长效降血糖融合蛋白的制作方法

长效降血糖融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明提供了重组的与人源免疫球蛋白亚型（IgG2）Fc段融合的人源胰高血糖素样肽-1（GLP-1）蛋白分子及其制备方法和用途。该融合蛋白质具有GLP-1的生物学活性，同时具有显著延长的体内半衰期。所述融合蛋白质可以用于治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖，以及通过降低血清葡萄糖、抑制胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它疾病。
【专利说明】长效降血糖融合蛋白

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体地属于治疗性生物大分子药物领域，更具体地，本 发明公开了一种融合蛋白及其制备方法和用途。

【背景技术】
[0002] II型糖尿病（Diabetes Mellitus II, DM II，胰岛素抵抗型糖尿病）患者占糖尿病 患者总数的90?95%，且每年以6%的数量递增。预计到2025年，全球II型糖尿病患者将达 到3. 8亿。目前，亚洲已是糖尿病患者最多的地区，全球糖尿病增长最快的国家是中国、印 度等发展中国家。最近一次中国的大型糖尿病流行病学调查是在2002年，在10万人中按 WHO 1999年公布的诊断标准，18岁以上人群患病率在城市和农村分别为4. 5%和1. 8%。中 国糖尿病患病率在过去20年中上升了近4倍。
[0003] 对于II型糖尿病的治疗，目前主要有胰岛素替代疗法(胰岛素、胰岛素类似物）和 口服化学类降糖药物(促胰岛素分泌剂磺脲类和格列奈类，可直接刺激胰岛素分泌；非促胰 岛素分泌剂双胍类、噻唑烷二酮类和a -糖苷酶抑制剂，双胍类药物主要减少肝脏葡萄糖 的输出，噻唑烷二酮类药物可改善胰岛素抵抗，a -糖苷酶抑制剂主要延缓碳水化合物在肠 道内的吸收）等。以上药物虽然能降低血糖，但是存在低血糖风险和体重增加的不良反应， 且会导致胰岛P细胞功能的进行性丧失（Nature. 2001;414:821-827)。
[0004] GLP-I (Glucagon Like Peptide-1，胰高血糖素样肽-1)作为肠促胰素之一， 其模拟生理状态降糖作用的"肠促胰素效应"针对糖尿病两大发病机制(胰岛素分泌不 足和胰岛素抵抗)，治疗机理独特，目前发达国家已将其列入二线治疗方案（Diabetes Care. 2009;32:193-203)。
[0005] GLP-I的促胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌作用具有血糖浓度依赖性，即当 血糖浓度高于正常时，GLP-I呈现促胰岛素分泌作用，而当血糖浓度正常时，GLP-I的促 胰岛素分泌作用减弱。因此，外源性GLP-I治疗不会由于过量而引起低血糖不良反应的 发生。这是GLP-I类似物优于其它促胰岛素分泌药物和胰岛素及其类似物的最显著特征 (Diabetologia. 1986;29:46-52)(J Clin Invest. 1993;91:301-307)(J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3717-3723)。
[0006] GLP-I通过与胰岛a细胞的受体结合，可控制餐后胰高血糖素的分泌；通过与 胰岛P细胞的作用，可促进P细胞增殖、抑制其凋亡、增加其对葡萄糖的敏感性，从而增 加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌；作用于肝脏，可减少肝糖原的输出；作用于胃，可延缓胃 排空，减少食物摄入；作用于下丘脑，可增加饱胀感，降低食欲，从而减轻体重（Diabetes Care. 2003;26:2929-2940) (Castroenterology. 2007;132:2131-2157) (Proc Natl Acad Sci.1982;79 (2):345-349) (Diabetologia.1996;39:1546-1553) (Endocrinology. 200 3;144:5149-5158) (Diabetes. 2002;51:5434-5442) (Diabetologia. 1993;36:741-744) (Lancet. 2002;359:824-830)〇
[0007] 此外，GLP-I可改善II型糖尿病患者的病理缺陷，保护胰岛@细胞和心血 管系统，同时具有保护神经的作用。因此，GLP-I可降低糖尿病患者并发症的产生， 其在低血糖、减轻体重、胰岛细胞保护和心血管保护方面的优势和综合作用，必定会 促进其未来在II型糖尿病治疗中的地位提升（Diabetes Care. 1998;21:1925-1931) (Diabetes Spectrum.2004;17:183-190) (Lancet.2006;368:1696-1705) (PLoS ONE. 2011;6(8):e23570)。
[0008] 天然的GLP-I在体内很容易被内源性DPP_4(Dipeptidyl peptidase-4,二肽基肽 酶-4)去除N末端组氨酸（His)和丙氨酸（Ala)残基而失活，半衰期不足2分钟，不具备成 药性。因此目前研究的药物都需要采取多种措施来克服这一难题。目前以GLP-I为靶标的 已上市或在研的药物主要有两大类：一类是可以抑制体内DPP-4降解作用的小分子药物； 另一类则是通过修饰天然GLP-I结构或寻找GLP-I类似物，在不损失其生物学作用的前提 下延长其半衰期（J Biol Chem. 1992;267:7402-7405) (Drug Dev Res. 2001;53:260-267) (Diabetes.2007;56:1475-1480) (Clin Ther. 2008;30:858-867) (Diabetes Obes Metab. 2008;10:82-90) (Curr Med Res Opin. 2008;24:275-286)。
