一种用于微血栓检测的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于微血栓检测的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒及其应用。所述的多模态纳米颗粒包括磁共振探针、近红外荧光探针、荧光染料、表面修饰分子和纤维蛋白靶向分子，所述磁共振探针为超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒；所述近红外荧光探针为IR783；所述荧光染料为罗丹明；所述表面修饰分子为聚乙二醇；所述纤维蛋白靶向分子为归巢肽。本发明的多模态纳米颗粒联合了磁共振探针和近红外荧光探针，能够实现血栓的多模态同步无创检测，同时保证检测的空间分辨率和敏感性，且纳米颗粒上分布有高密度的CREKA，进一步保证了特异性和敏感性，因此尤其适用于体积小、分布弥散的微血栓检测，同时纳米颗粒上连接有荧光染料，便于离体检测。
【专利说明】—种用于微血栓检测的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床诊断和分子显像【技术领域】，具体地说，涉及一种具有纤维蛋白主动靶向作用的多功能纳米颗粒的合成，用于微血栓的无创性多模态检测。
【背景技术】
[0002]血栓形成是急性缺血性心脑血管疾病(如不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、脑卒中及肺栓塞等)的主要发病机制，最近研究表明微血栓形成在心血管疾病中同样扮演着重要角色，参与冠脉无复流、心脏X综合症、冠脉微血管痉挛等疾病的发生。另外，在急性心肌梗死发病前一个月，不稳定动脉粥样斑块上已经出现微血栓。
[0003]临床常用的影像学手段(如超声、CTA、血管内超声(IVUS)、光学相干层析(OCT)及血管内镜等)可检测大、中血管内的血栓，却无法检测微循环血栓，也无法提供有关血栓分子及细胞成分的信息。这些信息的提供目前只能依靠活检或尸检的病理学检测。
[0004]近年来，分子影像学的快速发展为微血栓的分子检测提供了可能性。磁共振成像(MRI)组织空间分 辨率高、无电离辐射。随着新型纳米材料的研发(如超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒，SP10),多功能的纳米材料可携载分子探针使机体微血栓的多模态显像成为可能。已经有研究者将可靶向纤维蛋白分子的短肽EP-1873或纤维蛋白抗体用钆标记后，成功采用MRI检测体内血栓甚至斑块中沉积的纤维蛋白。但分子磁共振显像存在敏感性不足的缺陷。光学成像作为新兴影像技术具有高灵敏度、无电离辐射、成本低廉等优点，但由于低穿透率、漫反射和自发荧光等原因，光学成像空间分辨率较低。近年来，光学成像中近红外突光(Near-1nfrared Fluorescence)探针的研究悄然兴起。近红外突光材料(如IR783)的最大吸收和发射波长为65(T900nm，作为近红外荧光探针用于活体NIRF成像，具有穿透能力强、显像背景低、灵敏度高等优点，显著优于常规的光学成像。NIR技术已开始在生物成像领域发挥重要作用，如手术中的实时荧光引导、组织学边界状态分析等。
[0005]微血栓因为体积小、分布弥散，需要高敏感性及高空间分辨率的成像方式。但单一成像技术难以符合要求:如MRI时间和空间分辨率高、解剖定位准确，但敏感性相对不足；而光学成像敏感性高、可离体验证，但穿透深度及解剖分辨率有限。多模态显像可解决单一技术和显像模式的缺陷，兼顾敏感性和分辨率。联合磁性探针与近红外荧光探针，研发血栓靶向性高的多功能纳米分子探针是实现微血栓活体多模态成像的有效途径。
[0006]多功能分子探针不仅需要显像剂，同时需要可与靶位点相结合的配体。作为凝血系统正反馈的最终产物，纤维蛋白在血栓形成部位含量丰富，是微血栓靶向显像的理想靶点。在纤维蛋白靶向性配体选择上，抗体是用于靶向检测血栓纤维蛋白成分的的传统配体。与抗体等其他技术相比，蛋白修饰技术具有纯度高、可规模化制备、制备成本低等优点。因此，修饰性多肽可能是更好的选择。通过体内噬菌体展示得到的肿瘤归巢短肽CREKA(cysteine-arginine-glutamic acid-lysine-alanine),可与肿瘤血管及基质中的纤维蛋白特异性的结合，当CREKA连接到胶簇表面后，可特异性的结合在动脉粥样硬化斑块肩部的纤维蛋白，识别斑块易损部位。因此，特异性结合纤维蛋白的分子短肽CREKA可作为靶向微血栓成分的靶头，应用于微血栓的多模态成像。
