Her3抗体及其用途

Her3抗体及其用途
【专利摘要】本文提供的是对HER3特异的抗体。还提供的是治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的抗体。
【专利说明】HER3抗体及其用途
[0001]优先权申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年11月9日提交的美国临时申请N0.61/557，672的优先权，其通过引用整体并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本发明在来自美国国立卫生研究院的拨款N0.R01-CA112169下通过政府资助进行。美国政府具有本发明的某些权利。
[0005]背景
[0006]HER3，也称为ERBB3，是ErbB蛋白家族的成员。ErbB蛋白家族由四种密切相关的跨膜酪氨酸激酶受体:表皮生长因子受体(EGFR)(也称为HER1)、ERBB2 (HER2)、ERBB3 (HER3)和ERBB4(HER4)组成。每个受体包含胞外结构域、α -螺旋跨膜区段和细胞内酪氨酸激酶结构域。受体的二聚化对于受体功能是必不可少的需求。不同异二聚体可在ErbB受体蛋白家族之间形成，并且形成哪个异二聚体且结合哪个配体决定哪个信号传导途径被或活化。
[0007]概述
[0008]本文提供的是对HER3特异的抗体或其片段，其中抗体或片段阻断HER3的磷酸化(自体磷酸化和/或配体诱导的磷酸化)。本文提供的某些抗体或片段特异性结合HER3并且不阻断HER3配体结合，而其它抗体或片段特异性结合HER3但阻断配体结合。不阻断配体结合的本文所述的抗体或片段在本文被称为非配体依赖性抗体或片段，因为自体磷酸化被阻断。不阻断配体结合的本文所述的抗体或片段在本文被称为配体依赖性抗体或片段，因为配体诱导的磷酸化被阻断。
[0009]本文还提供的是治疗受试者的增殖性病症(例如癌症)的方法。该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的抗体或其片段。例如，该方法包括向所述受试者施用任选地与其它抗体或片段组合的非配体依赖性抗体或其片段和配体依赖性抗体或其片段的组合的方法。
[0010]一个或多个实施方案的详情在附图及下面描述中列出。其它特征、目的和优点根据描述和附图以及根据权利要求将是明显的。
[0011]附图描述
[0012]图1示出1Α5和3D4抗体与HER3的特异性结合。图1A和IB示出表明如通过ELISA测定确定的1Α5(图1Α)和3D4(图1B)的结合特异性的曲线图。ELISA板用Iyg/ml重组可溶性EGFR、HER2、或HER3 (胞外结构域)涂敷并且用指示浓度的1A5或3D4、之后用HRP-山羊抗-小鼠IgG孵育。呈现一式三份的平均OD值。egFR的值与HER2的值重叠。图1C和ID示出表明1A5(图1C)和3D4(图1D)的结合特异性的流式细胞术结果。EGFR、HER2或HER3-转染的SP2/0细胞用I μ g/ml纯化抗体、用PE-山羊抗-小鼠IgG染色。
[0013] 图2示出1A5和3D4抗体对HER3的配体结合的效应。图2A示出表明如通过ELISA测定确定的1A5抗体不阻断HER3的配体结合、而3D4抗体阻断HER3的配体结合的曲线图。ELISA板用I μ g/ml重组可溶性HER3涂敷，然后用100ng/ml生物素-缀合的重组NRGl在缺少或存在指示浓度的1A5和3D4抗体下孵育。通过HRP-链霉亲和素检测NRGl与HER3的结合(垂直轴)。图2B示出表明如通过流式细胞术确定的1A5抗体不阻断HER3的配体结合、而3D4抗体阻断HER2的配体结合的曲线图。HER3-转染的SP2/0细胞用100ng/ml生物素-缀合的NRGl在缺少或存在指示浓度的1A5或3D4抗体下孵育。通过PE-链霉亲和素检测NRGl结合。呈现所结合NRGl的平均荧光强度(MFI)。
[0014]图3示出表明1A5和3D4抗体识别HER3上的不同表位的曲线图。ELISA板用2yg/ml纯化的1A5涂敷，然后用指示浓度的重组可溶性HER3在存在200ng/ml HRP-缀合的3D4下孵育。通过化学荧光底物检测3D4与HER3的结合。呈现一式三份的平均计数每秒。
[0015]图4示出1A5抗体对HER3的非配体依赖性活化(自体磷酸化)的体外剂量依赖性抑制。人胃癌N87细胞(图4A)、乳腺癌BT474细胞(图4B)、乳腺癌ZR75-30细胞(图4C)和胰腺癌Panc2.03细胞(图4D)用指示浓度的1A5或3D4抗体处理24小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过ELISA确定HER3的酪氨酸磷酸化水平(pHER3，图4A-4D的左曲线图)。ELISA板用3F8抗-HER3抗体(识别与1A5和3D4不同的表位)涂敷以捕获总HER3 (总HER3，图4A-4D的右曲线图)。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的HER3。通过HRP-缀合的1E8抗-HER3抗体检测总HER3。然后通过化学荧光测量酪氨酸-磷酸化的HER3和总HER3水平。
[0016]图5示出1A5对一小组的人癌症细胞的自体磷酸化的效应。癌细胞用20 μ g/ml的1A5抗体处理24小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过ELISA测定HER3的酪氨酸-磷酸化水平。ELISA板用3F8抗-HER3抗体(识别与1A5抗体不同的表位)涂敷以捕获总HER3。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的HER3，并且通过化学荧光测量磷酸化水平。
[0017]图6示出对HER3的配体依赖性活化的剂量依赖性抑制。人胃癌N87细胞(图6A)、乳腺癌BT474细胞(图6B)、乳腺癌ZR75-30细胞(图6C)和胰腺癌Panc2.03细胞(图6D)用指示浓度的1A5或3D4处理24小时，然后用100pg/ml重组NRGl处理I小时。在25 μ I的2mg/ml总细胞裂解液中通过ELISA确定HER3的酪氨酸磷酸化水平。ELISA板用3F8抗-HER3抗体(识别与1A5和3D4不同的表位)涂敷以捕获总HER3。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的HER3，并且通过化学荧光测量磷酸化水平。
[0018]图7示出通过用1A5和3D4抗体组合处理的HER3的完全失活。人胃癌N87细胞(图7A)、乳腺癌BT474细胞(图7B)、乳腺癌ZR75-30细胞(图7C)和胰腺癌Panc2.03细胞(图7D)用指示浓度的1A5或3D4或两种抗体处理24小时，然后这些细胞用100pg/ml重组NRGl处理I小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过ELISA确定HER3的酪氨酸磷酸化水平。ELISA板用3F8抗-HER3抗体(识别与1A5和3D4不同的表位)涂敷以捕获总HER3。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的HER3，然后通过化学荧光测量磷酸化水平。