[0009] 陆续成功上市或在研的GLP-I类似物、改构体、长效制剂或DPP-4抑制剂，其初衷 都是为了延长活性物质的体内半衰期。目前国内外研发的GLP-I及其类似物大多疗效相 近，区别主要在于作用时间和免疫原性。其中，第一个上市的GLP-I类似物为Eli Iilly的 Exenatide (艾塞那肽)，于2005年4月在美国上市，是美洲毒蜥蜴唾液来源的GLP-I类似 物，需一日两次皮下注射给药。随后上市的Liraglutide(利拉鲁肽)，为Novo Nordisk开发 的人源GLP-I改构体，于2009年4月在欧洲上市，2011年10月正式在中国上市，需一日一 次皮下注射给药。而与人免疫球蛋白IgG Fc部分结合的人源GLP-I改构体(如Eli Iilly 在研的Dulaglutide)利用了 IgG长循环半衰期的特点，可以达到一周一次给药，是目前同 类产品中最理想的产品（Diabetes Obes Metab. 2011; 13:302 - 312)。
[0010] 本发明涉及人源GLP-I的第7-37位氨基酸序列与人IgG Fe相结合的融合蛋白， 其较Dulaglutide不同之处在于,该融合蛋白中的人IgG Fc采用的是IgG2 Fc。从安全性 角度来看：
[0011] 1)来自人源的GLP-I多肽免疫原性低，长期使用不易产生抗体；
[0012] 2)某些亚类的IgG (如IgGl)的Fc段可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合， 发挥ADCC作用（Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity,抗体依赖细胞介导的细胞毒性 作用）和调理作用。人IgG2的Fc段与高亲和力Fc受体⑶64和低亲和力Fc受体⑶32和 ⑶16都没有结合能力，因此可降低其ADCC作用。
[0013] 综合以上两点，本发明的融合蛋白不仅可降低免疫原性，还可避免与GLP-I治疗 作用不相关的Fc段的效应子功能。
[0014] 新生儿Fc受体（FcRn)能够延长血液中IgG的半衰期，维持血液循环中高水平的 IgG浓度，保持抗体水平的动态平衡。FcRn在正常成人表达于血管内皮细胞，能与IgG的Fc 段结合。血管内皮是FcRn保护IgG不受分解代谢的重要场所。FcRn依赖细胞内陷作用， 不仅从细胞外酸性环境中吸收IgG，而且在细胞内参与IgG循环和稳态调节。生理状态下， 当血清中IgG浓度低于正常时，更多的FcRn与Fc结合，IgG降解减少，使得IgG浓度得以 维持；当血清中IgG浓度高于正常时，内皮细胞表面的FcRn已经饱和，不能继续结合更多的 IgG,从而造成IgG降解加强，血清IgG浓度下降。利用FcRn与Fc结合保护含Fc蛋白不受 降解，可借以维持融合蛋白在血浆中的较高浓度的动态平衡，从而延长该蛋白的体内半衰 期。
[0015] 本发明利用了免疫球蛋白IgG特有的清除缓慢的代谢途径，采取将人源GLP-I多 肽与人免疫球蛋白IgG2的Fc段融合表达的方法，制成融合蛋白，在保留GLP-I生物学活性 的同时，使GLP-I的体内半衰期接近IgG的体内半衰期。
[0016] 该融合蛋白皮下注射可以吸收，由于较长的体内半衰期（IgG2类型的Fc段，其体 内半衰期较 IgG4 和 IgGl 类型的 Fc 段更长）（Nature Biotechnology. 2007; 25 (12) : 1369 - 1372)，可支持每1-2周一次皮下注射给药，并长时间维持体内有效血药浓度，减少了患 者必须接受频繁注射给药的痛苦，提高了治疗的依从性，并能降低治疗成本。
[0017] 尽管此途径对于GLP-I疗法是可行的，但是融合蛋白质长时期反复使用会产生抗 体，而糖尿病患者一经确诊必须终生接受治疗，如果所述融合蛋白的Fc段保留了不需要的 效应子功能，GLP-I-Fc融合蛋白质疗法可能有安全方面的顾虑。本发明尝试克服与使用 GLP-I-Fc融合物相关的关于潜在免疫原性和效应子活性的问题，本发明的融合蛋白质在 GLP-I部分和Fc部分中具有多个氨基酸残基的替换，此替换提供了更大的潜能以增加体内 稳定性，降低免疫原性并消除效应子功能。


【发明内容】

[0018] 本发明提供了重组的人源胰高血糖素样肽-I (GLP-I)的第7-37位氨基酸序列与 人源免疫球蛋白亚型（IgG2)的Fc段融合的蛋白分子及其制备方法和用途，所述GLP-I的C 末端通过富含甘氨酸（Gly)的肽接头（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-G ly-Gly-Gly-Ser，SEQ ID勵:11)与1§62?(：段连接。所述融合蛋白质具有61^-1的生物学 活性，同时具有显著延长的体内半衰期。所述融合蛋白质可以用于治疗和/或预防II型糖 尿病、肥胖，以及通过降低血清葡萄糖、抑制胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它 疾病。
[0019] 本发明利用基因工程技术构建了 GLP-I与IgG2 Fc部分融合的融合蛋白，具体地， 本发明公开了：
[0020] 1. -种融合蛋白，其由胰高血糖素样肽-1的C末端通过肽接头与IgG2 Fc部分的 N末端融合而成，所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6 所示。
[0021] 2. -种编码如1所述融合蛋白的基因，在一个实施方案中，所述基因的核苷酸序 列如 SEQ ID NO: 1 或 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 所示。
[0022] 3. -种制备如1所述融合蛋白的方法，其包括：
[0023] a.构建如上述2所述的基因；
[0024] b.将步骤a所述基因克隆至真核表达载体，得到可表达如上述1所述融合蛋白的 真核表达载体；
[0025] c.用步骤b所述表达载体转染细胞，使其表达所述重组融合蛋白，然后分离纯化 得到所述重组蛋白。
[0026] 4. 一种制剂，其含有如1所述融合蛋白作为其活性成分，其还可以含有一种或多 种本领域所熟知的可药用载体。
