抗癌融合蛋白的制作方法

抗癌融合蛋白的制作方法
【专利摘要】融合蛋白，其包含：结构域（a），其为hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和至少一个结构域（b），其为具有抗肿瘤细胞的抗增殖活性的效应子肽的序列，其中结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治疗癌症疾病。
【专利说明】抗癌融合蛋白
[0001]本发明涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本发明涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和抗增殖肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是作为抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。
[0002]TRAIL蛋白，细胞因子家族的成员(肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体)，也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白、其氨基酸序列、编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。
[0003]TRAIL蛋白通过与促细胞调亡表面TRAIL受体I和2 (TRAIL-R1/R2)结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5 (死亡受体4和死亡受体5)，是TNF受体家族的成员并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导阻抑基因P53非依赖性细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。[0004]TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。
[0005]TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了 TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，使用具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL (rhTRAIL)(在INN下称作dulanermin)进行的人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。
[0006]短于114-281的TRAIL片段也能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。
[0007]到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签的存在相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。
[0008]然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性(见例如W02007/022214)。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了 TRAIL作为抗癌试剂的有用性。
[0009]此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(W02009/002947; A.Almasan andA.Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviewsl4(2003)337-348;RK Srivastava, Neoplasis, Vol3，No6, 2001，535-546，Soria JC et al., J.Clin.0ncology, Vol28, No9 (2010), p.1527-1533)。在W02009/140469中描述了 rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡钼)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。
[0010]此外，已经证明与TRAIL治疗法相关的问题是其低稳定性以及在施用之后迅速从身体清除。
[0011]包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见A.1.Guo et al, Chinese Journal of Biochemistry and MolecularBiology2008, vol.24(10)，925-930。
[0012]包含血管生成抑制剂钙网蛋白和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示诱导细胞凋亡的效应，见CN1609124A。
[0013]CN1256347C 公开了由激肽原(kininogen)D560-148 和 TRAIL114-281 组成的融合蛋白。
[0014]包含通过编码GGGSGGSG的连接子连接于TRAIL114-281的N或C末端的血管生成抑制剂kininostatin、血管抑制素和canstatin的序列的构建的融合蛋白描述于FengFeng-Yi “Phaseland Clinical Trial of Rh_Apo2L and Apo2L_Related ExperimentalStudy”，Ph.D.degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01;http://www.1w23.com/lunwen_957708432。
[0015]包含血管生成抑制剂肿瘤抑`素(tumstatin)的Tumstatinl83_230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N.Ren et al, Academic Journal of Second Military Medical University2008, vol.28 (5)，676-478。
[0016]US2005/244370和对应的W02004/035794公开了 TRAIL95-281 的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。
[0017]Shin J.N.等人，Experimental Cell Research,第 312 卷，第 19期，2006，p.3892-3898公开了作为TRAIL的前体形式的具有在连接位置引入的基质金属蛋白酶切割位点的sTRAIL与IL-18的构建的融合蛋白，所述TRAIL的前体形式可在病理地产生金属蛋白酶的区域例如肿瘤环境中被激活和释放。还产生了具有IFN-Y和内皮他丁的sTRAIL的构建体，但既没有表征也没有测试该构建体。
[0018]癌症治疗的目标之一是抑制肿瘤细胞增殖(生长)。具有获得的恶性表型(因突变、致癌物活性或DNA修复的障碍而引起的)的细胞丧失其正确分化的能力，并且获得浸润的能力。肿瘤细胞的克隆主要转录与快速生长和侵袭相关的基因，并且肿瘤细胞的特征，除其它以外，在于增殖控制的扰乱。
[0019]肿瘤细胞增殖的抑制在癌症治疗中的有益效应是已知的。作为癌症治疗和辅助癌症治疗，进行了抑制或调节增殖过程的物质的临床使用的尝试。
[0020]肿瘤细胞增殖的抑制可以以各种方式例如综述论文“Hallmarks of Cancer:TheNext Generation”(Cell, 2011，646-674)中描述的方式来实现。存在已知的用于抗癌疗法的抗增殖蛋白质-例如曲妥珠单抗-用于具有HER2过表达的乳腺癌患者的阻断HER2的单克隆抗体。还已知仍未被发现在人癌症的治疗中具有临床上效用的许多蛋白质的抗增殖活性。
[0021]例如，人甲胎蛋白及其片段的抗增殖活性是公知的。个别蛋白质结构域的性质的详细研究揭示了负责雌二醇依赖性细胞的生长抑制的位于34个氨基酸区域内的结构的存在(Mizejewski 等人,Mol.Cell.Endocrinol., 18:15-23，1996)。由 8 个连续氨基酸组成的该区域的羧基末端是最重要的片段，并且能够单独地抑制癌细胞的生长(MizejewskiG., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，22:73-98，2007)。
[0022]p2IffAFl蛋白的抗增殖性质也是已知的。合成基于p21WAFl的氨基酸序列的短肽，所述短肽显示可比较的结合并且抑制D1-CDK4复合物、从而在Gl期终止细胞周期的潜能(Ball 等人,Current Biology, 7:71-80，1996)。
[0023]还已知蛋白质D0C_2/DAB2(在卵巢癌-2/失能的2中差异表达的)是前列腺癌细胞的增殖的强效抑制剂。其通过结合许多它们各自的亚元件(c-Src，Grb2)来抑制MAPK激酶传播途径而起作用(Zhou 等人，JBiol Chem276:27793-27798, 2001，Zhou 等人，J BiolChem, 278:6936-6941, 2003)。其基本组分是存在于羧基末端D0C-2/DAB2上的富含脯氨酸的结构域(Zhou 等人，Cancer Res, 66:8954-8958，2006)。
[0024]pl6蛋白或其片段对CDK4-细胞周期蛋白结合的抑制通常被认为是瘤形成的抑制剂(Fahraeus 等人,Oncogene, 16:587-596，1998)。
[0025]还已知激酶ERK对肿瘤细胞增殖程度的影响(Handra-Luca A.,等人，AmericanJournal of Pathology.20 03; 163:957-967)。已知 MEK-1 蛋白的肽片段是选择性 ERK 激酶底物，从而其可用作其选择性抑制剂(Bradley R.等人，The Journal of BiologicalChemistry, 2002，277，8741-8748)。
[0026]还已知Akt激酶活性的选择性抑制导致细胞增殖的抑制和肿瘤细胞死亡(Hennessy B.T,等人，Nature Reviews Drug Discovery2005, 4，988-1004)。
[0027]还已知Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr六肽的抗增殖性质在于E2F与DP缔合的抑制和 E2F 对 DNA 结合的直接抑制(Janin Y.L.，Amino Acids, 25:1 - 40，2003)。
[0028]微管蛋白纤维解聚的抑制(在有丝分裂中阻止了姊妹染色单体分离并且引起染色体迁移的障碍)也导致增殖过程的障碍(Xiao等人，J.Cell Mol.Med.，2010)。
[0029]显示了蜂毒肽与TRAIL蛋白的活性的协同作用(Wang等人，JBC Journal ofBiological Chemistry, 284, 3804-3813)。
[0030]作为蜂防卫素的片段的蛋白质及其类似物对端粒酶活性和在线粒体膜中的积累的抑制也是已知的(Iwasaki 等人,Biosc1.Biotechnol.Biochem., 73:683-687，2009)。
[0031]还已知Iasioglossins (从蜂Lasioglossum Iaticeps的毒液分离的带正电荷的肽)产生抗肿瘤细胞的细胞毒性活性(Cerovskf等人，Chembiochem, 2009, 10:2089-2099)。
[0032]还已知例如来自SH3结构域的蛋白质适体对RasGAP-Aurora B相互作用的抑制对癌细胞的增殖产生了抑制性影响(Pamonsinlapatham P.等人，PLoS0NE3(8):e2902, 2008)。[0033]使用例如P16肽(其为pl6INK4A基因产物的片段)对细胞周期依赖性激酶例如激酶⑶K4的抑制的影响也是已知的(Derossi D,等人，J BiolChem.269:10444-10450，1994)。
[0034]还已知Pep27蛋白的抗增殖性质，细胞受体对其的结合导致组氨酸激酶的磷酸化，这引起效应子因子VncR的去磷酸化，从而导致自动催化途径和细胞死亡的抑制(DongGun Lee 等人，Cancer Cell International2005, 5:21)。
[0035]许多抗增殖物质目前处于不同的研究阶段，包括临床试验。然而，目标在于抑制增殖的已知疗法具有许多公知的不利方面。例如，存在有害作用例如血栓栓子并发症、咳血和肺出血。许多抗增殖药物还显示不良的生物利用度和毒性副作用。
[0036]由于治疗的长期使用和缺乏选择性，因此抗增殖药物的安全性是特别重要的。对有效的治疗剂的强烈需要和肿瘤疾病的性质使得必需简化这类药物的注册程序，从而不可能了解药物的所有副作用和不利方面。尽管如此，与针对所有快速增殖细胞的化学治疗剂相反，肽抗增殖药物针对负责触发蛋白质的磷酸化和去磷酸化的级联的蛋白质激酶和磷酸酶或针对其底物或在细胞周期的正确进程中衔接的其它蛋白质，这导致治疗毒性的一定减小。然而，针对抑制增殖同时确保针对肿瘤细胞的选择性的抗癌疗法仍然是未知的。从而存在对具有改善的毒理学特征的新型抗增殖抗癌疗法的需要。
[0037]本发明提出了解决该问题的方案:提供了新的融合蛋白，其包含源自TRAIL的结构域和具有抗增殖活性并不包括TRAIL片段的短的效应子肽结构域，其中所述效应子肽加强或补充TRAIL的作用。
[0038]根据本发明的蛋白选择性针对癌细胞，其中蛋白的元件发挥它们的效应，特别地，效应子肽抑制肿瘤细胞增殖。 本发明的蛋白向肿瘤环境的递送使得针对体内的健康细胞的毒性以及副作用最小化，并且减小了施用频率。此外，通过使用本发明的蛋白的靶向治疗允许避免之前已知的非特异性抗增殖治疗法的低效率问题(由高毒性和必需施用高剂量所引起的)。