[0019] 图8示出在N87胃癌细胞中用1A5和3D4抗体对HER3活化的完全阻断使拉帕替尼的抗增殖效应敏感。人胃癌N87细胞用20 μ g/mllA5或3D4或两种抗体在有或没有IOOnM拉帕替尼下处理24小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过化学荧光ELISA确定EGFR(图8A)、HER2 (图8B)和HER3 (图8C)的酪氨酸磷酸化水平。ELISA板用抗-EGFR(克隆:1E1,图8A)、抗-HER2 (克隆:5G12，图8B)、或抗-HER3 (克隆:3F8，图8C)涂敷。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的EGFR、HER2和GER3，并且通过化学荧光测量磷酸化水平。细胞用EdU标记，并且通过流式细胞术检查EdU+增殖细胞(图8D)。
[0020]图9示出在A549肺癌细胞中用1A5和3D4抗体对HER3活化的完全阻断使埃罗替尼的抗增殖效应敏感。人肺癌A549细胞用2(^8/1111认5或304或两种抗体在有或没有IOOnM埃罗替尼下处理24小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过化学荧光ELISA确定EGFR(图9A)和HER3 (图9B)的酪氨酸磷酸化水平。ELISA板用抗_EGFR(克隆:1E1，图9A)或抗-HER3 (克隆:3F8，图9B)涂敷。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的EGFR和HER3，并且通过化学荧光测量磷酸化水平。细胞用EdU标记，并且通过流式细胞术检查EdU+增殖细胞(图9C)。
[0021]图10示出在ZR75-30乳腺癌细胞中用1A5和3D4抗体对HER3活化的完全阻断使拉帕替尼的抗增殖效应敏感。人乳腺癌ZR75-30 细胞用20 μ g/mllA5或3D4或两种抗体在有或没有IOOnM拉帕替尼处理24小时。在2mg/ml总细胞裂解液中通过化学荧光ELISA确定HER2(图10A)和HER3(图10B)的酪氨酸磷酸化水平。ELISA板用抗-HER2 (克隆:5G12)或抗-HER3 (克隆:3F8)涂敷。通过HRP-缀合的4G10抗-酪氨酸磷酸化抗体检测酪氨酸-磷酸化的HER2和HER3，并且通过化学荧光测量磷酸化水平。细胞用EdU标记，并且通过流式细胞术检查EdU+增殖细胞(图10C)。
[0022]图11示出表明在A549人肺癌异种移植模型中用1A5和3D4抗体对HER3活化的阻断使肿瘤体积减小的曲线图。
[0023]图12示出表明在A549人肺癌异种移植模型中用与爱必妥组合的1A5和3D4抗体对HER3活化的阻断协同地减小肿瘤体积的曲线图。
[0024]图13示出表明在N87人胃癌模型中用与拉帕替尼组合的1A5抗体对HER3活化的阻断协同地减小肿瘤体积的曲线图。
[0025]图14示出表明在MKN28人胃癌模型中用与拉帕替尼组合的1A5抗体对HER3活化的阻断协同地减小肿瘤体积的曲线图。
[0026]图15示出表明在HT29人结肠癌模型中用1A5抗体对HER3活化的阻断使肿瘤体积减小的曲线图。
[0027]图16示出表明在HT29人结肠癌模型中用与拉帕替尼组合的1A5抗体对HER3活化的阻断协同地减小肿瘤体积的曲线图。
[0028]图17示出在胰腺癌细胞系中ERBB家族蛋白的表达和功能。图17A示出所有细胞系表达高水平的EGFR并且8个细胞系中的5个和7个分别表达可变水平的HER2和HER3。图17B-17D示出TGF- α诱导不依赖于EGFR表达水平的差分磷酸化响应，但不活化HER2和HER3。NRGl不诱导EGFR活化但能够以HER-依赖性方式活化HER2和HER3两者。所有HER3阳性细胞系具有不同水平的HER3自体磷酸化(非配体依赖性活化)。
[0029]图18示出1Α5抗体、埃罗替尼和拉帕替尼对ERBB家族蛋白的非配体依赖性活化的效应。图18Α示出在所有HER3阳性细胞系(除了 Panel)中1A5抗体而不是埃罗替尼和拉帕替尼抑制HER3的自体磷酸化。图18B示出在所有胰腺细胞系中埃罗替尼抑制自体磷酸化，而单独的1A5抗体以HER3-依赖性方式部分抑制EGFR自体磷酸化。1A5抗体能够增强埃罗替尼的抑制活性。图18C示出单独的拉帕替尼抑制EGFR的自体磷酸化；然而，1A5抗体不能够增强拉帕替尼的活性。图18D示出1A5和拉帕替尼的组合使HER2自体磷酸化的水平降低的程度比单独的1A5抗体或拉帕替尼高。
[0030]图19示出3D4抗体、埃罗替尼和拉帕替尼对ERBB家族蛋白的配体依赖性活化的效应。图19A示出3D4抗体抑制NRG-1诱导的HER3磷酸化并且拉帕替尼部分使NRG-1-诱导的磷酸化降低。图19B示出两种3D4抗体和拉帕替尼而不是埃罗替尼抑制NRG-1-诱导的HER2磷酸化。
[0031]图20示出用抗-HER3抗体和埃罗替尼或拉帕替尼的组合处理的抗增殖活性。图20A示出在MIAcapa(左)和BXPC3 (右)细胞系中用抗-HER3抗体和埃罗替尼或拉帕替尼的组合处理的抗增殖活性。图20B示出在Panel (左)和Panc2.03 (右)细胞系中用抗-HER3抗体和埃罗替尼或拉帕替尼的组合处理的抗增殖活性。图20C示出在S2013 (左)和S2VplO (右)细胞系中用抗-HER3抗体和埃罗替尼或拉帕替尼的组合处理的抗增殖活性。图20D示出在S2LM-7AA(左)和Suit2(右)细胞系中用抗-HER3抗体和埃罗替尼或拉帕替尼的组合处理的抗增殖活性。
[0032]图21示出在无胸腺裸小鼠中单独的和与白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)组合的HER3抗体针对原位基底A型异种移植的体内功效。在哺乳动物脂肪垫中植入HCC1187细胞，并且当确立肿瘤后10天开始处理。箭头指示施用处理(n = 10只小鼠/组)的间隔。处理由以下组成:每周两次给予200 μ glA5和3D4HER3抗体，持续3周，于第28天结束；在第11、15、18和22天给予20mg/kg白蛋白结合型紫杉醇；HER3+白蛋白结合型紫杉醇；或未处理。
[0033]图22示出在无胸腺裸小鼠中单独的和与拉帕替尼组合的HER3抗体针对原位基底A型异种移植的体内功效。在哺乳动物脂肪垫中植入MDA-MB-468细胞，并且当确立肿瘤后7天开始处理。箭头指示施用处理(n = 10只小鼠/组)的间隔。处理由以下组成:每周两次给予200 μ glA5和3D4HER3抗体，持续3周，于第24天结束；每周5天100mg/kg拉帕替尼，持续3周；HER3+拉帕替尼；或未处理。
