从紫苏叶中提取高纯度总三萜酸类化合物的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物有效成分提取【技术领域】，具体涉及一种从紫苏叶中提取高纯度的以熊果酸为主并包含齐墩果酸的总三萜酸类化合物的方法及其应用。该方法采用乙醇对紫苏叶进行提取，提取液回收乙醇后，稠膏再用热水洗涤以除去水溶性物质，水洗后的残渣用含碱性乙醇溶液进行提取，提取液先用活性炭进行脱色处理，然后回收乙醇至近干后，残渣再用适量乙醇溶解，用盐酸调pH，使沉淀，滤取沉淀，沉淀先用适量乙醇洗涤，除去残留的母液，然后再用适量热水洗涤除去残留的盐，干燥，得到产物。该方法获得的总三萜纯度较高，操作简单，适用于大工业生产。
【专利说明】从紫苏叶中提取高纯度总三萜酸类化合物的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物有效成分提取【技术领域】，具体涉及一种从紫苏叶中提取高纯度的 以熊果酸和齐墩果酸为主的总三萜酸类化合物的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 萜酸类化合物是具有广泛的药理作用和重要的生物活性的一类物质，其广泛存在 于植物中。大量的动物试验和临床预试研究已显示，萜酸类化合物在抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗 HIV和护肝等方面均显现出令人关注的药理特性，并且在治疗肿瘤、肝炎和生产化妆品等方 面已开发了许多药用产品。其中，研究应用较多的是熊果酸和齐墩果酸，市面上常见的产品 有齐墩果酸片（胶囊）、泰脂安胶囊等产品。现有技术研究发现，紫苏叶中含有的总三萜酸 类化合物以熊果酸和齐墩果酸为主，其具有显著地抗抑郁活性，各种研究结果证明其具有 明显的成药价值。
[0003] 毫无疑问，如何从植物中提取、制备高纯度的总三萜酸类物质，是开发相关产品的 关键技术之一。但现有技术中公开的几种常用的从植物中提取、制备较高纯度熊果酸或同 类三萜酸类化合物的方法，主要有溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、或通过水解将三萜酸苷类 除去糖后再制备的方式。但是，溶剂萃取法一般需要使用石油醚对提取物进行脱脂处理，对 车间的防爆提出极高的要求，使得工业应用受到限制，同时萃取操作不仅受环境影响大，且 易乳化，使得提取结果的重复性较差；而大孔吸附树脂法则主要有树脂残留和操作重复性 较差等问题。
【发明内容】
[0004] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种采用"碱溶-酸沉法"从紫苏叶中 提取高纯度的以熊果酸和齐墩果酸为主的总三萜类化合物的方法及其应用。
[0005] 本发明为解决上述问题，提供了一种从紫苏叶中提取高纯度总三萜酸类化合物的 方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0006] (1)取紫苏叶药材，加入乙醇进行提取，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至 稠浸膏，并将所述稠浸膏加沸水洗涤；
[0007] (2)取水洗后的稠浸膏加入碱性乙醇溶液混匀，并过滤；
[0008] (3)取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干；
[0009] (4)取回收物加入乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值至强酸性，滤过取沉淀物； [0010] (5)取沉淀物以强酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀物表面的母液，然后加沸水洗 漆，烘干，即得。
[0011] 进一步的，所述的方法包括如下步骤：
[0012] (1)取紫苏叶药材0· 5-2重量份，加入4-15体积份浓度为75% -100%的乙醇，提 取1-3次，每次40-120min，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠 浸膏加入5-30重量倍量的沸水，洗涤2-5次；
[0013] (2)取水洗后的稠浸膏加入6-10重量倍量浓度为0. 3-1. 5 %的碱性乙醇溶液混 匀，并过滤；
[0014] (3)取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干；
[0015] (4)取回收物加入浓度为80%-95%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为 0. 8-2,滤过取沉淀物；
[0016] (5)取沉淀以pH值为0.8-1. 5、浓度为60%-90%的酸性乙醇洗漆，除去残留在沉 淀表面的母液，然后加4-8重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得；
[0017] 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL的关系。
[0018] 更进一步的，所述的方法包括如下步骤：
[0019] (1)取紫苏叶药材1重量份，加入15体积份浓度为95%的乙醇提取2次，每次提 取2h，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入15重量倍量 的沸水，洗涤2-5次；
[0020] (2)取水洗后的稠浸膏加入6重量倍量浓度为1. 0%的碱性乙醇溶液混匀，并过 滤；
[0021] (3)取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干；
[0022] (4)取回收物加入滤液等量的浓度为85%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为 1. 0,滤过取沉淀物；
[0023] (5)取沉淀以pH值为1. 0、浓度为85%的酸性乙醇洗漆，除去残留在沉淀表面的母 液，然后加4-8重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得；
[0024] 或
[0025] (1)取紫苏叶药材1重量份，加入15体积份浓度为85%的乙醇提取2次，每次提 取2h，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入10重量倍量 的沸水，洗涤4次；
[0026] (2)取水洗后的稠浸膏加入6重量倍量浓度为1. 0%的碱性乙醇溶液混匀，并过 滤；
