专利名称：一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程，涉及一种全人源白血病单链抗体库和其构建方法，及其在制备白血病抗体药物中的应用。
背景技术：
自K6hler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术至今,单克隆抗体在肿瘤的诊断和治疗领域得到了广泛的应用。第一代应用于人类疾病治疗的主要是鼠源性单抗，但是鼠单抗的主要缺点是引起人体免疫反应，人体产生的人抗鼠抗体使其很快清除，不能很好的发挥其生物学功能，因此在临床应用中受到限制；第二代抗体是在鼠单抗基础上，通过基因重组形成了嵌合式抗体和人源化抗体，但两者应用于人体依旧存在免疫原性问题；目前，人们正致力于第三代抗体即全人源性单克隆抗体的研究，主要采用噬菌体展示技术(phagedisplay)结合基因工程技术，由此产生的多株人源性单克隆抗体已经成功地应用于临床疾病的治疗。特别是在肿瘤治疗领域，迄今为止，美国FDA已经批准了 12种单克隆抗体药物上市，成为全球生物制药领域的热点。噬菌体展示技术最初由Smith于1985年创建，噬菌体作为一种表达载体将多肽展示于病毒外壳。基本原理是将外源DNA插入到丝状噬菌体的基因组DNA中，使外源DNA编码的肽段得以表达并伸展到噬菌体表面。通过采用与固定配体相互作用的亲和筛选方法，可以富集得到能表达某种特异肽序列的曬菌体。曬菌体(口1^86)和卩遼菌粒(口1^861]11(1)都可作为表达载体来展示抗体或其他蛋白。噬菌粒携带表达gin外壳的基因、克隆位点及噬菌体包装信号，并由辅助噬菌体(如M13K07或VCS-M13)提供完成包装所需的结构蛋白。含有完整噬菌体基因组的丝状噬菌体常用来构建肽库，而噬菌粒能够展示大量重组蛋白，更易于产生可溶性蛋白，同时自身不易受异源基因影响，因此在噬菌体抗体库构建中占据主导地位。抗体片段是首次在曬菌体表面成功展示的蛋白质。1990年，McCafferty等采用PCR方法扩增出完整的抗体可变区基因，将多样性可变区基因组装到表达载体内，转化宿主细胞，并最终表达到噬菌体表面，从而得到多样性噬菌体抗体集合，即噬菌体抗体库。噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将抗体基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过DNA测序可以获得特定展示抗体片段的基因序列信息，并可用特定的靶抗原筛选出特异性的噬菌体抗体；在此基础上，可以通过基因工程的方法，在大肠杆菌表达可以得到大量表达的抗体。噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链等功能基因连接起来，插入噬菌体载体上，使其展示在噬菌体表面。目前，最受关注的卩遼菌体展示的抗体分子，主要包括抗体结合片段(fragment antigenbinding, Fab)、单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)等。相对于完整的抗体分子，Fab和scFv等小分子片段结构简单(不存在Fe段)，组织穿透率高，并且能够在原核生物中高效表达。其中scFv是目前报导最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区Fv段组成。scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接区(linker)连接而成。所加的linker很重要,必须不影响scFv的构象。将scFv基因克隆在丝状曬菌体载体pill基因先导序列和PlII基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scFv，在加入辅助噬菌体M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。pCANTAB_5E载体的特点是，在scFv基因后面含有一段编码Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一个琥珀(Amber)终止密码，位于scFv基因与pill基因之间，在抑制性细菌TGl中，这种琥珀密码子只有20%有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此终止子被识别，同时scFv基因在pill基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。再用特定的肿瘤相关抗原，通过“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程(panning)，可筛选出特异性单链抗体
发明内容
本发明目的是提供一种白血病单链抗体库，即噬菌体单链抗体库，含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL(包括V K和VX)，及中间连接区linker序列为(GGGGS)3，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到I. 5X 109。经DNA序列分析后证明其多样性良好，并且可以通过感染宿主(大肠细菌TGl)进行大量扩增和再生。利用特定的白血病细胞的靶抗原，可以通过噬菌体展示的方法，方便地筛选出白血病特异的单链抗体，进而用于白血病的靶向治疗。本发明的另一个目的是提供一种白血病单链抗体库的构建方法，通过以下技术方案实现(I)总RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR (RT-PCR)逆转录为cDNA。这一步中，我们直接采用人类的淋巴细胞作为抗体基因的来源，可以获得全人源的单链抗体，可以避免其它动物来源抗体作为药物在人类使用中的免疫原性和过敏反应；同时，因为采用了多种白血病患者的样本，提高了单链抗体库的多样性。(2)用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，引物序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步骤(I)获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL (包括V k和V入)。这一步中，我们设计的引物包含了不同免疫球蛋白家族的抗体类型，使之可以克隆人类全套VH和VL基因。