[0034]图23示出在无胸腺裸小鼠中单独的和与吉西他滨组合的HER3抗体针对原位胰腺癌异种移植的体内功效。在胰腺中植入MIAPaCa-2细胞，并且当确立肿瘤后27天开始处理。箭头指示施用处理(n= 10只小鼠/组)的间隔。处理由以下组成:每周两次给予200 μ g1A5和3D4HER3抗体，持续6周，于第65天结束；在第28、34、56和63天120mg/kg吉西他滨；HER3+吉西他滨；或未处理。
[0035]详述
[0036]本文提供的是对HER3特异的抗体或其片段。抗体阻断HER3的磷酸化。被阻断的磷酸化可以是自体磷酸化或配体诱导的磷酸化。任选地，HER3抗体不阻断HER3配体结合。如本文所用，因为自体磷酸化被阻断，所以不阻断HER3配体结合的抗体或片段被称为非配体依赖性拮抗性抗体或其片段。任选地，HER3抗体阻断HER3配体结合。如本文所用，因为配体诱导的磷酸化被阻断，所以阻断HER3配体结合的抗体或片段被称为配体依赖性拮抗性抗体或片段。HE R3特异性抗体阻断HER3的磷酸化，并且任选地，HER3的磷酸化不依赖于HER3的配体结合。抗体可例如通过阻断配体诱导的HER2和EGFR的磷酸化的试剂使HER2和EGFR的磷酸化的阻断敏感。
[0037]任选地，HER3特异性抗体或片段可在表达HER3的癌细胞中以低剂量体外阻断HER3的磷酸化。任选地，非配体依赖性和配体依赖性HER3特异性抗体或片段可以低剂量体外组合施用至表达HER3的癌细胞。HER3特异性抗体的剂量可例如为0.1 μ g/ml、0.5 μ g/ml、I μ g/ml、2.5 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、20 μ g/ml、50 μ g/ml、或于其中的任何剂量。癌细胞可例如选自由以下组成的组:胃癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、神经系统癌症细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、皮肤癌细胞、结直肠癌细胞和肺癌细胞。
[0038]非配体依赖性HER3特异性抗体或片段可例如具有与以下抗体或片段相同的表位特异性:所述抗体或片段含有具有包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5的多肽序列(互补决定区或CDR)的轻链和具有包含SEQ IDN0:6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的多肽序列(OTR)的重链。任选地，抗体或片段包含包含SEQ ID NO:1的轻链。任选地，抗体或片段包含包含SEQ ID NO:2的重链。轻链可例如包含包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO: 5的多肽序列(CDR)。重链可例如包含包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的多肽序列(CDR)。
[0039]配体依赖性HER3特异性抗体或片段可例如具有与以下抗体或片段相同的表位特异性:所述抗体或片段含有具有包含SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的多肽序列(互补决定区或CDR)的轻链和具有包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16的多肽序列(OTR)的重链。任选地，抗体或片段包含包含SEQ ID NO:9的轻链。任选地，抗体或片段包含包含SEQ ID NO: 10的重链。轻链可例如包含包含SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的多肽序列(CDR)。重链可例如包含包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQID NO: 16的多肽序列(CDR)。
[0040]如本文所用，术语抗体涵盖但不限于任何类别的整个免疫球蛋白(即完整抗体)。天然抗体通常为由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异源四聚体糖蛋白。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同工型的重链之间的二硫键联的数目不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一端有可变结构域(V(H))，其后是多个恒定结构域。每条轻链的一端有可变结构域(V(L))，另一端有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于它们恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的称为kappa( K )和lambda( λ )的类型之一。取决于它们重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被指定为不同的类别。有五种主要类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可进一步被分为亚类(同工型)，例如、IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ；IgA-1和IgA_2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、Y和μ。
[0041] 术语“可变”在本文用于描述抗体中抗体结构域的某些部分在序列上不同，并且它用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在抗体的可变结构域中。它通常集中于轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域中较高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，它们多半采用β -折叠构型，通过三个CDR连接，所述CDR形成连接环并且在某些情况下形成β_折叠结构的部分。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一条链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出不同的效应功能，诸如抗体在抗体依赖性的细胞毒性中的参与。[0042]如本文所用，术语表位意指包括能够与所提供抗体发生特异性相互作用的任何决定子。表位决定子通常由分子的化学活性表面分组诸如氨基酸或糖侧链组成并且通常具有特殊的三维结构特征、以及特殊的电荷特征。如下进行抗体识别的表位的鉴定。首先，制备了单克隆抗体识别的靶分子的各种部分结构。部分结构通过制备该分子的部分肽来制备。此类肽通过例如已知寡肽合成技术或通过将编码所需部分多肽的DNA并入适合的表达质粒来制备。将表达质粒递送至适合的宿主诸如大肠杆菌(E.coli)以生成肽。例如，从靶分子的C-或N-端工作的具有适当减少的长度的一系列多肽可通过确定的基因工程技术来制备。通过确定哪个片段与抗体反应，来鉴定表位区。通过使用确定的寡肽合成技术合成多种较小的肽或该肽的突变体来更密切地鉴定表位。例如在竞争性抑制测定中使用较小的肽以确定特异性肽是否干扰抗体与靶分子的结合。如果这样的话，则该肽是抗体结合的表位。商购可得的试剂盒诸如SPOTs试剂盒(Genosys Biotechnologies, Inc., TheWoodlands, TX)和基于多针(multipin)合成的一系列多针肽合成试剂盒(ChironCorporation, Emeryvile, CA)可用于获得各种各样寡肽。
