新的抗‑RNF43抗体和使用方法与流程

本申请要求2014年4月21日提交的美国临时申请号61/982,294的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。序列表本申请包含以ASCII格式通过EFS-Web提交和藉此通过引用以其整体结合到本文中的序列表。所述ASCII副本创建于2015年4月21日，被命名为sc3701pct_S69697_1210WO_SEQL_042115.txt，大小为278,070(271KB)。发明领域本申请主要涉及新的抗-RNF43抗体或其免疫反应片段和包含所述抗体或其免疫反应片段的组合物(包括抗体药物缀合物)，用于治疗、诊断或预防癌症和其任何复发或转移。本发明选择的实施方案提供这样的抗-RNF43抗体或抗体药物缀合物用于治疗癌症(包括减少致瘤细胞频率)的用途。发明背景干细胞和祖细胞的分化和增殖是在器官发生、细胞修复和细胞更换期间共同起作用以支持组织生长的正常进行的过程。系统被严格调节以确保根据生物体的需要仅产生合适的信号。细胞增殖和分化通常仅为更换损伤或濒死的细胞或为生长而按需要发生。然而，这些过程的中断可由许多因素触发，包括各种信号转导化学物质的过少或过多、存在改变的微环境、遗传突变或其组合。正常细胞增殖和/或分化的中断可导致各种病症，包括增殖性疾病，例如癌症。对癌症的常规治疗性治疗包括化学疗法、放射疗法和免疫疗法。这些治疗经常是无效的，和手术切除可能不会提供可行的临床备选方案。在患者经历一线治疗并随后复发的情况下，当前护理标准的局限性特别明显。在这样的情况下频繁发生难治性肿瘤，经常是侵略性和不可治愈的。多年以来，许多实体肿瘤的总体存活率在很大程度上仍未改变，这至少部分地归因于现有疗法不能预防再发、肿瘤复发和转移。因此，仍然极其需要开发增殖性病症的更具靶向和有效的疗法。本发明解决了这一需要。发明概述本发明总体上涉及可用于预防、诊断或治疗癌症的抗体、抗体药物缀合物(ADC)和药物组合物。在某些实施方案中，本发明包含式M-[L-D]n的抗体药物缀合物或其药学上可接受的盐，其中M包含抗-RNF43抗体；L包含接头；D包含细胞毒素；和n是1-20的整数。在另一个实施方案中，本发明的抗-RNF43ADC包含作为内化抗体的抗-RNF43抗体。在另一方面，本发明涉及作为内化抗体的抗-RNF43抗体。在进一步的实施方案中，本发明的抗-RNF43ADC包含作为嵌合抗体、CDR移植抗体或人源化抗体或其片段的抗-RNF43抗体。在进一步的方面，本发明涉及抗-RNF43抗体，其是嵌合的、CDR移植的或人源化的。在本发明的一个方面，本发明的抗-RNF43ADC包含结合肿瘤引发细胞的抗-RNF43抗体。在另一方面，本发明涉及结合肿瘤引发细胞的抗-RNF43抗体。本发明还包含抗-RNF43ADC，其包含与人RNF43(SEQIDNO:5)结合且不与人ZNRF3(SEQIDNO:6)结合的抗-RNF43抗体。在另一方面，本发明涉及与人RNF43(SEQIDNO:5)结合且不与人ZNRF3(SEQIDNO:6)结合的抗-RNF43抗体。已经表明RNF43是WNT信号转导途径的一种负反馈调节物，因此结合RNF43的抗体可具有干扰RNF43功能的能力。如本文所示，存在三个主要类型的抗-RNF43抗体：作为关于WNT信号转导的“中立抗体”且不影响WNT信号转导途径的抗体，增加WNT信号转导的抗体，和减少WNT信号转导的抗体。因此在一个方面，本发明涉及包含抗-RNF43抗体的抗-RNF43ADC，所述抗体在真核细胞的表面上与人RNF43(SEQIDNO:5)结合，其中抗体的结合减少WNT信号转导。在进一步的方面，本发明涉及包含抗-RNF43抗体的抗-RNF43ADC，所述抗体在真核细胞的表面上与人RNF43(SEQIDNO:5)结合，其中抗体的结合增加WNT信号转导。在又一方面，本发明涉及包含抗-RNF43抗体的抗-RNF43ADC，所述抗体在真核细胞的表面上与人RNF43(SEQIDNO:5)结合，其中抗体的结合不影响WNT信号转导。因此，在一些方面，本发明的抗-RNF43ADC将包含作为关于WNT信号转导的“中立抗体”的抗-RNF43抗体。在进一步的方面，本发明涉及与人RNF43(SEQIDNO:5)结合并且增加、减少或不影响WNT信号转导的抗-RNF43抗体。R-spondin(RSPO)是参与WNT信号转导途径的蛋白，并阻断RNF43，因此导致WNT配体产生的增量调节和WNT信号转导增加。在一个实施方案中，本发明的抗-RNF43ADC包含与人RNF43(SEQIDNO:5)结合且阻断R-spondin与RNF43的结合的抗-RNF43抗体。在另一方面，本发明涉及与人RNF43(SEQIDNO:5)结合且不阻断R-spondin与RNF43的结合的抗-RNF43抗体。在本发明的另一方面，本发明的抗-RNF43ADC包含在真核细胞的表面上与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的抗-RNF43抗体，其中抗体的结合不阻断R-spondin刺激的WNT信号转导。在另外的实施方案中，本发明的抗-RNF43ADC包含在真核细胞的表面上与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的抗-RNF43抗体，其中抗体的结合阻断R-spondin-刺激的WNT信号转导。在一个实施方案中，本发明涉及这样的分离的抗体，其与人RNF43(SEQIDNO:5)结合并与包含以下的抗体竞争人RNF43的结合：(1)SEQIDNO:78所示的轻链可变区和SEQIDNO:80所示的重链可变区；或(2)SEQIDNO:110所示的轻链可变区和SEQIDNO:112所示的重链可变区。在另一个实施方案中，本发明涉及与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的分离的抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含以下轻链互补决定区(CDRL):CDRL1:SEQIDNO:288;CDRL2:SEQIDNO:289;CDRL3:SEQIDNO:290；和所述重链包含以下重链互补决定区(CDRH):CDRH1:SEQIDNO:291;CDRH2:SEQIDNO:292;CDRH3:SEQIDNO:293。在另外的实施方案中，本发明涉及与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的分离的抗体，其包含轻链和重链，所述轻链包含以下轻链互补决定区(CDRL):CDRL1:SEQIDNO:294;CDRL2:SEQIDNO:295;CDRL3:SEQIDNO:296；和所述重链包含以下CDRH:CDRH1:SEQIDNO:297;CDRH2:SEQIDNO:298;CDRH3:SEQIDNO:299。本发明的一个方面是与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的人源化抗体，其包含SEQIDNO:273所示的轻链和SEQIDNO:275所示的重链。本发明的另一方面是与人RNF43(SEQIDNO:5)结合的人源化抗体，其包含SEQIDNO:276所示的轻链和SEQIDNO:278所示的重链。本发明的进一步的方面是编码SEQIDNO:273或276所示的轻链或SEQIDNO:275或278所示的重链的核酸。在另一方面，本发明是包含载体的宿主细胞，所述载体包含上述核酸。