赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂的应用。本发明以斑马鱼和小鼠两种模式动物，建立毛细胞损伤及保护研究的动物模型，结果表明全身及圆窗局部给予LSD1抑制剂，能明显上调组蛋白H3K4二甲基化表达水平，显著降低耳蜗毛细胞Cleaved?Caspase-3表达，从而减轻毛细胞损伤，实现听力保护的目的，表明赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂对感音神经性聋具有听力保护作用。本发明为寻找、防治感音神经性耳聋提供了新的途径，具有临床应用价值。
【专利说明】赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及赖氨酸特异性去甲基化酶I (LSDl)抑制剂类的新用途，具体涉及LSDl抑制剂对感音神经性聋的听力保护作用，尤其是涉及对氨基糖苷类药物致感音神经性聋的听力保护上的用途。
【背景技术】
[0002]感音神经性聋是耳鼻咽喉科的常见病和多发病，近年来发病呈上升趋势，它不仅给患者及其家庭带来生理上和心理上的痛苦，而且给社会和经济发展造成严重影响。据第二次全国残疾人抽样调查显示，我国现有听力残疾人2004万、言语残疾人127万。这是一个数量众多、困难突出的社会群体。听力损伤与耳聋已成为影响人口素质的重要因素之一。感音神经性聋是一个医学难题，由于内耳毛细胞和螺旋神经的损伤修复和再生能力的缺乏，感音神经性聋的防治工作仍无突破性进展。因此，早期的毛细胞保护策略在感音神经性聋的防治工作中尤为重要。
[0003]近年来表观遗传学调控在胚胎发育、细胞周期、肿瘤发生等过程中的调控机制逐渐被人们所认识和关注。研究发现，在神经元凋亡过程中，组蛋白H3和H4的乙酰化水平均有显著下降；近期的研究中也发现了与耳聋相关的小RNA调控，某些小RNA的特异性敲除会导致小鼠进行性听力下降。
[0004]赖氨酸特异性去甲基化酶I (lysine-specific demethylasel, LSDI)是最早发现的组蛋白去甲基化酶(Yujiang Shi, Fei Lan, Caitlin Matson, etal.2004，Cell.119:941 - 953)。目前认为，组蛋白甲基化异常与肿瘤的发生、发展、预后有着密切的关系。作为LSDl特异性抑制剂，S2101和CBB1007等小分子药物具有特异性高、能够通过血脑屏障等优点，其在抑制肿瘤发生及精神类疾病领域的调控机制逐渐被人们所认识和关注(Jing Wang, Fei Lu, Qi Ren, et al.2011，Cancer Res.71:7238-7249)。
[0005]但是关于赖氨酸特异性去甲基化酶I (LSDl)抑制剂对感音神经性聋听力的保护作用还未见相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供LSDl抑制剂新的药用用途，具体涉及其在防治感音神经性聋中的用途。
[0007]本发明提供的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂的用途，用于:
[0008]⑴制备预防和/或治疗感音神经性聋的药物或药物组合物；或
[0009](ii)制备保护感音神经性聋患者听力的药物或药物组合物。
[0010]根据本发明，所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂能够提高耳蜗毛细胞中的组蛋白H3K4 二甲基表达水平。所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂用于制备提高耳蜗毛细胞中的组蛋白H3K4 二甲基表达水平的药物或药物组合物。
[0011] 根据本发明，所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂能够降低耳蜗毛细胞凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂用于制备所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂用于制备的的药物或药物组合物。
[0012]根据本发明，所述预防和/或治疗感音神经性聋是指提高耳蜗毛细胞中的组蛋白H3K4 二甲基表达水平和/或降低耳蜗毛细胞凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。
[0013]根据本发明，所述保护感音神经性聋患者听力是指提高耳蜗毛细胞中的组蛋白H3K4 二甲基表达水平和/或降低耳蜗毛细胞凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。
[0014]根据本发明，所述感音神经性聋是氨基糖苷类药物致感音神经性聋。
[0015]根据本发明，所述赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂选自:小分子药物S2101、小分子药物CBB1007。
[0016]根据本发明，所述药物或药物组合物通过全身或圆窗局部给药方式施用。