[0043]术语抗体或其片段也可涵盖具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，及包括杂合片段的片段诸如F(ab’)2、Fab’、Fab等。因此，提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体的片段。例如，维持HER3结合活性的抗体的片段包括在术语抗体或其片段的含义内。此类抗体和片段可通过本领域已知的技术制备并且可根据用于生产抗体和筛选抗体的特异性和活性的通用方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane.Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988))。
[0044]还包括在抗体或其片段的含义内的是例如在美国专利N0.4，704, 692中描述的抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物，其内容由此通过引用以其整体并入。
[0045]任选地，该抗体是单克隆抗体。本文所用的术语单克隆抗体是指来自基本上同源的抗体群体的 抗体，即包含在群体内的个别抗体是相同的，除了可能少量存在的可能的天然存在的突变之外。单克隆抗体可使用杂交瘤方法诸如由Kohler和 Milstein, Nature, 256:495 (1975)或 Harlow 和 Lane, Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Publications, New York(1988)描述的方法来制备。在杂交瘤方法中，小鼠或其它适当的宿主动物通常用免疫剂免疫来引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。可选地，可对淋巴细胞进行体外免疫。免疫剂可以是HER3或其免疫原性片段。
[0046]—般而言，在生产单克隆抗体的方法中使用外周血淋巴细胞(PBL)(如果需要人源的细胞的话)，或者使用脾细胞或淋巴结细胞(如果需要非人哺乳动物源的细胞的话)。然后淋巴细胞使用适合的融合剂诸如聚乙二醇与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press,第 59-103页(1986))。永生化细胞系通常为转化的哺乳动物细胞，包括啮齿类动物、牛科动物、马科动物和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在适合的培养基中培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制非融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常包括预防HGPRT缺陷性细胞的生长的次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT介质”)物质。[0047]本文有用的永生化细胞系为有效地稠合抗体、维持所选的抗体生产细胞对抗体的稳定高水平表达，并且对介质诸如HAT介质敏感的细胞。永生化细胞系包括鼠科动物骨髓瘤系，其可例如由 Salk Institute Cell Distribution Center ；San Diego, Calif.和 American Type Culture Collection ；Rockville, Md 获得。人骨髓瘤和小鼠人杂合骨髓瘤细胞系也被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor, J.1mmunol., 133:3001(1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, MarcelDekker, Inc., New York (1987)第 51-63 页)。
[0048]然后可测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对HER3或其所选的表位的单克隆抗体的存在。由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此类技术和测定在本领域中是已知的，并且进一步在 Harlow 和 Lane Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Publications, New York(1988)中描述。
[0049]在鉴定所需的杂交瘤细胞之后，该克隆可通过有限稀释或FACS分选方法进行亚克隆并且通过标准方法使其生长。适用于该目的的培养基包括，例如杜尔贝科氏改良伊格尔培养基和RPM1-1640介质。可选地，杂交瘤细胞可体内(如哺乳动物中的腹水)生长。
[0050]由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规免疫球蛋白纯化方法诸如例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲合色谱从培养基或腹水液分离或纯化。
[0051]单克隆抗体也可通过重组DNA方法诸如在美国专利N0.4，816，567中描述的方法来制备。可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠科动物抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码单克隆抗体的DNA并对其测序。杂交瘤细胞可用作此类DNA的优选来源。一旦被分离，则可将DNA置于表达载体中，其然后被转染至不另外生产免疫球蛋白的宿主细胞诸如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、浆细胞瘤细胞、或骨髓瘤细胞，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。也可例如通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域而不是同源性鼠科动物序列(美国专利N0.4，816，567)或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分的编码序列共价联接至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。可用此类非免疫球蛋白多肽取代本文提供的抗体的恒定结构域，或可用其来取代抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含一个对HER3具有特异性的抗原组合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原组合位点。