在另一方面，本发明涉及包含本文所述的任何抗-RNF43抗体或ADC的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给予有需要的受试者本发明的药物组合物。在一些方面，癌症选自结肠直肠癌或肺癌。附图简述图1A描述使用源自正常组织和患者来源的异种移植物(PDX)肿瘤细胞的RNA的全转录组(SOLiD)测序测量的RNF43的表达水平。图1B表明使用源自正常组织和患者来源的异种移植物(PDX)肿瘤细胞的RNA的全转录组(Illumina)测序测量的RNF43的表达水平。图2A描述在自正常组织和自各种PDX肿瘤分离的RNA样品中通过qRT-PCR测量的RNF43转录物的相对表达水平。图2B描述在自各种正常组织和自分离自各种PDX肿瘤的癌症干细胞(CSC)和非致瘤性(NTG)细胞分离的RNA样品中通过qRT-PCR测量的RNF43转录物的相对表达水平。图3表明在正常组织和各种PDX细胞系中通过微阵列杂交测量的RNF43转录物表达的标准化强度值。图4表明在正常组织和来自癌症基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)(一个公众可得的数据集)的原发肿瘤中RNF43转录物的表达。图5A表明示例性的抗-RNF43抗体的各种生理学和功能特征。图5B表明RNF43(SEQIDNO:3)和ZNRF3(SEQIDNO:4)的细胞外结构域的比对。图6A表明在简化形式的典型的WNT信号转导途径中遗传相互作用的图示。图6B表明在响应用包含或缺乏WNT3A的条件培养基处理时，在存在或不存在RNF43的过表达的情况下，一对典型的WNT信号转导报告细胞系的行为。图7A和7B提供示例性的鼠和人源化抗-RNF43抗体的轻链和重链可变区的连续的氨基酸序列(SEQIDNO:22-268，偶数)。图7C提供编码图7A和7B中的抗-RNF43抗体的氨基酸序列的核酸序列(SEQIDNO:21-269，奇数)。图7D提供全长人源化抗体hSC37.2、hSC37.17、hSC37.17ss1、hSC37.39、hSC37.39ss1、hSC37.67和hSC37.67变体1的氨基酸序列。图7E-7H表明小鼠抗-RNF43抗体SC37.2(图7E)、SC37.17(图7F)、SC37.39(图7G)和SC37.67(图7H)的轻链和重链可变区的带注释的氨基酸序列(按照Kabat等编号)，其中CDR使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法衍生。图8表明使用电化学发光夹心ELISA测定法测量的人RNF43的相对蛋白表达。图9表明在各种PDX肿瘤细胞系中通过原位杂交测定的RNF43的RNA表达。图10表明在癌症干细胞(CSC)(实心黑线)或非致瘤细胞(NTG)(虚黑线)中，与同种型对照染色群(实心灰色)相比，在代表性的PDX细胞系中通过流式细胞术测定的RNF43的表面蛋白表达(黑线)。关于测试的各PDX系，对于IgG1同种型对照抗体和抗-RNF43抗体，显示了平均荧光强度(MFI)值。图11表明选择的抗-RNF43人源化抗体(组合了与皂草素(saporin)直接缀合的山羊抗人抗体)内化至过表达RNF43蛋白的HEK293T细胞和杀死所述细胞的能力。发明详述本发明可以许多不同的形式体现。本文公开了本发明的非限制性的说明性实施方案，其举例说明了本发明的原理。本文使用的任何章节标题仅为组织目的，和不应解释为限制所述的主题。为本文公开的目的，所有识别序列登记号可见于NCBI参考序列(NCBIReferenceSequence,RefSeq)数据库和/或NCBIGenBank®档案序列数据库，除非另外注明。已令人惊讶地发现，RNF43是许多肿瘤类型的生物标记物，和可利用这种关联来治疗这样的肿瘤。还出人意料地发现，RNF43与致瘤细胞有关，和可有效地利用RNF43来抑制或消除它们。致瘤细胞，其将在下文更详细地描述，已知对许多常规治疗显示抗性。与现有技术的教导相比，本发明公开的化合物和方法有效地克服这种固有的抗性。本发明提供抗-RNF43抗体(包括抗体药物缀合物)和它们在预后、诊断、治疗诊断(theragnosis)、治疗和/或预防各种RNF43-相关的癌症中的用途，而无关乎任何特定的作用机制或特别靶向的细胞或分子组分。I.RNF43生理学RING指蛋白43(RNF43；亦称为E3泛素-蛋白连接酶RNF43或RNF124)是一种单通道1型跨膜蛋白，其作为WNT信号转导的重要的反馈调节物起作用。代表性的RNF43蛋白直向同源物包括但不限于人(NP_060233)、黑猩猩(XP_001172611)、恒河猴(XP_001106574)、大鼠(NP_001129393)和小鼠(NP_766036)。在人中，RNF43基因由跨越染色体17的细胞遗传位点17q22上的大约63.9kBp的10个外显子组成。人RNF43基因座的转录得到剪接的4.6kBp成熟mRNA转录物(NM_017763)，其编码783个氨基酸的前蛋白(NP_060233)。RNF43前蛋白的加工预期包括除去包含分泌信号肽的前23个氨基酸。成熟RNF43蛋白预期包含174个氨基酸的细胞外结构域(氨基酸24–197)、21个氨基酸的螺旋跨膜结构域(氨基酸198–218)和565个氨基酸的胞质结构域(氨基酸219–783)，其一部分包含非典型的RING结构域锌指(氨基酸272–313)，该蛋白的名字来源于此。RING结构域是与介导蛋白-蛋白相互作用的锌指结构的形成有关的序列确定的结构域，通常存在于参与蛋白遍在化(ubiquitylation)过程的蛋白中。蛋白的遍在化是一个生物学缀合过程，其中热稳定的76个氨基酸的蛋白泛素(Ub)共价连接至靶蛋白的各个赖氨酸残基。Ub通过其C-端甘氨酸残基(UbG76)添加至靶蛋白的赖氨酸的ε-氨基(对于综述，参见Shen等，2013;PMID23822887)。此外，因为Ub本身包含7个赖氨酸(UbK6、UbK11、UbK27、UbK29、UbK33、UbK49和UbK63)，因此在给定的赖氨酸上靶蛋白的初始单-遍在化之后，靶蛋白可通过Ub部分彼此的连锁而被多遍在化。细胞利用Ub标签作为运输遍在化蛋白的信号，这取决于Ub共价连接的性质和Ub标签的多聚化状态。例如，当蛋白被包含UbG76-UbK48连键的多聚Ub链标记时，发生将错误折叠、氧化或短寿的蛋白靶向26S蛋白酶体，所谓的泛素-蛋白酶体系统(Dikic等，2009;PMID:19773779)。相比之下，多个单遍在化可指导细胞表面蛋白(例如受体酪氨酸激酶或蛇根碱(serpentine)受体)通过各种胞吞隔室，最终导致在溶酶体中降解(Railborg和Stenmark，2009，PMID:19325624;Mukai等，2010，PMID:20495530;Haglund和Dikic，2012;PMID:22357968)。Ub与靶蛋白的生物学缀合由酶促级联介导，其包括三种不同的酶：Ub活化酶(E1)，其在化学上激活UbG76；Ub缀合酶(E2)，其作为活化的Ub的载体起作用；和Ub蛋白-连接酶(E3)，其与E2蛋白和靶蛋白两者复合，并介导活化的Ub从E2转移至蛋白靶标。在人基因组内，存在赋予该过程特异性的数百个E3Ub-蛋白连接酶，其中各E3蛋白识别特定或有限组的蛋白。RING指E3蛋白是最丰富类型的E3Ub-蛋白连接酶，和作为支架起作用以使蛋白底物接近活化的E2-Ub复合物。根据保守的RING序列的存在，RNF43被鉴定为有希望的E3泛素-蛋白连接酶(Yagyu等，2004，PMID:15492824)，该结果由后来的研究证实，其中表明RNF43的过表达促进泛素-介导的各种细胞表面分子的减量调节(Koo等，2012，PMID:22895187)。