[0027] 5.如上述1所述融合蛋白或含有其的制剂在制备用于治疗和/或预防II型糖尿 病、肥胖以及通过降低血清葡萄糖、抑制胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它疾 病的药物中的用途。
[0028] 在一个实施方案中，将编码本发明所述融合蛋白的基因克隆到真核表达载体293。
[0029] 在一个实施方案中，用包含编码本发明所述融合蛋白的基因的真核表达载体转染 FreeStyle 293F细胞，从而使其表达本发明所述融合蛋白。

【专利附图】

【附图说明】
[0030] 图1显示了用于本发明所述融合蛋白表达的重组真核表达载体 293-GLP-l-Fc(IgG2)的结构，三种融合蛋白（GLP-l-Fc-l、GLP-l-Fc-2 和 GLP-l-Fc-3)重组 真核表达载体结构在基因插入位点上相同。
[0031] 图2A显示了表达载体293经EcoR I、BamH I双酶消化线性化后的片段和编码所 述融合蛋白GLP-I-Fc-I的基因片段自pGEM-T质粒载体（由捷瑞合成）上酶切后的DNA琼 脂糖电泳图；图2B显示了经聚合酶链反应（PCR)获得的编码所述融合蛋白GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3的基因片段；图2C和图2D分别显示了构建完成的编码三种所述融合蛋白的 293表达载体经EcoR I、BamH I双酶消化后鉴定的DNA琼脂糖电泳图。
[0032] 图3A显示了所述三种融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)图；图3B显示 了所述三种融合蛋白的免疫印迹（Western-blot)检测结果图。
[0033] 图4显示了所述三种融合蛋白在P -TC-6细胞上的结合实验结果图。
[0034] 图5显示了所述三种融合蛋白促进e -TC-6细胞内cAMP (腺苷-3'，5'-环化 一磷酸）释放的实验结果图。
[0035] 图6显示了所述三种融合蛋白促进P -TC-6细胞分泌胰岛素的实验结果图。
[0036] 图7A和图7B分别显示了所述三种融合蛋白在高葡萄糖灌注大鼠模型中升高血清 胰岛素水平的实验结果图。
[0037] 图8显示了所述三种融合蛋白与FcRn蛋白结合的实验结果图。
[0038] 图9显示了所述三种融合蛋白与Fe Y R III a (⑶16a)蛋白结合的实验结果图。

【具体实施方式】
[0039] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员 的通常理解具有相同的含义。
[0040] 在一个实施方案中，产生本发明所述融合蛋白的具体技术解决方案如下：
[0041] -、构建编码本发明融合蛋白的表达载体
[0042] 根据文献公开的 GLP-I (7-37)序列（Diabetes Metab Res Rev. 2010;26:287 -296.)和Pubmed上公开的IgG2型Fe序列（AJ250170)，本发明人合成了编码人 GLP-I (7-37)、编码15个氨基酸肽接头以及编码IgG2型Fc的cDNA序列。将所述cDNA中 对应于所述人GLP-I (7-37) C末端的基因序列通过所述肽接头基因序列与编码人IgG2型 Fc部分的基因相连接，从而得到编码本发明所述融合蛋白的融合基因序列。发明人对所 述GLP-I (7-37)氨基酸序列进行了修饰，其中第8位氨基酸由丙氨酸(Ala)替换为甘氨酸 (Gly)，第22位氨基酸由甘氨酸（Gly)替换为谷氨酸（Glu)，第36位氨基酸由精氨酸(Arg) 替换为甘氨酸(Gly)。
[0043] 本发明所述融合蛋白中人IgG2型Fe部分的氨基酸序列有三种不同修饰形 式，从而对应三个不同序列的融合蛋白，本文中分别称为GLP-l-Fc-1、GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3,其对应的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所 示，其对应的基因序列分别如SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。其中在 GLP-I-Fc-I的氨基酸序列（SEQ ID N0:4)中，第1-19位为分泌信号肽序列（分泌信号肽指 通常出现在较大多肽N末端区域的氨基酸序列，其功能是启动所述多肽与细胞内质网的结 合以及该多肽通过质膜分泌)，第20-50位为GLP-I (7-37)序列，第51-65位为肽接头序列， 第 66-288 位为 IgG2 的 Fe 序列（其铰链区为 VECPPCP，SEQ ID NO: 12);在 GLP-l-Fc-2 的氨 基酸序列（SEQ ID N0:5)中，第1-19位为信号肽序列，第20-50位为GLP-I (7-37)序列，第 51-65位为肽接头序列，第66-292位为IgG2的Fe序列（其铰链区为ERKCCVECPPCP(SEQ ID N0:13)，且C端去除K);在GLP-l-Fc-3的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)中，第1-19位为信号 肽序列，第20-50位为GLP-I (7-37)序列，第51-65位为肽接头序列，第66-287位为IgG2的 Fe序列(其铰链区为VECPPCP(SEQ ID N0:12)，且C端去除K)。在GLP-I-Fc-I的基因序列 (SEQ ID NO: 1)中，第1-57位为信号肽基因序列，第58-150位为GLP-I (7-37)基因序列， 第151-195位为肽接头基因序列，第196-864位为IgG2 Fe基因序列；在GLP-l-Fc-2的基 因序列（SEQ ID N0:2)中，第1-57位为信号肽基因序列，第58-150位为GLP-I (7-37)基因 序列，第151-195位为肽接头基因序列，第196-876位为IgG2 Fe基因序列；在GLP-l-Fc-3 的基因序列（SEQ ID NO: 3)中，第1-57位为信号肽基因序列，第58-150位为GLP-I (7-37) 基因序列，第151-195位为肽接头基因序列，第196-861位为IgG2的Fe基因序列。