(3)单链抗体(SCFv)基因片段的组装和全长扩增设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽(linker)序列和酶切位点SfiI、NotI的引物,所述连接肽和酶切位点SfiI、NotI的引物序列如SEQ ID NO. 33-64所示，在上述扩增的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因的基础上，再经重叠PCR (SOE-PCR)获得scFv基因。在这一步中，我们使用的linker序列很重要，其结构不会影响scFv的构象，有利于其活性发挥。(4)重组噬菌粒的构建分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体PCANTAB-5E，构建重组噬菌粒(见图1)，转化感受态E. coli TG1，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库；经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库(噬菌体单链抗体库)，库容达到1.5X109。在这一步中，我们采用了重复转化的策略，即制备足够量的重组噬菌粒，经过100多次的转化E. coli TG，并采用电转化的方式大大提高转化的效率，得到较大库容量的单链抗体库。(5)单链抗体库的多样性分析随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析；证明其多样性良好。本发明的再一个目的是提供所述全人源白血病单链抗体库在在制备白血病抗体药物中的应用，通过以下步骤实现用白血病相关抗原(如⑶33胞外区蛋白⑶33-E⑶)作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选上述全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。经免疫荧光法证明，筛选出来的单链抗体可以与CD33阳性的白血病细胞特异结合，并能有效地抑制CD33阳性的白血病细胞的生长，从而可以用于白血病的靶向治疗。 总之，本发明构建了一种独特的全人源白血病单链抗体库，可以用于筛选与白血病细胞特异结合的单链抗体，这类特异识别和结合肿瘤细胞的单链抗体本身或者经过结构改造后，可作为靶向药物用于白血病的治疗。本发明的特点是(I)本发明提供的全人源白血病单链抗体库，库容量大，多样性良好；以噬菌粒PCANTAB-5E为载体，包含全套人类单链抗体的组合；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(GGGGS) 3连接而成，且含有完整的抗原结合部位。(2)本发明提供的构建全人源白血病单链抗体库的技术，从白血病人血液出发，设计32条特异的引物，主要利用RT-PCR、SOE-PCR等分子生物学技术结合噬菌体展示技术，通过重复电转化，可以获得全人源单链抗体库；技术可操作性强，库容量大。(3)本发明的全人源白血病单链抗体库，因为以噬菌粒为载体，通过感染大肠杆菌而扩增并将单链抗体展示在噬菌体表面，从而可以用特定的白血病相关抗原作为靶标，可方便地筛选出对白血病特异的全人源单链抗体，这些全人源单链抗体可作为靶向药物，用于白血病的治疗。
图I、重组载体pCANTAB-5E的构建图。图2、总RNA电泳检测结果。图3、PCR扩增重链可变区VH基因。图4、PCR扩增轻链可变区VX基因。图5、PCR扩增轻链可变区Vk基因。图6、PCR 二次扩增轻链可变区VH基因。图7、PCR 二次扩增重链可变区V A基因。图8、PCR 二次扩增轻链可变区V K基因。图9、SOE-PCR 扩增 scFv 基因。图10、细胞免疫荧光分析结果。
图11、单链抗体对白血病细胞的特异杀伤作用。
具体实施例方式本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。实施例I :白血病人淋巴细胞总RNA的提取和cDNA的合成实验方法(I)分离白血病人血淋巴细胞取白血病病人志愿者血液，采用TAKARA公司的淋巴细胞分离液，每份按照下列方法分别分离外周血淋巴细胞①取白血病病人外周血f 2ml，加入等体积PBS稀释；
②取无菌15ml离心管，加入淋巴细胞分离液，使分离液PBS :外周血=1 1 :1，小心将稀释后的血液加到分离液上面，开始时要尽量贴近液面，慢慢滴加；③置于低速水平离心机，2500rpm,常温，离心20min，离心过程中升速和降速都要缓慢，以免混层；④轻轻取出，可见管中呈现四层，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)，分离液层(无色)和红细胞层(红色)，用一次性吸管轻轻吸取淋巴细胞层，于I. 5ml EP 管，约取 400 U I/ 管；⑤用PBS缓冲液等比例稀释，2500rpm，常温离心lOmin，备用。(2) TRIZOL法提取细胞总RNA采用Invotrigen公司的TRIZOL试剂进行如下操作①上述分离得到的人外周血淋巴细胞，经计数后，按每毫升裂解液裂解5X IO6个细胞的量，每I. 5ml的EP管中加Iml TRIZOL溶液，用移液枪将细胞沉淀吹打散，振荡器稍微震荡，至混合液基本澄清，室温静置5min ；②每管加入200 ill氯仿，用力摇晃试管15 30s，30° C下孵育2 3min ;③用12000Xg，4° C，离心15min，离心后混合物呈三层上层无色的水相，中间层和下层红色的苯酚-氯仿层；④吸取上层水相(约500-600 U I)转入新的I. 5ml EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置lOmin，沉淀RNA ；⑤用12000Xg，4。C，离心 IOmin ;⑥弃去上清，用Iml 75%的乙醇(临用前十分钟内用DEPC水配制，置冰浴)洗涤RNA沉淀；⑦2-8° C下，不超过7500 Xg的离心力离心5min ;⑧尽量弃去上清，倒置于吸水纸上，自然晾干(但不能完全干燥)，用IOlOiUDEPC水溶解；⑨取2 ill RNA做1%琼脂糖凝胶电泳检测。该步骤后，将用于逆转录成cDNA。(3) cDNA链的合成①在I. 5ml RNase-free PCR管中加入如下混合液Oiigo dT Primer (50 ,uVI)I \i\
dNTP Mixture (10 mM each) I jil.