E3Ub-蛋白连接酶的合适的表达和功能可能是参与各种生物学过程的蛋白的运输、功能和受调节的降解所必需的(Haglund和Dikic，同上)。然而，E3泛素-蛋白连接酶的失调的表达或错误功能可能导致癌症发生(对于综述，参见Mani和Gelmann，2005，PMID:16034054;Hoeller和Dikic，2009，PMID:19325623;Nakayama和Nakayama，2006，PMID:16633365)。RNF43通过表达分析被鉴定为在结肠直肠癌中增量调节，其中这些作者还报道了在胎儿肾和肺中有限表达，以及在正常成人组织中不可检出的表达，如通过RNA印迹测量的(Yagyu等，2004，PMID:15492824)。一些初期的研究报道了在内质网和细胞核中(Sugiura等，2008，PMID:18313049)或作为分泌蛋白(Yagyu等，2004，PMID:15492824)检出该蛋白。然而，最近的研究将RNF43定位在细胞表面上，将其功能关联至WNT信号转导的调节，和提示正确的细胞表面定位是其在WNT信号转导的调节中的功能活性所必需的(Hao等，2012，PMID:22575959;Koo等，2012，PMID:22895187;Jiang等，2013，PMID:23847203;Tsukiyama等，2015，PMID:25825523)。1.RNF43在WNT信号转导中的作用WNT途径是调节细胞生长和分化的关键的发育和干细胞相关的信号转导途径(Seifert和Mlodzik，2007，PMID:17230199;vanderFlier和Clevers，2009，PMID:18808327;Nihers，2012，PMID:23151663)，并且是其异常再活化或过度活化与癌症有关的一个途径(Barker和Clevers，2006，PMID:17139285;Krausova和Korinek，2013，PMID:24308963)。在人基因组中，存在19个不同的WNT基因，其编码19种WNT蛋白配体，它们与各种细胞表面受体结合以形成配体/受体复合物，通过称为WNT信号转导途径的特定蛋白-蛋白相互作用的途径将信号从细胞外部传递至细胞内部。存在三个充分表征的WNT信号转导途径：(1)典型的WNT信号转导途径，(2)非典型的平面细胞极性途径，和(3)非典型的WNT/钙途径。尽管所有三个WNT信号转导途径通过WNT蛋白配体与在细胞表面上的Frizzed(FZD)蛋白受体的结合而活化，并且随后信号转导至在细胞膜内侧上的Dishevelled(DVL)蛋白，但典型的途径通过WNT与FZD和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(LRP5/6)共-受体的结合而运行，导致下游蛋白相互作用，其导致转录的共激活物蛋白β-连环蛋白(CTNNB1)的稳定。稳定的β-连环蛋白能够易位至细胞核，与TCF/LEF蛋白配合，和激活促进细胞生长和分化的WNT靶基因的转录，以及该信号转导途径的负反馈调节物。典型的WNT途径的简化图显示在图6A中。相比之下，非-典型的平面细胞极性途径不通过β-连环蛋白中间体的稳定而发生；而是，DVL蛋白调节可选的细胞表面共-受体例如蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)或vanGogh-样蛋白(VANGL1、VANGL2)的活性，导致调节肌动蛋白的行为和细胞骨架。类似地，非-典型的WNT/钙信号转导途径不通过稳定的β-连环蛋白中间体而发生，而在来自DVL蛋白和相关的G-蛋白的信号转导调节细胞内钙水平时产生，这最终导致细胞粘着、迁移和组织分离的改变。已经表明E3Ub-蛋白连接酶RNF43和ZNRF3是WNT信号转导的重要的调节物。这两种在功能上同源但序列不同的蛋白(总体上同一性仅26%，外结构域中40%，和非典型的RING结构域锌指中69%)是WNT信号转导的负反馈调节物，这可通过它们与AXIN2(一个已知的WNT应答基因，其也作为WNT信号转导的负反馈调节物起作用)的表达正相关(Lustig等，2002，PMID:11809809)，通过它们在具有过度活化的β-连环蛋白信号转导的原发性结肠直肠肿瘤中的表达升高，和通过它们在用针对β-连环蛋白的siRNA处理的细胞中表达降低(Hao等，同上)推论出来。最近据报道，两个WNT应答元件定位于RNF43基因的内含子，直接将β-连环蛋白信号转导与RNF43增量调节相关联(Takahaski等，2014，PMID:24466159)。RNF43和ZNRF3通过控制这些受体的遍在化而各自调节细胞表面FZD和LRP受体水平(Koo等，同上；Hao等，同上)。在RNF43的情况下，外结构域和功能性RING结构域两者均是对于将FZD遍在化和调节典型的WNT信号转导的这种能力所需要的。RNF43在微调典型的WNT信号转导中的生物学功能在一系列研究中进一步得到证明，所述研究证实了R-spondin蛋白通过它们与E3泛素-蛋白连接酶的物理缔合来抑制这些E3泛素-蛋白连接酶的水平，导致细胞表面上的WNT受体表达升高和结果完全使WNT信号转导成为可能(Chen等，2013，PMID:23756651;Hao等，同上)。在胰腺管腺癌中使RNF43功能上失活的突变赋予这些肿瘤WNT依赖性(Jiang等，同上)。最后，RNF43表达失调和其对在干细胞中和在癌症中WNT信号转导的影响的关联被Koo等(同上)证实。发现RNF43和ZNRF3表达限制在小鼠的肠中的LGR5+干细胞隔室。肠双敲除RNF43和ZNRF3基因的小鼠快速发生生长的腺瘤，其表型与β-连环蛋白信号转导的过度活化一致，和形态学与Paneth细胞和肠干细胞增生一致。最近还表明，RNF43还可通过其与DVL蛋白的相互作用而调节非-典型的WNT信号转导(Tsukiyama等，2015，PMID:2582552)。上述研究证实，RNF43是WNT信号转导的精细的激动剂、拮抗剂和抗-拮抗剂反馈网络的节点，可能暗示了癌症的发生。β-连环蛋白过度活化是许多增生和癌症的共同标志，因此这些癌症可能表明，RNF43表达升高作为不能对β-连环蛋白过度活化的同种静止应答的一部分。2.WNT信号转导的测量典型的WNT信号转导途径的蛋白调节物的功能可使用以下测定法阐明：(1)直接评价天然包含TCF/LEF转录因子的DNA结合位点(亦称为WNT应答元件或WRE)的“WNT应答”基因(例如，AXIN2、MYC、CCND1、ASCL2)的升高的转录，或(2)通过使用合成的报告基因构建体，其中TCF/LEF因子与WRE的结合导致转录、随后的翻译和因此导致报告基因产物(例如，GFP、萤光素酶或其活性可容易测量的报告酶)的活性。在一个实施方案中，WNT活性可使用TOPFLASH测定法或其衍生方法测量(Korinek等，1997，PMID:9065401;Veeman等，2003，PMID:12699626)。在另一个实施方案中，可使用包含WNT信号转导途径需要的所有蛋白和经工程改造以在包含WRE的DNA序列的控制下表达报告基因例如萤火虫萤光素酶基因的WNT响应报告细胞系。在本发明中，WNT响应报告细胞系称为293.TCF，被产生和用于测定本发明的抗-RNF43抗体或抗体药物缀合物调节典型的WNT信号转导的能力(见实施例8)。293.TCF细胞系表达四个WRE下游的萤火虫萤光素酶基因。在WNT配体(例如，WNT3A)或可选的“WNT激活物”的存在下，TCF/LEF转录因子结合WRE并激活萤火虫萤光素酶基因的转录，最终导致萤光素酶的酶活性(例如，光的产生)的增加，如当加入萤光素酶的合适的底物和辅助因子时所测量的。