[0039]在很多情况下，本发明的融合蛋白比可溶性TRAIL及其变体、包括序列的片段效力更强。直至目前，用于本发明的融合蛋白中的已知的效应子肽未被用于药物，因为例如不理想的动力学、被非特异性蛋白酶迅速降解或由于缺乏正确的激活途径次序(这对于使效应子肽在靶位点的正确作用是必须的)而在体内积累。效应子肽向融合蛋白中的掺入允许使它们选择性地递送至需要它们发挥作用的位点。此外，效应子肽的连接增大了蛋白质的质量，这产生了延长的半衰期并增加了肿瘤中蛋白的保持以及其增强的效率。另外，在很多情况下，新的融合蛋白还克服了对于TRAIL的天然或诱导的抗性。
【专利附图】

【附图说明】
[0040]现在将通过阅读附图详细描述本发明。
[0041]图1显示了根据Ex.UEx.2、Ex.3、Ex.4和Ex.5的本发明的融合蛋白的示意性结构。
[0042]图2显示了根据EX.6、Ex.7、Ex.8、Ex.8A、Ex.9和Ex.10的本发明的融合蛋白的示意性结构。
[0043]图3显示了根据Ex.11、Ex.12、Ex.13、Ex.14和Ex.15的本发明的融合蛋白的示意性结构。
[0044]图4显示了根据Ex.16, Ex.17, Ex.18, Ex.19和Ex.20的本发明的融合蛋白的示意
性结构。
[0045]图5显示了根据Ex.21, Ex.22, Ex.23, Ex.24和Ex.25的本发明的融合蛋白的示意
性结构。
[0046]图6A和 6B 显不了以比捕圆率(specific ellipticity)表不的 rhTRAIL95_281 和Ex.1''与Ex.2a的融合蛋白(图6A)以及Ex.8a的融合蛋白和rhTRAILl 14-281 (图6B)的圆二色性光谱。
[0047]图7显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.2a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCTl 16的Crl: CDl-Foxnlnu小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的百分率)。
[0048]图8显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.2a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl = CDl-FoxnlnuI小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0049]图9显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.2a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的CrKDl-Foxnlnu小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的百分率)。
[0050]图10显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.2a的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NC1-H460-Luc2的Crl: CDl-FoxnlnuI小鼠中的的肿瘤生长抑制值(％TGI )。
[0051]图11显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCTl 16的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的
百分率)。
[0052]图12显示了，相对于rhTRAIL114_281处理，以Ex.8a的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0053]图1Ia显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.83的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCTl 16的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的百分率)。
[0054]图12a显示了，相对于rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌HCT116的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0055]图13显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的
百分率)。
[0056]图14显示了，相对于rhTRAIL114-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌SW620的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0057]图15显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的百分率)。
[0058]图16显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有结肠癌Colo205的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0059]图17显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌H印G2的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的百分率)。[0060]图18显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有肝癌H印G2的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0061]图19显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrto小鼠中的肿瘤体积变化(相对于初始阶段的
百分率)。
[0062]图20显示了，相对于以rhTRAILl 14-281处理，以Ex.8b的本发明的融合蛋白处理的具有肺癌NC1-H460的Crl = SHO-PrkdcseidHrhr小鼠中的肿瘤生长抑制值(％TGI)。
[0063]发明详述
[0064]本发明涉及融合蛋白，其包含:
[0065]-结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和
[0066]-至少一个结构域(b)，其为具有抗肿瘤细胞的抗增殖活性的效应子肽的序列，
[0067]其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。
[0068]术语“可溶性hTRAIL的序列的功能性可溶性片段”应该被理解为指可溶性hTRAIL的任何能够在结合于哺乳动物细胞表面上的其受体之后在该细胞中诱导细胞调亡信号的片段。
[0069]本领域技术人员还将认识到:TRAIL序列的至少70%的同源性的存在是本领域已知的。
[0070]应该理解，本发明的融合蛋白中的效应子肽结构域(b)不是hTRAIL蛋白，也不是hTRAIL蛋白的一部分或片段。
[0071]根据本发明的术语“肽”应被理解为从通过肽键连接在一起的多个氨基酸构建的分子。因此，根据本发明的术语“肽”包括寡肽、多肽和蛋白质。
[0072]在本发明中，肽的氨基酸序列将以本领域采纳的常规方式表示，从肽的N末端(N-端)至其C末端(C-端)。因此，任何序列均为左侧为N末端，右侧为C末端的线性表示。
[0073]本发明的融合蛋白在结构域(a)的C末端和/或N末端连接至少一个效应子肽结构域(b)。
[0074]在具体的实施方式中，结构域(a)是hTRAIL序列的片段，起始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，含端点，结束于氨基酸hTRAIL281。
[0075]具体地，结构域(a)可选自对应于hTRAIL95-281,hTRAILl 14-281、hTRAILl 19-281、hTRAIL120-281和hTRAIL121_281的序列。本领域技术人员将认识到，hTRAIL95_281、hTRAILl 14-281、hTRAILl 19-281、hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281 分别代表 GenBank 中登记号P50591的hTRAIL的已知序列中的起始于编号95、114、119、120和121的氨基酸和终止于最后一个氨基酸281的人TRAIL蛋白的片段。
[0076]在另一个【具体实施方式】中，结构域(a)是起始于不低于hTRAIL95的氨基酸位置并结束于氨基酸hTRAIL281的可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段的同源物，该序列与原始序列至少70%、优选85%同一。
[0077]在该实施方式的具体变体中，结构域(a)是选自对应于hTRAIL95_281，hTRAILl 14-281，hTRAILl 16-281, hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281 的序列的片段的同源物。
[0078]应该理解，hTRAIL片段的同源物是该片段的氨基酸序列的变体/修饰，其中至少一个氨基酸被改变，包括I个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸，和不超过15%的氨基酸，并且其中修饰的序列的片段具有hTRAIL序列的保留的功能，即结合细胞表面死亡受体和在哺乳动物细胞中诱导细胞凋亡的能力。氨基酸序列的修饰可以包括例如，置换、缺失和/或添加氨基酸。
[0079]优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言，与死亡受体DR4 (TRAIL-Rl)或DR5 (TRAIL-R2)的改变的亲和性。
[0080]术语“改变的亲和性”是指增加的亲和性和/或具有改变的受体选择性的亲和性。
[0081]优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出相对于hTRAIL的天然片段而言对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性。
[0082]特别优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出对于死亡受体DR5比对于死亡受体DR4增加的亲和性，即增加的选择性DR5/DR4。
[0083]同样优选地，具有修饰的序列的hTRAIL片段的同源物显示出对于死亡受体DR4和/或DR5的比对于受体DRl (TRAIL-R3)和/或DR2 (TRAIL-R4)的与亲和性相关的增加的选择性。
[0084]产生对于死亡受体DR4和DR5的增加的亲和性和/或选择性的hTRAIL的修饰是本领域已知的，例如见 Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, CoolRH, Samali A, Serrano L,Quax WJ.DR4-selective tumor necrosis factor-relatedapoptosis-1nducing ligand(TRAIL)variants obtained by structure-based design.J.Biol.Chem.2008Jull8; 283 (29): 20560-8，其描述了 D218H 突变具有对于 DR4 的增加的选择性；或 Gasparian ME, Che`rnyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, SychevaAM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP.Generation of new TRAIL mutants DR5-A andDR5-B with improved selectivity to death receptor5,Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87，其描述了 D269H突变对于DR4具有降低的亲和性。产生对于选自DR4和DR5的一种受体的增加的亲和性(相对于DRl和DR2受体)和对于受体DR5的增加的亲和性(相对于DR4)的 hTRAIL 突变体也描述于 W02009077857 和 W02009066174。
[0085]合适的突变是选自下列的天然hTRAIL位置中的一个或多个氨基酸突变:131，149，159，193，199，201,204, 204，212，215，218和251，特别地，涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸，或诸如谷氨酸或天冬氨酸的氨基酸置换某氨基酸的突变。特别地可提及选自下列的一个或多个突变:G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 和 K251Q,描述于 TO2009066174。
[0086]合适的突变还有选自氨基酸195、269和214的天然hTRAIL位置中的一个或多个突变，特别是涉及以碱性氨基酸例如赖氨酸、组氨酸或精氨酸置换某氨基酸的突变。具体地可提及选自D269H, E195R和T214R的一个或多个突变，描述于W02009077857。
[0087]在具体的实施方式中，为hTRAIL的片段的同源物的结构域(a)选自天然TRAIL序列的D218H突变体，如W02009066174所描述，或天然TRAIL序列的Y189N-R191K-Q193R-H264R-1266R-D269H突变体，如 Gasparian ME等人.Generation of new TRAIL mutants DR5-Aand DR5-B with improved selectivity to death receptor5, Apoptosis.2009Jun;14(6):778-87中所描述。
