被
去甲基化。图2A是Basic-PCR分析中的凝胶电泳照片，通过针对UNCOT特异性引物，对肾癌以及癌旁组织cDNA进行检测，说明UNCro mRNA在配对的肾癌组织中表达下调。GAPDH为系统内参。图2B显示实时定量PCR分析结果，通过对UNCro与GAPDH的检测值之比进行比较，说明UNCro mRNA在配对的肾癌组织中表达下调。图2C是免疫组化分析中的组织染色照片，用UNCro的抗体分别对肾癌以及癌旁组织进行染色，进一步证明UNCro蛋白在配对的肾癌组织中表达下调。箭头所指的就是UNCro阳性区，本发明发现在正常以及癌旁组织中，UNCro主要分别于肾小管胞质中。图2D显示UNCro在癌旁组织与配对癌组织中的表达比例(N/T ratio)与相应肿瘤组织的临床Fuhrman分级之间的统计分析结果。可以看出，随着Fuhrman分级的增高,N/T ratio呈下调趋势。图2E显示检测的肾癌组织与配对癌旁组织中UNCro启动子区CpG岛的甲基化水平，与上述表达谱及细胞系中的甲基化情况一致，肾癌组织中UNCro启动子区CpG岛普遍呈高度甲基化状态，而相应的癌旁组织则呈非甲基化或低度甲基化状态。图2F显示甲基化测序分析结果，进一步证实图2E中显示的结果。图2G显示对肾癌与配对癌旁组织进行的染色体杂合性缺失(LOH)检测的结果，如图，本发明在所选择的分别位于UNCro编码区上游、中游及下游的三个微卫星微点D8S1083、D8S505及D8S1750中均检测到了缺失的情况，图2G是三个位点发生LOH的图例。图2H是本发明对44份配对肾癌与癌旁组织进行LOH检测结果的统计图，在44对标本中，本发明检测到有14对发生了杂合性缺失。以上结果说明，除了甲基化外，LOH也是导致UNCro在肾癌组织中发生表达下降的重要原因。图3为本发明实施例3中UNCro载体的酶切鉴定图谱。图4A显示在UNCro表达下调或缺失的肾癌细胞系786_0及A498中恢复UNCOT的表达，然后用cck-8试剂检测不同时间点的细胞增殖情况，UNC5D可以明显抑制肿瘤细胞系786-0及A498的细胞增殖。图4B显示分析的肾癌细胞系786-0表达UNCOT前后细胞周期的变化情况，发现过表达UNCro的786-0细胞系无论是否用Nocodazole进行阻滞，处于G2/M期的细胞数量都明显多于对照组，这说明UNCro对786-0细胞系的增殖抑制是通过将细胞组织在G2/M期实现的。图4C显示平板克隆 形成实验结果，说明786-0细胞在过表达UNCro后，在单细胞clone生长过程中存在着差异。图4D显示软琼脂克隆形成实验结果，是研究肿瘤形成的体外实验，说明UNCro对肾癌细胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用。图4E显示划痕试验结果，说明UNCro对肾癌细胞系786-0的迁移能力具有抑制性作用。图4F显示对划痕试验进一步的定量试验分析结果，通过测量不同时间点用腺病毒过表达UNCro的786-0及对照组细胞的划痕宽度，以显示UNCro对肾癌细胞系786-0的迁移能力所具有的抑制性作用。图4G显示Transwell小室迁移实验的结果，说明UNCOT能够抑制肾癌细胞系的迁移。图4H显示Transwell小室侵袭实验结果，用以研究肿瘤细胞在体内的侵袭转移过程，结果说明UNCro能够抑制肾癌细胞系的侵袭能力。图5A显示用细胞核形态学的方法所做的细胞凋亡实验结果，过表达UNCro的HEK293T细胞系与对照组相比显示出更多的核碎裂和凋亡小体，说明UNCOT能够诱导HEK293T细胞的凋亡。图5B显示用Annexin V-7AAD双染色的方法来证实UNCOT对HEK293T细胞所诱导的凋亡实验结果，从流式图来看，无论是早期凋亡还是晚期凋亡，实验组都明显多于对照组。
图5C是用PI染色的方法来检测由于凋亡所形成的DNA定量检测时所出现的亚二倍体峰，UNCro过表达的HEK293T中出现了明显的亚二倍体峰。同时发现，加入caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK后，亚二倍体峰消失，说明UNCro所诱导的HEK293T细胞的凋亡是caspase依赖的。图显示Western blot的实验结果，UNC5D过表达的HEK293T中能够检测到明显的PAPR剪切，而且这种剪切时UNCro剂量依赖的。同样，加入caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，进一步说明UNCOT所诱导的HEK293T细胞的凋亡是caspase依赖的。