[0007]而目前还未见将超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒、近红外荧光材料IR783以及肿瘤归巢短肽CREKA连接或结合，制备多模态纳米探针的相关报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒。
[0009]本发明的再一的目的是，提供所述纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的制备方法。
[0010]本发明的另一的目的是，提供所述纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的用途。
[0011]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，包括磁共振探针、近红外荧光探针、荧光染料、表面修饰分子和纤维蛋白靶向分子， 所述磁共振探针为SPIO (超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒)；
所述近红外荧光探针为IR783 ；
所述突光染料为Rhodamine (罗丹明)；
所述表面修饰分子为PEG (聚乙二醇)；
所述纤维蛋白靶向分子为CREKA (归巢肽)。
[0012]所述SPIO为葡聚糖包裹、表面为氨基活性基团的纳米颗粒。
[0013]所述PEG 为 Mal-PEG34-SCM，所述 Mal_PEG34_SCM 为 3000-3800KD，优选 3400KD。
[0014]所述CREKA为半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸五肽。
[0015]所述IR783、Rhodamine均与SPIO连接，所述SPIO被PEG所修饰，所述CREKA通过PEG桥连在SPIO的氨基上。
[0016]每个SPIO表面平均连接有1800-2200个CREKA分子，优选2000个CREKA分子。
[0017]所述PEG与CREKA的摩尔比为(2.5-3.5):1，优选为3:1。
[0018]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤:
a)纳米颗粒的近红外荧光标记:将近红外荧光探针IR783连接到磁共振探针SPIO表面，得至Ij IR783-SP10 ；
b)纳米颗粒的荧光染料标记:将荧光染料Rhodamine连接到步骤a)制备的IR783-SP10表面，得到 IR783-R-SP10 ；
c)PEG修饰纳米颗粒:将PEG连接到步骤b)制备的IR783-R-SP10表面，得到IR783-R-SP10-PEG ；
d)纤维蛋白靶向分子CREKA偶联:通过步骤c)制备的IR783-R-SP10-PEG表面修饰的PEG与纤维蛋白靶向分子CREKA进行偶联。
[0019]所述的制备方法具体为:
a)将磁共振探针SPIO溶液和近红外荧光探针IR783-NHS溶液25°C条件下50W超声震荡反应2h获得IR783-SP10溶液，其中所述SPIO与IR783-NHS的质量比为100:1 ;
b)将Rhodamine 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W 超声 2h 获得 IR783-R-SP10 溶液；
C)将Mal-PEG34-SCM加入到IR783-R-SP10溶液中，在氮气保护下，25°C 50prm反应2h,然后4000prm超滤30分钟获得IR783-R-SPIO-PEG溶液，其中所述Mal_PEG34_SCM与IR783-R-SPIO 的质量比为 1:1 ；
d)向IR783-R-SPIO溶液加入CREKA溶液，在氮气保护下，25 °C 50prm反应2h，然后4000rpm超滤30min，共3次，其中所述IR783-R-SPIO与CREKA质量比为50:1。
[0020]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的用途，用于制备血栓早期诊断和/或实时示踪的试剂，尤其是用于微血栓的早期诊断和/或实时示踪。
[0021]需要说明的是，所述的SPIO为磁共振显像剂，同时为探针载体；IR783为近红外荧光基团，为光学成像剂；Rhodamine用于离体病理切片的荧光显微镜观察；PEG为聚乙二醇，CREKA通过功能化PEG桥连到SPIO载体的氨基上；Mal为马来酰亚胺，用于PEG的功能化，桥连SPIO纳米颗粒和CREKA归巢肽；标记在纳米颗粒上的CREKA归巢肽可与肿瘤血管及基质中的纤维蛋白特异性的结合，为靶向微血栓的分子探针。本文中，所述的“磁共振探针”、“磁共振显像剂”可互换使用；所述的“近红外荧光探针”、“近红外荧光基团”可互换使用。