[0088]根据本发明，融合蛋白包含抗增殖肽作为效应子肽，其具有抗肿瘤细胞的抗增殖活性，即对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
[0089]应当理解，“肿瘤细胞增殖”涉及细胞分裂和在肿瘤细胞周期中的生长的步骤，因此效应子肽在肿瘤细胞生长方面具有抗增殖活性。
[0090]因此，“肿瘤细胞增殖”抑制作用不包括抑制作为血管生成的步骤的内皮细胞的增殖。具有抗血管发生活性(即抑制内皮细胞生长的活性)的效应子肽因此不包括在根据本发明的效应子肽的范围内。
[0091]具体地，本发明不包括选自钙网蛋白、肿瘤抑素183-230、激肽原D5、血管抑素、激肽源、内皮他丁和canstatin的效应子肽。
[0092]根据本发明，效应子肽可以以不同的方式例如选自如下的方式产生其抗肿瘤细胞的抗增殖效应:
[0093]-抑制MAPK激酶(丝裂原活化蛋白激酶)传播途径，例如通过阻断FGF-2受体(碱性成纤维细胞生长因子2受体，也称为bFGF-、FGF2-或FGF- β受体)或源自DAB2蛋白的DD2 肽;
[0094]-雌二醇依赖性细胞的生长的抑制，例如通过人甲胎蛋白或其片段；
[0095]-在Gl期中终止细胞周期，例如通过抑制细胞周期蛋白Dl-⑶Κ4(细胞周期蛋白依赖性激酶4)复合物；
[0096]-精氨酸的酶促断裂，例如通过来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶；
[0097]-细胞周期激酶的抑制，例如CDK4/5/6激酶(细胞周期蛋白依赖性激酶)的抑制，或ERK激酶(细胞外信号调节的激酶)激活的抑制或Akt激酶(也称为蛋白质激酶B(PKB)、丝氨酸/苏氨酸特异性激酶)共激活的抑制；
[0098]-转录因子E2F(高等真核生物中的转录因子(TF))与DP蛋白(也称为转录因子DP, E2F 二聚化伴侣)的缔合的抑制；
[0099]-微管蛋白纤维缔合/聚合的抑制；
[0100]-端粒酶活性的抑制；
[0101]-RasGAP (Ras-样GTP酶的GTP酶激活蛋白)-Aurora B激酶相互作用或组氨酸激酶激活的抑制；和
[0102]-扰乱跨细胞膜的离子平衡。
[0103]在本发明的一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制MAPK激酶传播途径的肽。实例是负责FGF-2受体的阻断，从而抑制肿瘤生长的FGF-2受体的结合结构域的类似物。具体地，这样的效应子肽可以是由序列表中的SEQ.N0.26所示的16个氨基酸肽。
[0104]本发明的该实 施方式的另一个效应子肽可以是D0C-2/DAB2蛋白的片段。具体地，这样的效应子肽可以是18个氨基酸的肽DD2 -存在于D0C-2/DAB2的羧基末端上的富含脯氨酸的结构域，示于序列表中的SEQ.N0.30，其通过结合许多它们各自的亚元件(c-Src, Grb2)参与MAPK激酶的传播途径的抑制。
[0105]在本发明的另一个实施方式，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制雌二醇依赖性细胞的生长的肽，例如人甲胎蛋白或其片段。具体地，这样的效应子肽可以是序列表中的SEQ.N0.27所示的人α-甲胎蛋白的34个氨基酸的片段。本实施方式的另一个效应子肽可以是位于SEQ.N0.27的C末端上的人α-甲胎蛋白的8个氨基酸的片段，并且示于序列表中的 SEQ.N0.28。
[0106]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够使细胞周期终止于Gl期的肽，例如通过抑制细胞周期蛋白D1-CDK4复合物。具体地，这样的效应子肽可以是trojan pl6肽，或其片段，其抑制激酶⑶K4和⑶K6的活性。具体地，效应子肽-P16INK4A基因产物的片段-示于序列表中的SEQ.N0.32。这样的效应子肽还可以是trojan pl6肽的另一个片段-与触角足蛋白的17个氨基酸转运结构域融合的pl6INK4A 基因产物的片段(Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J BiolChem.269:10444-10450, 1994)，示于序列表中的 SEQ.N0.33。
[0107]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够酶促断裂精氨酸的肽，例如利用来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶。具体地，这样的效应子肽示于序列表中的 SEQ.N0.31。
[0108]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制细胞周期激酶的肽，例如⑶K4/5抑制剂。具体地，这样的效应子肽可以是P21WAF1蛋白的片段，例如序列表中的SEQ.N0.29所示的p21WAFl蛋白的20个氨基酸的片段。
[0109]本实施方式的另一个效应子肽可以是肽-ERK激活的抑制剂。具体地，这样的效应子肽可以是序列表中的SEQ.N0.34所示的MEK-1蛋白的片段。
[0110]本发明的另一个效应子肽可以是Akt激酶的肽-共激活物。具体地，这样的效应子肽-TCLl蛋白的PH结构域的N末端片段-示于序列表中的SEQ.N0.35。
[0111]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制转录因子E2F与DP蛋白缔合的肽。具体地,这样的效应子肽-六肽Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr -示于序列表中的SEQ.N0.36。结构域(b)的另一个效应子肽可以是为FGF-2结合结构域的类似物的肽。具体地，这样的效应子肽-阻断FGF-2受体的8个氨基酸的肽-示于序列表中折 SEQ.N0.41。
[0112]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制微管蛋白纤维缔合/聚合的肽。这样的效应子肽可以是负责形成异二聚体结构、促成微管蛋白纤维聚合的抑制的微管蛋白的片段。具体地，这样的效应子肽-微管蛋白的13个氨基酸的片段-示于序列表中的SEQ.N0.37，另一个效应子肽-微管蛋白的10个氨基酸的片段-示于序列表的中的SEQ.N0.38。
[0113]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制端粒酶活性的肽。这样的效应子肽可以是负责端粒酶活性抑制的基于蜂防卫素的序列的肽。具体地，这样的效应子肽-基于蜂防卫素的6个氨基酸的C2肽-不于序列表中的SEQ.N0.40。该实施方式的另一个效应子肽可以是存在于蜂毒中的肽lasioglossin。具体地，这样的效应子肽-lasioglossin LL-2 -示于序列表中的 SEQ.N0.42。
[0114]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够抑制RasGAP-Aurora B相互作用或组氨酸激酶激活的肽。具体地,这样的效应子肽_结合RasGAP的SH3结构域的13个氨基酸肽-示于序列表的SEQ.N0.43。本实施方式的另一个效应子肽可以是在被细胞受体结合后引起组氨酸激酶磷酸化的肽，其继而导致效应子因子VncR去磷酸化。具体地，这样的效应子肽- P印27肽的类似物-示于序列表中的SEQ.N0.44。
[0115]在本发明的另一个实施方式中，结构域(b)的效应子肽可以是能够扰乱跨细胞膜离子平衡的肽。具体地，这样的效应子肽蜂毒肽-显示于序列表中的SEQ.N0.39。
[0116]在本发明的融合蛋白的【具体实施方式】中，效应子肽选自:
[0117]-SEQ.N0.26 (阻断FGF-2受体的16个氨基酸的肽)，
[0118]-SEQ.N0.27 ( α甲胎蛋白的片段)，
[0119]-SEQ.N0.28 ( α甲胎蛋白的C末端片段)，
[0120]-SEQ.N0.29 (p2Iwafi 蛋白的片段)，
[0121 ] -SEQ.N0.30 (来自 DAC-2/DAB-2 蛋白的 DD2 肽)，
[0122]-SEQ.N0.31(精氨酸脱亚胺酶)，
[0123]-SEQ.N0.32(pl6 肽的片段)，
[0124]_SEQ.N0.33(与触角足蛋白的17个氨基酸的转运结构域融合的pl6肽的片段)，
[0125]-SEQ.N0.34 (MEK-1 的片段)，
[0126]-SEQ.N0.35 (T CL1蛋白的pH结构域的片段)，
[0127]-SEQ.N0.36 (E2F 的六肽抑制剂)，
[0128]-SEQ.N0.37 (微管蛋白聚合作用的抑制剂)，
[0129]-SEQ.N0.38 (微管蛋白聚合作用的抑制剂)，
[0130]-SEQ.N0.39 (蜂毒肽)，
[0131]-SEQ.N0.40 (合成的C2端粒酶抑制剂)，
[0132]-SEQ.N0.41 (与FGF-2R相互作用的8个氨基酸的抑制剂)，
[0133]-SEQ.N0.42 (lassioglossin LL—2)，
[0134]-SEQ.N0.43 (Aurora RG27 激酶的抑制剂)，和
[0135]-SEQ.N0.44 (Pep27 的类似物)。
[0136]在结合存在于癌细胞表面上的TRAIL受体后，融合蛋白显示双重效应。结构域(a)，其为TRAIL的功能片段或具有保留的功能的其同源物，将显示出其已知的激动剂活性，即结合细胞表面上的死亡受体并激活细胞凋亡的外部途径。融合蛋白的结构域(b)的效应子肽将能够通过抑制肿瘤细胞的增殖来与TRAIL结构域的活性平行地潜在地细胞内地发挥其作用。
[0137]如果融合蛋白包含被蛋白酶识别的切割序列，则效应子肽可先前被在肿瘤环境中过表达的金属蛋白酶或尿激酶从TRAIL的片段切除掉。
[0138]在本发明的融合蛋白中，TRAIL的抗肿瘤效应可通过其它影响细胞增殖的元件的激活来潜在地增强，例如抑制雌二醇依赖性细胞的生长、抑制细胞周期蛋白D1-CDK4复合物、抑制MAPK激酶传输途径、精氨酸的酶促断裂、CDK4/5/6激酶的抑制、抑制ERK激酶激活、抑制Akt激酶共激活、抑制转录因子E2F与DP蛋白缔合、抑制微管蛋白纤维缔合、抑制端粒酶活性、抑制RasGAP-AuiOra B相互作用或组氨酸激酶激活。
[0139]在本发明的一个实施方式中，结构域(a)和结构域(b)通过至少一个结构域(c)连接，结构域(C)包含被存在于细胞环境、特别是肿瘤细胞环境中的蛋白酶识别的切割位点序列。结构域(a)和结构域(b)通过至少一个结构域(C)连接意思是在结构域(a)和(b)之间可以存在不止一个结构域(C)，特别是I个或2个结构域(C)。
[0140]蛋白酶切割位点可以选自:
[0141]-被金属蛋白酶MMP识别的序列，特别是表示为SEQ.N0.45的(Pro Leu Gly LeuAla Gly Glu Pro/PLGLAGEP)或(Pro Leu Gly He Ala Gly Glu/PLGIAGE)或(Pro LeuGly Leu Ala Gly GluPro/PLGLAGEP)；
[0142]-被尿激酶uPA识别的序列，特别是表示为SEQ.N0.46的Arg Val Val Arg (RVVR)；或其片段，其与其所结合的序列的最后一个氨基酸形成SEQ.N0.46 ；
[0143]以及它们的组合。
[0144]在本发明的一个实施方式中，蛋白酶切割位点是被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合，以任何顺序彼此相邻。
[0145]在一个实施方式中，结构域(c)是MMP/uPA的组合，例如SEQ.N0.45/SEQ.N0.46的组合，或uPA/MMP的组合，例如SEQ.No46/SEQ.N0.45的组合。
[0146]金属蛋白酶MMP和尿激酶uPA在肿瘤环境中过表达。被蛋白酶识别的序列的存在能够使结构域(a)从结构域(b)切割下来，即释放效应子结构域(b)并由此实现其激活。
[0147]蛋白酶切割位点的存在允许迅速释放效应子肽，增加融合蛋白被存在于细胞中的蛋白酶随机降解之前肽向其作用位点转运的机会。
[0148]此外，转运结构域(d)可连接于本发明的融合蛋白的效应子肽的结构域(b)。
[0149]结构域(d)可以例如选自:
[0150](dl)由6，7，8，9，10或11个Arg残基组成的转运通过细胞膜的聚精氨酸序列，
[0151](d2)作为转运通过细胞膜的结构域的触角足蛋白结构域的片段(SEQ.N0.48)，
[0152](d3)作为转运通过细胞膜的结构域的触角足蛋白结构域的另一个片段(SEQ.N0.49)，
[0153]及其组合。
[0154]结构域(dl)、(d2)和(d3)的组合可具体地包括(dl)/(d2)、(dl)/(d3)或(dl)/(d2)/(d3)的组合。
[0155]此外，结构域(dl)、(d2)和(d3)的组合可包括彼此相邻的并且连接于结构域(b)的一个末端和/或连接于结构域(b)的不同末端的结构域。
[0156]应当理解,在当融合蛋白具有连接于结构域(b)的转运结构域(d)和在结构域(a)和(b)之间具有切割位点的结构域(C)的情况下，结构域(C)以在切割构建体转运结构域(d)后仍然连接于结构域(b)的方式定位。换句话说，如果融合蛋白包含转运结构域(d)和切割位点结构域(c)，则结构域(d)位于结构域(b)和结构域(c)之间，或位于与结构域(d)的连接位置相对的结构域(b)的末端。
[0157]本发明不包括其中结构域(d)位于结构域(C)和结构域(a)之间的这样的变体，即为当切割构建体转运结构域后仍然连接于TRAIL结构域的情况。