[0027] (3)取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干；
[0028] (4)取回收物加入滤液等量的浓度为85%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为 1. 5,滤过取沉淀物；
[0029] (5)取沉淀以pH值为1. 5、浓度为85%的酸性乙醇洗漆，除去残留在沉淀表面的母 液，然后加6重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得；
[0030] 或
[0031] (1)取紫苏叶药材1重量份，加入5体积份浓度为75 %的乙醇提取3次，每次提取 2h，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入15重量倍量的 沸水，洗涤3次；
[0032] (2)取水洗后的稠浸膏加入10重量倍量浓度为1. 0 %的碱性乙醇溶液混匀，并过 滤；
[0033] (3)取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干；
[0034] (4)取回收物加入滤液等量的浓度为80%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为 0. 8,滤过取沉淀物；
[0035] (5)取沉淀以pH值为0. 8、浓度为80%的酸性乙醇洗漆，除去残留在沉淀表面的母 液，然后加6重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得。
[0036] 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL的关系。
[0037] 更进一步的，任一所述的方法，所述步骤（2)中，所述碱性乙醇溶液为Κ0Η乙醇溶 液或NaOH乙醇溶液。
[0038] 任一所述的方法，所述步骤（3)中，所述活性炭的加入重量为所述滤液体积的 1. 5-3%。
[0039] 任一所述的方法，所述步骤（3)中，还包括加入活性炭后进行加热回流处理并冷 却至室温的步骤。
[0040] 进一步的，任一所述的方法提取得到的总三萜酸类提取物。
[0041] 更进一步的，所述提取物选择性添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受 的制剂。
[0042] 所述的制剂包括丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或 冻干粉针剂。
[0043] 本发明的上述技术方案所提取的制备工艺安全环保，操作过程没有使用有毒害的 化学试剂，有利于操作人员的身体健康，而且该工艺操作简单、成本低，副产物少、原料的回 收率很高、不仅受环境影响、操作的重复性很高。所提取产物中熊果酸的含量和纯度均很 高，并且含有一定的齐墩果酸，产品不易乳化，具有很高的经济应用前景。
[0044] 实验例
[0045] 1、实验材料
[0046] 1. 1 试剂
[0047] 香草醛（分析纯）、高氯酸（分析纯）、冰醋酸（分析纯）、醋酸乙酯（分析纯）、三 乙胺（分析纯）、甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）。
[0048] 1. 2主要仪器
[0049] 岛津UV-2401PC型紫外可见分光光度计、岛津LC-10AT高效液相色谱仪、DI0NEX P680高效液相色谱仪（戴安公司）、SPD-10AVP紫外检测器、浙大智能N2000工作站、电热恒 温鼓风干燥箱（型号：101-3 ;上海跃进医疗器械厂）、D-800LS智能药物溶出仪（天津大学 无线电厂）、SENCO?: R系列旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）、BECKMAN DU640型紫 外可见分光光度计（岛津公司）、Sartorius BP211D型电子天平（德国赛多利斯）、METTLER TOLEDO XP56型电子天平（瑞士梅特勒-托利多）、VD53型真空干燥箱（德国BINDER)。
[0050] 1. 3 药材
[0051] 紫苏叶（广东、江苏、安徽产）。
[0052] 1.4对照品
[0053] 熊果酸（中国药品生物制品检定所提供，批号：0742-200010纯度为98. 37% )。
[0054] 2、对产物中总三萜的含量和熊果酸的含量测定方法
[0055] 2. 1总三萜的含量具体的测定方法
[0056] 对照品溶液的制备：精密称取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含熊果酸 60 μ g的溶液，即得；
[0057] 供试品溶液的制备：取本品0. 015g，精密称定，置250ml量瓶中，加甲醇使溶解，并 稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（〇.45μπι)滤过，取续滤液，即得；
[0058] 测定法：精密量取供试品溶液和对照品溶液各1ml，置具塞刻度试管中，水浴挥干 甲醇，冷却至室温，分别依次加入新配制的5 %香草醛冰醋酸溶液0. 2ml、高氯酸0. 8ml，摇 匀，密塞，70°C水浴加热15分钟，流水冷却，加乙酸乙酯4ml，摇匀，密塞，放置30分钟，以空 白试剂为空白，于556nm波长处分别测定吸收度，计算，即得。
[0059] 2. 2紫苏叶中熊果酸的含量测定
[0060] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-甲 醇-水-冰乙酸-三乙胺（60 :30 :10 :0. 15 :0. 3)为流动相；检测波长为215nm，理论板数 按熊果酸峰计算应不低于10000 ;
[0061] 对照品溶液的制备：精密称取熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含熊果酸 l〇〇g的溶液，即得；
[0062] 供试品溶液的制备：取供试品，研细，取0. 015g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇 溶解，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μπι)滤过，取续滤液，即得。
[0063] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0064] 采用HPLC法，测定五批原料药材熊果酸含量，实验结果见表-1，高效液相色谱见 图-2。图2中峰可见，采用上述方法还可以有效检测紫苏叶中含有的齐墩果酸的含量。 [0065] 表-1紫苏叶中熊果酸含量测定结果