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory (CSHL) Press, 2001)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，主要试剂和材料为:实验用到以下细胞系:五·种肾癌细胞系包括786-0，A498，ACHN, Cak1-1和0S-RC-2 ;两种膀胱癌细胞系包括RT-4和MGH-ul ;五种肝癌细胞系包括H印G2，Bel-7402,SMMC-7721, HLE 和 HCC-LM3 ;五种肺癌细胞系包括 NC1-H446，NC1-H460，pAa, A549 和NC1-H1299 ;四种消化道肿瘤细胞系包括SW480，SW620, HT-29和MKN-45 ;五种白血病细胞系包括U937，K562，Jurkat,Daudi和D341MED ;—种前列腺肿瘤细胞系为PC-3 ;—种乳腺癌细胞系为MCF-7 ;宫颈癌细胞系Hela ;—种卵巢癌细胞系SK-0V6 ;两种黑色素细胞瘤细胞系WM-451和SK-Mel-37 ；以及骨肿瘤细胞系Saos_2。这些细胞系购自ATCC或北京协和医学院细胞库。以上细胞系使用10% FBS/RPM1-DMEM(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml 青霉素，IOOy g/ml 链霉素)或 10% FBS/RPM1-1640(4.5g/L 葡萄糖，4mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，100 u g/ml链霉素)培养。44例人原发肾癌和癌旁配对组织由北京大学第三医院泌尿外科提供。组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司；引物(包括LOH检测所用的荧光引物)合成及测序委托北京擎科生物技术有限公司完成;Cell Counting Kit~8 (CCK-8)购自 Dojindo 公司；5-氮杂-2-脱氧胞苷(5_aza_2’ -deoxycytidine)、亚硫酸氢钠(sodiumbisulfite)、染料 33258 (Hoechst33258)、Nocodazole、碘化丙唆(Propidium iodide)以及核糖核酸酶A (RNase A)购自Sigma-Aldrich公司；TRIZ0LTM 试剂、Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司；正常组织cDNA panel (Normal tissue cDNA panel)购自 Clontech 公司；实时定量PCR 试剂 Power SYBR Green PCR master mix 购自 Bio-Rad 公司；Wizard Plus Miniprep DNA Purification System、Reverse TranscriptionSystem、pGEM-TEasy vector、T4DNA ligase、pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK、限制性内切酶BglI1、EcoR1、NheI以及高保真DNAGo Taq聚合酶购自Promega公司；KOD DNA polymerase 酶购自 TOYOBO 公司；抗UNCro抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记山羊抗兔的二抗购自Promega公司；抗GAPDH抗体购自Proteintech公司；抗Flag抗体购自Sigma-Aldrich公司；抗PARP购自Cell Signaling 公司；Fibronectin、matrigel、FITC 标记的 Annexin V 及 7-AAD 凋亡染色试剂盒购自BDBiosciences 公司。实施例1、UNCro在肿瘤细胞系中表达下调及其表观遗传学机制1.UNC5D在正常组织中的表达谱PCR检测人16种正常组织中UNCro的表达情况，反应中所用引物序列如表I中SEQID Nos.3和4所示，反应条件参见表2，用GAPDH作为系统内参(内参引物见SEQ IDNos.5 和 6)。2.细胞或组织的RNA提取按照TRIZOLTM(InVitix)gen)试剂的说明书，分别提取细胞或组织总RNA，并将其用紫外分光光度计定量。