[0158]构成触角足蛋白结构域的片段(SEQ.N0.48)以及触角足蛋白结构域的另一个片段(SEQ.N0.49)的易位结构域能够通过细胞膜转移(Derossi D, AH Joliot1GChassaings, A Prochiantz, J Biol Chem.269:10444-10450 (1994)并且可用于将效应子月太引入肿瘤细胞区室。[0159]转运通过细胞膜的序列(dl)可以是本领域已知的由几个精氨酸残基组成的任何序列，其将效应子肽转移通过细胞膜至靶细胞的细胞质(D.，Hea, H.，Yangb, Q.，Lina, H.，Huang, Arg9-peptide facilitates the internalization of an ant1-CEA immunotoxin andpotentiates its specific cytotoxicity to target cells, The international Journalof Biochemistry & Cell Biology37 (2005) 192 - 205; Shiroh Futaki 等人 JBC,第 276卷，N0.8，2 月 23 日，pp.5836 - 5840，2001)。
[0160]其它有用的细胞渗透性肽描述于F.Said Hassane等人Cell.Mol.Life Sc1.D0I10.1007/s00018-009-0186-0 中。
[0161]除了融合蛋白的主要功能元件和切割位点结构域之外，本发明的融合蛋白可包含中性序列/柔性空间甘氨酸-半胱氨酸-丙氨酸连接子(间隔子)的序列。此类连接子/间隔子是本领域熟知的并且在文献中有描述。将它们掺入融合蛋白的序列中是为了使得通过在宿主细胞中过表达而产生的蛋白的正确折叠。
[0162]特别地，柔性空间连接子可以是SEQ.N0.47，其为半胱氨酸和丙氨酸残基的组合。在另一实施方式中，柔性空间连接子可以是甘氨酸和丝氨酸残基的组合例如片段Gly GlyGly Ser Gly/GGGSG，或用作空间连接子的其任何片段例如Gly Gly Gly/GGG。
[0163]在其它实施方式中，柔性空间连接子可以是SEQ.N0.47和甘氨酸和丝氨酸残基组成的任何连接子组合，例如片段Gly Gly Gly Ser Gly/GGGSG或用作空间连接子的其任何片段例如片段Gly Gly Gly/GGG。在这样的情况下，空间连接子可以是甘氨酸、半胱氨酸和丙氨酸残基的组合，例如 Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly/CAACAAACGGG。
[0164]在其它实施方式中，柔性空间连接子可以是序列Gly Gly Gly Cys Ala Ala AlaCys Ala Ala Cys Gly Ser Gly/GGGCAAACAACGSG(SEQ.N0.77)或其任意组合。
[0165]在一个实施方式中，柔 性空间连接子也可以选自单一氨基酸残基，例如单一半胱氨酸残基。
[0166]本发明的【具体实施方式】是选自由SEQ.N0.1、SEQ.N0.4、SEQ.N0.5和SEQ.N0.6代表的蛋白质的融合蛋白质，其包含由SEQ.N0.27所示的人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段作为抗增殖效应子肽。
[0167]本发明的其它【具体实施方式】是选自由SEQ.N0.2、SEQ.N0.3和SEQ.N0.7所示的蛋白质的融合蛋白，其包含SEQ.N0.28所示的人甲胎蛋白的8个氨基酸的片段作为抗增殖效应子肽。
[0168]本发明的其它【具体实施方式】是选自由SEQ.N0.8和SEQ.N0.9所示的蛋白质的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.29所示的来自P21WAF的肽作为效应子肽。
[0169]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.10所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.26所示的来自结构域结合性FGF-2受体的16个氨基酸类似物作为效应子肽。
[0170]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.11所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.30所示的来自D0C-2/DAB2蛋白的DD2作为效应子肽。
[0171]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.12所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.31所示的来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶作为效应子肽。
[0172]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.13所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.32所示的pl6肽的片段作为效应子肽。[0173]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.13所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.33所示的与触角足蛋白的17个氨基酸的转运结构域融合的pl6肽的片段作为效应子肽。
[0174]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.14所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.34所示的MEK-1蛋白的片段作为效应子肽。
[0175]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.15所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.35所示的TCLl蛋白的PH结构域的N末端片段作为效应子肽。
[0176]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.16所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.36所示的六肽Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr作为效应子肽。
[0177]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.17所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.37所示的微管蛋白的13个氨基酸的片段作为效应子肽。
[0178]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.18所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.39所示的微管蛋白的10个氨基酸的片段作为效应子肽。
[0179]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.19所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.39所示的蜂毒肽作为效应子肽。
[0180]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.20所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.40所示的基于蜂防卫素的序列的6个氨基酸的肽C2作为效应子肽。
[0181]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.21所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.41所示的结合FGF-2配体的8个氨基酸的肽作为效应子肽。
[0182]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.22所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.42所示的15个氨基酸的肽lasioglossin LL2作为效应子`肽。
[0183]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.23所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.43所示的结合RasGAP的SH3结构域的13个氨基酸的肽作为效应子肽。
[0184]本发明的其它【具体实施方式】是由SEQ.N0.25所示的融合蛋白，其包含由SEQ.N0.44所示的Pep27肽的类似物作为效应子肽。
[0185]上述代表性融合蛋白的详细描述显示于图1-5，以及如下文的实施例所描述。
[0186]根据本发明，融合蛋白意思是包含2个或更多个蛋白或其片段的单一的蛋白分子，所述2个或更多个蛋白或其片段通过它们各自的肽链内的肽键共价连接而无另外的化学连接子。
[0187]融合的蛋白也可另外被描述为蛋白构建体或嵌合蛋白。根据本发明，术语“构建体”或“嵌合蛋白”如果被使用的话，应该被理解为是指上文定义的融合蛋白。
[0188]对于本领域技术人员，显而易见的是由此定义的融合蛋白可通过肽和蛋白的已知的化学合成方法来合成。
[0189]融合蛋白可通过化学肽合成的方法来合成，特别是使用合适的树脂作为载体，使用固相肽合成技术进行。此类技术是常规的和本领域已知的，特别描述于例如下列专论中:Bodanszky 和 Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag,New York, Stewart 等人，Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, PierceChemical Company。
[0190]融合蛋白可通过肽的化学合成方法作为连续蛋白来合成。或者，可以单独合成蛋白的各个片段(结构域)，然后通过一个肽片段的氨基末端与另一个肽的羧基末端的缩合经由肽键而组合在一起。此类技术是常规的和本领域已知的。
[0191]为了验证得到的肽的结构，可以使用肽的氨基酸组成的已知的分析方法，例如高分辨率质谱技术，以确定肽的分子量。为了确认肽的序列，也可以使用蛋白测序仪，其依次降解肽并鉴定氨基酸的序列。
[0192]然而，优选地，本发明的融合蛋白是重组蛋白，通过编码融合蛋白的多核苷酸序列在宿主细胞中的基因表达的方法来产生。
[0193]本发明的另一方面是编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列。
[0194]优选地，根据本发明的编码如上所述的融合蛋白的多核苷酸序列、特别是DNA序列是针对在大肠杆菌中表达而优化的序列。
[0195]本发明的另一个方面是包含多核苷酸序列、特别是如上所述的本发明的DNA序列的表达载体。
[0196]本发明的另一个方面是包含上文所述的表达载体的宿主细胞。
[0197]用于表达本发明的融合蛋白的优选宿主细胞是大肠杆菌细胞。
[0198]用于产生重组蛋白、包括融合蛋白的方法是熟知的。简而言之，该技术为:产生编码靶蛋白的氨基酸序列和在宿主中指导靶蛋白的表达的多核苷酸分子例如DNA分子。然后，将编码靶蛋白的多核苷酸分子掺入合适的表达载体，其确保多肽的有效表达。然后将重组表达载体导入宿主细胞以进行转染/转化，由此产生转化的宿主细胞。然后培养转化的细胞以过表达靶蛋白，纯化所获`得的蛋白，任选地通过切割用于表达或纯化蛋白的标签序列而切下来。
[0199]用于表达和纯化的合适的技术描述于例如下列专著:Goeddel, Gene ExpressionTechnology, Methods in Enzymologyl85, Academic Press,San Diego,CA(1990)和A.Staron 等人,Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995。
[0200]作为用于导入和在宿主细胞中复制DNA序列的表达载体，可以使用粘粒、质粒或修饰的病毒。通常使用质粒作为表达载体。合适的质粒是熟知的和商业上可获得的。
[0201]本发明的表达载体包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸分子和用于转录和翻译掺入合适的宿主细胞的编码序列的必要的调节序列。调节序列的选择取决于宿主细胞的类型，可以由本领域技术人员容易地进行。此类调节序列的实例是包含转录起始信号的、插入编码序列之前的转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，和插入编码序列之后的转录终止序列。此外，取决于所用的宿主细胞和载体，可以将其它序列导入表达载体，例如复制起始子，另外的DNA限制性位点，增强子和允许诱导转录的序列。
[0202]表达载体还包含标记物基因序列，其赋予转化的细胞确定的表型并使得能够特异性选择转化的细胞。此外，载体还可以包含第二标记物序列，其允许将以包含插入的编码靶蛋白序列的重组质粒转化的细胞与摄取了无插入物的质粒的细胞区分开。通常，使用典型的抗生素抗性标记物，然而，任何其它本领域已知的报告子基因均可使用，其在细胞(在体内)中的存在可使用放射自显影技术、分光光度法或生物和化学发光法容易地确定。例如，取决于宿主细胞，可使用例如下列报告基因:β -半乳糖苷酶、β -葡萄糖苷酸酶、萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白。[0203]此外，表达载体可包含信号序列，其将蛋白转运至合适的细胞腔室，例如周质，在那里促进折叠。另外，可以存在编码标记物/标签例如连接于N末端的HisTag或连接于C末端的GST的序列，其促进后续使用亲和法、通过镍柱上的亲和层析纯化所产生的蛋白。也可以存在另外的序列，其保护蛋白免于宿主细胞中的蛋白水解降解，以及增强其溶解性的序列。
[0204]连接于靶蛋白的序列的辅助元件可能阻断其活性，或者由于别的原因而具有有害效应，例如由于毒性。此类元件必须被除掉，这可通过酶促或化学切割来完成。特别地，为了允许通过亲和层析而纯化蛋白而连接的6个组氨酸的标签HisTag或这种类型的其它标记物应该被除去，因为其被描述对于可溶性TRAIL蛋白的肝脏毒性具有影响。可以使用基于多种熟知的宿主细胞的异源表达系统，包括原核细胞:细菌，例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母；和真核细胞系(昆虫、哺乳动物、植物)。