[0044] 在获得如上编码所述融合蛋白的三个融合基因后，采用分子克隆技术，进一步将 上述融合基因克隆至真核表达载体293,构建真核表达载体293-GLP-l-Fc (IgG2)。
[0045] 对于本发明，可以使用任何合适的真核表达载体。
[0046] 二、表达本发明融合蛋白的一般方法
[0047] 用如上所述获得的表达载体293-GLP-l-Fc(IgG2)转染宿主真核细胞FreeStyle 293F，使其产生融合蛋白。用重组DNA转染宿主细胞的技术是本领域熟知的。
[0048] 三、收获并纯化重组产生的融合蛋白
[0049] 三个亚类的IgG (IgGl，IgG2和IgG4)的非抗原结合部分，即Fe段，可与葡萄球菌 蛋白A (Staphylococci Protein A, SPA)结合，借此可纯化上述亚类的抗体或含相应亚类 Fe段的融合蛋白，为其工业化制备提供便利纯化方法。用Protein A亲和柱分离纯化得到 Fe融合蛋白。通过SDS-PAGE及Western-blot鉴定融合蛋白。
[0050] 四、本发明所述融合蛋白的体内外活性检测
[0051] (一）本发明所述融合蛋白在体外与小鼠 P胰腺瘤细胞结合活性检测
[0052] 用融合蛋白与GLP-I受体（GLP-IR)阳性的小鼠 P胰腺瘤细胞P -TC-6进行直接 结合活性的检测（方法参考PLoS ONE. 2010; 5(9) :el2734)，结果显示本发明的融合蛋白与 细胞上GLP-IR的结合呈现特异性的浓度梯度依赖性的增加。本结果提示，本发明所述与Fe 融合的GLP-I可与细胞表面的相应受体特异性地结合。
[0053] (二）本发明所述融合蛋白在体外对cAMP水平的影响
[0054] 将本发明的融合蛋白加入到@ -TC-6细胞中，按文献所述方法 (Diabetes. 2004;53:2492-2500)测定cAMP水平，结果显示本发明的融合蛋白在体外引起 cAMP水平升高，效果与利拉鲁肽相当。本结果提示，在与细胞表面相应受体结合以后，本发 明所述与Fc融合的GLP-I可激活该受体介导的细胞内信号传递。
[0055] (三）本发明所述融合蛋白在体外对小鼠 P胰腺瘤细胞胰岛素分泌水平的影响
[0056] 将本发明的融合蛋白加入到P-TC-6细胞中，按文献所述方法（Shi-Ying Ding, et al. JBC. 2011; 286 (19) :16768-16774, PLoS ONE. 2010; 5(9) :el2734)测定细胞分泌胰岛素 的水平，结果显示在低浓度葡萄糖的培养基中，本发明所述的三种融合蛋白或利拉鲁肽对 小鼠 P胰腺瘤细胞P-TC-6的促胰岛素分泌作用不明显；而在含高浓度葡萄糖的培养基 中，浓度为3、30、300和IOOOnM的三种融合蛋白均可不同程度地显著增加 P -TC-6细胞的 胰岛素分泌水平，其效果与利拉鲁肽相当，均呈现出浓度梯度依赖性的增加。
[0057] (四）本发明所述融合蛋白对高糖灌注下大鼠血清中胰岛素水平的影响
[0058] 根据文献所述（Diabetes Metab Res Rev. 2010; 26:287-296) (Diabetes. 2004; 53:2492-2500),用正常 SD (Sprague-Dawley)大鼠建立高糖灌注模型以 测定药物促进血清中胰岛素水平升高的方法，为检测GLP-I类促胰岛素药物常用的药效检 测方法。本发明即利用该模型，给SD大鼠皮下注射本发明的融合蛋白（3nM/kg)或利拉鲁 肽（3nM/kg，阳性对照）或生理盐水（阴性对照)，禁食过夜（16-18h)后依次静脉持续灌注生 理盐水20分钟、低浓度葡萄糖（50mg/kg/min)30分钟、高浓度葡萄糖（150mg/kg/min)30分 钟。以生理盐水灌注结束的时间点为0点，分别在_20、0、30和60分钟时采血。结果显示， 在皮下注射生理盐水的健康大鼠组中，静脉灌注生理盐水或低浓度葡萄糖后，与无静脉灌 注组相比，血清胰岛素水平无明显升高，而在静脉灌注高浓度葡萄糖后，血清胰岛素水平显 著升高。在给予皮下注射本发明的三种融合蛋白或利拉鲁肽的健康大鼠组中，对其静脉灌 注生理盐水依然不能诱导血清胰岛素水平升高，而在低浓度和高浓度葡萄糖静脉灌注后， 血清胰岛素水平均比皮下注射生理盐水组相应浓度葡萄糖灌注所诱导的胰岛素水平有不 同程度的升高。实验动物体内这种葡萄糖浓度依赖性的促胰岛素分泌作用，提示本发明的 GLP-I (7-37)与Fc融合的蛋白皮下注射可吸收，且能够发挥与利拉鲁肽相同的药理作用。 [0059](五）本发明所述融合蛋白与新生儿受体（FcRn)蛋白结合能力的检测
[0060]按文献所述方法（The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276 (9) : 6591 - 6 604)，将本发明的融合蛋白包被于酶标板上，加入His标记的FcRn蛋白，在酸性（pH=6. 0)条 件下孵育，用鼠源抗His单抗和辣根过氧化酶（HRP)标记的羊抗鼠抗体（Goat anti-human IgG-HRP)检测结合于所述融合蛋白上的FcRn。结果显示，与IgGl型对照抗体的Fe段相 t匕，本发明融合蛋白的Fc段具有与IgGl相当的结合FcRn的能力。由于在血管内皮细胞上 FcRn介导的含Fc段蛋白的细胞内吞和循环能维持血清中该蛋白浓度的稳态，本实验结果 提示所述GLP-I-Fc融合蛋白的体内半衰期可能与IgGl型抗体相当，远高于利拉鲁肽(需一 天注射一次),将达到1-2周注射一次的频率。
[0061](六）本发明所述融合蛋白的效应子活性检测
[0062]按文献所述方法（Angiogenes i s. 2004 ; 7 : 335-345，Cancer Res. 2010:4481-4489)，将Fe Y Rma (CD16a)蛋白包被于酶标板上，将本发明的融合蛋白加 入板中，检测其与Fe Y RIIIa (⑶16a)蛋白的结合能力。结果显示，与IgGl型对照抗体的Fc 段相比，本发明融合蛋白的Fc段与Fe Y RIIla (CD 16a)蛋白的结合能力极低，从而可避免其 Fe段的效应子功能(如ADCC)。