[0017]根据本发明，所述药物组合物包含所述赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂以及药学上可接受的载体。
[0018]本发明以临床常见的感音神经性聋为靶，从新的研究领域——表观遗传学入手，通过抑制LSDl表达，实现毛细胞保护的目的，为临床工作中感音神经性聋防治提供新的途径，为寻找预防感音神经性聋提供了依据；也为进一步分析LSDl抑制剂在抑制毛细胞凋亡的作用机制奠定了基础。
[0019]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是斑马鱼侧线系统毛细胞损伤模型的建立。A:Brn3c:mGFP转基因斑马鱼侧线器神经丘；B:新霉素损伤I小时后Brn3c:mGFP转基因斑马鱼侧线器神经丘，箭头表示凋亡小体。其中，绿色代表毛细胞，蓝色代表细胞核。
[0021]图2是LSDl抑制剂(S2101和CBB1007)对斑马鱼侧线系统毛细胞损伤的保护作用。A:5dpf Brn3c:GFP转基因斑马鱼侧线器及神经丘的整体观。其中箭头代表初级侧线系统神经丘L1-L5和尾部神经丘T1-T3，星号代表次级侧线系统神经丘。B-D:对照组、S2101处理组和CBB1007处理组的神经丘免疫荧光情况；E-G:新霉素处理组、S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组的神经丘免疫荧光情况；Bar=10 μ m.H-1:不同处理后神经丘毛细胞计数，实验组明显高于对照组，且呈浓度依赖性。*P〈0.05。
[0022]图3是小鼠耳蜗毛细胞体外培养损伤模型的建立。图A是ImM新霉素损伤4小时，洗脱24小时后基底膜整体观。图B、图C、图D分别代表顶圈、中圈和底圈的典型图片。其中绿色代表毛细胞，蓝色代表细胞核。Scale bar=20 μ m0
[0023]图4是LSDl抑制剂对新霉素致小鼠耳蜗毛细胞损伤的体外保护作用。A_C:对照组、S2101实验组和CBB1007实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞存活情况。其中红色代表毛细胞。Scalebar=1ymt5我们将基底膜分为三段，进行毛细胞存计数，实验组(S2101处理组和CBB1007处理组)明显多于对照组(新霉素处理组)。每组标本数n=9.**P〈0.001。
[0024]图5是体内试验给药时间示意图，左耳为实验组，右耳为对照组。
[0025]图6是新霉素损伤致小鼠耳蜗组蛋白H3K4 二甲基化表达下调。A_C:新霉素损伤O分钟、15分钟和3小时组蛋白H3K4 二甲基化的免疫荧光强度变化。新霉素处理后毛细胞H3K4me2荧光强度明显降低。其中绿色代表H3K4me2，红色代表myosin7a标记的毛细胞。蓝色代表DAPI标记的细胞核。D:对照组和实验组H3K4me2表达的Western blotting结果。E:对照组和实验组H3K4me2表达的Western blotting灰度分析结果。
[0026]图7是LSDl抑制剂致小鼠耳蜗组蛋白H3K4 二甲基化表达上调。A_C:对照组、S2101实验组和CBB1007实验组组蛋白H3K4 二甲基化的免疫荧光强度变化。LSDl抑制剂处理后毛细胞H3K4me2荧光强度明显增强。其中绿色代表H3K4me2，红色代表myosin7a标记的毛细胞。蓝色代表DAPI标记的细胞核。D:对照组和S2101处理组H3K4me2表达的Western blotting结果及其灰度分析。E:对照组和CBB1007处理组H3K4me2表达的Westernblotting结果及其灰度分析。
[0027]图8是LSDl抑制剂致凋亡标记物Cleaved Caspase-3表达下调。A-C:对照组、S2101实验组和CBB1007实验组Cleaved Caspase-3的免疫荧光强度变化；D:对照组和S2101实验组Cleaved Caspase-3蛋白表达的Western blotting结果及灰度分析结果。E:对照组和CBB1007实验组Cleaved Caspase-3蛋白表达的Western blotting结果及灰度分析结果。其红色代表Myosin7a标记的毛细胞,绿色代表Cleaved Caspase-3标记的凋亡细胞，蓝色代表DAPI标记的细胞核。
[0028]图9是LSDl抑制剂S2101不影响毛细胞对FM1-43FX的摄取能力。A:对照组；B:S2101处理组。其中红色代表FM1-43FX，蓝色代表DAPI标记的细胞核。