[0052]体外方法也适用于制备单价抗体。抗体生产其片段、特别是Fab片段的消化可使用本领域已知的常规技术来完成。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例在 W094/29348、美国专利 N0.4, 342, 566 以及 Harlow 和 Lane, Antibodies, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)中描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常生产两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个具有单个抗原结合位点)，和剩余的Fe片段。木瓜蛋白酶处理产生具有两个抗原组合位点的片段，称为F(ab’)2片段，并且仍能够交联抗原。
[0053]抗体消化中生产 的Fab片段也可含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链结构域的羧基端添加数个残基。F (ab’)2片段为包含两个通过在铰链区的二硫桥连接的Fab’片段的二价片段。Fab’ -SH在本文为其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游尚硫醇基的Fab’的名称。
[0054]生产包含所提供的抗体或片段的蛋白的一种方法是通过蛋白化学技术将两个或更多个肽或多肽连接在一起。例如，可使用目前可得的实验装置利用Fmoc (9-芴基甲基-氧基擬基)或 Boc (叔丁基氧基擬基)化学(Applied Biosystems, Inc.；Foster City, CA)化学合成肽或多肽。本领域技术人员容易地理解，对应于本文提供的抗体肽或多肽例如可通过标准化学反应来合成。例如，肽或多肽可被合成并且未从其合成树脂切割，而抗体的其它片段被合成并且随后从树脂切割，从而使被功能阻断的末端基团暴露于另一片段上。通过肽缩合反应，这两个片段可分别经由在其羧基和氨基末端的肽键被共价地联接，以形成抗体、或其片段(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, ff.H.Freeman 和 C0., N.Y.(1992) ;Bodansky M和 Trost B.编辑(1993) Principles of Peptide Synthesis.SpringerVerlag Inc.，NY)。可选地，可独立地体内合成肽或多肽。一旦被分离,这些独立的肽或多肽可被连接以经由类似的肽缩合反应形成抗体或其片段。
[0055]例如，克隆或合成肽区段的酶促连接可允许相对短的肽片段联接以生产较大的肽片段、多肽或整个蛋白结构域(Abrahmsen等人，Biochemistry, 30:4151 (1991))。可选地，可利用合成肽的天然化学连接以由较短的肽片段合成构建大的肽或多肽。该方法由两个步骤化学反应组成(Dawson 等人 Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science, 266:776779 (1994))。第一步骤是具有硫酯的未被保护的合成肽与含有氨基末端Cys残基的另一个未被保护的肽区段的化学选择性反应以得到作为初始共价产物的硫酯连接的中间体。如果没有反应条件的变化，则该中间体经受自发的快速分子间反应以在连接位点形成天然肽键。通过制备人白介素8(IL-8)阐述了该天然化学连接方法对蛋白分子全合成的应用(Baggiolini 等人，FEBS Lett.307:97-101 (1992) ;Clark 等人，J.Biol.Chem.269:16075 (1994) ;Clark 等人，Biochemistry30:3128 (1991) ;Rajarathnam 等人，Biochemistry33:6623-30(1994))。
[0056]可选地，可使未被保护的肽区段化学连接，其中由于化学连接而在肽区段之间形成的键为非天然(非肽)键(Schnolzer等人,Science256:221 (1992))。已使用该技术来合成蛋白结构域的类似物以及大量的具有完全生物活性的相对纯的蛋(deLisle等人，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press, New York,第 257-267 页(1992))。
[0057]所提供的片段或抗体多肽可以是通过克隆核酸获得的重组蛋白，所述核酸在能够生产多肽其片段的表达系统诸如细菌、腺病毒或杆状病毒表达系统中编码多肽。例如，可确定来自特异性杂交瘤的抗体的活性结构域，所述活性结构域可导致与抗体和HER3的相互作用相关的生物效应。例如，可在没有相应活性损失的情况下缺失发现未有助于抗体的活性或结合特异性或亲和性的氨基酸。
[0058] 所提供的片段，不管是否连接至其它序列，也可包括插入、缺失、取代、或选择的对特定区域或具体氨基酸残基的其它修饰，只要片段的活性相比于未修饰的抗体或表位未发生显著的改变或损害。这些修饰可提供一些附加性质，诸如以除去或添加能够发生二硫键合的氨基酸，以增加其生物寿命，以改变其分泌特征等。在任何情况下，片段可具有生物活性，诸如结合活性，调节在结合结构域的结合等。功能或活性区域可通过诱变蛋白的特异性区域，之后表达和测试所表达的多肽来鉴定。此类方法对于本领域的熟练从业人员容易显而易见的并且可包括编码抗原的核酸的位点特异性诱变(Zoller等人，Nucl.AcidsRes.10:6487-500(1982))。
[0059]本文进一步提供的是抗体的人源化或人形式。任选地，该抗体通过抑制HER3分子的活化来调节HER3分子的活性。任选地，人源化或人抗体包含具有与由公开的杂交瘤细胞系生产的抗体相同的表位特异性的抗体的至少一个互补决定区(CDR)。例如，该抗体可包含具有与由杂交瘤细胞系生产的抗体相同的表位特异性的抗体的所有CDR。
[0060]任选地，人源化或人抗体可包含由公开的杂交瘤细胞系生产的单克隆抗体的框架区的至少一个残基。人源化和人抗体可使用熟练技术人员已知的方法来制备；例如，人抗体可使用种系突变体动物或通过噬菌体展示文库来生产。