[0063] 如上所述，体外及体内生物学活性的检测结果表明，本发明制备的三种融合蛋白 不仅具有GLP-I (7-37)多肽正常的生物学活性，其生物半衰期较GLP-I (7-37)多肽明显 延长，而且其Fe段的效应子功能低，不会发生与治疗目的不相关的效应子功能，使药物的 使用更安全。
[0064] 本发明的积极效果在于：融合蛋白中GLP-I (7-37)可保持其天然功能，人IgG2型 Fe部分则能够延长其半衰期，而且有利于融合蛋白的纯化，同时不引起与治疗作用不相关 的效应子作用。
[0065] 本发明中融合蛋白半衰期延长的原因如下：
[0066] DGLP-I (7-37)部分的第8位氨基酸由丙氨酸(Ala)替换为甘氨酸（Gly)，可降低 DPP-4对其的降解，从而延长半衰期。
[0067] 2)所述融合蛋白的Fe部分可与FcRn结合，从而使该融合蛋白的半衰期与IgGl型 和IgG2型抗体相当。
[0068] 下列实施例用于帮助描述如何实施本发明的各实施方案。这些实施例是为了举例 说明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
[0069] 实施例1本发明所述融合蛋白表达载体的构建
[0070] 编码本发明所述融合蛋白GLP-I-Fc-I的基因 （SEQ ID NO: 1)由上海捷瑞生物工 程有限公司合成并克隆至PGEM-T质粒载体，该基因5'端含有EcoR I、Not I、Hind III酶 切位点，3'端含有TGA终止密码子和Pme I、Xho I、BamH I酶切位点，将所述pGEM-T质粒 载体命名为GLP_l_Fc_l _T。
[0071] 用EcoR I和BamH I (购自NEB公司）按照说明书对GLP-I-Fc-I-T进行双酶消化 (37°C，4小时)，1%琼脂糖凝胶电泳（图2A)显示，双酶消化后产生长度为950bp左右的编码 GLP-I-Fc-I融合蛋白的基因片段和长度为3000bp左右的pGEM-T质粒载体片段。使用胶 回收试剂盒按照说明书说明回收基因片段GLP-I-Fc-I (胶回收试剂盒购自Axygen公司）。 同时将 293 表达载体（FreeStyle MAX293Expression System，K900-20,购自 Invitrogen 公 司）用EcoR I和BamH I双酶消化（37°C，4小时)。图2A示出了双酶消化后长度为4300bp 左右的293-EcoR I/BamH I片段，使用上述胶回收试剂盒回收该片段。
[0072] 将上述酶切获得的两个基因片段GLP-I-Fc-I和293-EcoRI/BamHI用T4DNA连 接酶(购自NEB公司）进行连接（16°C，16小时)，连接产物使用热休克法转化到大肠杆菌中 (42 °C，90秒)，铺板(Amp+LB培养基，即氨苄抗性的Lur ia-Bertan i培养基)，挑取克隆并提取 质粒。将质粒用EcoR I/BamH I双酶消化（37°C，2小时)进行鉴定筛选，筛选得到的阳性克 隆即含有构建成功的真核表达载体293-GLP-l-Fc-l (如图2C所示)。
[0073] 以GLP-I-Fc-I-T质粒为模板，分别以1，2和3, 4为引物，经聚合酶链反应（PCR)扩 增获得GLP-l-Fc-2对应基因的两段中间产物；再以所述两段中间产物为模板，1，4为引物， 经overlap-PCR (重叠 PCR)扩增获得GLP-l-Fc-2的基因片段。
[0074] 以GLP-I-Fc-I-T质粒为模板，1，4为引物，经PCR扩增获得GLP-l-Fc-3的基因片 段。
[0075] PCR引物如下：
[0076] L 5, -GCGGCCGCGAATTCATGGAGTTGGGACTGTCTTG-3' （SEQ ID N0:7)
[0077] 2. 5'-CCACCGCCACCGTCGCTCGCGTTTACAACACAGCTC-3'（SEQ ID N0:8)
[0078] 3. 5,-GGTGGCGGTGGCAGCGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGC-3，（SEQ ID N0:9)
[0079] 4. 5,-GTTTAAACGGATCCTCAACCCGGAGACAGGGAGAG-3'（SEQ ID N0:10)
[0080] 图2B显示的分别是长度均为950bp左右的编码GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3融合 蛋白的基因片段。使用上述方法回收基因片段GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3,用EcoR I和 BamH I双酶消化（37°C，4小时)，与同样用EcoR I和BamH I双酶消化（37°C，4小时）后的 293-EcoR I/BamH I片段用T4DNA连接酶连接（16°C，16小时)，将连接产物使用热休克法转 化大肠杆菌（42°C，90秒)，铺板(Amp +LB培养基)，挑取克隆并提取质粒。将质粒用EcoR 1/ BamH I双酶消化（37°C，2小时）进行鉴定筛选，筛选得到的阳性克隆即分别含有构建成功 的真核表达载体293-GLP-1-FC-2和293-GLP-1-FC-3 (如图2D所示)。
[0081] 图1为构建成功的融合蛋白表达载体293-GLP-l-Fc (IgG2)的基因结构图。 293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-1-FC-2 和 293-GLP-1-FC-3 三种表达载体的基因结构相同， 不同的是在EcoR I和BamH I酶切位点之间950bp左右的基因分别编码GLP-I-Fc-I、 GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3融合蛋白，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO: 3所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6 所示。图2C和图2D的结果则分别显示了真核表达载体293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-l-Fc-2 和293-GLP-l-Fc-3经EcoR I/BamH I双酶消化后鉴定的结果，其在950bp和4300bp左右 处分别有正确的融合蛋白基因片段和293-EcoR I/BamH I片段。