Total RNA<5 Mg
RNase free dd.H20 up to10 j..il②将上述RNase-free PCR管于65。C保温5min后置冰上急冷，简易离心数秒；③继续在上述RNase-free PCR管中加入如下混合液
上述反应液10j.il
5 X Reaction Buffer4 )..il
RNase ! nhibitor(40 U/fil)0.5 .Lil PrimeScript Ii RTase (200 U/.lU) I (.il
RNase free ddH204.5 ial
Total20 ,Lil轻柔混匀，简易离心数秒；④在PCR仪上按以下反应条件逆转录42。C 60min70° C 15min4° C holding反应产物置于-20° C保存，-80° C可长期保存。实验结果以白血病志愿者外周血为材料,分离淋巴细胞后,抽提总RNA，将抽提出的总RNA取2iU，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，染色后在紫外灯下观察，并拍照，结果见图2。图2中，共2个测试样品，可见三条明显的条带，分别为核糖体5S、18S和28S RNAdl明总RNA抽提正常，无降解。逆转录合成的cDNA包含了人全部抗体基因，为白血病单链抗体基因的克隆准备了起始材料。实施例2 :用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因实验方法(I)引物设计根据GenBank中人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的引物(见表I)，共32条(序列如SEQ ID NO. 1_32所示)，委托上海生工生物工程有限公司合成。表I.人免疫球蛋白可变区基因PCR扩增引物
权利要求
1.一种白血病单链抗体库，其特征在于该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列为(GGGGS) 3，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒PCANTAB-5E为载体，库容达到I. 5X 109。
2.根据权利要求I所述的一种白血病单链抗体库的构建方法，其特征在于通过以下步骤实现 (1)总RNA提取和cDNA的合成取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA ； (2)用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，序列如SEQ ID NO. 1-32所示；以步骤(I)获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL，包括Vk和V λ ； (3)单链抗体scFv基因片段的组装和全长扩增设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽序列和酶切位点Sfil、NotI的引物，在上述扩增的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上，再经重叠PCR获得scFv基因； (4)重组噬菌粒的构建分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体PCANTAB-5E,构建重组噬菌粒，转化感受态瓦coli TG1，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库，经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库，库容达到I. 5 X IO9 ; (5)单链抗体库的多样性分析随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明其多样性良好。
3.根据权利要求2所述的一种白血病单链抗体库的构建方法，其特征在于步骤(3)所述连接肽序列和酶切位点Sfil、NotI的引物序列如SEQ ID NO. 33-64所示。
4.根据权利要求I所述的一种白血病单链抗体库在制备白血病抗体药物中的应用，其特征在于通过以下步骤实现用白血病相关抗原作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述白血病相关抗原选用CD33胞外区蛋白。
全文摘要
本发明提供一种白血病噬菌体单链抗体库，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×109，经DNA测序证明其多样性良好。从该全人源白血病单链抗体库中，通过噬菌体展示技术，以特定的白血病相关抗原为靶标，经过多轮淘筛，可以方便地获得白血病细胞特异的全人源单链抗体。本发明提供的抗体库的库容量大，多样性良好；包含全套人类单链抗体的组合；单链抗体由重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(GGGGS)3连接而成，且含有完整的抗原结合部位。所述方法可操作性强，库容量大，可方便地筛选出对白血病特异的全人源单链抗体，这些全人源单链抗体可制备为靶向药物，用于白血病的治疗。
文档编号A61P35/02GK102978713SQ201210484448
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者詹金彪, 范娜娜, 张珍珍, 林莉, 汤沁, 代争 申请人:浙江大学