如本文所用的，术语“WNT激活物”意指激活WNT信号转导级联的化合物(例如WNT配体)。WNT激活物例如可如下鉴定：使用WNT响应报告细胞系(例如293.TCF细胞)，通过仅加入WNT激活物化合物(例如WNT3A)和观察与未暴露于这样的WNT激活物化合物的293.TCF细胞相比是否存在萤光素酶活性增加；或者例如通过使用各种生理化学技术(例如，脂转染、电穿孔等)将所述试剂引入WNT响应报告细胞，或通过转染编码所述化合物(例如，膜结合或跨膜蛋白)的DNA构建体至WNT-响应报告细胞系并允许天然细胞机器产生所述化合物。在一个实施方案中，293.TCF细胞系可用来自过表达WNT3A的细胞的上清液(例如来自L/WNT3A细胞的条件培养基)处理，萤光素酶活性(即WNT信号转导)可与未用WNT3A处理的细胞(例如，暴露于来自不表达WNT3A的亲本L-细胞的条件培养基的细胞)相比，在WNT3A-处理的细胞中测量。与WNT激活物相比，本文描述为“WNT调节剂”的各种化合物(例如，R-spondin；FZD)能够在WNT激活物(例如，WNT3A或来自L/WNT3A细胞的条件培养基)的存在下通过增加或降低WNT信号转导来影响WNT信号转导途径的活性，但不能独立于WNT激活物而激活WNT信号转导途径。WNT调节剂可例如这样鉴定：使用WNT响应报告细胞系(例如293.TCF)，通过将这些细胞暴露于潜在的WNT调节剂以及WNT激活物化合物(例如WNT3A)和观察与仅暴露于WNT激活物的293.TCF细胞相比是否存在可测量和显著的萤光素酶活性变化。用于鉴定WNT调节剂的其它方法包括：使用各种生理化学技术(例如，脂转染、电穿孔等)将潜在的WNT调节剂引入WNT响应报告细胞，或通过将编码所述化合物(例如，膜结合或跨膜蛋白)的DNA构建体转染至WNT-响应报告细胞系和允许天然细胞机器产生WNT调节剂，然后将处理的细胞暴露于WNT激活物化合物(例如WNT3A)和观察与不表达WNT调节剂的对照WNT-响应报告细胞相比是否存在可测量和显著的萤光素酶活性变化。在一个实施方案中，293.TCF细胞可经工程改造以过表达RNF43或ZNRF3蛋白(例如在RNF43的情况下为293.TCF.37)，和在将这些细胞系与不表达RNF43的对照293.TCF细胞系暴露于合适的WNT激活物(例如条件培养基)后，比较两种细胞系的萤光素酶活性。以这样的方式，RNF43的生物学活性首次得到证实(Koo等，同上)，其观察结果被发明人确认，其中证实了RNF43是减少(或拮抗)WNT信号转导的WNT调节剂，如与不表达RNF43的293.TCF细胞系的萤光素酶活性相比，通过观察表达RNF43的293.TCF.37WNT响应报告细胞系的萤光素酶活性的降低所测量的(见实施例8；图6B)。RNF43-介导的WNT的降低或拮抗与RNF43(一种结合并特异性标记FZD蛋白以降解的E3-泛素连接酶)降低细胞表面上的WNT受体密度和降低对激活的WNT信号(例如WNT3A配体)的应答的能力相关联。WNT调节剂也可在更复杂的条件下测试，其中可加入多种调节剂以测定它们对WNT信号转导的加和作用。在一个实施方案中，经工程改造以过表达已知的WNT调节剂的293.TCF细胞(例如，过表达RNF43的293.TCF.37细胞)可暴露于另外的WNT调节剂，以测定与未暴露于所述另外的WNT调节剂的对照细胞相比，这样的暴露是否导致可测量的和显著的萤光素酶活性变化。已知R-spondin(RSPO)家族的蛋白参与WNT信号转导途径(Kim等2008;PMID:18400942;参见图6B)，并经本发明人证实是一种增加WNT信号转导的WNT调节剂。这通过与在WNT3A的存在下但在R-spondin的缺失下相同细胞系293.TCF.37的萤光素酶活性相比，在WNT3A和R-spondin(例如RSPO3)的存在下观察293.TCF.37(例如，RNF43-过表达)WNT响应报告细胞系的萤光素酶活性增加得到证实(数据未显示)。公开的分子细胞生物学研究表明：(1)R-spondin是WNT调节剂；它们单独不激活WNT信号转导(例如，在WNT配体不存在时)，但在WNT配体存在时，正调节(即增加)WNT信号转导；和(2)R-spondin增加WNT信号转导的能力与它们促进LGR受体与RNF43或ZNRF3的相互作用的能力相关，导致RNF43或ZNRF3的膜清除，随后促进在细胞表面上FZD驻留增加，从而正调节或增加WNT信号转导。如本文所用的，相关术语例如“增加WNT信号转导”、“减少WNT信号转导”或“不影响WNT信号转导”表示相对于对照条件或参比化合物，各种WNT调节剂或WNT激活物(例如本发明的抗-RNF43抗体或抗体药物缀合物)单独或组合调节WNT信号转导途径的能力。在一个实施方案中，某些化合物(例如本发明的抗-RNF43抗体或抗体药物缀合物)调节WNT信号转导的能力可通过在WNT配体(例如WNT3A；参见实施例8)的存在下将293.TCFWNT响应报告细胞系暴露于这样的化合物来测定。增加萤光素酶活性高于自暴露于单独的WNT配体所观察到的活性的化合物被称为“增加WNT信号转导”(例如，抗-RNF43抗体SC37.231；参见图5A)；而与自暴露于单独的WNT配体所观察到的活性相比，不改变萤光素酶活性的化合物被称为“不影响WNT信号转导”(例如，抗-RNF43抗体SC37.170；参见图5A)；和降低萤光素酶活性低于自暴露于单独的WNT配体所观察到的活性的化合物被称为“降低WNT信号转导”(例如，抗-RNF43抗体SC37.231；参见图5A)。WNT信号转导的变化可表示为“TCF活性倍数”，其中在试验条件下在WNT报告系中测量的TCF活性除以在对照条件下对于WNT报告系观察到的TCF活性。根据本领域技术人员众所周知的标准统计学技术(例如，StudentT-检验；p值)，与对照相比，WNT信号转导的增加或降低被确定为“显著的”；因此，可测量的变化被认为是统计学显著的，只要它们在对于实验测定法的正常生物学变异性的范围之外。例如，如果测定法可以可靠地区分在测定群和对照群中的统计学显著差异，其中各群体的均值与其它群体差异达2倍或以上，即2倍差异，则“显著增加WNT信号转导”的WNT调节剂可被认为增加WNT信号转导(例如TCF活性)至2.0倍以上(例如测定群和对照群的比率为2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更大)。同样，“显著减少WNT信号转导”的WNT调节剂可被认为降低WNT信号转导(例如TCF活性)至1/2以下(例如测定群和对照群的比率为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更小)。“对WNT信号转导没有显著影响”的WNT调节剂(例如中性抗体)可例如被认为对WNT信号转导的改变(增加WNT信号转导或降低WNT信号转导)小于2.0倍。3.通过抗-RNF43抗体和抗体药物缀合物调节WNT信号转导典型的WNT信号转导途径的简化图显示于图6A。抗-RNF43抗体调节WNT信号转导的能力可使用各种方法测定，其中的一些描述于本说明书上文的章节I.2.。如上文所述，抗体作为WNT调节剂的活性可使用WNT报告测定法测定，其提供WRE激活的转录的直接读出，并因此直接测量WNT信号转导。在本发明中，与在WNT3A配体的存在下但无抗-RNF43抗体的TCF活性(图5A)相比，在WNT3A配体和抗-RNF43抗体的存在下TCF活性的测量是WNT调节剂对WNT信号转导的作用的直接测量的实例。另外，根据在WNT信号转导途径中蛋白生物学的已知理解，本领域公认的其它测定法可用于推知WNT调节。