[0205]优选地，由于培养和遗传操作的容易性和大量的获得的产物，使用大肠杆菌表达系统。因此，包含编码本发明的融合蛋白的靶序列的多核苷酸序列将针对在大肠杆菌中的表达而进行优化，即，其将包含在大肠杆菌中表达优化的编码序列密码子，选自本领域已知的可能的序列变体。此外，表达载体将包含适合大肠杆菌的连接于编码序列的上述元件。
[0206]因此，在本发明的优选实施方式中，针对在大肠杆菌中表达而优化的包含编码本发明的融合蛋白的序列的多核苷酸序列选自下组的多核苷酸序列:[0207]SEQ.N0.50 ；SEQ.N0.51 ；SEQ.N0.52 ；SEQ.N0.53 ；SEQ.N0.54 ；SEQ.N0.55 ；SEQ.N0.56 ；SEQ.N0.57 ；SEQ.N0.58 ；SEQ.N0.59 ；SEQ.N0.60 和 SEQ.N0.61 ；SEQ.N0.62; SEQ.N0.63; SEQ.N0.64; SEQ.N0.65; SEQ.N0.66，SEQ.N0.67 ；SEQ.N0.68 ；SEQ.N0.69 ；SEQ.N0.70 ；SEQ.N0.71 ；SEQ.N0.72 ；SEQ.N0.73 ；SEQ.N0.74 和 SEQ.N0.76 ;其分别编码具有对应于选自下列的氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白:
[0208]SEQ.N0.1 ；SEQ.N0.2 ；SEQ.N0.3 ；SEQ.N0.4 ；SEQ.N0.5 ；SEQ.N0.6 ；SEQ.N0.7 ；SEQ.N0.8 ；SEQ.N0.9 ；SEQ.N0.10 ；SEQ.N0.11，SEQ.N0.12，SEQ.N0.13 ；SEQ.N0.14 ；SEQ.N0.15，SEQ.N0.16 ；SEQ.N0.17 ；SEQ.N0.18 ；SEQ.N0.19; SEQ.N0.20 ; SEQ.N0.21; SEQ.N0.22; SEQ.N0.23; SEQ.N0.24; SEQ.N0.25 和 SEQ.N0.75。
[0209]在优选实施方式中，本发明还提供了适合于转化大肠杆菌的表达载体,其包含上述选自SEQ.N0.50至SEQ.N0.74和SEQ.N0.76的多核苷酸序列，以及以此类表达载体转化的大肠杆菌细胞。
[0210]转化，即将DNA序列导入细菌宿主细胞特别是大肠杆菌，通常在准备好摄取DNA的感受态细胞上进行，例如通过以钙离子在低温(4°C )处理，然后进行热击(37-42°C )或通过电穿孔进行。此类技术是熟知的并且通常由表达系统的生产商确定，或描述于文献和实验室工作手册中，例如 Maniatis 等人，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, N.Y.，1982)。
[0211]在大肠杆菌表达系统中过表达本发明的融合蛋白的程序将在下文详述。
[0212]本发明还提供了包含如上文所述的本发明的融合蛋白作为活性成分以及合适的药学上可接受的载体、稀释剂和常规辅助性成分的药物组合物。药物组合物将包含有效量的本发明的融合蛋白和药学上可接受的溶解或分散于载体或稀释剂中的辅助性成分，优选是配制为单元剂型或包含多剂的制剂的药物制剂的形式。药物形式和其配制方法以及其它成分、载体和稀释剂是本领域技术人员已知的并且在文献中有描述。例如，描述于下列专著：Remington's Pharmaceutical Sciences, ed.20, 2000, Mack PublishingCompany, Easton, USA。
[0213]术语“药学上可接受的载体、稀释剂和辅助性成分”包含本领域已知的任何溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)等渗剂。本发明的药学上可接受的载体可包含多种类型的载体、稀释剂和赋形剂，这取决于所选的施用途径和需要的剂型，例如液体、固体和气雾剂形式，用于口服、胃肠外、吸入、表面，以及所选的形式对于施用途径(例如注射)是否必须是无菌的。本发明的药物组合物的优选施用途径是胃肠外，包括注射途径，例如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、肿瘤内或通过单次或连续静脉内输注。
[0214]在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以通过直接注射至肿瘤来施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可通过静脉内施用。在另一实施方式中，本发明的药物组合物可皮下或腹膜内施用。用于胃肠外施用的药物组合物可以是药学上可接受的水性或非水性介质中的溶液或分散体，所述介质缓冲至合适的pH和与体液等渗(如果必要)，并且还可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和可溶性物质，其使得组合物与受体的组织或血液相容。可包含于组合物中的其它成分是例如水、醇例如乙醇、多元醇例如甘油、丙二醇，液体乙二醇，脂质例如甘油三酯，植物油，脂质体。合适的流动性和物质粒度可通过涂覆性物质例如卵磷脂和表面活性剂例如羟丙基纤维素、聚山梨酸酯等来提供。
[0215]用于液体胃肠外组合物的合适的等渗剂是例如糖，例如葡萄糖，和氯化钠，及其组
口 ο
[0216]或者，用于通过注射或输注施用的药物组合物可以是粉末形式，例如冻干的粉末，用于在临使用前以合适的载体例如无菌无热源水进行重构。
[0217]用于胃肠外施用的本发明的药物组合物也可具有经鼻施用的形式，包括溶液、喷雾剂或气雾剂。优选地，用于经鼻施用的形式可以是水溶液，并且是等渗的或缓冲至保持从大约5.5至大约6.5的pH，以维持类似于鼻分泌物的性质。此外，其将包含防腐剂或稳定剂，例如熟知的鼻内制剂中包含的那些。
[0218]组合物可包含多种抗氧化剂，其延迟一种或多种成分的氧化。此外，为了防止微生物的作用，组合物可包含多种抗细菌和抗真菌试剂，包括例如，但不限于，尼钼金酯类，氯丁醇，硫柳汞，山梨酸和这种类型的类似的已知物质。一般地，本发明的药物组合物可以包含例如至少大约0.01wt%的活性成分。更具体地,组合物可包含1%至75%重量的活性成分，或例如25%至60%重量，但不限于这些数值。施用于患者包括人类的根据本发明的组合物的实际剂量将由物理和生理因素决定，例如体重、病况的严重性、被治疗的疾病的类型，之前或同时的治疗性干预，患者和施用途径。合适的单元剂量，总剂量和组合物中的活性成分的浓度将由主治医生决定。
[0219]组合物可例如以下列剂量施用:大约I μ g/kg体重至大约1000mg/kg患者体重，例如5mg/kg体重至100mg/kg体重,或5mg/kg体重至500mg/kg体重。融合蛋白和包含它的组合物显示出抗癌或抗肿瘤活性，可用于治疗癌症疾病。本发明还提供了如上所述的本发明的融合蛋白用于治疗哺乳动物包括人类中的癌症疾病的用途。本发明还提供了治疗哺乳动物包括人类中的肿瘤(neoplastic) /癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用抗肿瘤/抗癌有效量的如上所述的本发明的融合蛋白，任选为合适的药物组合物的形式。
[0220]本发明的融合蛋白可用于治疗血液恶性肿瘤，例如白血病，肉芽肿病，骨髓瘤和其它血液恶性肿瘤。融合蛋白也可用于治疗实体瘤，例如乳腺癌、肺癌包括非小细胞肺癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌，前列腺癌，肾癌，脑癌等。用于治疗癌症的融合蛋白的合适的施用途径特别为胃肠外途径:以注射或输注的形式、在组合物中和以适合于该施用途径的形式施用本发明的融合蛋白。本发明将以下列一般性程序和具体融合蛋白的实例进行更详细的描述。
[0221]用于过表达融合蛋白的一般性程序
[0222]质粒的制备
[0223]靶融合蛋白的氨基酸序列用作模板以产生编码它的DNA序列，包含针对在大肠杆菌中的表达优化了的密码子。此程序允许增大在大肠杆菌中进行靶蛋白合成的后续步骤的效率。然后自动化合成得到的核苷酸序列。另外，将限制性酶Ndel的切割位点(在引导链的5’末端)和Xhol的切割位点(在引导链的3’末端)添加到得到的编码靶蛋白的基因中。它们用于将基因克隆进入载体pET28a(Novagen)。它们也可用于将编码蛋白的基因克隆进入其它载体。从该构建体表达而来的靶蛋白在N末端可任选地具有多聚组氨酸标签(6个组氨酸)，其之前是凝血酶识别的位点，该位点用于后续通过亲和层析进行纯化。一些靶在不使用任何标签的情况下表达，特别是不使用组氨酸标签，随后在SP琼脂糖上纯化。首先通过使用酶Ndel和Xhol对分离的质粒进行限制性分析、然后通过靶蛋白的整个阅读框的自动化测序来确认得到的构建体的正确性。用于测序的引物互补于存在于载体中的T7启动子的序列(5’ -TAATACGACTCACTATAGG-3’)和T7终止子的序列(5’ -GCTAGTTATTGCTCA GCGG-3’)。得到的质粒用于在商业化大肠杆菌菌株中过表达靶融合蛋白，所述菌株根据生产商的推荐进行转化。在选择性培养基(LB琼脂，卡那霉素50 μ g/ml, 1%葡萄糖)上获得的菌落用于制备LB液体培养基(补充了 50 μ g/ml的卡那霉素和1%葡萄糖)中的过夜培养物。在摇动的温育箱中生长大约15小时之后，培养物用于接种合适的培养物。
[0224]融合蛋白的过表达和纯化一一般程序A
[0225]以过夜培养物接种含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸锌的LB培养基。将培养物在37°C温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.25-lmM。在25°C摇动温育后(3.5_20h)，将培养物在6，OOOg离心25分钟。将细菌沉淀物重悬于含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl，IOmM咪唑，pH7.4的缓冲液中。将悬浮液在冰上超声8分钟(40%振幅，15秒脉冲，10秒间隔)。通过在20000g、4°C离心40分钟而使得到的提取物澄清。以用于制备细菌细胞提取物的缓冲液平衡来预处理N1-Sepharose树脂(GEHealthcare)。然后使用离心提取物后获得的上清液将树脂在4°C过夜温育。然后将其载入色谱柱并以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 20mM咪唑，pH7.4洗涤。使用含有0.5M NaCl pH7.4的50mM KH2PO4缓冲液中的咪唑梯度从柱洗脱获得的蛋白。通过SDS-PAGE分析获得的级份。将合适的级份组合并针对50mM Tris缓冲液，pH7.2，150mMNaCl, 500mM L-精氨酸，0.1mM ZnSO4, 0.01%Tween20在4°C过夜透析，同时，以凝血酶(1:50)切割Histag(如果存在的话)。切割之后，通过使用Benzamidine Sepharose?树脂纯化而从与Histag —起表达的祀融合蛋白分离凝血酶。在SP琼脂糖上进行不与Histag —起表达的祀融合蛋白的纯化。通过SDS-PAGE电泳分析产物的纯度(Maniatis等人，MolecularCloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。
[0226]融合蛋白的过表达和纯化一一般程序B
[0227]以过夜培养物接种含有卡那霉素(30 μ g/ml)和100 μ M硫酸锌的LB培养基。将培养物在37°C温育直至600nm下的光密度(OD)达到0.60-0.80。然后加入IPTG至终浓度为0.5-lmM。在25°C摇动温育20h后，将培养物在6000g离心25分钟。将过表达后的细菌细胞在弗氏细胞压碎器中在含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, IOmM咪唑，5mMβ -巯基乙醇，0.5mMPMSF(苯基甲基磺酰氟)，pH7.8的缓冲液中破碎。通过在8000g离心50分钟使得到的提取物澄清。使用获得的上清液过夜温育N1-Sepharose树脂。然后将结合了蛋白的树脂载入色谱柱。为了洗掉含有非结合性蛋白的级份，以15-50倍体积的缓冲液50mM KH2PO4, 0.5MNaCl，IOmM咪唑，5mM β -巯基乙醇，0.5mM PMSF (苯基甲基磺酰氟)，pH7.8洗涤柱。然后，为了洗掉大部分的特异性与床结合的蛋白，以含有50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 500mM咪唑，10%甘油，0.5mM PMSF, pH7.5的缓冲液洗涤柱。通过SDS-PAGE分析获得的级份(Maniatis等人，Molecular Cloning.Cold Spring Harbor, NY, 1982)。将含有革巴蛋白的级份组合(如果蛋白是与组氨酸标签一起表达)，以凝血酶切割(lU/4mg蛋白，16°C，8小时)以除掉多聚组氨酸标签。然后将级份针对配制缓冲液(500mM L-精氨酸，50mM Tris, 2.5mM ZnSO4, pH7.4)透析。
[0228]此外，在本说明书中最初表达、随后被除去的组氨酸标签的蛋白质在Ex.N0.中被称为a)。最初表达为不具有组氣酸标签的蛋白质在Ex.N0.中被称为b)。
[0229]实施例1:SEQ.N0.1的融合蛋白
[0230]SEQ.N0.1的蛋白是具有203个氨基酸的长度和23.3kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段(SEQ.N0.27)连接于TRAIL114-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了被尿激酶uPA识别的切割位点的序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0231]该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.1和SEQ.N0.50。