取 I U g 总 RNA,利用 Reverse Transcription System(Promega)通过Oligo dT合成第一链cDNA。3.RT-PCR 反应体 系取I ill上述cDNA产物作模板进行PCR扩增。反应中所用引物序列如表I中SEQIDNos.7和8所示，反应条件参见表2，用GAPDH作为系统内参。本实施例从32例肾癌以及癌旁配对组织中提取RNA，制备cDNA。利用BIO-RAD荧光定量PCR系统进行实时定量PCR检测。其中扩增GAPDH作为内参。4.细胞或组织的基因组DNA提取按照DNA extraction kit (Promega)的说明书提取细胞或组织的基因组DNA并将其用紫外分光光度计定量。5.UNC5D启动子区CpG岛预测通过软件(http://www.urogene.0rg/methprimer/.)进行预测，并分别设计甲基化特异性引物(SEQ ID Nos.9和10)、非甲基化特异性引物(SEQ ID Nos.11和12)及甲基化测序引物(SEQ IDNos.13和14)(如表I所示，反应条件参见表2)。6.使用bisulfite处理检测DNA甲基化水平将提取的基因组DNA使用BglII限制性内切酶酶切；使用不针对目的片段的限制性内切酶，酶切不多于700ng的基因组DNA ;通过沸水水煮10分钟以终止反应；加入2MNa0H至终浓度为0.3M，50°C放置15分钟以使DNA变性；对于每一个样品，准备6个EP管，装入300微升石蜡油，冰上放置，预冷。加入2倍体积的2%低熔点琼脂糖溶解溶液(用水溶解)到DNA溶液中，用“枪”反复吹匀；形成琼脂糖珠子:吸取10微升的DNA/琼脂糖混合物，加入到预冷的石蜡油中；(一个Ep管中只放一个珠子)将管子放置于冰上30分钟，以形成坚实的珠子；向每一个管子加入200-500微升2.5M Sodium Metabisulfite ;在暗室中，50°C放置4-12小时；用ImlTE (pH 8.0)洗珠子3遍，每次15分钟，以除去剩余的SodiumMetabisulfite ;用500微升0.2M NaOH洗珠子2遍，每次15分钟，以结束修饰；用ImlTE (pH
8.0)洗珠子3遍，每次10分钟；用小体积的TE (pH8.0)保存珠子于4°C ；(珠子可以存放数周)PCR检测前用Iml双蒸水洗珠子；以处理后得到的珠子为模板，使用GoTaq DNA合成酶(Promega),在touchdown的条件下,进行PCR扩增；DNA电泳检测结果。7.亚硫酸氢盐-基因组DNA测序以处理后得到的珠子为模板,使用GoTaq DNA合成酶,在touchdown的条件下,进行PCR扩增；DNA电泳及胶回收、纯化扩增片段；以胶回收得到的片段连接至pGEM-T easy载体；转化并进行蓝白斑筛选；挑取白色菌落(10个)进行接种到LA培养基中；送菌液进行测序；根据测序结果比对NCBI提供的正常DNA序列。 8.5-aza处理细胞系用终浓度为10 U mol/L 的 5_aza_2’-deoxycytidine (Sigma-Aldrich)处理 786-0、Hela, SW480、SW620及A549五种细胞系，然后检测UNCOT启动子区的甲基化水平。结果显示:本实施例用PCR检测UNCro在人的16种正常组织的表达情况，发现UNCOT在人的脑、肾、前列腺、睾丸、小肠及结肠组织中均检测到了较强的表达(图1A)。PCR检测UNCro在多种组织来源的肿瘤细胞系中的表达情况，发现UNCro的表达在多种组织来源的肿瘤细胞系中普遍呈下调趋势。UNC5D在非恶性的人胚肾细胞系HEK293中有很强的表达(图1B)。本实施例中，通过在线软件预测到UNCro基因启动子区的存在CpG岛，所设计的MSP引物及BGS引物的位置参见图1C中所标示。MS-PCR检测了 13种细胞系中UNCOT启动子区CpG岛的甲基化情况，发现UNCro启动子区的CpG岛在多数肿瘤细胞系中呈甲基化状态，人胚肾细胞系HEK293则呈非甲基化状态(图1D-左)；甲基化测序技术进一步证实在MS-PCR检测阳性的几种细胞系中UN`Cro启动子区的CpG岛确实呈甲基化状态，而HEK293细胞确实呈非甲基化状态(图1D-右)。用去甲基化药物5-aza处理UNCOT低表达或表达阴性的786-0、Hela, SW480、SW620及A549五种细胞系，然后检测UNCOT的表达情况，可见在用5-aza处理一定时间后，UNC5D的表达均上调。