[0022]本发明优点在于:
本发明联合磁共振探针SPIO与近红外荧光探针IR783，将磁共振显象、光学显像融为一体，能够实现血栓的多模态同步无创检测，同时保证了检测的空间分辨率和敏感性，克服了以往单一显像模式 的局限性。本发明在以下方面均具有实质性特点:
1、纳米材料表面所连接配体的密度对于纳米材料的靶向能力至关重要。纳米材料表面配体密度越高，其通过循环时与对应靶点的接触机会越多，从而提高靶向能力及效率。本发明摸索出合适的CREKA投入量，可保证每个SPIO表面平均连接有约2000个CREKA分子，高密度的CREKA分布确保了 SPIO与靶位点纤维蛋白的结合力，进一步保证了 SP10-CREKA对血栓检测的特异性和敏感性。能够获得如此高密度配体的纳米颗粒，主要原因在于本申请发明人在本领域广泛而深入的研究，充分考虑并意识到影响配体连接效果的因素，进而作出以下选择:(I)本发明中使用的SPIO表面有足够多的氨基活性基团可用于连接PEG ; (2)本发明使用的PEG为3000-3800KD，可在SPIO表面形成“云雾状”结构，利于CREKA的共价连接；(3)配体连接过程中使用氮气保护，可有效保留Mal的活性，避免其被氧化失活。
[0023]2、本领域技术人员均知，利用纳米颗粒进行生物学检测或治疗时，纳米颗粒将直接或间接释放进入血液，其良好的生物形容性是临床应用的前提。目前有关纳米材料毒性的研究多集中于细胞毒性及组织毒性，较少涉及其致栓性。通过前期的实验证明，本发明使用的50nm葡聚糖包裹表面为氨基活性基团的SPIO致栓性较弱，可安全的应用于血栓性疾病的研究。
[0024]3、SPIO表面连接的荧光探针其密度至关重要，密度较低，不利于体内示踪及显象，而密度过高，则容易淬灭。本发明中每个SPIO颗粒表面连接有约300个IR783分子及约1500个Rhodamine分子，具有较强的荧光显像能力。
[0025]4、使用PEG修饰SP10，由于PEG链的立体屏障作用，能提高本发明的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的生物相容性和血液循环时间，可使纳米颗粒避免单核巨噬系统的吞噬，延长血浆中的半衰期。[0026]5、本发明的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒上标记有罗丹明，用荧光显微镜观察离体切片时，更方便追踪纳米颗粒。
[0027]综上可知，本发明的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒尤其适用于体积小、分布弥散的微血栓检测，可望应用于临床微血栓的早期诊断和实时示踪。
[0028]【专利附图】
【附图说明】
图1:多功能纳米探针(IR783-R-SP10-PEG-CREKA，简称SP10-CREKA)的合成路线图。
[0029]图2:连接效率。A:1R783连接效率(IR783浓度-吸光度标准曲线)，每颗SPIO磁珠上连接约300个IR783分子。B =Rhodamine连接效率(Rhodamine浓度-吸光度标准曲线)，每个IR783-SP10上约连接1500个Rhodamine分子。C:PEG连接效率(PEG浓度-吸光度标准曲线)，每个IR783-R-SP10上约连接6000个PEG分子。D =CREKA连接效率(CREKA浓度-峰面积标准曲线)，每个IR783-R-SP10-PEG约连接2000个CREKA分子。
[0030]图3:多功能纳米探针的粒径分布图和电位图。
[0031]图4:荧光显微镜下观察纳米探针与血栓纤维蛋白的体外靶向结合。第一行为血栓图片明场下图像，第二行为N3通道下观察纳米材料与血栓图片的结合情况，红色荧光为纳米材料，第三行为上述二者的融合图像。
[0032]图5:纳米探针对血栓的体外光学显像。A:血栓在活体成像中的显像；B:各组纳米材料荧光值的半定量分析。*SP10-CREKA组与SPIO-PEG组及PBS组比较代0.001。
[0033]图6:纳米探 针对血栓的磁共振T2加权显像。A:MRI T2加权像上的血栓显像。B:各组纳米材料MRI T2加权像上信号值。*SP10-CREKA组与SPIO-PEG组及PBS组比较代0.001。
[0034]图7:免疫荧光检测大鼠心肌缺血再灌注24h后纤维蛋白微血栓的表达。左室前壁fibrin沉积明显增加,而左室后壁及右室未见fibrin表达。