[0232]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.1用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.50。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用大肠杆菌BL21 (DE3)菌株或来自Novagen的Tuner (DE3) pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0233]实施例2:SEQ.N0.2的融合蛋白
[0234]SEQ.N0.2的蛋白是具有178个氨基酸的长度和20.5kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8个氨基酸的片段(SEQ ID N0:28)连接于序列TRAIL114-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了被尿激酶uPA识别的切割位点的序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0235]该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码 序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.2和SEQ.N0.51。
[0236]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.2用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.51。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0237]实施例3:SEQ.N0.3的融合蛋白
[0238]SEQ.N0.3的蛋白是具有179个氨基酸的长度和20.5kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8个氨基酸的序列(SEQ.N0.28)连接于序列TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL的序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。 [0239]该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.3和SEQ.N0.52。
[0240]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.3用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.52。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0241]实施例4:SEQ.N0.4的融合蛋白
[0242]SEQ.N0.4的蛋白是具有204个氨基酸的长度和23.2kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段(SEQ.N0.27)连接于序列TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL的序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0243]该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.4和SEQ.N0.53。
[0244]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.4用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.53。产生包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达,使用来自Stratagene的大肠杆菌BL21DE3pLysSRIL菌株或来自Novagen的Tuner(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0245]实施例5:SEQ.N0.5的融合蛋白
[0246]SEQ.N0.5的蛋白是具有230个氨基酸的长度和26kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段(SEQ.N0.27)连接于序列TRAIL95-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0247]该融合蛋白的结构显示于图1，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.5和SEQ.N0.54。
[0248]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.5用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.54。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0249]实施例6:SEQ.N0.6的融合蛋白[0250]SEQ.N0.6的蛋白是具有238个氨基酸的长度和26.7kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段(SEQ.N0.27)连接于序列TRAIL95-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸连接子(SEQ.N0.47)。[0251]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显不于序列表中的SEQ.N0.6和SEQ.N0.55。
[0252]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.6用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.55。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0253]实施例7:SEQ.N0.7的融合蛋白
[0254]SEQ.N0.7的蛋白是具有213个氨基酸的长度和24.1kDa的质量的融合蛋白，其中人甲胎蛋白的8个氨基酸的片段(SEQ.N0.28)连接于序列TRAIL95-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽序列和TRAIL序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸连接子(SEQ.N0.47)。
[0255]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.7和SEQ.N0.56。
[0256]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.7用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.56。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0257]实施例8.SEQ.N0.8的融合蛋白
[0258]SEQ.N0.8的蛋白是具有191个氨基酸的长度和23kDa的质量的融合蛋白，其中源自P21WAF蛋白的肽的20个氨基酸的片段(SEQ.N0.29)连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。此外，触角足蛋白结构域的片段(SEQ.N0.49)连接于效应子蛋白的C末端作为转运肽，其帮助穿过细胞膜并且将融合肽转运进入细胞。在转运序列与TRAIL序列之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0259]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.8和SEQ.N0.57。
[0260]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.8用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.57。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点的序列，第二形式无任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。[0261]实施例8A:SEQ.N0.75的融合蛋白
[0262]SEQ.N0.75的蛋白是具有212个氨基酸的长度和24.13kDa的质量的融合蛋白，其中来源于P21WAF蛋白的肽的20个氨基酸的片段(SEQ.N0.29)连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。此外，触角足蛋白结构域的片段(SEQ.N0.49)连接于效应子蛋白的C末端上作为转运序列，所述转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白运入细胞。在转运序列和TRAIL序列之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，在金属蛋白酶切割位点与TRAIL的序列之间，融合蛋白包含额外的柔性连接子(SEQ.N0.77)。
[0263]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.75和SEQ.N0.76。
[0264]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.75用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.76。产生了两种形式的包含DNA编码序列的质粒，一种允许表达His标签和被凝血酶识别的位点，另一种不含任何标签，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0265]实施例9:SEQ.N0.9的融合蛋白
[0266]SEQ.N0.9的蛋白是具有231个氨基酸的长度和26.5kDa的质量的融合蛋白，其中源自P21WAF蛋白的肽的20个氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)连接于序列TRAIL95-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间，插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列和切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸连接子(SEQ.N0.47)。此外，触角足蛋白结构域的片段(SEQ.N0.49)连接于效应子肽的C末端，从而形成作为转运序列的完整构`建体的C末端片段，所述转运序列帮助穿过细胞膜，并且将融合蛋白运入细胞。
[0267]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.9和SEQ.N0.58。
[0268]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.9用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.58。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0269]实施例10:SEQ.N0.10的融合蛋白
[0270]SEQ.N0.10的蛋白是具有200个氨基酸的长度和22.8kDa的质量的融合蛋白，其中结合FGF-2受体的结构域的肽类似物的16个氨基酸的片段(SEQ.N0.26)连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列与切割位点序列之间，整合蛋白质额外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸连接子(SEQ.N0.47)。此外，切割位点序列与柔性连接子序列之间以及柔性连接子序列与TRAIL结构域之间插入了由两个甘氨酸残基组成的帮助稳定三聚体结构的连接子。
[0271]该融合蛋白的结构显示于图2，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.10和SEQ.N0.59。
[0272]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.10用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.59。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0273]实施例11:SEQ.N0.11的融合蛋白
[0274]SEQ.N0.11的蛋白是具有233个氨基酸的长度和26.5kDa的质量的融合蛋白，其中源自D0C-2/DAB2的肽DD2的18个氨基酸的片段(SEQ.N0.30)连接于序列TRAIL95-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。效应子肽的序列在其N末端连接于由7个Arg残基组成的聚精氨酸转运结构域。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白运输进入细胞。在TRAIL序列与切割位点之间，融合蛋白额外地包含柔性半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸连接子CAACAAACGGG。