[0061]也可在其它物种中产生抗体并且被人源化用于向人施用。可选地，全人抗体也可通过使能够制备全人抗体的小鼠或其它物种免疫来制备(例如，进行基因修饰以生产人抗体的小鼠)以及筛选结合HER3的克隆。参见，例如Lonberg和Huszar, Int.Rev.1mmunol.13:65-93, (1995)，其通过引用以其整体并入本文用于生产全人抗体的方法。如本文所用，关于抗体的术语人源化和人涉及预期在人受试者中引发治疗耐受性的弱的免疫原性反应的任何抗体。因此，该术语包括全人源化或全人以及部分人源化或部分人。
[0062]非人(例如，鼠科动物)抗体的人源化形式为含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的CDR的残基被来自非人物种诸如小鼠、大鼠或兔(供者抗体)的具有所需的特异性、亲和性和容量的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体也 可包含既未在受者抗体中发现又未在输入的CDR或框架序列发现的残基。一般而言，人源化抗体包含基本上所有或至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳的是，人源化抗体也包含免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Jones等人,Nature, 321:522-525 (1986) ；Riechmann等人，Nature, 332:323-327 (1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol., 2:593-596 (1992))。
[0063]一般而言，人源化抗体具有一个或更多个从非人来源引入到其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。可基本上按照Jones 等人，Nature321:522-525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature332:323-327 (1988);或Verhoeyen等人，Science239:1534-1536 (1988)中描述的方法、通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实施人源化。因此，此类人源化抗体为嵌合抗体(美国专利N0.4，816，567)，其中基本上小于完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常为其中一些⑶R残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
[0064]可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠科动物抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码所提供的抗体的核苷酸序列并对其测序。也可例如通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域而不是同源性鼠科动物序列(参见美国专利N0.4，816，567)来修饰或人源化这些核苷酸序列。可在适当的宿主细胞中表达编码任何所提供的抗体的核苷酸序列。这些包括原核宿主细胞，其包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙门氏菌(Serratia marcesans)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。也可利用真核宿主细胞。这些包括但不限于酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris))、以及哺乳动物细胞诸如VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138细胞、BHK细胞、C0S-7细胞、293T细胞和MDCK细胞。由这些细胞生产的抗体可从培养基纯化并且通过利用本文所列的和本领域中标准的方法测定单克隆抗体的结合、活性、特异性或任何其它性质。
[0065]可采用在免疫后能够在缺少内源性免疫球蛋白生产下生产完全人抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已描述了嵌合和种系突变体小鼠中的抗体重链联接区(J(H))基因的纯化性缺失导致内源性抗体生产的完全抑制。此类种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将在抗原激发后导致人抗体的生产(参见例如 Jakobovits 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2551-5 (1993) ； Jakobovits 等人，Nature362:255-8 (1993) ;Bruggemann 等人，Year in Immun0.7:33 (1993))。人抗体也可在曬菌体展不文库中生产(Hoogenboom 等人,J.Mol.Biol., 227:381 (1991) ；Marks 等人,J.Mol.Biol.，222:581 (1991))。Cole等人和Boerner等人的用于制备人单克隆抗体的技术也是可得的(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss 编辑，第 77 页(1985) ；Boerner 等人，J.Tmmunol., 147 (I): 86-95 (1991))。
[0066]所提供的抗体或片段可被标记或与另一多肽或其片段融合。例如，所提供的抗体或其片段可与治疗剂融合。因此，结合HER3的抗体或其片段可与治疗剂连接。该连接可以是共价或非共价的(例如离子型)。治疗剂包括但不限于毒素类，所述毒素类包括但不限于植物和细菌毒素类、小分子、肽、多肽和蛋白。还提供了基因工程化的融合蛋白，其中编码抗体或其包括Fv区的片段的基因可与编码毒素的基因融合以将毒素递送至靶细胞。如本文所用，一个或多个 靶细胞为HER3阳性细胞。
[0067]治疗剂的其它实例包括化学治疗剂(包括小分子)、放射治疗剂和免疫治疗剂、以及其组合。用这种方式，递送至受试者的抗体复合物可以是多功能的，因为其通过与HER3结合而发挥一种治疗效应并且通过递送补充治疗剂而发挥第二治疗效应。
[0068]该治疗剂可细胞外起作用，例如通过引发或影响免疫响应，或其可细胞内起作用，直接通过易位穿过细胞膜或间接通过例如影响跨膜细胞信号传导。该治疗剂任选地可从抗体或片段切割。切割可以是自溶性，通过蛋白水解来实现，或通过使细胞与切割剂接触。