[0066]
【权利要求】
1. 一种从紫苏叶中提取高纯度总三萜酸类化合物的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 取紫苏叶药材，加入乙醇进行提取，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至稠浸 膏，并将所述稠浸膏加沸水洗涤； (2) 取水洗后的稠浸膏加入碱性乙醇溶液混匀，并过滤； (3) 取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干； (4) 取回收物加入乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值至强酸性，滤过取沉淀物； (5) 取沉淀物以强酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀物表面的母液，然后加沸水洗涤，烘 干，即得。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取紫苏叶药材〇. 5-2重量份，加入4-15体积份浓度为75 % -100 %的乙醇，提取1-3 次，每次40-120min，滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加 入5-30重量倍量的沸水，洗涤2-5次； (2) 取水洗后的稠浸膏加入6-10重量倍量浓度为0. 3-1. 5%的碱性乙醇溶液混匀，并 过滤； (3) 取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干； (4) 取回收物加入浓度为80 % -95 %的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为0. 8-2,滤 过取沉淀物； (5) 取沉淀以pH值为0. 8-1. 5、浓度为60% -90%的酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀表 面的母液，然后加4-8重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得； 所述重量份与所述体积份的关系为g/mL的关系。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取紫苏叶药材1重量份，加入15体积份浓度为95%的乙醇提取2次，每次提取2h， 滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入15重量倍量的沸 水，洗漆2_5次； (2) 取水洗后的稠浸膏加入6重量倍量浓度为1. 0%的碱性乙醇溶液混匀，并过滤； (3) 取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干； (4) 取回收物加入滤液等量的浓度为85%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为1. 0， 滤过取沉淀物； (5) 取沉淀以pH值为1. 0、浓度为85%的酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀表面的母液， 然后加4-8重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得； 或 (1) 取紫苏叶药材1重量份，加入15体积份浓度为85%的乙醇提取2次，每次提取2h， 滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入10重量倍量的沸 水，洗涤4次； (2) 取水洗后的稠浸膏加入6重量倍量浓度为1. 0%的碱性乙醇溶液混匀，并过滤； (3) 取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干； (4) 取回收物加入滤液等量的浓度为85%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为1. 5， 滤过取沉淀物； (5)取沉淀以pH值为1. 5、浓度为85%的酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀表面的母液， 然后加6重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得； 或 (1) 取紫苏叶药材1重量份，加入5体积份浓度为75%的乙醇提取3次，每次提取2h， 滤过并合并提取液，减压回收乙醇，浓缩为稠浸膏，并将所述稠浸膏加入15重量倍量的沸 7K，洗漆3次； (2) 取水洗后的稠浸膏加入10重量倍量浓度为1. 0%的碱性乙醇溶液混匀，并过滤； (3) 取滤液加入活性炭进行吸附处理，滤过后取滤液减压回收乙醇至干； (4) 取回收物加入滤液等量的浓度为80%的乙醇溶解，并以盐酸调节溶液pH值为0. 8， 滤过取沉淀物； (5) 取沉淀以pH值为0. 8、浓度为80%的酸性乙醇洗涤，除去残留在沉淀表面的母液， 然后加6重量倍量的沸水洗涤，烘干，即得。
4. 如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中，所述碱性乙醇溶液 为KOH乙醇溶液或NaOH乙醇溶液。
5. 如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述活性炭的加入 重量为所述滤液体积的1. 5-3%。
6. 如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，还包括加入活性炭 后进行加热回流处理并冷却至室温的步骤。
7. 由权利要求1-6任一所述的方法提取得到的总三萜酸类提取物。
8. 由权利要求7所述提取物选择性添加常规辅料，按照常规工艺制成的临床可接受的 制剂。
9. 根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片 齐?、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂。
【文档编号】A61P25/24GK104208145SQ201410483987
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】陈周全, 谭沛, 韩正洲, 谈英, 马鹏岗 申请人:华润三九医药股份有限公司