通过甲基化测序进一步证实UNCOT启动子区的CpG岛已被去甲基化(图1E)。实施例2、UNC5D在肾癌组织中表达下调及其相关机制1.细胞或组织的RNA及RT-PCR反应体系和基因组DNA提取如实施例1中所述本实施例从32例肾癌以及癌旁配对组织中提取RNA，制备cDNA。利用BIO-RAD荧光定量PCR系统进行实时定量PCR检测。其中扩增GAPDH作为内参。所用引物如表I所示，反应条件参见表2。2.免疫组化分析组织芯片经过脱蜡，梯度酒精水化，在柠檬酸钠缓冲液中煮沸15min进行抗原修复，用3% H2O2室温避光孵育20min去除内源性过氧化物酶，用正常羊血清工作液室温封闭30min，然后滴加兔抗人UNCro多克隆抗体(Santa)至终浓度1: 100，于37°C反应lh。用同样浓度的正常兔源IgG作为阴性对照。用PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔小鼠抗山羊二抗室温反应30分钟，用PBS洗涤三次，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。3.UNC5D表达相关的统计分析UNCro在癌旁组织与配对癌组织中的表达比例(N/T ratio)与相应肿瘤组织的临床Fuhrman分级之间的统计分析。本发明将Fuhrman级别分为三组,1/1_11、11/11_111和III/II1-1V，分别有11、37、12份病例对应。4.检测DNA甲基化水平及亚硫酸氢盐-基因组DNA测序方法如实施例1所述。共检测病例标本44份，每份均包括肾癌与配对的癌旁组织。5.杂合性缺失检测本发明选择了分别位于UNCro编码区上游、中游及下游的三个微卫星微点，即:D8S1083、D8S505及D8S1750,并合成相应地的荧光引物(见表I中SEQ ID Nos.15和16、SEQ ID Nos.17和18、SEQ ID Nos.19和20)，反应条件参见表2，通过分析PCR产物的大小来确定是否发生了 L0H。共检测病例标本44份，每份均包括肾癌与配对的癌旁组织。结果显示:根据前面的生物信息学分析及细胞系结果的提示，本发明把注意力转向临床标本，本发明选择了肾透明细胞癌。通过普通PCR检测发现:UNC 在四对所检测的肾癌与配对癌旁组织中均表现为肾癌组织中表达确实或明显下调(图2A)。然后本发明对32对标本进行实时定量PCR检测，通过对UNCro与GAPDH的检测值之比进行比较，说明UNC5DmRNA在配对的肾癌组织中表 达下调(图2B)。免疫组化结果进一步证实UNCro蛋白在配对的肾癌组织中表达下调(图2C，图中箭头所指的就是UNCro阳性区，本发明发现在正常以及癌旁组织中，UNCro主要分别于肾小管胞质中)。通过UNCro在癌旁组织与配对癌组织中的表达比例(N/T ratio)与相应肿瘤组织的临床Fuhrman分级之间进行统计分析,本发明发现一个有意思的现象=UNCOT在恶性程度越低的肾癌组织中似乎表达受抑制程度相对越低(图2D，随着Fuhrman分级的增高，N/Tratio呈下调趋势)。本发明从两方面来描述UNCro在肾癌组织中表达下调的机制，一是UNCro基因启动子区的甲基化检测(图2E及图2F)，二是染色体上UNCro区段的杂合性缺失(图2G及图2H)。实验证实这两种机制均参与了了 UNCro在肾癌组织中表达下调的调控。具体地，图2E是检测的肾癌组织与配对癌旁组织中UNCro启动子区CpG岛的甲基化水平，与上述表达谱及细胞系中的甲基化情况一致，肾癌组织中UNCro启动子区CpG岛普遍呈高度甲基化状态，而相应的癌旁组织则呈非甲基化或低度甲基化状态；图2F是通过甲基化测序分析进一步证实图2E的结果。图2G是对肾癌与配对癌旁组织进行的染色体杂合性缺失(LOH)检测的结果，如图，本发明在所选择的分别位于UNCro编码区上游、中游及下游的三个微卫星微点D8S1083、D8S505及D8S1750中均检测到了缺失的情况，图2G是三个位点发生LOH的图例。图2H是本发明对44份配对肾癌与癌旁组织进行LOH检测结果的统计图，在44对标本中，本发明检测到有14对发生了杂合性缺失。以上结果说明，除了甲基化外，LOH也是导致UNC5D在肾癌组织中发生表达下降的重要原因。实施例3、UNC5D对肿瘤细胞系的增殖、迁移及克隆形成能力的抑制作用1.UNCro真核表达载体的构建本发明以脑组织cDNA为模板，通过高保真Taq酶K.0.D酶进行PCR扩增(扩增引物见表I中SEQ ID Nos.21和22，反应条件参见表2)，其中上游引物带有EcoRI酶切位点，下游引物带有NheI酶切位点，将PCR产物及pRK空载体用EcoRI和NheI进行双酶切处理，然后DNA电泳分离纯化，用T4连接酶将产物进行连接，经过转化-挑单克隆-小摇菌液-小提质粒等一系列操作后，最后经测序及酶切进行验证(酶切图谱见图3)，测序正确。