[0069]毒素类或毒素部分的实例包括白喉毒素、蓖麻毒素、链霉亲和素及其修饰。抗体或抗体片段可缀合至治疗剂部分诸如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括紫杉醇、顺钼、卡钼、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、放线菌素D、l_去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素或其同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨喋呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧唳、达卡巴嗪)、烷化剂(例如卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、(II) (DDP)顺钼)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
[0070]用于将此类治疗剂部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见例如Arnon等人，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等人(编辑)，第 243-56页(1985) ；Hellstrom 等人，Controlled Drug Delivery (第 2 版)，Robinson 等人(编辑)，第 623-53 页(1987) ；Thorpe, Monoclonal Antibodies ‘84:BiologicalAnd Clinical Applications, Pinchera 等人(编辑)，第 475-506 页(1985)；“Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy” 于 Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy, Baldwin 等人(编辑)，第 303-16 页(1985)中，和 Thorpe 等人，Immunol.Rev.62:119-58(1982) ο可选地，抗体可缀合至第二抗体以形成抗体杂合缀合物，如美国专利 N0.4，676，980 中描述。
[0071]本文提供的是HER3抗体、人源化HER3抗体、HER3抗体的重链和轻链免疫球蛋白、HER3抗体的CDR、 以及这些抗体或免疫球蛋白的执行全长抗体或免疫球蛋白的功能的某些截短或片段。例如，编码HER3抗体的核酸序列可以改变。正因如此，公开了编码多肽序列、变体及其片段的核酸。这些序列包括具体蛋白序列的所有简并序列，即具有编码一个特定蛋白序列的序列的所有核酸，以及编码所公开的蛋白序列的变体和衍生物的所有核酸(包括简并核酸)。因此，尽管每个特定核酸序列不可在本文写出，但是应理解，每个和每一个序列实际上在本文通过所公开的蛋白序列而被公开和描述。
[0072]关于所有肽、多肽和蛋白(包括其片段)，应理解HER3抗体的氨基酸序列中的另外修饰可发生，但不改变肽、多肽或蛋白的性质或功能。此类修饰包括保守性氨基酸取代并且在下文详细讨述。
[0073]本文提供的HER3抗体或片段具有所需的功能。HER3抗体或片段结合HER3蛋白的特异性表位。表位的结合可例如抑制HER3的磷酸化(自体磷酸化或配体诱导的磷酸化)。
[0074]本文所述的HER3抗体或片段可被进一步修饰并且改变，只要维持所需的功能。应理解，定义任何已知修饰和衍生物的一种方法或可在本文产生所公开的核酸序列和蛋白的方法是通过在特异性已知序列的同一性方面定义修饰和衍生物进行的。特异性公开的是与本文提供的HER3抗体或片段的多肽具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 百分比同一性的多肽。本领域技术人员容易理解如何确定两个多肽的同一性。例如，可在比对两个序列后计算同一性以使同一性处于其最高水平。
[0075]计算同一性的另一种方法可通过公布的算法来执行。用于比较的序列的最佳比对可通过 Smith 和 Waterman, Adv.App1.Math2:482 (1981)的本地同一性算法、通过Needleman和 ffunsch, J.Mol Biol.48:443 (1970)的同一性比对算法、通过 Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444 (1988)的相似性方法的研究、通过这些算法(在WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI 中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实施、或通过查验来进行。
[0076]针对核酸的相同类型的同一性可通过例如Zuker, Science244:48-52 (1989)；Jaeger 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:7706-7710 (1989) ； Jaeger 等人，MethodsEnzymol.183:281-306(1989)中公开的算法来获得，所述文献中关于至少与核酸比对相关的物质通过引用并入本文。应理解，通常可利用任何方法并且在某些情况下这些不同方法的结果可以是不同的，但是熟练技术人员理解如果用这些方法中的至少一种发现同一性，则据说序列具有所述的同一性并且在本文公开。
[0077]蛋白修饰包括氨基酸序列修饰。氨基酸序列中的修饰可由于基因变异(例如由于遗传多态性)而天然产生，可由于环境影响(例如暴露于紫外光)而产生、或可通过人介入(例如通过克隆DNA序列的诱变)诸如诱发点、缺失、插入和取代突变体而生成。这些修饰可导致氨基酸序列的变化，提供沉默突变，修饰限制位点，或提供其它特异性突变。氨基酸序列修饰通常属于三类修饰(取代修饰、插入修饰或缺失修饰)中的一种或多种。插入包括单个或多个氨基酸残基的氨基和/或末端融合以及序列内插入。插入通常为比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如约一个至四个残基。缺失的特征为从蛋白序列除去一个或多个氨基酸残基。通常，不超过约2至6个残基在蛋白分子内的任一个位点缺失。氨基酸取代通常具有单个残基，但可在多个不同位置同时发生；插入将为约I至10个氨基酸残基；而缺失将为约I至30个残基的范围。缺失或插入优选以相邻对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。可结合取代、缺失、插入或其任何组合以达到最终构建体。突变不能将该序列置于阅读框之外并且优选不产生可生成次级mRNA结构的补充区。取代修饰为其中至少一个残基已去除并且不同残基已插入其位置的修饰。此类取代一般根据下表1来进行并且被称为保守性取代。