[0275]该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.11和SEQ.N0.60。
[0276]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.11用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.60。产生了包含DNA编码序列的质粒，具根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21 (DE3)或Tuner (DE3) pLysS菌株。根据上述一般程序通过电泳分`离蛋白。
[0277]实施例12:SEQ.N0.12的融合蛋白
[0278]SEQ.N0.12的蛋白是具有590个氨基酸的长度和66.7kDa的质量的融合蛋白，其中源自精氨酸支原体的精氨酸脱亚氨酶(SEQ.N0.31)连接于TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL序列之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)识别的切割位点序列和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。在TRAIL序列与金属蛋白酶切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含由甘氨酸和丝氨酸残基组成的柔性连接子Gly Gly Ser Gly0在尿激酶切割位点序列与效应子蛋白序列之间，融合蛋白额外地包含柔性甘氨酸-丝氨酸连接子 Gly Gly Gly Ser Gly0
[0279]该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.12和SEQ.N0.61。
[0280]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.12用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.61。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0281]实施例13.SEQ.N0.13的融合蛋白
[0282]SEQ.N0.13的蛋白是具有187个氨基酸的长度和21.6kDa的质量的融合蛋白，其中来自P16蛋白的10个氨基酸的肽(SEQ.N0.32)连接于TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL结构域的N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。效应子肽序列在其C末端连接于由触角足蛋白结构域片段的片段组成的转运序列(SEQ.N0.49)。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。
[0283]该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.13和SEQ.N0.62。
[0284]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.13用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.62。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达,使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)菌株或来自Stratagene的BL21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0285]实施例14.SEQ.N0.14的融合蛋白
[0286]SEQ.N0.14的蛋白是具有203个氨基酸的长度和23.6kDa的质量的融合蛋白，其中MEK-1蛋白一ERK活化的抑制剂一的13个氨基酸的片段(SEQ.N0.34)连接于TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在TRAIL的C末端和效应子肽结构域之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。效应子肽序列在其N末端连接于由触角足蛋白结构域片段的片段组成的转运序列(SEQ.N0.48)。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。在TRAIL序列与切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含柔性甘氨酸-半胱氨酸连接子GS。
[0287]该融合蛋白的结构显 示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.14和SEQ.N0.63。
[0288]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.14用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.63。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)菌株或来自Novagen的BL21DE3pLysSRIL菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0289]实施例15.SEQ.N0.15的融合蛋白
[0290]SEQ.N0.15的蛋白是具有205个氨基酸的长度和24kDa的质量的融合蛋白，其中用作Akt共激活物的TCLl蛋白的PH结构域的15个氨基酸的N末端片段(SEQ.N0.35)连接于TRAIL121-281的C末端作为效应子肽。在TRAIL结构域和效应子肽之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。效应子肽序列在其N末端上连接于由触角足蛋白结构域片段的片段组成的转运序列(SEQ.N0.48)。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。在TRAIL序列与切割位点序列之间，融合蛋白额外地包含柔性甘氨酸-半胱氨酸连接子GS。
[0291]该融合蛋白的结构显示于图3，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.15和SEQ.N0.64。
[0292]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.15用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.64。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0293]实施例16.SEQ.N0.16的融合序列
[0294]SEQ.N0.16的蛋白是具有183个氨基酸的长度和21.2kDa的质量的融合蛋白，其中用作E2F的抑制剂的六肽(SEQ.N0.36)连接于TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL结构域之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，效应子肽序列在其C末端连接于由触角足蛋白结构域片段的片段组成的转运序列(SEQ.N0.49)。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。
[0295]该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显不于序列表中的SEQ.N0.16和SEQ.N0.65。
[0296]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.16用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.65。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0297]实施例17.SEQ.N0.17的融合蛋白
[0298]SEQ.N0.17的蛋白是具有190个氨基酸的长度和22.3kDa的质量的融合蛋白，其中微管蛋白的13个氨基酸的片段(SEQ.N0.37)连接于TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽与TRAIL结构域的N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割 。此外，效应子肽序列在其C末端连接于由6个精氨酸残基组成的转运肽。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。
[0299]该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.17和SEQ.N0.66。
[0300]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.17用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.66。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)菌株或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0301]实施例18:SEQ.N0.18的融合蛋白
[0302]SEQ.N0.18的蛋白是具有187个氨基酸的长度和21.7kDa的质量的融合蛋白，其中微管蛋白的10个氨基酸的片段(SEQ.N0.38)连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，效应子肽序列在其C末端连接于由6个精氨酸残在组成的转运序列。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运进入细胞。
[0303]该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.18和SEQ.N0.67。
[0304]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.18用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.67。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0305]实施例19.SEQ.N0.19的融合蛋白
[0306]SEQ.N0.19的蛋白是具有196个氨基酸的长度和22.54kDa的质量的融合蛋白，其中蜂毒肽(SEQ.N0.39)连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0307]该融合蛋白的结构显示于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.19和SEQ.N0.68。
[0308]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.19用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.68。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0309]实施例20.SEQ.N0.20的融合蛋白
[0310]SEQ.N0.20的蛋白是具有184个氨基酸的长度和21.4kDa的质量的融合蛋白，其中源自蜂防卫素的6个氨基酸的肽C2 (SEQ.N0.40)连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，效应子肽序列还在其C末端连接于由6个精氨酸组成的转运序列。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白转运入细胞。
[0311]该融合蛋白的结构显示`于图4，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.20和SEQ.N0.69。
[0312]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.20用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.69。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0313]实施例2 L SEQ.N0.21的融合蛋白
[0314]SEQ.N0.21的蛋白是具有189个氨基酸的长度和21.4kDa的质量的融合蛋白，其中结合FGF-2配体的8个氨基酸肽(SEQ.N0.41)的两个重复序列连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，在第二效应子肽和TRAIL结构域序列之间插入了由两个甘氨酸残基组成的帮助稳定三聚体结构的连接子。
[0315]该融合蛋白的结构显示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.21和SEQ.N0.70。
[0316]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.21用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.70。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0317]实施例22.SEQ.N0.22的融合蛋白