[0082] 实施例2本发明所述融合蛋白的表达
[0083] 实施例1中所构建的重组表达载体293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-l-Fc-2和 293-GLP-1-FC-3 的表达，可采用瞬时转染 FreeStyle293F 细胞（R790-07,购自 Invitrogen 公司）的方法。转染前24小时，将FreeStyle293F细胞按6 X IO5个细胞/毫升（ml)传代，于 恒温摇床135转，37°C，8%C02条件下培养，使得转染当天的细胞密度约为1. 2?I. 5 X IO6/ ml。用FreeStyle293F培养基（12338-018,购自Invitrogen公司）稀释细胞，至密度为 I X IOfVml。为确保最佳转染效果，细胞活力应大于95%。
[0084] 将转染用试剂FreeStyle Max Reagent( 16447-500,购自 Invitrogen 公司）轻度颠 倒混匀4次。在转染用培养液OptiPRO SFM (12309-050,购自Invitrogen公司）中分别加 入 625 ii g293-GLP-l-Fc-l 或 293-GLP-1-FC-2 或 293-GLP-1-FC-3 载体质粒，并用 OptiPRO SFM补充体积至IOml,混勻。另取一支离心管，用OptiPRO SFM稀释625 u I FreeStyleMax Reagent至IOml,轻度颠倒混勻。将稀释的质粒和稀释的FreeStyle Max Reagent混勻，室 温孵育15分钟。缓慢将20ml混合液加入装有500ml FreeStyle293F培养基的摇瓶中。摇 瓶于恒温摇床培养7天（135转，37°C，8%C0 2)。
[0085] 7天后，将分别表达GLP-I-Fc-I或GLP-l-Fc-2或GLP-l-Fc-3三种融合蛋白的细 胞用冷冻离心机以9000转/分的速度离心20分钟，收集上清液进行下一步蛋白纯化。
[0086] 实施例3本发明所述融合蛋白的纯化
[0087] 将上述实施例2获得的分别含本发明的三种融合蛋白的FreeStyle293F细 胞上清液，在AKTA仪器（购自GE Healthcare Bio-Sciences公司）上过Protein A柱 (71-5000-09AD，购自GE Healthcare Bio-Sciences公司），分别捕获三种融合蛋白，用 50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（PH=3. 3)洗脱，分别收集洗脱物(各约0. 5ml)，在其中加 入100 iillM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（TriS-HCL)缓冲液（PH=ILO)中和至中性。经 0D280nm测定各自的蛋白含量后，分别经IOK透析膜在磷酸盐缓冲液PBS (0. OlM Na2HPO4 .12H20+0. 002M KH2P04P+0. 14M NaCl+0. 002M KC1，PH=7. 2)中透析，经 0? 22 ii m 滤器(购自 Millipore公司）过滤除菌后-80°C保存。
[0088] 实施例4本发明所述融合蛋白的SDS-PAGE和Western-blot检测
[0089] 纯化后的三种融合蛋白经50mM DTT (二硫苏糖醇，DL-Dithiothreitol)还原 后用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度和分子量大小，同时通过Western-blot进一 步鉴定其性质和分子量。将电泳后的胶通过电转移方法（300mA，80分钟）转移至PVDF (Polyvinylidene Fluoride,聚偏氟乙烯）膜上，将膜用10%脱脂奶粉封闭后加入Iii g/ml 抗人GLP-I (7-37)鼠单抗(购自BioPorto公司），4°C孵育过夜，PBST (含0.02%吐温-20 的PBS缓冲液）洗两遍，加入HRP标记的羊抗鼠 IgG (H+L)抗体（I ii g/ml，购自R&D公司）， 室温孵育45分钟后再用PBST洗两遍，最后用电化学发光法（Electrochemiluminescence， ECL)显色。聚丙烯酰胺凝胶电泳（图3A)和Western-blot (图3B)的结果均显示，在还原条 件下，所述的三种融合蛋白GLP-l-Fc-1、GLP-l-Fc-2、GLP-l-Fc-3均呈现分子量为约40KDa 的条带，与所述融合蛋白的理论分子量一致。这些结果表明，本发明所构建的三种融合蛋 白，其结构和性质均正确。
[0090] 实施例5本发明所述融合蛋白体外结合P -TC-6细胞的活性测定
[0091] 收集小鼠 P胰腺瘤细胞P-TC-6 (购自ATCC) 8. 5 X IO6个，离心后用8.5ml固定 液（IC Fixation buffer,购自Invitrogen公司）固定（4°C，10分钟）。再次离心后用3.4ml PBS重悬，以2.5X10 5/孔（IOOiil)接种于96孔U型板。同时分别将本发明的三种融合蛋 白各从500 ii g/ml开始，用PBS进行4倍比稀释共10个梯度。
[0092] 96孔U型板的细胞经离心后弃上清，按照100 iil/孔加入稀释后的融合蛋白，4°C 孵育1小时。再次将细胞离心，弃上清，用200 iil/孔PBS洗涤两次，加入I ii g/ml( 100 iil/ 孔)HRP标记的羊抗人抗体IgG (购自Bethyl laboratories公司)，并在4°C孵育45分钟。 细胞离心后，用200 iil/孔PBS洗涤三次，加入100 iil/孔显色液(底物缓冲液9ml+底物显 色液lml+0. 3%H202溶液10 iil，其中底物缓冲液为0. 02M柠檬酸+0. OlM Na2HPO4. 12H20,底 物显色液为2mg/ml的TMB，即3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)，室温孵育15分钟显色后加入 50 iil/孔终止液（1M硫酸)，在M5多功能酶标仪(购自Molecular Devices公司)450/570nm 波长下读出吸光值，结果在图4示出。