[0035]图8:透射电镜检测大鼠心肌缺血再灌注24h后纤维蛋白微血栓形成。PLT:血小板；RBC:红细胞，EC:内皮细胞；箭头:纤维蛋白。
[0036]图9:基于多功能纳米探针的大鼠心脏微血栓磁共振成像。A为各组的MRI T2加权代表性图像，B为LVAW相对信号值。*SP10-CREKA组与SPIO-PEG组及PBS组比较代0.01。
[0037]图10:基于多功能纳米探针的大鼠心脏微血栓的光学成像。A:离体心脏成像检测SP10-CREKA对大鼠心脏微血栓的光学成像能力；B:各组大鼠心脏荧光半定量强度。*spio-creka 组与 spio-peg 组及 pbs 组比较代ο.οοι。
[0038]图11:纳米探针的组织分布。A:SP10_CREKA经尾静脉注射后在各器官组织中的分布情况:各组织器官的荧光半定量强度。
[0039]图12:纳米探针靶向定位心脏微血栓的激光共聚焦观察。蓝色荧光为细胞核染色；绿色荧光为大鼠心肌M/R后血管内纤维蛋白沉积；红色为相应SPIO ;第四列为前三者的融合图。箭头表示SP10-CREKA与纤维蛋白共定位。
[0040]图13:纳米探针靶向定位心脏微血栓的电镜图。RBC:红细胞；PLT:血小板；En:血管内皮细胞；LUMEN:血管腔。
[0041]【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0042]实施例中，所述的Rhodamine-NHS为若丹明-NHS，分子式=C29H25N3O7,分子量:527.53。所用的Mal-PEG34-SCM为马来酰亚胺_聚乙二醇_琥珀酰亚胺乙酸酯(MW 3400KD)。所用的SPIO是micromod厂家生产的商品化的粒径为50nm葡聚糖包裹的表面为氨基活性基团的SPIO纳米颗粒。
[0043]实施例1多功能纳米探针IR783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(一)
合成过程示意图见附图1。将荧光染料携载于SPIO表面，再采用PEG修饰SP10，Mal-PEG 与 CREKA 共价结合，得到 IR783-R-SP10-PEG-CREKA(简称 SP10-CREKA)。具体步骤如下:
(I) IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超滤后置换成 ρΗ7.4的PBS缓冲液;取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超声2h ;将反应所得物通过预先用PH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的IR783 ;并测量IR783-NHS连接效率。见附图2A。
[0044](2) IR783-R-SP10 的合成:将 40 μ I rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超声2h ;取反应所得物通过预先用pH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的rhodamine-NHS ;并测量rhodamine-NHS连接效率。见附图2B。
[0045](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 20mg Mal_PEG34_SCM(3400KD)，在氮气保护下，25°C 50pr反应2h ;反应物置于超滤管中，4000prm超滤30分钟，分离游离的P EG ;反复超滤3次，收集超滤液；测量PEG连接效率。见附图2C。
[0046](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 400 μ I (lmg/ml);在氮气保护下，25°C，50prm 反应 2h ;4000rpmX 30min，超滤 3次，分离游离CREKA ;计算CREKA连接效率。见附图2D。
[0047]实施例2多功能纳米探针的粒径分布及Zeta电位
分别取 800 μ I SP10、IR783-R-SP10、IR783-R-SP10-PEG 及 IR783-R-SP10-PEG-CREKA溶液，采用粒径/Zeta电位测量仪，测定其光散射粒径和粒子分布宽度。分别取Iml SP10、IR783-R-SP10、IR783-R-SP10-PEG 及 IR783-R-SP10-PEG-CREKA 溶液，分别通过事先用
0.001Μ的NaCl溶液平衡后的Hitrap柱置换缓冲液，采用粒径/Zeta电位测量仪，测定其Zeta电位。