[0029]图10是LSDl抑制剂S2101和CBB1007对新霉素致小鼠毛细胞损伤的体内保护作用。A-B:对照组和S2101 实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞存活情况。其中色代表Myosin7a,:蓝色代表DAPI标记的细胞核；C_D:对照组和S2101实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞存活情况。其中红色代表phalloidine，:蓝色代表DAPI标记的细胞核；E:对照组和S2101实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞的计数结果，n=9, **P〈0.001。F:对照组和S2101实验组的平均ABR阈值，η=16, *Ρ〈0.05。G-H:对照组和CBB1007实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞存活情况。其中红色代表Myosin7a，:蓝色代表DAPI标记的细胞核对照组和CBB1007实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞存活情况。其中红色代表phalloidine,:蓝色代表DAPI标记的细胞核；K:对照组和CBB1007实验组的顶圈、中圈和底圈的毛细胞的计数结果，η=9，#Ρ〈0.001。L:对照组和CBB1007实验组的平均ABR阈值，η=13，*Ρ〈0.05。
【具体实施方式】
[0030]本发明人首次发现LSDl抑制剂新的药用用途，用于防治感音神经性聋。在此基础上，完成了本发明。
[0031]赖氨酸特异性去甲基化酶I (LSDl)抑制剂
[0032]LSDl是一种高度保守的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖、赖氨酸特异性脱甲基酶，能够特异性地抑制组蛋白Η3Κ4的甲基表达水平。近期研究表明，LSDl抑制剂CBB1007通过选择性调控Η3Κ4的甲基化状态，促进了 Gl期细胞周期阻滞，诱导细胞分化，从而抑制肿瘤发生。因此，特异性LSDl抑制剂——S2101, CBB1007等小分子药物在具有特异性高、能够通过血脑屏障等优点，其在抑制肿瘤发生及精神类疾病领域的调控机制逐渐被人们所认识和关注。
[0033]本发明以斑马鱼和小鼠两种模式动物，建立毛细胞损伤及保护研究的动物模型，定量研究LSDl抑制剂能够有效的降低耳蜗毛细胞Cleaved Caspase-3表达，从而抑制毛细胞凋亡，实现对感音神经性聋的听力保护作用。
[0034]首先建立斑马鱼侧线器神经丘毛细胞损伤模型，采用斑马鱼模型进行初步药物筛选，结果发现，LSDl抑制剂(S2101和CBB1007)对斑马鱼侧线系统毛细胞具有凋亡保护作用。然后建立小鼠毛细胞药物损伤模型，采用圆窗膜局部给药的方法在小鼠耳蜗抑制LSDl表达，利用免疫荧光化学技术和蛋白质免疫印迹实验(Western blot)证实小鼠内耳H3K4二甲基化及凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平；利用免疫荧光化学和耳蜗毛细胞计数的方法对耳蜗存活毛细胞进行定量研究，利用亲水脂膜探针FM1-43FX检测耳蜗毛细胞的摄取功能，采用听性脑干反应(ABR)的方法检测小鼠听力；结果表明，通过自身对照比较，实验组组蛋白H3K4 二甲基化表达水平明显上调,Cleaved Caspase-3表达明显下调,凋亡活动明显减少，耳蜗毛细胞数量明显多于对照组，利用ABR听力检测进一步证明实验组听阈较对照组明显降低，差异具有统计学意义。因此证实LSDl抑制剂可减轻毛细胞损伤，达到听力保护的目的，从而为感音神经性耳聋的防治提供新的手段。
[0035]本发明的目的通过下述方法和步骤实现
[0036]1、建立斑马鱼侧线系统毛细胞损伤模型
[0037]本研究采用的Brn3c:mGFP转基因斑马鱼(美国哈佛大学眼耳医院Eaton-Peabody实验室)。出生后5天(5days post fertilizat1n, 5dpf)的斑马鱼暴露于含400 μ M新霉素的斑马鱼饲养水中I小时，去除新霉素后，MS-222麻醉5分钟，4%PFA固定2小时，DAPI染色，荧光显微镜观察斑马鱼侧线系统毛细胞损伤情况。
[0038]2、利用斑马鱼模型进行药物筛选
[0039]本实验主要采用S2101和CBB1007两种小分子作为LSDl抑制剂进行药物筛选，对照组和实验组随机分组，保持相同饲养条件。分别将S2101 (美国Millipore公司，溶于DMS0，储存浓度为50mM)和CBB1007 (美国Millipore公司，溶于DMS0，储存浓度为10mM)溶于斑马鱼饲养用水配置成不同终末浓度，2小时后加入含400 μ M新霉素的斑马鱼饲养用水I小时，洗去新霉素，MS-222麻醉5分钟、4%PFA固定2小时，荧光显微镜观察侧线器毛细胞存活情况。
[0040]3、建立小鼠耳蜗毛细胞损伤模型
[0041]I)体外模型
[0042]作为氨基糖苷类药物，新霉素损伤模型是研究毛细胞损伤与保护的常见模型之一。新霉素损伤4小时，然后洗脱24小时后就能在体外培养的内耳毛细胞检测到毛细胞的缺失。本发明选用新霉素损伤模型来进一步研究毛细胞损伤和保护。
[0043]首先将新生小鼠耳蜗听觉上皮进行分离，贴壁2小时，标本贴壁后，加入实验组或对照组药物的无血清DMEM/F12培养液共培养24小时，再加入含ImM新霉素的无血清DMEM/F12培养液共培养4小时。最后加入无血清培养液共培养24小时(图4)。
[0044]2)体内模型
[0045]实验采用自身对照设计，将小鼠左耳作为实验组，右耳作为对照组。在出生后P5天时，左耳圆窗给药，右耳作为空白对照。从出生后P7天开始，皮下注射新霉素5天，具体流程见图5。