例如，可在细胞表面上测量WNT受体FZD5的表达水平，因为已知细胞表面上存在的FZD5受体的量的变化与WNT信号转导的变化正相关(参见Koo等，同上)。已知RNF43是一种通过涉及RNF43和FZD受体之间的物理相互作用的机制来减少WNT信号转导的WNT调节剂，导致细胞表面上的FZD水平降低和导致WNT信号转导降低(Koo等，同上;Hao等，同上)。功能上阻断RNF43与FZD相互作用的抗体(在图6A中标记为组I抗体)预期导致细胞表面上FZD受体密度增加，导致WNT信号转导增加。在一个实施方案中，本发明的抗-RNF43抗体或ADC增加WNT信号转导的能力可通过这样的抗-RNF43抗体和ADC与RNF43竞争结合FZD，从而防止FZD降解，导致WNT信号转导增加的能力间接测定。这样的竞争实验可使用ELISA测定法或本说明书的章节IV.5中更详细描述的其它竞争测定法进行，其中测定抗-RNF43抗体阻断RNF43与分离的FZD蛋白、FZD外结构域或过表达FZD的细胞结合的能力。同样地，本领域技术人员已知R-spondin(RSPO)在功能上阻断RNF43的活性。RNF43的表面表达对RNF43调节FZD受体的能力是重要的；通过募集LGR4受体至由RSPO、RNF43和LGR4组成的三元复合物，RSPO阻断RNF43的活性，从而隔离RNF43与FZD，导致细胞表面上的FZD(WNT受体)水平增加，这导致WNT信号转导增加(Hao等，同上;Zebisch等，2013，PMID24225776;Xie等2013，PMID:24165923)。因此，相对于具有RSPO但缺少抗体的对照条件，功能上阻断RSPO与RNF43相互作用的抗体(在图6A中标记为组II抗体)将预期导致细胞表面上的FZD受体密度降低，和导致WNT信号转导降低。在一个实施方案中，抗-RNF43抗体和ADC的WNT调节剂活性可通过这样的抗-RNF43抗体和ADC与R-spondin竞争结合RNF43并从而阻断R-spondin与RNF43的结合的能力间接测定。这样的竞争实验可使用ELISA测定法进行，例如基本上如下：抗-RNF43抗体可加入重组的RNF43细胞外结构域蛋白，将混合物加入用R-spondin包被的ELISA板(见实施例8；图5A)以测定抗体是否阻断R-spondin与RNF43的相互作用。阻断R-spondin与RNF43相互作用的抗-RNF43抗体或ADC意指与在缺少抗体时R-spondin与RNF43的结合相比，显示R-spondin与RNF43的结合减少例如50%、60%、70%、80%、90%或更多的抗体。在其它实施方案中，另外的竞争测定法可按本说明书的章节IV.5中更详细描述的进行。WNT信号转导的间接测量，如通过WNT调节剂(例如R-spondins和FZD)的活性测量的，可使用本说明书的章节I.2.中描述的直接WNT信号转导测定法证实。最后，可预期将存在不显示上文描述的组I或组II抗体的性质的抗-RNF43抗体和ADC，即这样的抗体或ADC将不阻断R-spondin与RNF43相互作用，它们也不阻断RNF43与FZD的相互作用。该组抗体或ADC，尽管仍能够特异性结合RNF43，但由于它们对WNT信号转导不具有作用的事实，可被称为“中立抗体”。II.癌症干细胞根据目前的模型，肿瘤包含非致瘤细胞和致瘤细胞。非致瘤细胞不具有自我更新的能力，甚至当以过量的细胞数移植到免疫缺失的小鼠中时，也不能够繁殖形成肿瘤。致瘤细胞，本文亦称为“肿瘤引发细胞”(TIC)，其构成肿瘤的细胞群的0.1-40%，具有形成肿瘤的能力。致瘤细胞包含肿瘤永生细胞(TPC)(可替换地称为癌症干细胞(CSC))和肿瘤祖细胞(TProg)两者。CSC，像在正常组织中支持细胞分层的正常的干细胞一样，能够无限自我复制，同时保留多谱系分化的能力。CSC能够产生致瘤性子代和非致瘤性子代两者，和能够完全重演亲代肿瘤的异质细胞组分，如通过连续分离和移植低数量的分离的CSC至免疫缺失的小鼠证实的。TProg，像CSC一样，具有在原代移植物中刺激肿瘤生长的能力。然而，与CSC不同的是，它们不能够重演亲代肿瘤的细胞异质性和在随后的移植物中再起始肿瘤发生的效率更低，这是因为TProg通常仅能够有限次细胞分裂，如通过连续移植低数量的高度纯化的TProg至免疫缺失的小鼠所证实的。TProg可进一步分成早期TProg和晚期TProg，它们可通过表型(例如，细胞表面标记物)和它们重演肿瘤细胞结构的不同能力进行区分。尽管二者均不能重演肿瘤至与CSC相同的程度，但与晚期TProg相比，早期TProg具有重演亲代肿瘤的特征的更大能力。虽然有上述差异，但已经表明在个别情况下，一些TProg群可获得正常属于CSC的自我更新能力，本身可成为CSC。与以下细胞相比，CSC显示更高的致肿瘤性和相对更加静止：(i)TProg(早期和晚期TProg两者)；和(ii)非致瘤细胞，例如肿瘤-侵润细胞，例如可源自CSC和通常包含大多数肿瘤的成纤维细胞/间质、内皮和造血细胞。鉴于常规疗法和方案在很大程度上设计为将肿瘤分散和快速攻击增殖性细胞，与更快速增殖的TProg和其它大多数肿瘤细胞群例如非致瘤细胞相比，CSC对常规疗法和方案更有抗性。可使CSC对常规疗法有相对化学抗性的其它特征是增加的多重耐药性转运蛋白的表达、增强的DNA修复机制和抗细胞凋亡基因表达。CSC中的这些性质构成确保晚期肿瘤的大多数患者长期获益的标准肿瘤学治疗方案失效的重要原因，这是因为标准化学疗法不靶向实际上刺激连续肿瘤生长和复发的CSC。令人惊讶地发现，RNF43表达与各种致瘤细胞亚群相关。本发明提供抗-RNF43抗体，其可特别用于靶向致瘤细胞和可用于沉默、敏化、中和、降低频率、阻断、废除、干扰、降低、妨碍、抑制、控制、减少、减轻、调节、减小、改变、消除或以其它方式抑制(统称为“抑制”)致瘤细胞，从而促进增殖性病症(例如癌症)的治疗、管理和/或预防。有利的是，本发明的新的抗-RNF43抗体可经选择使得它们在给予受试者时优选地降低致瘤细胞的频率或致肿瘤性，而不管RNF43决定子的形式(例如，表型或基因型)如何。致瘤细胞频率的减少可因为以下而发生：(i)致瘤细胞的抑制或根除；(ii)控制致瘤细胞的生长、扩增或复发；(iii)阻断致瘤细胞的起始、繁殖、维持或增殖；或(iv)通过其它方式阻碍致瘤细胞的存活、再生和/或转移。在一些实施方案中，致瘤细胞的抑制可因为一个或多个生理学途径的变化而发生。所述途径的变化，无论是通过致瘤细胞的抑制、它们的潜力的改变(例如，通过诱导分化或生境破坏)或以其它方式干扰致瘤细胞影响肿瘤环境或其它细胞的能力，允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移和复发而更有效地治疗RNF43相关病症。可用于评价致瘤细胞的频率减少的方法包括但不限于细胞计数分析或免疫组织化学分析，优选地通过体外或体内有限稀释分析(Dylla等2008，PMID:PMC2413402和Hoey等2009，PMID:19664991)。体外有限稀释分析可通过在促进集落形成的固体培养基上培养分级或未分级的肿瘤细胞(例如分别来自治疗和未治疗的肿瘤)并计数和表征生长的集落进行。或者，肿瘤细胞可连续稀释至包含液体培养基的带孔的板中，和各孔可对在接种后的任何时间，但优选地在接种后超过10天的集落形成评分为正值或负值。体内有限稀释通过以连续的稀释度移植来自未治疗的对照或来自暴露于选择的治疗剂的肿瘤的肿瘤细胞至免疫缺失的小鼠，和随后对肿瘤形成评分各小鼠为正值或负值来进行。可在可检出植入的肿瘤后的任何时间进行评分，但优选地在移植后60天或更久进行。