[0048]结果显示，用动态光散射的方法测定纳米探针的流体动力学粒径为103.6±4.7nm，平均 Zeta 电位-2.2±0.7mV。见附图 3。
[0049]实施例3多功能纳米探针对体外血栓的结合能力检测
分别采用荧光显微镜、光学成像系统和MRI成像系统检测多功能纳米探针对血栓纤维蛋白的体外结合能力。具体步骤如下:
(I)荧光显微镜检测:玻片上加入20μ I人新鲜血浆、2μ I CaCl2 (0.4mol/L)溶液及2μ I凝血酶(0.1U/μ I);将玻片置于37°C恒温箱，孵育60分钟；分别加入20 μ I PBS、SPIO-PEG (5mg/ml SP10)及 SP10-CREKA (5mg/ml SP10)后，置于 37°C恒温箱，孵育 15 分钟；PBS清洗5minX3次后荧光显微镜下观察(N3通道，激发546±6nm，激发600±20nm)。
[0050]结果显示，SP10-CREKA组在纤维蛋白栓子表面可观察到红色荧光，而PBS组及SPIO-PEG组均无明显红色荧光。见附图4。
[0051](2)活体光学成像系统检测:96孔板中加入90 μ I人新鲜血浆，5 μ I CaCl2溶液及5μ I凝血酶(0.1 U/μ I);将96孔板置于37°C恒温箱，孵育90分钟；分别加入相应纳米材料 50 μ 1，即 PBS,SPIO-PEG (5mg/ml)及 SPIO-CREKA (5mg/ml)，37°C恒温箱，孵育 30 分钟；PBS清洗5minX 3次后小动物活体成像仪检测(激发波长783nm，发射波长840nm)。
[0052]结果显示，SP10-CREKA组荧光强度为(1.29 土 0.25) X 101CI，而对照组SP10-PEG组为(0.17±0.07) X101Q，SP10-CREKA 组荧光强度为 SPIO-PEG 组的 7.5 倍，/7 < 0.001，实验组荧光强度远远高于对照组。见附图5。
[0053](3) MRI检测:活体成像检测完毕后，在96孔板中血凝块加入100 μ I 2%琼脂糖凝胶，等待其冷却凝固，包埋血凝块；3.0T MR成像，参数设置:T2 fl2d, TR = 800 ms ；TE = 26ms ；flip angle = 25° ;层厚 2 mm, F0V=90 mm，矩阵 256X 160，空气信号强度设置为 O。
[0054]结果显示，SPIO-CREKA组在MRI显示为低信号，信号值为(66.4±13.7)，而SPIO-PGE组信号改变不明显，为(201.8± 11.0)，PBS组信号值为(210.9± 17.2)，SPIO-CREKA 组与 SPIO-PEG 组及 PBS 组比较，/7 < 0.001。见附图 6。
[0055]实施例4多功能纳米探针对大鼠心脏微血栓的多模态成像
(I)心肌缺血再灌注(I/R)法建立大鼠心脏微血栓模型。大鼠开胸后，在左心耳下方2mm处6-0 Prolene线缝针进针，冠脉与结扎线间垫一橡皮筋后将无创伤丝线打活结阻断前降支，在缺血60 min后松开活结，再灌注24h。进行纤维蛋白抗体法免疫荧光染色和心肌透射电镜检测，以验证心脏微血栓形成。
[0056]大鼠心脏缺血再灌注后24h后，在左室前壁可观察到纤维蛋白在微血管内沉积(绿色荧光)，形成纤维蛋白微血栓，而左室后壁、右室未见纤维蛋白免疫荧光(附图7)。透射电镜观察到大鼠心肌缺血再灌注24h后，再灌注区域的毛细血管内分布着数量不等的血小板及红细胞，血小板周围可 见纤维蛋白形成(附图8)。
[0057](2)实验分组。实验动物分为 I/R+PBS、I/R+SPIO-PEG、I/R+SP10-CREKA 及Sham+SPIO-CRKEA组，每组11大鼠。I/R+PBS组:SD大鼠接受I/R手术操作，再灌注24h后尾静脉注射0.2ml PBS,作为对照。I/R +SPIO-PEG组:SD大鼠接受I/R手术操作，再灌注 24h 后尾静脉注射 0.2ml SPIO-PEG 溶液(20mg SPIO/kg)。I/R+SP10-CREKA 组:SD 大鼠接受I/R手术操作，再灌注24h后尾静脉注射0.2ml SPIO-CREKA溶液(20mg SPIO/kg)。Sham+SP IO-CRKEA组:SD大鼠接受假手术操作，术后24h静脉注射0.2ml SPIO-CREKA溶液(20mg SPIO/kg)。
[0058](3)大鼠心脏微血栓的MRI成像:大鼠接受尾静脉注射相应纳米材料4小时后进行3T小动物线圈磁共振显像。MRI成像参数:T2 fl2d，重复时间(TR)750 ms，回波时间(TE)2，8ms，层厚2mm，偏转角20。，视野(FOV) 90mm，矩阵400 X 400，26个心动周期；使用ImageJ software 1.37v软件分析左室心肌信号强度，计算左室前壁相对信号强度=左室前壁信