[0046]4、组蛋白H3K4 二甲基化表达水平检测
[0047]I)按照体外培养方案进行小鼠耳蜗基底膜培养，分别对其用新霉素损伤处理O分钟、15分钟和3小时采用免疫荧光染色检测组蛋白表达水平，并采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)进行半定量检测。
[0048]2)按照体外培养方案进行小鼠耳蜗基底膜培养，取对照组、S2101处理组和CBB1007处理组耳蜗基底膜，采用免疫荧光染色检测组蛋白表达水平，并采用Western blot进行半定量检测。
[0049]5、凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平检测
[0050]按照体外培养方案进行小鼠耳蜗基底膜培养，分别取对照组、S2101处理组和CBB1007处理组耳蜗基底膜，新霉素损伤4小时后，采用免疫荧光染色检测CleavedCaspase-3表达水平,并米用Western blot进行半定量检测。
[0051]6、检测毛细胞对FM1-43FX摄取能力
[0052]实验组或者对照组预处理24小时，PBS漂洗后加入FM1-43FX，培养3分钟；PBS再次漂洗，PFA固定30分钟后附染DAPI。
[0053]7、小鼠听性脑干反应检测
[0054]动物麻醉后， 将小鼠平稳放置于BME-421A型动物体温控制仪上，温度设定为38°C，全程恒温。由前置放大器分别引出三根已消毒的电极置于动物皮下。其中，颅顶为采集电极，测试同侧耳耳后乳突为参考电极，鼻根为接地电极。内置扬声器置于动物外耳道口内。放置内置扬声器，并用PA5进行衰减。刺激声选用短纯音(tone burst), Blackman包络。具体参数如下:测试频率为8kHz、16kHz、24kHz与32kHz ;刺激频率为21.37次/秒；采集放大倍数为20 ;持续时间为5ms ；rise-fall时间为0.5ms ;采集带宽为0.3~3.0kHz ;叠加次数为500-1000次。测试从90dB SPL左右开始，1dB SPL递减，靠近阈值时5dB SPL递减。具体阈值判断主要以III波为准，兼考察波形重复性，选择能引起听反应的最低刺激强度为ABR反应阈值。因扬声器最高输出为10dB,当不能引起听反应时，ABR反应阈值记录为100dB。阈值频率重复采集I次。
[0055]结果:
[0056]I) LSDl抑制剂对斑马鱼侧线系统毛细胞损伤的保护作用
[0057]为了排除LSDl抑制剂的毒性作用，选择适当的药物浓度。免疫荧光组织化学及毛细胞计数结果发现，S2101 (2(^]\0和0881007 (100 μ M)处理5dpf的fcn3c:mGFP转基因斑马鱼2小时，毛细胞的数量与对照组相比，无明显差异，表明本研究所采用的的LSDl抑制剂浓度对毛细胞无明显毒副作用。
[0058]对神经丘毛细胞进行计数，使用不同浓度的S2101 (5“1、1(^11和2(^10处理5dpf的Brn3c:mGFP转基因斑马鱼2小时，再用新霉素处理I小时，对存活毛细胞进行计数，结果显示不同浓度S2101处理组毛细胞的数量均高于对照组，且呈浓度依赖性(图2，Ρ〈0.05, Kruskal - Wallis one-way ANOVA of ranks 和 Dunn，s test)。
[0059]进一步用另一种LSDl抑制剂验证毛细胞凋亡保护作用的有效性和特异性，使用不同浓度的CBB1007(20 μ Μ、50 μ M和100 μ Μ)进行同样的处理，结果显示不同浓度CBB1007处理组毛细胞的数量均高于对照组，且呈浓度依赖性(图2)。
[0060]2) LSDl抑制剂对小鼠耳蜗毛细胞损伤的体外保护作用
[0061]将体外培养的耳蜗组织分为三组:即新霉素，S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组。从免疫荧光染色结果提示，S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组毛细胞数量明显多于对照组，尤其在中圈和底圈。计数结果也表明S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组的中圈、底圈毛细胞存活情况明显高于对照组，差异具有统计学意义(Ρ〈0.01)(图 4)。
[0062]3)损伤导致毛细胞Η3Κ4 二甲基化表达明显下调
[0063]免疫组化结果提示:正常组耳蜗组蛋白H3K4me2有一定强度表达；新霉素损伤后耳蜗毛细胞H3K4me2表达强度明显下调。为了半定量验证新霉素损伤对H3K4me2表达的影响，Western blot及灰度分析结果发现,新霉素损伤组组蛋白H3K4me2 (17kDa)表达强度明显减弱，差异具有明显统计学意义(P〈0.05)(图6)。
[0064]4) LSDl抑制剂能够有效抑制耳蜗毛细胞的凋亡