正确的质粒进行大量提取。UNCro蛋白产物的C端标有flag标签。2.腺病毒Ad-UNCOT载体的构建和病毒的包装Ad-UNC5D以及对照空载体病毒Achnull (Mock)、Ad-GFP委托本元正阳公司重组、包装、纯化获得，TCID50亦由该公司测定。3.肾癌细胞系的感染以及转染细胞在感染前一天以适宜密度接种于96孔板、12孔板、6孔板或60mm细胞培养皿中，18-22小时后进行细胞计数，用不同的MOI值感染细胞。吸去原细胞培养上清，加入半量新鲜完全培养基，而后在加入腺病毒的第一小时里每15分钟轻轻晃动培养皿，一小时后补足培养基。待转染的细胞提前24小时接种于6孔板中，转染前将培养基换成Opt1-MEM培养基，将含有12ii I的lipofetamine2000的Opt1-MEM培养基2504 y I与含有4 y g质粒DNA的OptiM培养基混合，室温30分钟后，滴加入培养基中，4-6小时后换为普通培养基。24小时后观察。4.CCK-8法绘制细胞的生长曲线将腺病毒感染后的细胞按照2000细胞/孔的密度接种于96孔板中，每组细胞设3个平行复孔，分别于0h、24h、48h、72h加入10 U I的CCK-8试剂，于37°C在5% CO2下孵育2小时后，用ELISA Reader 450nm测量光密度值。对各时间点不同组的结果进行统计后绘制细胞的生长曲线。5.细胞周期实验将786-0细胞以I X 106接种于60mm培养板，80%汇合后感染。24小时后在新鲜培养液中加入nocodazole (300ng/ml ； Sigma-A I dr ich), 16小时后收集变圆的细胞，PBS洗两遍，弃上清，培基重悬以2X10 5/well铺入6孔板中，每两小时为一时间点收获细胞，PBS洗两遍，加入Iml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4°C固定12小时以上。以PBS洗涤去乙醇，IOOOrpm, 5min,洗两遍。0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50 u g/ml，37°C温浴30min。用流式细胞仪测定周期。以FlowJo软件(Tree Star)分析流式数据。6.平板克隆形成实验分别将转染pRK的细胞(对照组)以及pRK-UNC5CL的细胞(实验组)按每孔1000个、2000个以及10000个细胞接种到6孔板中，24小时后将培养基换成含有G418的普通培养基培养，每三天换一次液，14天后使用预冷的甲醇固定，0.005结晶紫染色。7.软琼脂克隆形成实验将腺病毒感染后的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至IX IO6细胞/L。用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40°C中使之不凝固。按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2 X DMEM培养基(含有2 X抗生素和20 %的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直径为6cm的平皿中(IOcm平皿加7 IOml),冷却凝固，可作底层琼脂置于CO2温箱中备用。按1:1比例使0.7%的琼脂糖和2XDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再将感染Ad-GFP的细胞(对照组)以及感染Ad-UNC5CL的细胞(实验组)分别加入1.5ml的刚刚配好的混合物中，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37°C、5% CO2的温箱中培养10 14天。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
