一种下调微小rna-7表达的载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种下调微小RNA-7表达的载体及其应用，所述的载体为含miR-7-sponge（海绵）核苷酸序列的真核表达载体。本发明的载体不仅可以方便、快速、长效地下调miR-7的表达，同时还可快捷地观察miR-7下调表达后的生物学效应。
【专利说明】—种下调微小RNA-7表达的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明专利涉及一种下调微小RNA-7表达的载体及其应用，尤其用于长效抑制其活性。
【背景技术】
[0002]微小RNA-7 (microRNA-7，miR-7)具有重要的生物学作用。目前，改变miR_7的表达，从而研究其生物学功能的技术主要有反义核酸(Antisense oligonucleotides, ASO)、抑制剂(Inhibitor)和Antagomir等。然而,这些方法存在有效作用时间短、长时间作用效果较差等缺点，难以达到体内长效稳定下调miR-7表达的效果。
【发明内容】
[0003]为了克服现有下调miR-7表达技术的局限性，本发明专利提供了一种新的下调方法。该方法设计简单，操作容易，不仅适于细胞的转染，也可用于整体水平转基因动物的制作。
[0004]本发明的技术方案是:利用分子生物学技术，构建含miR-7-sponge (海绵)的真核表达载体。将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-7成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-7表达后的生物学效应。
[0005]本发明一方面涉及一种下调微小RNA-7表达的载体，所述的载体为含miR-7-sponge (海绵)核苷酸序列的真核表达载体,优选的,所述的miR-7-sponge (海绵)核苷酸序列为SEQ ID N0.1.[0006]本发明另一方面还涉及上述下调微小RNA-7表达的载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤:合成miR-7-sponge序列；用Hind III /KpnI双酶切骨架载体pEGFP_C2和miR-7-sponge序列，回收片段纯化，连接后转化，接种到含卡那霉素的LB培养基中,成功构建重组质粒载体。
[0007]在本发明的另一方面，本发明还涉及上述下调微小RNA-7表达载体在下调微小RNA-7表达中的应用，优选的，所述的下调是在离体细胞中进行；进一步优选的，所述的离体细胞是人肺癌细胞。
[0008]本发明的载体不仅可以方便、快速、长效地下调miR-7的表达，同时还可快捷地观察miR-7下调表达后的生物学效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:表达载体转染真核细胞后，miR-7表达水平检测。
[0010]图2:表达载体转染真核细胞后，miR-7生物学效应检测，(A，光镜；B，MTT实验)，图中:MCS,多克隆位点(Multiple clone sites) ; SV40,猴空泡病毒 40 (Simian virus40)；EGFP,增强型绿色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ;Kanr,卡那霉素抗性(Kanamycin resistance) ;HSV,单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus) ；Puc Ori,复制起始位点(origin of replication) ;Pcmv,人巨细胞病毒启动子(Human cytomegaloviruspromoter)；
【具体实施方式】:
[0011 ]合成 miR-7-sponge 序列:5，-AAGCTTA ACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAMATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAMTCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCA-3’。最后在5’端加上Hind III酶切位点，3’端加上KpnI酶切位点。miR-7-sponge序列设计完成。
[0012]用Hind III/KpnI双酶切骨架载体pEGFP-C2 (商购)、目的片段miR-7-sponge,回收片段纯化，16°C过夜连接。连接后转化，挑取4个菌落，接种到含10μ g/ml卡那霉素的LB培养基中。
[0013]重组质粒经Hind III和KpnI双酶切后，电泳鉴定，并测序，成功构建重组质粒pEGFP-C2-miR-7-sponge,命名为 pG-miR-7-Sp (对应的 pEGFP_C2 命名为 eGFP-Control)，如图2所示。
[0014]将质粒pG-miR-7-Sp大量抽提后，鉴定纯度和浓度。结果显示，0D260/280=1.76，浓度为128mg/L，_80°C保存；
[0015]常规培养人肺癌细胞株95D细胞，按3X105/ml的细胞密度接种于6孔板中，将IOug质粒pG-miR-7-Sp和对照质粒eGFP-Control (pEGFP_C2)体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞，继续在5%C02、37°C条件下培养。48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime PCR探针法检测miR_7表达水平。结果显示，pG-miR-7-Sp转染组中，miR-7表达水平明显 下调(图1)，提示该载体可以显著下调miR-7的表达。
[0016]进一步检测了各转染组中9邪细胞生长的变化，如图2所示，培养72小时后，与eGFP-Control转染组相比，pG-miR-7-Sp载体转染组中％D细胞的生长明显增强(p〈0.05)，提示miR-7表达水平下调后，可显著促进肿瘤细胞体外生长，结果表明，含miR-7-sponge真核表达载体不仅可以下调miR-7在真核细胞中的表达，同时，也可通过体外转染观察miR-7下调表达后的生物学效应。
[0017]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0018]
【权利要求】
1.一种下调微小RNA-7表达的载体,所述的载体为含miR-7-sponge (海绵)核苷酸序列的真核表达载体，优选的，所述的miR-7-sponge (海绵)核苷酸序列为SEQ ID N0.1 ;进一步优选的，所述的载体具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的下调微小RNA-7表达的载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤:合成 miR-7-sponge 序列；用 Hind III /KpnI 双酶切骨架载体 pEGFP_C2 和 miR-7-sponge序列，回收片段纯化，连接后转化，接种到含卡那霉素的LB培养基中，成功构建重组质粒载体。
3.权利要求1或2所述的下调微小RNA-7表达载体在下调微小RNA-7表达中的应用，优选的，所述的下调是在离体细胞中进行；进一步优选的，所述的离体细胞是人肺癌细胞。
【文档编号】A61P35/00GK103789347SQ201410047018
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2014年2月11日
【发明者】徐林, 李永菊, 周涯, 陶弋婧 申请人:遵义医学院