[0065]线粒体释放细胞色素C后可激活CaSpaSe9/CaSpaSe3信号途径引起传统的细胞凋亡。本发明通过免疫荧光组织化学和Western blot结果显示，实验组(S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组)和对照组(新霉素处理组)均出现Cleaved Caspase-3染色阳性细胞，以中底圈表达尤为明显。为了进一步定量Cleaved Caspase-3的表达，Westernblot及灰度分析结果显示,实验组和对照组均有Cleaved Caspase-3表达,对照组高于实验组，差异有统计学意义(P〈0.05)。小鼠耳蜗损伤后,Cleaved Caspase-3表达显著升高,并且在LSDl抑剂处理后Cleaved Caspase-3表达显著降低，表明LSDl抑制剂对毛细胞的保护作用可能通过Capase-3经典内源性凋亡通路来实现的(图8)。
[0066]5) LSDl抑制剂不影响毛细胞对氨基糖苷类的摄取功能
[0067]FM1-43FX是用来研究细胞内吞和胞吐作用的苯乙烯基染料，目前在毛细胞研究中可以作为毛细胞功能的标记物。为了进一步验证LSDl抑制剂是否影响毛细胞的功能状态，我们检测LSDl抑制剂预处理后的毛细胞对FM1-43FX的摄取能力，结果发现，LSDl抑制剂不影响毛细胞对FM1-43FX的摄取能力(图9)。
[0068]6) LSDl抑制剂对新霉素致小鼠耳蜗毛细胞损伤的体内保护作用
[0069]以Phaollidine缺失作为毛细胞纤毛缺失的标准，Phaollidine与DAPI共染结果发现，毛细胞纤毛损伤情况实验组明显低于对照组。以Myosin7a缺失作为毛细胞缺失的计数标准，整体观上，实验组(S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组)Myosin7a阳性细胞明显多于对照组(新霉素处理组)。我们将基底膜分为顶圈、中圈和地圈进行毛细胞计数，结果发现实验组明显多于对照组，差异具有统计学意义。ABR结果显示，高频听力损伤明显高于低频听力损伤，对照组听力损伤明显高于实验组。其中，S2101-新霉素处理组听阈在24kHz和32kHz上较对照组降低10_20dB，CBB1007-新霉素处理组听阈在24kHz和32kHz上较对照组降低10dB，差异显著性差异(P〈0.05)(图10)。
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0071]本发明所采用的实验动物和材料，其中:
[0072]本研究采用的Brn3c:mGFP转基因斑马鱼来自美国哈佛大学眼耳医院Eaton-Peabody实验室。C57BL/6J小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；啮齿类动物普通饲料(复旦大学实验动物部XABR检测采用复旦大学附属眼耳鼻喉科医院中心实验室TDTSystem3apparatus 设备检测(Tucker Davies Technologies, Gainesville, FL, USA);蛋白提取试剂盒(AllPr印DNA/RNA/Protein Mini Kit)购于德国QIAGEN公司；麻醉药MS-222、新霉素均购于Sigma-Aldrich公司；S2101和CBB1007购于Millipore公司；亲水脂膜探针FM1-43FX 购于 Eugene 公司；H3K4me2 抗体购于 Abcam 公司；cleaved caspase-3 抗体购于Cell Signaling Technology 公司；rhodamine_phalloidin 购于 Invitrogen 公司；myosinVila 抗体购于 Proteus B1sciences 公司。
[0073]实施例1建立斑马鱼侧线系统毛细胞损伤模型
[0074]本研究采用的Brn3c:mGFP转基因斑马鱼(美国哈佛大学眼耳医院Eaton-Peabody实验室)。斑马鱼在28.5°C恒温环境中生长，光周期为14小时光照/10小时黑暗，养殖方案按照《Zebrafish Book》(http://www.zfin.0rg)常规进行。具体操作如下:
[0075]①将出生后5天(5days post fertilizat1n, 5dpf )斑马鱼暴露于含400 μ M新霉素的斑马鱼饲养水中I小时；
[0076]②在新鲜的斑马鱼饲养水中漂洗3次；
[0077]③0.02% 的 MS-222 麻醉 5min ；
[0078]④4%多聚甲醛室温固定2h ；
[0079]?0.011\^85漂洗511^11\3;
[0080]⑥1:800DAPI 室温 20min ；
[0081]⑦封片，荧光显微镜观察斑马鱼侧线系统毛细胞损伤情况，如图1所示，新霉素损伤后斑马鱼侧线系统毛细胞显著减少，存活毛细胞数量为1.0±0.64。
[0082]实施例2利用斑马鱼模型进行药物筛选
[0083]1)S2101-新霉素处理:斑马鱼胚胎发育至5dpf进行加药处理:包括对照组(DMS020yM)和S2101实验组(5 μ M、10 μ Μ、20 μ M)。药物处理2h后加入新霉素损伤Ih(400 μ Μ),新鲜的斑马鱼饲养水中漂洗3次，MS-222麻醉5min，4%多聚甲醛室温固定2h ；0.01M PBS漂洗5minX 3 ; 1:800DAPI室温20min ;封片，荧光显微镜观察计数，观察侧线器毛细胞存活情况。其中η = 50-70，统计结果用SPSS11.5统计软件分析(图2)。