[0078]表1:氨基酸取代
[0079]
【权利要求】
1.一种对HER3特异的抗体，其中所述抗体不阻断配体结合并且其中所述抗体阻断HER3的磷酸化。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述磷酸化不依赖于HER3的配体结合。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体在表达HER3的癌细胞中以低剂量体外阻断HER3的磷酸化。
4.如权利要求1所述的抗 体，其中所述抗体使阻断HER2和EGFR的磷酸化敏感。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有与以下抗体相同的表位特异性:所述抗体含有具有包含SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 5的多肽序列的轻链和具有包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 的多肽序列的重链。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体含有具有包含SEQID NO: 3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5的多肽序列的轻链和具有包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8的多肽序列的重链。
7.如权利要求6所述的抗体，其中所述轻链包含SEQID NO:1并且所述重链包含SEQ IDN0:2。
8.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-7中任一项所述的抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者被选择为具有HER3表达癌症。
10.如权利要求8所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断HER3的配体结合的抗体。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断HER2的配体结合的抗体。
12.如权利要求8-11所述的方法，进一步包括向所述受试者施用一种或多种化学治疗剂。
13.如权利要求8-11中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断EGFR的配体结合的抗体。
14.如权利要求8-11中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种酪氨酸激酶抑制剂选自由埃罗替尼和拉帕替尼组成的组。
16.一种预防或减轻受试者中对酪氨酸激酶抑制剂的抗性的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求O所述的HER3抗体。
17.如权利要求16所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断HER3配体结合的抗体。
18.一种预防或减轻受试者中对化学治疗剂的抗性的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求O所述的HER3抗体。
19.如权利要求18所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断HER3配体结合的抗体。
20.—种对HER3特异的抗体，其中所述抗体在表达HER3的癌细胞中以低剂量体外阻断HER3的配体结合。
21.如权利要求20所述的抗体，其中所述抗体具有与以下抗体相同的表位特异性:所述抗体含有具有包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的多肽序列的轻链和具有包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16的多肽序列的重链。
22.如权利要求20所述的抗体，其中所述抗体含有具有包含SEQID NO: 11、SEQ IDNO: 12和SEQ ID NO: 13的多肽序列的轻链和具有包含SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15和SEQ IDNO: 16的多肽序列的重链。
23.如权利要求20所述的抗体，其中所述轻链包含SEQID NO:9并且所述重链包含SEQID NO: 10。
24.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求20-23中任一项所述的抗体。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者被选择为具有HER3表达癌症。
26.如权利要求24所述的方法，进一步包括向所述受试者施用不阻断HER3的配体结合的抗体，其中所述阻断HER3的磷酸化。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断HER2的配体结合的抗体。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用阻断EGFR的配体结合的抗体。
29.如权利要求24 -27中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用一种或多种化学治疗剂。
30.如权利要求24-27中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用一种或多种酪氨酸激酶抑制剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种酪氨酸激酶抑制剂选自由埃罗替尼和拉帕替尼组成的组。
32.—种筛选阻断HER3的非配体依赖性磷酸化的试剂的方法，所述方法包括 (a)向HER3-表达细胞施用待测试的所述试剂；以及 (b)检测HER3磷酸化水平，其中与未处理的HER3-表达细胞或对照相比，HER3自体磷酸化的水平的降低指示阻断非配体依赖性磷酸化的试剂。
33.如权利要求32所述的方法，进一步包括向所述HER3-表达细胞施用HER3配体。
34.如权利要求33所述的方法，其中在待测试的所述试剂之前施用所述HER3配体。
35.一种试剂，通过如权利要求32-34中任一项所述的方法鉴定。
【文档编号】A61P35/00GK104011079SQ201280064525
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月9日
【发明者】T·周, 唐纳德·J·布奇斯鲍姆, 沈恩允, 陈宪 申请人:Uab研究基金会, 北京同为时代生物技术有限公司