[0318]SEQ.N0.22的蛋白是具有188个氨基酸的长度和21.6kDa的质量的融合蛋白，其中15个氨基酸的lasioglossin LL2 (SEQ.N0.42)连接于序列TRAILl 19-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0319]该融合蛋白的结构显示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.22和SEQ.N0.71。
[0320]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.22用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.71。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0321]实施例23.SEQ.N0.23的融合蛋白
[0322]SEQ.N0.23的蛋白是具有193个氨基酸的长度和21.6kDa的质量的融合蛋白，其中用作相互作用RasGAP - Aurora B的抑制剂的13个氨基酸的肽(SEQ.N0.43)连接于序列TRAIL121-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，效应子肽序列在其C末端连接于由8个精氨酸残在组成的转运序列。转运序列帮助穿过细胞膜并且将融合蛋白运输进入细胞。此外，在金属蛋白`酶切割位点序列与TRAIL结构域序列之间插入了帮助稳定三聚体结构的半胱氨酸残基。
[0323]该融合蛋白的结构显示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.23和SEQ.N0.72。
[0324]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.23用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.72。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌B.21 (DE3)或Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0325]实施例24.SEQ.N0.24的融合蛋白
[0326]SEQ.N0.24的蛋白是具有243个氨基酸的长度和27.8kDa的质量的融合蛋白，其中与触角足蛋白的17个氨基酸的转运结构域融合的pl6肽的38个氨基酸的片段(SEQ.N0.33)连接于序列TRAIL95-281的C末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域之间插入了彼此连续的被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)和被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。此外，在TRAIL序列与被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列之间插入了柔性半胱氨酸-丙氨酸连接子(SEQ.N0.47)。
[0327]该融合蛋白的结构显示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.24和SEQ.N0.73。[0328]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.24用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.73。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序A进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0329]实施例25.SEQ.N0.25的融合蛋白
[0330]SEQ.N0.25的蛋白是具有199个氨基酸的长度和23.4kDa的质量的融合蛋白，其中P印27肽的类似物(SEQ.N0.44)连接于序列TRAIL120-281的N末端作为效应子肽。在效应子肽和TRAIL结构域N末端之间插入了彼此连续的被尿激酶uPA识别的切割位点序列(SEQ.N0.46)和被金属蛋白酶MMP识别的切割位点的序列(SEQ.N0.45)，因此效应子肽在肿瘤环境中将进行切割。
[0331]该融合蛋白的结构显示于图5，其氨基酸序列和包含针对在大肠杆菌中表达而优化的密码子的DNA编码序列分别显示于序列表中的SEQ.N0.25和SEQ.N0.74。
[0332]上述结构的氨基酸序列SEQ.N0.25用作模板以产生其编码DNA序列SEQ.N0.74。产生了包含DNA编码序列的质粒，根据上述一般性程序进行融合蛋白的过表达。根据一般程序B进行过表达，使用来自Novagen的大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Tuner (DE3)菌株。根据上述一般程序通过电泳分离蛋白。
[0333]实施例26:融合蛋白的抗肿瘤活性的测定
[0334]在体外在肿瘤细胞系中在细胞毒性测定中以及在体内在小鼠中进行了融合蛋白的抗肿瘤活性的测定。为了比较目的，使用了 rhTRAILl 14-281蛋白和安慰剂。
[0335]1.圆二色件(circular dichroism)测定
[0336]通过Ex.1a，Ex.2lPEx.8a的圆二色性(⑶)测定融合蛋白的制备物的质量(就它们的结构而言)。
[0337]圆二色性用于测定蛋白质的二级结构和构象。CD方法使用蛋白结构的光学活性，表现为使光偏振平面旋转和椭圆偏振的出现。远紫外(UV)中的蛋白的CD光谱提供了关于主要多肽链的构象的精确数据。
[0338]将待分析的蛋白的样品在配制于由50mM Tris-HCl pH8, O, IOOmM NaCl, 10%甘油，0.1mM ZnCl2, 80mM蔗糖，5mM DTT组成的缓冲液后于具有12kD截留值的透析袋(Sigma-Aldrich)中透析。针对相对于蛋白制剂100倍过量(v/v)的缓冲液进行透析，同时搅拌，在4°C持续数个小时。透析完成之后，将每个制剂离心(25000rpm，IOmin, 4°C )，收集适当的上清液。通过Bradford法测定由此获得的样品中的蛋白浓度。
[0339]在Jasco J-710分光偏振计中，在具有0.2mm或Imm光程的石英杯中进行浓度范围为0.1-2.7mg/ml的蛋白的圆二色性测定。在71/min的氮气流下进行该测定，这允许在195至250nm波长范围内进行测定。测量参数:光谱分辨率-1nm ;光束的半宽Inm ;灵敏性20mdeg, 一个波长的平均时间_8s,扫描速度10nm/min。
[0340]结果显示为3次测量的平均值。rhTRAILl 14-281和Ex.1a，Ex.2a和Ex.8a的蛋白的圆二色性光谱显示于图6。
[0341]使用CDPro软件在193_250nm范围内对获得的光谱进行数值分析。忽略掉光电倍增管中的电压超过700V的点，因为该波长范围内的信噪比太低。
[0342]获得的数据用于计算所分析的蛋白中的特定二级结构含量，使用CDPio软件(表
【权利要求】
1.融合蛋白，其包含: -结构域(a)，其包含:可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或具有至少70%序列同一性的所述功能片段的同源物；和-至少一个结构域(b)，其为具有抗肿瘤细胞的抗增殖活性的效应子肽的序列， 并且其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。
2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域(a)包含可溶性hTRAIL(SEQ.N0.78)蛋白序列的片段，起始于hTRAIL95至h TRAIL121的氨基酸，含端点，结束于氨基酸281。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中结构域(a)选自hTRAIL95-281,hTRAILl 14-281,hTRAILl19-281, hTRAIL120-281 和 hTRAIL121_281。
4.权利要求1-3任一项的融合蛋白，其中结构域(b)选自 -SEQ.N0.26的阻断FGF-2受体的16个氨基酸的肽； -SEQ.N0.27的人甲胎蛋白的34个氨基酸的片段； -SEQ.N0.28的人甲胎蛋白的8个氨基酸的片段；
-SEQ.N0.29 的源自 p21WAF 的肽; -SEQ.N0.30 的来自 DOC-2/DAB2 蛋白的肽 DD2; -SEQ.N0.31的来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶； -SEQ.N0.32的pl6肽的片段; -SEQ.N0.33的与触角足蛋白的17个氨基酸的转运结构域融合的pl6肽的片段； -SEQ.N0.34的MEK-1蛋白的片段; -SEQ.N0.35的TCLl蛋白的PH结构域的N末端片段；
-SEQ.N0.36 六妝 Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr; -SEQ.N0.37的13个氨基酸的微管蛋白片段； -SEQ.N0.38的10个氨基酸的微管蛋白片段； -SEQ.N0.39的蜂毒肽； -SEQ.N0.40的源自蜂防卫素的6个氨基酸的肽C2; -SEQ.N0.41的结合FGF-2配体的8个氨基酸的肽；
-SEQ.N0.42 的 15 个氛基酸的 lasioglossin LL2 月太; -SEQ.N0.43的结合SH3RasGAP结构域的13个氨基酸的肽； -SEQ.N0.44的P印27肽的类似物。
5.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其在结构域(a)与结构域(b)之间包含结构域(c )，结构域(c )包含蛋白酶切割位点，其选自被金属蛋白酶MMP识别的序列、被尿激酶uPA识别的序列，及其组合。
6.权利要求5的融合蛋白，其中被金属蛋白酶MMP识别的序列是SEQID N0:45，被尿激酶uPA识别的序列是SEQ.N0.46。
7.权利要求5或6的融合蛋白，其中结构域(c)是彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列和被尿激酶uPA识别的序列的组合。
8.前述权利要求1至7任一项的融合蛋白，其中结构域(b)另外地连接于选自下列的转运结构域⑷: -(dl)SEQ.N0.48的触角足蛋白结构域的片段，-(d2)SEQ.N0.49的触角足蛋白结构域的片段， -(d3)转运通过细胞膜的聚精氨酸序列，其由6，7，8，9，10或11个Arg残基组成， 及其组合。
9.权利要求8的融合蛋白，其中序列(d)位于融合蛋白的C末端上或N末端。
10.权利要求8的融合蛋白，其中转运序列(d)位于结构域(b)与(c)之间。
11.权利要求8的融合蛋白，其中序列(d)位于融合蛋白质的C末端。
12.权利要求5至11任一项的融合蛋白，其额外地在结构域(a)、(b)、(c)和/或(d)之间包含柔性空间连接子。
13.权利要求11的融合蛋白，其中柔性空间连接子选自SEQ.N0.47，序列Gly Gly Ser,序列Gly Gly Gly Ser Gly,两个甘氨酸残基Gly Gly,半胱氨酸残基Cys,及其组合。
14.权利要求1的融合蛋白，其具有选自SEQ.N0.1; SEQ.N0.2; SEQ.N0.3; SEQ.N0.4 ; SEQ.N0.5 ; SEQ.N0.6 ; SEQ.N0.7 ; SEQ.N0.8 ; SEQ.N0.9 ; SEQ.N0.10 ; SEQ.N0.11; SEQ.N0.12; SEQ.N0.13 ; SEQ.N0.14，SEQ.N0.15，SEQ.N0.16 ; SEQ.N0.17; SEQ.N0.18; SEQ.N0.19; SEQ.N0.20; SEQ.N0.21; SEQ.N0.22; SEQ.N0.23; SEQ.N0.24; SEQ.N0.25 和 SEQ.N0.75的氨基酸序列。
15.前述权利要求任一项的融合蛋白，其是重组蛋白。
16.多核苷酸序列，编码如权利要求1-14任一项中定义的融合蛋白。
17.权利要求16的多核苷酸序列,其针对在大肠杆菌中的遗传表达进行了优化。
18.权利要求17的多核苷酸序列，其选自SEQ.N0.50; SEQ.N0.51; SEQ.N0.52; SEQ.N0.53 ; SEQ.N0.54 ; SEQ.N0.55 ; SEQ.N0.56 ; SEQ.N0.57 ; SEQ.N0.58 ; SEQ.N0.59 ; SEQ.N0.60 ; SEQ.N0.61; SEQ.N0.62 ; SEQ.N0.63 ; SEQ.N0.64 ; SEQ.N0.65 ; SEQ.N0.66 ; SEQ.N0.67; SEQ.N0.68; SEQ.N0.69; SEQ.N0.70; SEQ.N0.71; SEQ.N0.72; SEQ.N0.73，SEQ.N0.74 和SEQ.N0.76。
19.表达载体,其包含权利要求16至18的任一项的多核苷酸序列。
20.宿主细胞，其包含权利要求19中定义的表达载体。
21.权利要求20的宿主细胞，其为大肠杆菌细胞。
22.药物组合物，其包含与药学上可接受的载体组合的作为活性成分的权利要求1至15任一项中定义的融合蛋白。
23.权利要求22的药物组合物，其为用于胃肠外施用的形式。
24.权利要求1至15任一项定义的融合蛋白，用于治疗哺乳动物、包括人的肿瘤疾病。
25.治疗哺乳动物、包括人的癌症疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用抗肿瘤有效量的权利要求1至15中定义的融合蛋白或者权利要求22或23中定义的药物组合物。
【文档编号】A61K38/17GK103562220SQ201280019018
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月19日
【发明者】J·S·皮克齐考兰, S·D·波莱克, B·M·扎泽克, P·K·罗兹加, U·M·萨劳斯卡 申请人:阿达梅德公司