[0084]2) CBB1007-新霉素处理:斑马鱼胚胎发育至5dpf进行加药处理:包括对照组(DMSOlOOyM)和CBB1007实验组(20 μ Μ、50 μ M、100 μ M)。药物处理2小时后加入新霉素损伤Ih (400 μ Μ)，新鲜的斑马鱼饲养水中漂洗3次，MS-222麻醉5min，4%多聚甲醛室温固定2h ；0.01M PBS漂洗5minX3 ;1:800DAPI室温20min ;封片，荧光显微镜观察计数。其中η = 50-70，统计结果用SPSS11.5统计软件分析(图2)。
[0085]实施例3建立小鼠耳蜗毛细胞损伤模型
[0086]I)体外模型
[0087]①新生小鼠耳蜗听觉上皮的分离
[0088]②新生小鼠听觉上皮的体外组织培养
[0089]③药物处理
[0090]将新生小鼠耳蜗听觉上皮进行分离，贴壁2小时，标本贴壁后，加入含S2101或CBB1007的无血清DMEM/F12培养液共培养24小时，然后加入含ImM新霉素的无血清DMEM/F12培养液共培养4小时。无血清DMEM/F12漂洗3次。最后加入无血清培养液共培养24小时，耳蜗基底膜毛细胞损伤模型呈现由底圈到顶圈的损伤梯度变化(图3，底圈严重，顶圈轻微)。
[0091]2)体内模型
[0092]实验采用自身对照设计，将小鼠左耳作为实验组，右耳作为对照组。在出生后P5天时，左耳圆窗给药，右耳作为空白对照。从出生后P7天开始，皮下注射新霉素5天，具体流程见图5。
[0093]①手术给药:P5天小鼠放置冰上麻醉2min，将麻醉好的小鼠放置在手术显微镜下，侧卧位，使左耳朝向术者。术区用碘伏消毒后在周围覆盖无菌巾(后部)及无菌纱布块(前、上、下方)。切开耳后皮肤，注意勿损伤皮下的血管，切开皮肤后可以看到面静脉，将面静脉推向一侧，钝性分离皮下肌肉和组织，直到看到听泡，将听泡上的软组织钝性剥离，用小的眼科剪刀，将听泡打开，暴露圆窗龛，将浸有目的药物的约Imm3大小明胶海绵放置在圆窗龛上，注意不要损伤中耳结构，包括听小骨、镫骨上动脉等。缝合切口。切口表面涂安尔碘。
[0094]②新霉素皮下注射:使用新霉素干粉与注射用水配置浓度为20mg/ml的新霉素溶液，现配现用，充分混匀后使用微量注射器以lOul/g的剂量对P7天小鼠进行背部皮下注射，以达到200mg/kg的新霉素注射浓度。每天早上10点注射I次,连续进行5天。
[0095]实施例4组蛋白H3K4 二甲基化表达水平检测
[0096]I)按照体外培养方案进行小鼠耳蜗基底膜培养，分别对其用新霉素损伤处理O分钟、15分钟和3小时采用免疫荧光染色检测组蛋白表达水平，并采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)进行半定量检测，新霉素组H3K4me2 (17kDa)表达强度较对照组明显减弱，如图6所示。
[0097]2)按照体外培养方案进行小鼠耳蜗基底膜培养，取实验组和对照组、S2101处理组和CBB1007处理组耳蜗基底膜24小时，漂洗后新霉素损伤4小时，采用免疫荧光染色检测组蛋白表达水平，并采用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)进行半定量检测,S2101处理组和CBB1007处理组H3K4me2 (17kDa)表达强度较对照组明显增强，如图7所示。
[0098]实施例5毛细胞凋亡检测
[0099]I)免疫突光标记 Cleaved Caspase-3 和 DAPI (图 8)；
[0100]①0.01]\^85漂洗5111丨11\3，放入？85+0.l%Triton X_10037°C通透 40min
[0101]②10% 的驴血清室温下封闭 30min,加入一抗 Cleave Caspase-3 (1:200, Rabbit),4°C过夜；
[0102]③0.01M PBS 漂洗 5minX3 次，加入二抗:1:200Alexa Fluor533donkeyant1-rabbit,37°C Ih ；
[0103]④0.01M PBS 漂洗 5minX3 次，加入 1:1000DAPI, RT40min ；0.01M PBS 漂洗，5minX3次，抗淬灭剂封片。
[0104]2) Western blot 定量检测 Cleaved Caspase-3 表达(图 8)；
[0105]①总蛋白提取(AllPrepDNA/RNA/Protein Mini Kit, QIAGEN, Hilden, Germany)
[0106]a.每组12个基底膜，用超声匀浆器在冰上将组织充分研磨(350 μ I RLT+3.5 μ I β巯基乙醇)，4°C, 1200rpm,离心 3min。
[0107]b.上清液加入Allprep DNA spin column收集管(紫色柱子)中。1000rpm离心30s。
[0108]c.滤过液加入250ml无水乙醇，充分混匀，加入到RNeasy spin column中，1000rpm 离心 15s。
[0109]d.滤过液中加入通常Buffer ΑΡΡ600μ I。用力混匀，室温中静置1min,以使蛋白沉淀。1000rpm,离心10min。丢弃上清液。