分析有限稀释实验的结果以确定致瘤细胞的频率优选地使用泊松分布统计学或评价预定义的决定性事件例如体内产生或不产生肿瘤的能力的频率进行(Fazekas等，1982，PMID:7040548)。流式细胞术和免疫组织化学也可用于测定致瘤细胞频率。这两种技术采用结合已知致瘤细胞富含的本领域公认的细胞表面蛋白或标记物的一种或多种抗体或试剂(参见WO2012/031280)。如本领域已知的，流式细胞术(例如荧光活化细胞分选(FACS))也可用于表征、分离、纯化、富集或分选各种细胞群，包括致瘤细胞。流式细胞术通过使混合细胞群悬浮其中的液体流穿过电子检测装置测量致瘤细胞水平，所述装置能够测量多达数千个颗粒/秒的物理和/或化学特征。由于通过用结合致瘤细胞标记物的标记抗体或试剂染色组织样品，使致瘤细胞原位可视化成为可能(例如，在组织切片中)，免疫组织化学提供另外的信息。通过方法例如流式细胞术、磁性活化细胞分选(MACS)、激光介导的分组或FACS，本发明的抗体可用于鉴定、表征、监测、分离、分组或富集致瘤细胞群体或亚群。FACS是一种基于特异性细胞表面标记物以超过99.5%纯度分离细胞亚群的可靠方法。用于表征和操作致瘤细胞包括CSC的其它合适的技术可见于例如U.S.P.N.12/686,359、12/669,136和12/757,649。下文列举了与CSC群有关并已用于分离或表征CSC的标记物：ABCA1、ABCA3、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CEACAM6、CELSR1、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白多糖(decorin)、easyh1、easyh2、EDG3、eed、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、Nanog、NB84、巢蛋白、NID2、NMA、NPC1、制癌蛋白M、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、smarcA3、smarcD3、smarcE1、smarcA5、Sox1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、转铁蛋白受体、TrkA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1和β-连环蛋白。参见例如Schulenburg等，2010，PMID:20185329、U.S.P.N.7,632,678和U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。同样地，与某些肿瘤类型的CSC有关的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44hiCD24low、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38−、CD44+CD24−、CD46hiCD324+CD66c−、CD133+CD34+CD10−CD19−、CD138−CD34−CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域已知的其它CSC表面表型。参见例如：Schulenburg等，2010，同上；Visvader等，2008，PMID:18784658；和U.S.P.N.2008/0138313。本发明特别关心包含CD46hiCD324+表型的CSC群体。“正”、“低”和“负”表达水平当应用于标记物或标记物表型时如下定义。具有负表达(即“-”)的细胞在本文定义为在荧光发射的另外通道中标记其它目的蛋白的完全抗体染色混合物的存在下，表达低于或等于在荧光通道中用同种型对照抗体观察到的表达的95%的那些细胞。本领域技术人员将理解，用于定义负事件的该程序称为“荧光-1”或“FMO”染色。具有大于使用上述FMO染色程序用同种型对照抗体观察到的表达的95%的表达的细胞在本文定义为“正”(即”+”)。如本文定义的，存在广泛定义为“正”的各种细胞群。如果抗原的平均观察表达用上述的同种型对照抗体使用FMO染色测定高于95%，则细胞被定义为正。如果平均观察表达通过FMO染色测定高于95%并且在95%的一个标准偏差内，则正细胞可称为具有低表达(即“lo”)的细胞。或者，如果平均观察表达通过FMO染色测定高于95%并比95%高一个标准偏差，则正细胞可称为具有高表达(即“hi”)的细胞。在其它实施方案中，99%可优选地用作负和正FMO染色之间的划界点，和在特别优选的实施方案中，百分数可大于99%。CD46hiCD324+标记物表型和上文刚刚示例的那些可与标准流式细胞计数分析和细胞分选计数结合用于表征、分离、纯化或富集TIC和/或TPC细胞或细胞群，用于进一步分析。本发明的抗体降低致瘤细胞频率的能力因此可使用上述技术和标记物测定。在一些实例中，抗-RNF43抗体可降低致瘤细胞频率达10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其它实施方案中，致瘤细胞频率的减少可为大约40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些实施方案中，公开的化合物可降低致瘤细胞频率达70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。应理解，致瘤细胞频率的任何减少可能导致瘤形成的致肿瘤性、持续性、复发和侵袭性的相应减少。III.抗体1.抗体结构抗体和其变体及衍生物，包括公认的命名法和编号系统，已详细描述于例如Abbas等(2010)，CellularandMolecularImmunology(第6版)，W.B.SaundersCompany;或Murphey等(2011)，Janeway’sImmunobiology(第8版)，GarlandScience。如本文所用的，“完整抗体”通常是指Y-形四聚体蛋白，其包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重多肽链(H)和两条轻多肽链(L)。人轻链分为κ或λ轻链。各轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)构成。各重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区，在IgG、IgA和IgD的情况下恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四个结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类型中，CH1和CH2结构域通过柔性的铰链区分开，所述铰链区是不定长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段(在IgG中通常约10-约60个氨基酸)。在轻链和重链两者中的可变结构域通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定结构域连接，和重链还具有约10个另外的氨基酸的“D”区。各类型的抗体还包含由成对的半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。