号强度/左室后壁信号强度。
[0059]结果显示，SPIO-CREKA组大鼠心脏左室前壁左前降支供血区在T2加权像是显示为低信号，LVAM相对信号强度为(0.65±0.07)，SP10-PEG组为(0.95±0.08)，PBS组为(0.99 ±0.11)，SPIO-CREKA 组与其相比，P<Q.01, sham 组接受 SP10-CREKA 其 LVAM 相对信号强度为(0.92±0.06)。见附图9。
[0060](4)心脏及主要器官离体光学成像:腹腔注射氯胺酮麻醉后，打开大鼠胸腔，剪开右心耳，沿心尖部注射生理盐水20ml心脏灌流；取下心脏及主要器官:肝脏、脾脏、肺、肾脏及脑，用生理盐水充分洗涤后，滤纸吸干；将心脏及主要器官置于小动物活体成像仪中检测，激发波长为783nm,发射波长为840nm。[0061]结果显示SP10-CREKA组心脏局部荧光强度是SP10-PEG组的1.95倍(1.88±0.5X107 vs.0.96±0.09Χ107，P<Q.001)，PBS 组荧光强度为 0.99±0.IXlO7，sham+SPIO-CREKA 组荧光强度为 0.94±0.I X 107(附图 10)。SPIO-CREKA 及 SPIO-PEG 主要分布在肝脏及肾脏内，连接CREKA并未改变SPIO组织分布(附图11)。
[0062](5)SPIO-CREKA靶向微血栓的激光共聚焦和电镜检测:为进一步证实SP10-CREKA对微血栓的靶向性，激光共聚焦显微镜和透射电镜检测大鼠心脏微血栓与SP10-CREKA的共定位。
[0063]共聚焦观察大鼠I/R后组织切片可发现，SP10-CREKA组心脏血管内可观察到SPIO-CREKA (红光)结合在微血栓(绿色)表面，而PBS组及SPIO-PEG组未见明显红色荧光(附图12)。Steffen等研究表明在缺血再灌注的微循环中，纤维蛋白与血小板共同沉积在微血管表面。本研究结果显示，血小板直接粘附在血管内皮细胞表面，同时在血管壁、血小板及红细胞等表面可见密度较大的SP10-CREKA颗粒，结果表明SP10-CREKA对微血栓有较好的靶向能力。见附图13。
[0064]实施例5多功能纳米探针IR783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(二)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超滤后置换成 ρΗ7.4的PBS缓冲液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超声2h ;将反应所得物通过预先用PH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的IR783 ;并测量IR783-NHS连接效率，每颗SPIO磁珠上连接约300个IR783分子。
[0065](2) IR783-R-SP10 的合成:将 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超声2h ;取反应所得物通过预先用pH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的Rhodamine-NH S ;并测量rhodamine-NHS连接效率，每个IR783-SP10上约连接1500个 Rhodamine 分子。
[0066](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 22mg Mal_PEG34_SCM(3000KD)，在氮气保护下，25°C 50pr反应2h ;反应物置于超滤管中，4000prm超滤30分钟，分离游离的PEG ;反复超滤3次，收集超滤液；测量PEG连接效率，每个IR783-R-SP10上约连接7700个PEG分子。
[0067](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 500 μ I (lmg/ml);在氮气保护下，25°C，50prm 反应 2h ;4000rpmX 30min，超滤3次，分离游离CREKA ;计算CREKA连接效率，每个IR783-R-SP10-PEG约连接2200个CREKA分子。