8.迁移、侵袭和划痕以及划痕定量实验采用孔径为8 ii m 的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)的 24-wellTranswell (Corning公司)进行趋化性迁移实验(chemotaxis assay)。用10 % FBS置于下室，将fibronectin(纤粘连蛋白)(BD-Pharmingen公司)涂于聚碳酸酯膜的下层。收获对数生长期的细胞，用0.1% BSA/DMEM洗细胞2遍，调整细胞密度至I X 107ml，50 yl/孔，每种细胞设3个平行复孔。于37°C在5% CO2下孵育I小时后，收膜，用甲醇固定细胞，Giemsa染色20分钟，用棉签轻轻刮去上层未迁移的细胞，用PBS洗3遍，光学显微镜下观察。每孔随机选取3个高倍镜视野进行计数，对每种细胞3个平行复孔9个高倍镜视野的计数值取算术平均数进行统计。侵袭实验实在Transwell迁移实验的基础上在小室膜上面涂上30 ii g的Matrigel (BD Biosciences)。.划痕实验在6孔板中进行,将感染后的细胞铺于孔中直至长满一层，使用无菌枪头将细胞划痕，用PBS洗3次，孵育至相应时间点后在镜下进行观察照相。划痕定量试验中，每三个小时为一个时间点，用相差显微镜进行拍照记录，然后测量划痕的宽度并绘制曲线图。结果显示:在UNCro表达下调或缺失的肾癌细胞系786-0及A498中恢复UNCOT的表达，然后用cck-8试剂检测不同时间点的细胞增殖情况，UNCro可以明显抑制肿瘤细胞系786-0及A498的细胞增殖(图4A)。分析的肾癌细胞系786-0表达UNCro前后细胞周期的变化，发现过表达UNCro的786-0细胞系无论是否用Nocodazole进行阻滞，处于G2/M期的细胞数量都明显多于对照组，这说明UNCro对786-0细胞系的增殖抑制是通过将细胞组织在G2/M期实现的(图4B)。在平板克隆形成实验中，786-0细胞在过表达UNCro后，在单细胞clone生长过程中存在着差异(图4C)。同样，在软琼脂克隆形成实验中，UNCro对肾癌细胞系786-0的克隆形成能力具有抑制性作用(图4D)。划痕试验显示UNCro对肾癌细胞系786-0的迁移能力具有抑制性作用(图4E)。对划痕试验进一步的定量试验，通过测量不同时间点用腺病毒过表达UNCro的786-0及对照组细胞的划痕宽度，以显示UNCro对肾癌细胞系786-0的迁移能力所具有的抑制性作用(图4F)。Transwell小室迁移实验的结果说明UNCro能够抑制肾癌细胞系的迁移(图4G)，T ranswell小室侵袭实验，用以研究肿瘤细胞在体内的侵袭转移过程，结果说明UNCro能够抑制肾癌细胞系的侵袭能力(图4H)。实施例4、UNC5D对人胚肾细胞HEK293T的凋亡诱导及其相关分子机制1.细胞核形态学检测凋亡收获UNCro过表达的293T细胞及对照组细胞，PBS洗涤两次，以含4%福尔马林的PBS固定细胞30分钟，PBS洗涤两次，以Hoechst33258 (Sigma)染色5分钟，PBS洗涤两次，在荧光显微镜的UV通道下观察记录，出现核碎裂和凋亡小体的细胞被认为是凋亡细胞。2.流式细胞学检测凋亡Annexin V-7AAD双染色的方法为收获UNCOT过表达的293T细胞及对照组细胞，PBS洗漆两次,按照Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)的说明书进行检测。在用PI染色的方法来检测由于凋亡所形成的DNA定量检测时所出现的亚二倍体峰的试验中，在293T细胞中转入UNCro及MOCK质粒，加入或不加caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK，48小时后收获UNCro过表达的293T细胞及对照组细胞，PBS洗涤两次，然后加入Iml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4°C固定12小时以上。以PBS洗涤去乙醇，1000rpm，5min，洗两遍。0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50i! g/ml，37°C温浴30min。用流式细胞仪测定。3.Wertern blot 检测凋亡在293T细胞中转入UNCro及MOCK质粒，加入或不加caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK, 48小时后收获UNCOT过表达的293T细胞及对照组细胞，收获相同数量的UNCOT过表达的293T细胞及对照组细胞的总细胞蛋白，Wertern blot检测，PAPR及其剪切蛋白，GAI3DH 及 flag。