如本文所用的术语"抗体"包括多克隆抗体(polyclonalantibody)、多克隆抗体(multiclonalantibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和灵长类动物化抗体、CDR移植抗体、人抗体、重组产生的抗体、内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变型蛋白和其变体)、免疫特异性抗体片段(例如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如ScFv和ScFvFc)；和其衍生物，包括Fc融合物和其它修饰物，和任何其它免疫反应性分子，只要它显示与决定子的优先缔合或结合。此外，除非上下文的限制另外指示，该术语还包含所有类型的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚型(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。对应于不同类型的抗体的重链恒定结构域通常分别通过相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ和μ来表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链根据它们恒定结构域的氨基酸序列可指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个明显不同类型之一。抗体的可变结构域显示在抗体之间在氨基酸组成上的显著变化，和主要负责抗原识别和结合。各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是双价的)。VH和VL结构域包含极度可变的三个区，其称为超变区，或更通常称为互补决定区(CDR)，由四个称为框架区(FR)的较少可变的区域架构和分开。在VH和VL区之间的非共价缔合形成Fv片段(对于"可变片段")，其包含抗体的两个抗原结合位点之一。ScFv片段(对于单链可变片段)，其可通过基因工程改造获得，在单多肽链中缔合由肽接头分开的抗体VH和VL区。如本文所用的，指定氨基酸至各结构域、框架区和CDR可按照Kabat等(1991)SequenceofProteinsofImmunologicalInterest(第5版)，USDept.ofHealthandHumanServices，PHS，NIH，NIHPublicationno.91-3242;Chothia等，1987，PMID:3681981;Chothia等，1989，PMID:2687698;MacCallum等,1996，PMID:8876650;或Dubel编辑(2007)HandbookofTherapeuticAntibodies，第3版.，Wily-VCHVerlagGmbHandCoorAbM(OxfordMolecular/MSIPharmacopia)中提供的编号方案之一进行，除非另外注明。包含获自Abysis网站数据库(下文)的由Kabat、Chothia、MacCallum(亦称为Contact)和AbM定义的CDR的氨基酸残基在下文示出。表1KabatChothiaMacCallumAbMVHCDR131-3526-3230-3526-35VHCDR250-6552-5647-5850-58VHCDR395-10295-10293-10195-102VLCDR124-3424-3430-3624-34VLCDR250-5650-5646-5550-56VLCDR389-9789-9789-9689-97抗体序列的可变区和CDR可按照本领域开发的一般规则(如上所述，例如Kabat等编号系统)或通过比对所述序列与已知可变区的数据库来鉴定。用于鉴定这些区域的方法描述于Kontermann和Dubel编辑,AntibodyEngineering，Springer，NewYork，NY，2001和Dinarello等，CurrentProtocolsinImmunology，JohnWileyandSonsInc.，Hoboken，NJ，2000。抗体序列的示例性的数据库描述于“Abysis"网站www.bioinf.org.uk/abs(由theDepartmentofBiochemistry&MolecularBiologyUniversityCollegeLondon，London，England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，并可通过这些数据库进行评价，如Retter等，Nucl.AcidsRes.，33(数据库发行):D671-D674(2005)所描述。优选地，使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat等，IMGT的序列数据和来自PDB的具有结构数据的蛋白数据库(PDB)。参见Dr.AndrewC.R.Martin的书籍章节ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains.In:AntibodyEngineeringLabManual(编辑:Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg，ISBN-13:978-3540413547，亦可获自网站bioinforg.uk/abs)。Abysis数据库网站还包括已开发用于鉴定CDR的一般规则，其可按照本文的教导使用。其中随附的图7E-7H表明这样的分析在几个示例性的抗体重链和轻链可变区的注释中的结果。除非另外指明，否则本文所示的所有CDR根据Abysis数据库网站按照Kabat等导出。对于本发明所述的重链恒定区氨基酸位置，编号按照首次描述于Edelman等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1):78-85的Eu索引进行，其描述了骨髓瘤蛋白Eu的氨基酸序列，据报道其是第一个测序的人IgG1。Edelman的EU索引也显示在Kabat等，1991(同上)。因此，在重链的情况下，术语“Kabat所示的EU索引”或“Kabat的EU索引”或“EU索引”是指根据Edelman等的人IgG1Eu抗体的残基编号系统，如Kabat等，1991(同上)所示。用于轻链恒定区氨基酸序列的编号系统同样地示于Kabat等，(同上)。适合于本发明的示例性的κ轻链恒定区氨基酸序列如下示出：。同样地，适合于本发明的示例性的IgG1重链恒定区氨基酸序列如下示出：。本领域技术人员将理解，使用标准分子生物学技术，公开的恒定区序列可与公开的重链和轻链可变区连接，以提供全长抗体，其可原样使用，或掺入本发明的抗-RNF43ADC中。本发明的抗体或免疫球蛋白可自特异性识别任何相关决定子(即，RNF43)或与其缔合的抗体产生。如本文所用的“决定子”或“靶标”意指任何可检测性状、性质、标记物或因子，其可鉴定地与特定细胞、细胞群或组织相关，或特异性地存在于其中或其上。决定子或靶标在性质上可以是形态学的，功能的或生物化学的，和优选地是表型的。在某些优选的实施方案中，决定子是由特定细胞类型或由细胞在某些条件下(例如，在细胞周期的特定点期间或特定生境中的细胞)差异表达(过表达或表达不足)的蛋白。为本发明的目的，决定子优选地在异常癌症细胞上差异表达和可包含RNF43蛋白或任何其剪接变体、亚型或家族成员，或其特定的结构域、区域或表位。“抗原”、“免疫原性决定子”、“抗原决定子”或“免疫原”意指当引入具有免疫能力的动物时可刺激免疫反应并被自免疫反应产生的抗体识别的任何蛋白或其任何片段、区域或结构域。