[0110]e.在蛋白颗粒中加入500ul70%的乙醇，最大速度离心lmin，移除上清液。
[0111]室温放置5至lOmin。
[0112]f.加入100 μ I buffer ALO,充分混匀溶解。
[0113]g.95°C加热5min以使蛋白完全溶解及变性。随后冷却样本。最大速度离心lmin。取上层-20°C保存。
[0114]h.用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
[0115]②蛋白质免疫印迹实验
[0116]1.制备分离胶和浓缩胶。
[0117]b.调整蛋白浓度，加入上样缓冲液，100°C水浴5min ;将蛋白质用微量加样器在加样孔内加样。
[0118]c.盖好保护罩，接通电源，以80V的电压电泳至溴酚蓝前沿进入分离胶后，提d.高电压为110V，直至溴酚蓝电泳至胶底。
[0119]e.电泳结束后，切下目的蛋白所处凝胶区域，将其用转膜缓冲液(2.9gGlycine+5.8g Tris+800ml ddH20+200ml 甲醇)漂洗；按“三明治法”装好转膜装置，100V，2h。
[0120]f.转膜后取下PVDF膜，在盛有封闭液(5%脱脂奶粉)的玻璃皿中室温平缓摇动1-2h。
[0121]g.用封闭液将兔抗一抗1:1500稀释成1.5ml，加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，4°C过夜。二抗(1:2000)室温孵育lh，PBST漂洗4X15min ;
[0122]h.将PVDF在事先混合好的ECL试剂中孵育5min，然后将PVDF膜置于显色暗盒，进入暗室用X光胶片曝光、显影，调节显、定影时间以使显影效果最佳。
[0123]实施例6毛细胞对FM1-43FX摄取能力检测
[0124]I)实验组或者对照组预处理24h ；
[0125]2)温的PBS漂洗2次，5min每次；
[0126]3 )加入 FM1-43FX，培养 3min ；
[0127]4) PBS漂洗5minX2次，PFA固定30min后附染DAPI，结果如图9所示。
[0128]实施例7小鼠听性脑干反应检测
[0129]动物麻醉:氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(4:1) (25mg/kg)的混合麻药腹腔注射以全身麻醉。待小鼠的角膜反射、疼痛反射均消失，呼吸缓慢平稳后进行下一步实验。
[0130]测量环境:安静(环境噪声小于20dB SPL)屏蔽室内，外置扬声器ESl由TDT本身设备及程序校准，并用PA5进行衰减。
[0131]将小鼠平稳放置于BME-421A型动物体温控制仪上，温度设定为38°C，全程恒温。由前置放大器分别引出三根已消毒的电极置于动物皮下。其中，颅顶为采集电极，测试同侧耳耳后乳突为参考电极，鼻根为接地电极。内置扬声器置于动物外耳道口内。
[0132]刺激声选用短纯音(tone burst), Blackman包络。具体参数如下:测试频率为8kHz、16kHz、24kHz与32kHz ;刺激频率为21.37次/秒；采集放大倍数为20 ;持续时间为5ms ；rise-fall时间为0.5ms ;采集带宽为0.3~3.0kHz ;叠加次数为500-1000次。测试从90dB SPL左右开始，1dB SPL递减，靠近阈值时5dB SPL递减。具体阈值判断主要以III波为准，兼考察波形重复性，选择能引起听反应的最低刺激强度为ABR反应阈值。因扬声器最高输出为10dB,当不能引起听反应时，ABR反应阈值记录为100dB。阈值频率重复采集I次。
[0133]实施例1-7实验结果表明:
[0134]结果:
[0135]I) LSDl抑制剂对斑马鱼侧线系统毛细胞损伤的保护作用
[0136]为了排除LSDl抑制剂的毒性作用，选择适当的药物浓度。免疫荧光组织化学及毛细胞计数结果发现，S2101 (2(^]\0和0881007 (100 μ M)处理5dpf的fcn3c:mGFP转基因斑马鱼2小时，毛细胞的数量与对照组相比，无明显差异，表明本研究所采用的的LSDl抑制剂浓度对毛细胞无明显毒副作用(图2)。
[0137]对神经丘毛细胞进行计数，使用不同浓度的S2101 (5 4 11、1(^11和2(^10处理5dpf的Brn3c:mGFP转基因斑马鱼2小时，再用新霉素处理I小时，对存活毛细胞进行计数，结果显示不同浓度S2101处理组毛细胞的数量均高于对照组，且呈浓度依赖性(图2，Ρ〈0.05, Kruskal - Wallis one-way ANOVA of ranks 和 Dunn，s test)。
[0138]进一步用另一种LSDl抑制剂验证毛细胞凋亡保护作用的有效性和特异性，使用不同浓度的CBB1007(20 μ Μ、50 μ M和100 μ Μ)进行同样的处理，结果显示不同浓度CBB1007处理组毛细胞的数量均高于对照组，且呈浓度依赖性(图2)。
[0139]2) LSDl抑制剂对小鼠耳蜗毛细胞损伤的体外保护作用