结果显示:在用细胞核形态学的方法所做的细胞凋亡实验中，过表达UNCro的HEK293T细胞系与对照组相比显示出更多的核碎裂和凋亡小体，说明UNCro能够诱导HEK293T细胞的凋亡(图5A)。用Annexin V-7AAD双染色的方法来证实UNCOT对HEK293T细胞所诱导的凋亡，无论是早期凋亡还是晚期凋亡，实验组都明显多于对照组(图5B)。用PI染色的方法来检测由于凋亡所形成的DNA定量检测时所出现的亚二倍体峰，UNC5D过表达的HEK293T中出现了明显的亚二倍体峰。同时发现，加入caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK后，亚二倍体峰消失，说明UNCro所诱导的HEK293T细胞的凋亡是caspase依赖的(图5C)。Westernblot的实验结果中，UNCro过表达的HEK293T中能够检测到明显的PAPR剪切，而且这种剪切时UNCro剂量依赖的。同样，加入caspase的广泛抑制剂Z-VAD-FMK后，PAPR剪切消失，进一步说明UNCro所诱导的HEK293T细胞的凋亡是caspase依赖的(图OT)。表1-引物列表
权利要求
1.UNC5D基因和/或其编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。
2.检测UNCro基因或其编码的蛋白的试剂在制备用于癌症的辅助诊断和/或预后判断的组合物中的应用； 优选地，所述检测UNCro基因或其编码的蛋白的试剂包括:用于在PCR中合成UNCro基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物、或抗UNCOT蛋白的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述癌症为肾癌。
4.UNC5D基因和/或其编码的蛋白在制备具有抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的迁移、抑制肿瘤细胞的成瘤性、和/或诱导细胞凋亡的效果的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。
6.根据权利要求4所述的应用，其中，所述迁移为细胞外基质纤粘连蛋白诱导的肾癌细胞的迁移。
7.根据权利要求1或2或4或5或6所述的应用，其中，所述UNCro基因包含于载体 中； 优选地，所述载体为真核表达载体或病毒，更优选为腺病毒。
8.一种用于治疗癌症、抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的迁移、抑制肿瘤细胞的成瘤性、和/或诱导细胞凋亡的药物组合物，该药物组合物含有: UNC5D基因和/或其编码的蛋白，以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述癌症为肾癌，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。
10.一种用于癌症诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有:用于在PCR中合成UNC5D基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物，或抗UNCOT蛋白的抗体； 优选地，所述癌症为肾癌。
全文摘要
本发明提供了新的抑癌基因UNC5D基因及其编码蛋白的新应用，具体涉及UNC5D基因和/或其编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用；检测UNC5D基因或其编码的蛋白的试剂在制备用于癌症的辅助诊断和/或预后判断的组合物中的应用；UNC5D基因和/或其编码的蛋白在制备具有抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的迁移、抑制肿瘤细胞的成瘤性、和/或诱导细胞凋亡的效果的制剂中的应用。本发明研究发现UNC5D是一种新的潜在抑癌基因，特别是在肾癌的发生、发展过程中具有重要作用。
文档编号A61P35/00GK103157116SQ20121036209
公开日2013年6月19日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者张君, 张毓, 吕丹, 董冬 申请人:北京大学