[0068]实施例6多功能纳米探针IR783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(三)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超滤后置换成 ρΗ7.4的PBS缓冲液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超声2h ;将反应所得物通过预先用PH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的IR783 ;并测量IR783-NHS连接效率，每颗SPIO磁珠上连接约300个IR783分子。
[0069](2) IR783-R-SP10 的合成:将 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超声2h ;取反应所得物通过预先用pH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的Rhodamine-NHS ;并测量rhodamine-NHS连接效率，每个IR783-SP10上约连接1500个 Rhodamine 分子。[0070](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 17mg Mal_PEG34_SCM(3800KD)，在氮气保护下，25°C 50pr反应2h ;反应物置于超滤管中，4000prm超滤30分钟，分离游离的PEG ;反复超滤3次，收集超滤液；测量PEG连接效率，每个IR783-R-SP10上约连接4500个PEG分子。
[0071](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 300 μ I (lmg/ml);在氮气保护下，25°C，50prm 反应 2h ;4000rpmX 30min，超滤3次，分离游离CREKA ;计算CREKA连接效率，每个IR783-R-SP10-PEG约连接1800个CREKA分子。
[0072]对比例I多功能纳米探针IR783-R-SP10-PEG-CREKA的合成(四)
(I)IR783-SP10 的合成:取 20mg SPIO 即 4ml SPIO 溶液(5mg/ml)超滤后置换成 ρΗ7.4的PBS缓冲液；取20 μ I IR783-NHS (10mg/ml)加入至SPIO溶液中，25°C，50W超声2h ;将反应所得物通过预先用PH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的IR783 ;并测量IR783-NHS连接效率，每颗SPIO磁珠上连接约300个IR783分子。
[0073](2) IR783-R-SP10 的合成:将 40 μ I Rhodamine-NHS 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W超声2h ;取反应所得物通过预先用pH7.4的PBS缓冲液平衡的Hitrap柱，去除未连接的Rhodamine-NHS ;并测量rhodamine_NHS连接效率，每个IR783-SP10上约连接1500个 Rhodamine 分子。
[0074](3) IR783-R-SP10-PEG 的合成:取 IR83-R-PEG 20mg 加入 15mg Mal_PEG34_SCM(3800KD)，在氮气保护下，25°C 50pr反应2h ;反应物置于超滤管中，4000prm超滤30分钟，分离游离的PEG ;反 复超滤3次，收集超滤液；测量PEG连接效率，每个IR783-R-SP10上约连接3800个PEG分子。
[0075](4) IR783-R-SP10-PEG-CREKA 的合成:取 20mg IR783-R-SP10-PEG PBS 溶液加入CREKA 溶液 200 μ I (lmg/ml);在氮气保护下，25°C，50prm 反应 2h ;4000rpmX 30min，超滤3次，分离游离CREKA ;计算CREKA连接效率，每个IR783-R-SP10-PEG约连接1600个CREKA分子。
[0076]实施例7实施例5-6及对比例I制备的多功能纳米探针对体外血栓的结合能力检测按照实施例3的方法分别采用荧光显微镜、光学成像系统和MRI成像系统检测实施例5-6及对比例I制备的多功能纳米探针对血栓纤维蛋白的体外结合能力。荧光显微镜检测结果显示各组在纤维蛋白栓子表面可观察到红色荧光。活体光学成像系统检测结果显示实施例5、实施例6、对比例I组荧光强度分别为:(1.01 ± 0.15) X 10'(1.08 ± 0.19) X 10'(058 ± 0.09)X101CI，实施例5、实施例6分别与对比例I组荧光强度比较，/7 < 0.001。MRI检测结果显示，实施例5、实施例6、对比例I组信号值分别为(78.6±12.5)、(82.5± 12.9)、(120.3±16.1)，实施例5、实施例6分别与对比例I组MRI信号值比较，产< 0.01。以上结果表明CREKA连接效率以及Mal-PEG与CREKA的摩尔比对于多功能纳米探针光学成像和磁共振显象会产生显著影响。