[0140]将体外培养的耳蜗组织分为三组:即新霉素，S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组。从免疫荧光染色结果提示，S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组毛细胞数量明显多于对照组，尤其在中圈和底圈。计数结果也表明S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组的中圈、底圈毛细胞存活情况明显高于对照组，差异具有统计学意义(Ρ〈0.01)(图 4)。
[0141]3)损伤导致毛细胞Η3Κ4 二甲基化表达明显下调
[0142]免疫组化结果提示:正常组耳蜗组蛋白H3K4me2有一定强度表达；新霉素损伤后耳蜗毛细胞H3K4me2表达强度明显下调。为了半定量验证新霉素损伤对H3K4me2表达的影响，Western blot及灰度分析结果发现,新霉素损伤组组蛋白H3K4me2 (17kDa)表达强度明显减弱，差异具有明显统计学意义(P〈0.05)(图6)。
[0143]4) LSDl抑制剂能够有效抑制耳蜗毛细胞的凋亡
[0144]线粒体释放细胞色素C后可激活CaSpaSe9/CaSpaSe3信号途径引起传统的细胞凋亡。本发明通过免疫荧光组织化学和Western blot结果显示，实验组(S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组)和对照组(新霉素处理组)均出现Cleaved Caspase-3染色阳性细胞，以中底圈表达尤为明显。为了进一步定量Cleaved Caspase-3的表达，Westernblot及灰度分析结果显示,实验组和对照组均有Cleaved Caspase-3表达,对照组高于实验组，差异有统计学意义(P〈0.05)。小鼠耳蜗损伤后,CleavedCaspase-3表达显著升高,并且在LSDl抑剂处理后Cleaved Caspase-3表达显著降低，表明LSDl抑制剂对毛细胞的保护作用可能通过Capase-3经典内源性凋亡通路来实现的(图8)。
[0145]5) LSDl抑制剂不影响毛细胞对氨基糖苷类的摄取功能
[0146]FM1-43FX是用来研究细胞内吞和胞吐作用的苯乙烯基染料，目前在毛细胞研究中可以作为毛细胞功能的标记物。为了进一步验证LSDl抑制剂是否影响毛细胞的功能状态，检测LSDl抑制剂预处理后的毛细胞对FM1-43FX的摄取能力，结果发现，LSDl抑制剂不影响毛细胞对FM1-43FX的摄取能力(图9)。
[0147]6) LSDl抑制剂对新霉素致小鼠耳蜗毛细胞损伤的体内保护作用
[0148]以Phaollidine缺失作为毛细胞纤毛缺失的标准，Phaollidine与DAPI共染结果发现，毛细胞纤毛损伤情况实验组明显低于对照组。以Myosin7a缺失作为毛细胞缺失的计数标准，整体观上，实验组(S2101-新霉素处理组和CBB1007-新霉素处理组)Myosin7a阳性细胞明显多于对照组(新霉素处理组)。将基底膜分为顶圈、中圈和地圈进行毛细胞计数，结果发现实验组明显多于对照组，差异具有统计学意义。ABR结果显示，高频听力损伤明显高于低频听力损伤，对照组听力损伤明显高于实验组。其中，S2101-新霉素处理组听阈在24kHz和32kHz上较对照组降低10_20dB，CBB1007-新霉素处理组听阈在24kHz上较对照组降低15dB，差异显著性差异(P〈0.05)(图10)。
[0149] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂的用途，其特征在于，用于: (i)制备预防和/或治疗感音神经性聋的药物或药物组合物；或 (?)制备保护感音神经性聋患者听力的药物或药物组合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂提高耳蜗毛细胞中的组蛋白H3K4 二甲基表达水平。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂能够降低耳蜗毛细胞凋亡标志物Cleaved Caspase-3表达水平。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述感音神经性聋是氨基糖苷类药物致感音神经性聋。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂选自:小分子药物S2101、小分子药物CBB1007。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或药物组合物通过全身或圆窗局部给药方式施用。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包含所述赖氨酸特异性去甲基化酶I抑制剂以 及药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P27/16GK104042616SQ201410058438
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】李华伟, 于慧前, 何英姿, 孙珊, 黎奥, 柴人杰 申请人:复旦大学附属眼耳鼻喉科医院