[0093] 如图4所示，本发明的三种融合蛋白GLP-l-Fc-l、GLP-l-Fc-2和GLP-l-Fc-3均与 3 -TC-6细胞表面的GLP-IR呈现特异性的结合活性。
[0094] 实施例6本发明所述融合蛋白在体外对P -TC-6细胞cAMP水平的影响
[0095] P-TC-6细胞以IXlO4/孔（5 iil/孔，无血清不含葡萄糖的DMEM培 养基，购自Gibco公司）接种于384孔板，加入含5000 ii M cAMP抑制剂IBMX (3-isobutyl-l_methylxanthine，3-异丁基-1-甲基黄噪呤，购自Sigma公司）的无血清不 含葡萄糖的DMEM培养基5 iil/孔(使IBMX终浓度为2500 ii M)，使所述细胞在37 °C孵箱饥 饿4-5小时。
[0096] 将384孔板以800转/分钟离心1分钟，弃5 iil/孔上清后，加入250mM葡萄糖及 25mM IBMX各I iil/孔，再分别加入本发明的三种融合蛋白和对照药物利拉鲁肽(购自Novo Nordisk公司）各I iil/孔，使三种融合蛋白和利拉鲁肽的终浓度均为2、10、50和250nM四 个浓度，以不加蛋白或加入利拉鲁肽的组（OnM)为对照，最后加入I iU/孔无血清不含葡萄 糖的DMEM培养基，轻摇384孔板混匀，室温作用30分钟。
[0097] 根据cAMP检测试剂盒（dynamic2Kit，购自Cisbio公司）的实验步骤设立对照及 标准曲线，M5多功能酶标仪读数（Flu668/620nm)，结果在图5示出。
[0098] 图5的结果显示，不同浓度的本发明的三种序列的融合蛋白在体外均可不同程度 地升高小鼠 P胰腺瘤细胞P-TC-6内的cAMP水平，其效果与利拉鲁肽相当，均呈现出浓度 梯度依赖性的增加。本结果提示，继与细胞表面相应受体结合以后，与Fc融合的GLP-I可 激活该受体介导的细胞内信号传递。
[0099] 实施例7本发明所述融合蛋白在体外对P -TC-6细胞胰岛素分泌水平的影响
[0100] 将培养在含10%FBS(胎牛血清，购自Gibco公司）的DMEM培养基中的P-TC-6细胞 以2. 5X105/孔（500 ill)接种于24孔板，37°C培养过夜。弃上清，用Krebs-Ringer Buffer (KRB 缓冲液，125mM NaCl+5.9mM KCl+1.28mM CaCl2+1.2mM MgCl2+25mM HEPES+0.1%BSA， pH7. 4)洗涤一次后再加入KRB缓冲液，37°C饥饿细胞2小时。弃上清，分别加入不同浓度 的所述三种融合蛋白和对照药物利拉鲁肽，使四种样品的终浓度均为〇、3、30、300、IOOOnM 四种(稀释液均为KRB缓冲液+16. 8mM葡萄糖)，以不加所述四种样品的低浓度葡萄糖组(含 KRB缓冲液+2. 8mM葡萄糖）作为阴性对照组（neg)，37°C作用1小时。
[0101] 根据胰岛素检测试剂盒（Insulin Kit,购自Cisbio公司）的实验步骤设立对照及 标准曲线。胰岛素标准品的初始浓度为20ng/ml，以二倍比稀释7个梯度，同时用KRB缓冲 液稀释样品(所述细胞上清）至〇?20ng/ml (稀释10倍)，分别取10 ill的KRB缓冲液、稀 释的标准品、稀释的样品加至384孔板中，再分别加入5 iU/孔两种荧光标记的抗体抗胰岛 素 Ab-cryptate和抗膜岛素 Ab_XL665 (均来自Insulin Kit，购自Cisbio公司），轻摇384 孔板混匀，室温孵育2小时。M5多功能酶标仪读数(波长1 :激发/发射=314nm/668nm ;波 长 2 :激发 / 发射=314nm/620nm)。
[0102] 数据处理如下：比值（Ratio) =A668nm/A620nmX 104，Deta F=(标准品或样品比 值-KRB比值）/KRB比值，绘制标准曲线，并计算出样品胰岛素的值。
[0103] 图6的结果显示，在体外普通细胞培养基(结果未显示）或含低浓度葡萄糖 (2. 8mM)的培养基中（neg)，本发明所述的三种融合蛋白或利拉鲁肽对小鼠 P胰腺瘤细胞 3 -TC-6的促胰岛素分泌作用不明显（以此为对照）；而在含高浓度葡萄糖（16. 8mM)的培养 基中，不含样品的阴性对照组（〇. 〇)对0 -TC-6细胞的促胰岛素分泌作用有所增加，3、30、 300、IOOOnM的三种融合蛋白则均可不同程度地显著升高P -TC-6细胞的胰岛素分泌水平， 其效果与利拉鲁肽相当，均呈现出浓度梯度依赖性的增加。本结果提示，与Fc融合的GLP-I 激活细胞表面相应受体的最终效应为葡萄糖浓度依赖性地促进胰岛素的分泌。
[0104] 实施例8本发明所述融合蛋白对高糖灌注下大鼠血清中胰岛素水平的影响
[0105] 给SD (Sprague-Dawley)大鼠皮下注射本发明的三种融合蛋白（3nM/kg)或利拉 鲁肽（3nM/kg)或生理盐水（阴性对照)，禁食过夜（16-18h)后依次静脉持续灌注生理盐水 20分钟、低浓度葡萄糖（50mg/kg/min)30分钟、高浓度葡萄糖（150mg/kg/min)30分钟。以 生理盐水灌注结束的时间点为0点，分别在_20、0、30和60分钟时采血。将血液以4000 转/分钟离心10分钟，分离血清，用文献（Diabetes Metab Res Rev. 2010;26:287-296) (Diabetes. 2004;53:2492-2500)所述方法测定血清中胰岛素水平。