[0077]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，包括磁共振探针、近红外荧光探针、荧光染料、表面修饰分子和纤维蛋白靶向分子， 所述磁共振探针为SPIO ； 所述近红外荧光探针为IR783 ； 所述突光染料为Rhodamine ； 所述表面修饰分子为PEG ； 所述纤维蛋白靶向分子为CREKA。
2.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，所述SPIO为葡聚糖包裹、表面为氨基活性基团的纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，所述PEG为Mal-PEG34-SCM,所述 Mal_PEG34_SCM 为 3000-3800KD，优选 3400KD。
4.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，所述CREKA为半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸五肽。
5.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，所述IR783、Rhodamine均与SPIO连接，所述SPIO被PEG所修饰，所述CREKA通过PEG桥连在SPIO的氨基上。
6.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，每个SPIO表面平均连接有1800-2200个CREKA分子，优选2000个CREKA分子。
7.根据权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒，其特征在于，所述PEG与CREKA的摩尔比为(2.5-3.5):1，优选为3:1。
8.权利要求1所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a)纳米颗粒的近红外荧光标记:将近红外荧光探针IR783连接到磁共振探针SPIO表面，得至Ij IR783-SP10 ； b)纳米颗粒的荧光染料标记:将荧光染料Rhodamine连接到步骤a)制备的IR783-SP10表面，得到 IR783-R-SP10 ； c)PEG修饰纳米颗粒:将PEG连接到步骤b)制备的IR783-R-SP10表面，得到IR783-R-SP10-PEG ； d)纤维蛋白靶向分子CREKA偶联:通过步骤c)制备的IR783-R-SP10-PEG表面修饰的PEG与纤维蛋白靶向分子CREKA进行偶联。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法具体为: a)将磁共振探针SPIO溶液和近红外荧光探针IR783-NHS溶液25°C条件下50W超声震荡反应2h获得IR783-SP10溶液，其中所述SPIO与IR783-NHS的质量比为100:1 ; b)将Rhodamine 加入至 IR783-SP10 溶液中，25°C，50W 超声 2h 获得 IR783-R-SP10 溶液； c)将Mal-PEG34-SCM加入到IR783-R-SP10溶液中，在氮气保护下，25°C50prm反应2h,然后4000prm超滤30分钟获得IR783-R-SP10-PEG溶液，其中所述Mal_PEG34_SCM与IR783-R-SP10 的质量比为 1:1 ； d)向IR783-R-SP10溶液加入CREKA溶液，在氮气保护下，25°C 50prm反应2h，然后4000rpm超滤30min，共3次，其中所述IR783-R-SP10与CREKA质量比为50:1。
10.权利要求1-7任一所述的纤维蛋白靶向多模态纳米颗粒的用途，其特征在于，用于制备血栓早期诊断和 /或实时示踪的试剂。
【文档编号】A61K49/00GK104013977SQ201410248305
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】葛均波, 钱菊英, 黄浙勇, 宋亚楠, 庞志清 申请人:复旦大学附属中山医院