专利名称：一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法，属于纳米无机材料及生物化学领域。
背景技术：
纳米二氧化硅是一种无毒、生物相容性好的无机纳米材料，且其表面易于修饰和改性，被广泛的应用于生物标记、纳米探针、载药体系等生物医学领域。利用纳米二氧化硅包裹特定分子制备特殊材料应用十分广泛，如利用纳米二氧化硅包裹药物、利用纳米二氧化硅包裹荧光物质提高量子产率等，但是其潜在生物毒性是无法回避问题。本发明首次报到二氧化硅包裹荧光蛋白，具有优异生物相容性和分散性并成功应用于小动物活体成像。
发明内容
根据现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法，并且适用于其他蛋白质，具有以下的过程和步骤
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接取1-100 mg的荧光蛋白和50-1000ul的3_氛丙基二乙氧基娃烧,在10-500 mg I-(3-二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10-500 mg N-羟基丁二酰亚胺存在下反应，经G 25脱盐和1000-10000 g超滤即得产物；
b.包裹近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅的制备将50-500mg的碱性氨基酸加入去离子水中充分搅匀，加入上述O. 1-1 ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物，再加入10-100 ul四乙氧基硅烷和环己烷，室温搅拌反应完全后，3500g超滤洗涤3-5次除去氨基酸等杂质，即可得到包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。与现有技术相比，本发明具有如下的突出的优点
本发明利用一种简单的方法制备包裹荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒，将荧光蛋白包裹在纳米二氧化硅内部，通过包裹改善了荧光蛋白的稳定性，具有更好的热稳定性和pH稳定性，且具有不易被酶解和荧光不易被淬灭等优良的性能，大大扩展了蛋白的利用范围和领域。将所得的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小动物尾静脉注射，在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。
图I为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的透射电子显微镜(TEM)照片图。图2为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒的动态光散射(DLS)图。图3为本发明所得为同等浓度下的包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白的荧光光谱图。
图4为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白在小鼠肝脏S9体系中对比曲线图。图5为本发明所得包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒与近红外荧光蛋白酶解对比曲线图。图6为本发明所得直接包裹近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒小鼠尾静脉注射的小动物活体成像图。
具体实施例方式下面结合附图，将本发明的具体实施例进一步说明于后。
实施例I
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与近红外荧光蛋白共价连接取一定量的近红外荧光蛋白(叫 650)，溶于14.6毫升pH为7. 5的磷酸盐缓冲液，加入200毫克1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，250毫克N-羟基丁二酰亚胺，再加入400微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌24小时，经脱盐和超滤即得产物；
b.包裹近红外突光蛋白(eqFP650)的纳米二氧化娃的制备取75mg赖氨酸加入15ml去离子水中充分搅匀，加入2. Iml上述3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物，再加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷，室温剧烈搅拌反应12小时，在逐步加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷室温搅拌12小时至完全反应。超滤洗涤(3500g /分左右)数次除去氨基酸等杂质，即可得到包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。c.将所得的包含近红外荧光蛋白(eqFP650)的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小鼠尾静脉注射。在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。实施例2
a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与近红外荧光蛋白共价连接取一定量的近红外荧光蛋白(叫 650)，溶于14.6毫升pH为7. 5的磷酸盐缓冲液，加入200毫克1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，250毫克N-羟基丁二酰亚胺，再加入400微升3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌24小时，经脱盐和超滤即得产物；
b.包裹mNeptune荧光蛋白的纳米二氧化硅的制备取IOOmg赖氨酸加入15ml去离子水中充分搅匀，加入I. Iml上述3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物，再加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷，室温剧烈搅拌反应12小时，在逐步加入18ul四乙氧基硅烷和12ul环己烷室温搅拌12小时至完全反应。超滤洗涤(4000 g /分左右)数次除去氨基酸等杂质，即可得到包含近红外荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。c.将所得的包含mNeptune荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小鼠尾静脉注射。在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。实施例3
可将实施例I中的近红外突光蛋白换成其他红外突光蛋白(Infrared FluorescentProteins),其他操作方法参照实施例1，仍可得到包裹红外荧光蛋白的纳米二氧化硅材料应用于活体成像中。a.所制备的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒具有优异的分散性。将制备的纳米颗粒分散在磷酸盐缓冲液，生理盐水，细胞培养液，牛血清中静置三个月仍能够均匀分散在溶液中没有出现沉淀。b.所制备的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒在稳定性和荧光强度方面较单纯的荧光蛋白有显著的提升。所制备的荧光纳米颗粒在抗变性剂，抗蛋白酶解，抗小鼠肝S9方面较荧光蛋白有着显著的提升，且在相同浓度下其荧光强度时单纯荧光蛋白的I. 5倍。c.所制备的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒具有优异的生物相容性和生物安全性。所制备的包裹荧光蛋白的纳米颗粒相对于传统的含有重金属的量子点荧光探针来说，具有优异的生物相容性，不会对生物体产生潜在安全隐患。
d.纳米二氧化硅包裹的荧光蛋白能够成功的应用于动物水平成像。将所得的包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒分散在生理盐水中，通过小鼠尾静脉注射。在小动物活体成像系统中能够成功的进行小动物光学显像。
权利要求
1.一种利用纳米二氧化硅包裹荧光蛋白的方法，其特征在于，具有以下的步骤 a.3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接取1-100 mg的荧光蛋白和50-1000ul的3_氛丙基二乙氧基娃烧,在10-500 mg I-(3-二甲氛基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10-500 mg N-羟基丁二酰亚胺存在下反应，经G 25脱盐和1000-10000 g超滤即得产物； b.包裹荧光蛋白的纳米二氧化硅的制备将50-500mg的碱性氨基酸加入去离子水中充分搅匀，加入上述3-氨丙基三乙氧基硅烷与荧光蛋白共价连接产物O. 1-3 ml，再加入10-100 ul四乙氧基硅烷和环己烷，室温搅拌反应完全后，3500g超滤洗涤3-5次除去氨基酸等杂质，即可得到包含荧光蛋白的纳米二氧化硅颗粒。
全文摘要
本发明涉及一种利用纳米二氧化硅包裹蛋白质的方法。属于纳米无机材料及生物医学领域。本发明方法的主要步骤是将一定量的3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接，然后，利用碱性氨基酸催化四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷与蛋白质共价连接产物水解，即可得到包裹近红外、红外、绿色荧光蛋白的荧光纳米二氧化硅颗粒；制备方法简单易行，所制得的纳米颗粒具有极好稳定性、分散性和生物安全性，且具有不易被酶解优良的性能；能成功的应用于小动物活体成像。
文档编号A61K49/00GK102961762SQ201210442948
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者曹傲能, 杨宇, 崔阳冬, 韩凯, 王海芳 申请人:上海大学