[0106] 图7A和图7B的结果显示，在皮下注射生理盐水的健康大鼠组（阴性对照组）中， 静脉灌注生理盐水或低浓度葡萄糖后，与无静脉灌注组（0)相比，血清胰岛素水平无明显升 高；而在静脉灌注高浓度葡萄糖后，血清胰岛素水平显著升高。在给予皮下注射本发明的三 种融合蛋白或利拉鲁肽的健康大鼠组中，对其静脉灌注生理盐水依然不能诱导血清胰岛素 水平的升高；而在低浓度和高浓度葡萄糖静脉灌注后，血清胰岛素水平均比皮下注射生理 盐水组相应浓度葡萄糖灌注所诱导的胰岛素水平有不同程度的显著升高。实验动物体内这 种葡萄糖浓度依赖性的促胰岛素分泌作用，提示本发明所述的融合蛋白皮下注射可吸收， 且能够发挥与利拉鲁肽相同的药理作用。
[0107] 实施例9本发明所述融合蛋白与FcRn结合能力的检测
[0108] 将本发明的三种融合蛋白和IgGl型对照抗体（Remicade，购自西安杨森公司）分 别用PBS稀释至5 ii g/ml，按照100 iil/孔加入酶标板中，4°C包被过夜。PBST洗板4次后加 入1%BSA(牛血清白蛋白）300iU/孔，室温封闭1小时。PBST(PH=6.0)洗板4次后，将FcRn 蛋白（购自Sino Biological公司）用PBS缓冲液从5 ii g/ml开始二倍比稀释共7个梯度， 按照100 Ul/孔加入酶标板中，在酸性（pH=6. 0)条件下室温孵育1小时。PBST (PH=6. 0)洗 板4次，将抗His的鼠单抗(购自R&D公司）用PBS缓冲液稀释至I ii g/ml，按照100 iil/孔 加入酶标板中，室温孵育1小时。PBST (PH=6. 0)洗板4次，将HRP标记的羊抗鼠抗体（Goat anti-mouse IgG-HRP,购自R&D公司）用PBS缓冲液稀释至I ii g/ml，按照100 ii 1/孔加入 酶标板中，室温孵育1小时。PBST (PH=6. 0)洗板4次，加入100 iil/孔TMB显色液，室温孵 育15分钟显色，加入50 iil/孔终止液，在M5多功能酶标仪上450/570nm波长下读出吸光 值，结果在图8示出。
[0109] 图8的结果显示，本发明的三个序列融合蛋白的Fc段均具有与IgGl型对照抗体 的Fc段相当的结合FcRn的能力。由于在血管内皮细胞上FcRn介导的含Fc段蛋白的细胞 内吞和循环能维持血清中该蛋白浓度的稳态，本实验结果提示GLP-I-Fc融合蛋白的体内 半衰期可能与IgGl型抗体相当，远高于利拉鲁肽(需一天注射一次)，将达到1-2周注射一 次的频率。
[0110] 实施例1〇本发明所述融合蛋白的Fc段效应子活性检测
[0111] 将 Fe Y RIIIa(CD16a)蛋白（购自 Sino Biological 公司）用 PBS 缓冲液稀 释至0. 25iig/ml，按照IOOiil/孔加入酶标板中，4°C包被过夜。PBST洗板4次后加 入l%BSA300iil/孔，室温封闭1小时。本发明的三种融合蛋白和对照品IgGl型抗体 (Herceptin，购自Roche公司)从200 ii g/ml开始4倍比稀释共7个梯度，分别与从100 ii g/ ml开始4倍比稀释的兔抗人K链抗体（Rabbit Anti-Human K，购自R&D公司，共7个梯 度）按1:1混匀，室温孵育1小时。PBST洗板4次后，将孵育后的混合溶液以100 iil/孔 加入所述包被有Fe Y RHIa(⑶16a)蛋白的酶标板中，室温孵育2小时。PBST洗板4次后， 以100 Ul/孔加入PBS稀释的I ii g/ml HRP标记的羊抗人IgG H&L链的F(ab'）2抗体片 段（Goat anti-Human IgG H&L chain F(ab，）2Fragment_HRP，购自 CalBiochem 公司），室 温孵育1小时。PBST洗板4次，加入100 iil/孔TMB显色液，室温孵育15分钟显色后加入 50 iil/孔终止液，在M5多功能酶标仪上450/570nm波长下读出吸光值，结果在图9示出。
[0112] 图9的结果显示，与IgGl型对照抗体的Fc段相比，本发明的三种融合蛋白的Fc段 与Fe Y RIIIa (⑶16a)蛋白的结合能力均很低，从而可避免其Fe段的效应子功能(如ADCC)， 降低药物的副作用。
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其由胰高血糖素样肽-1的C末端通过肽接头与IgG2Fc部分的N末 端融合而成。
2. 如权利要求1所述融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID NO :6所示。
3. -种编码如权利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4. 如权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3所示。
5. -种制备如权利要求1或2所述融合蛋白的方法，其包括： a. 构建如权利要求3或4所述的基因； b. 将步骤a所述基因克隆到真核表达载体，得到可表达如权利要求1所述融合蛋白的 真核表达载体； c. 用步骤b所述表达载体转染细胞，使其表达所述重组融合蛋白，然后分离纯化得到 所述融合蛋白。
6. 如权利要求5所述的方法，其中真核表达载体为293。
7. 如权利要求5所述的方法，其中所用细胞为Freestyle 293F细胞。
8. -种制剂，其含有如权利要求1或2所述融合蛋白作为其活性成分，其还可以含有一 种或多种可药用载体。
9. 如权利要求1或2所述融合蛋白或含有其的制剂在制备用于治疗和/或预防II型糖 尿病、肥胖以及通过降低血清葡萄糖、抑制胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它 疾病的药物中的用途。
10. 如权利要求3或4所述基因在制备用于治疗和/或预防II型糖尿病、肥胖以及通 过降低血清葡萄糖、抑制胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它疾病的药物中的用 途。
【文档编号】A61K48/00GK104277112SQ201310280199
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月4日 优先权日:2013年7月4日
【发明者】周新华, 周清, 陈如雷, 石姝, 粘伟红, 闫洪滨 申请人:嘉和生物药业有限公司