本文预期的决定子的存在或缺失可用于鉴定细胞、细胞亚群或组织(例如，肿瘤、致瘤细胞或CSC)。在免疫球蛋白分子中存在两种类型的二硫桥或键：链间和链内二硫键。如本领域众所周知的，链间二硫键的位置和数量根据免疫球蛋白类型和物种而改变。尽管本发明不限于任何特定类型或亚型的抗体，但IgG1免疫球蛋白应在本公开全文中用于说明性的目的。在野生型IgG1分子中，存在12个链内二硫键(各重链4个和各轻链2个)和4个链间二硫键。链内二硫键通常稍微受到保护和与链间键相比对还原相对不敏感。相反地，链间二硫键位于免疫球蛋白的表面，易接近溶剂和通常相对容易还原。在重链之间存在两个链间二硫键，和从各重链至其各自的轻链存在一个。已经证实，链间二硫键对于链缔合不是必需的。IgG1铰链区包含在重链中的形成链间二硫键的半胱氨酸，链间二硫键提供结构支持以及利于Fab移动的柔性。重链/重链IgG1链间二硫键位于残基C226和C229(Eu编号)，而IgG1的轻链和重链之间(重链/轻链)IgG1链间二硫键在κ或λ轻链的C214和重链的上铰链区的C220之间形成。2.抗体产生和生产本发明的抗体可使用本领域已知的各种方法生产。A.在宿主动物中产生多克隆抗体在各种宿主动物中产生多克隆抗体是本领域众所周知的(参见例如，Harlow和Lane(编辑)(1988)Antibodies:ALaboratoryManual，CSHPress;和Harlow等(1989)Antibodies，NY，ColdSpringHarborPress)。为了产生多克隆抗体，具有免疫能力的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、非人灵长类动物等)用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的细胞或制备物免疫。一段时间后，包含多克隆抗体的血清通过放血或处死动物获得。血清可以获自动物的形式使用，或抗体可部分或完全地纯化以提供免疫球蛋白部分或分离的抗体制备物。任何形式的抗原或包含抗原的细胞或制备物可用于产生对决定子特异性的抗体。术语“抗原”以广泛的含义使用，和可包含选择的靶标的任何免疫原性片段或决定子，包括单个表位、多个表位、单个或多个结构域或整个细胞外结构域(ECD)。抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分的抗原的细胞免疫)或可溶性蛋白(例如，仅用蛋白的ECD部分免疫)。抗原可在遗传修饰的细胞中产生。任何前述抗原可单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，和可编码足以引发免疫原性反应的至少一部分的蛋白。任何载体可用于转化抗原在其中表达的细胞，包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。B.单克隆抗体在选择的实施方案中，本发明预期单克隆抗体的使用。术语"单克隆抗体"或“mAb”是指获自一群基本上同质的抗体的抗体，即，构成该群的个体抗体是相同的，除了可能以较少量存在的可能的突变之外(例如，天然存在的突变)。单克隆抗体可使用各种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物(例如，XenoMouse®)或其一些组合。例如，在优选的实施方案中，单克隆抗体可使用杂交瘤和生物化学和基因工程改造技术产生，例如更详细描述于An，Zhigiang(编辑)TherapeuticMonoclonalAntibodies:FromBenchtoClinic，JohnWileyandSons，第1版2009;Shire等(编辑)CurrentTrendsinMonoclonalAntibodyDevelopmentandManufacturing，SpringerScience+BusinessMediaLLC，第1版2010;Harlow等,Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，第2版1988;Hammerling等，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)。在产生特异性结合决定子的许多单克隆抗体后，特别合适的抗体可基于例如对决定子的亲和力或内化速率，通过各种筛选方法进行选择。在特别优选的实施方案中，按本文所述产生的单克隆抗体可用作“源”抗体和进一步修饰以例如改进对靶标的亲和力、改进其在细胞培养中的产量、降低体内免疫原性、产生多特异性构建体等。单克隆抗体产生和筛选的更详细的描述在下文和在随附的实施例中提供。C.人抗体抗体可包含完全人抗体。术语“人抗体”是指具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用下述的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体(优选地单克隆抗体)。在一个实施方案中，重组人抗体可通过筛选使用噬菌体展示制备的重组组合抗体库分离。在一个实施方案中，所述库是使用从分离自B-细胞的mRNA制备的人VL和VHcDNA产生的scFv噬菌体或酵母展示库。人抗体还可通过引入人免疫球蛋白基因座至转基因动物制备，所述动物例如其中内源免疫球蛋白基因已被部分或完全失活和人免疫球蛋白基因已被引入的小鼠。在激发时，观察到抗体产生，其在所有方面都非常类似于人中见到的情况，包括基因重排、装配和完全人抗体库。该方法描述于例如，U.S.P.N.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和关于XenoMouse®技术的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584;和Lonberg和Huszar，1995，PMID:7494109)。或者，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(这样的B淋巴细胞可自患有肿瘤病症或可能已在体外免疫的个体回收)。参见例如Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985);Boerner等，1991，PMID:2051030;和U.S.P.N.5,750,373。D.衍生的抗体：一旦源抗体已经按上所述产生、选择和分离，它们可进一步改变以提供具有改进的药学特征的抗-RNF43抗体。优选地，源抗体使用已知的分子改造技术被修饰或改变，以提供具有需要的治疗性质的衍生的抗体。E.嵌合和人源化抗体本发明的选择的实施方案包含免疫特异性地结合RNF43的鼠抗体，和为本公开内容的目的，可被认为是“源”抗体。在选择的实施方案中，适合于本发明的抗体可通过源抗体的恒定区和/或抗原结合氨基酸序列的任选修饰而源自这样的“源”抗体。在某些实施方案中，如果在源抗体中选择的氨基酸通过缺失、突变、置换、整合或组合而改变，则抗体“衍生”自源抗体。在另一个实施方案中，“衍生的”抗体是其中源抗体的片段(例如，一个或多个CDR或整个重链和轻链可变区)与受体抗体序列组合或掺入受体抗体序列中以提供衍生的抗体(例如嵌合或人源化抗体)的抗体。这些“衍生的”抗体可使用下文所述的标准分子生物学技术产生，例如以改进对决定子的亲和力；改进抗体稳定性；改进在细胞培养物中的产量和收率；降低体内免疫原性；降低毒性；促进活性部分的缀合；或产生多特异性抗体。这样的抗体还可通过化学方式或翻译后修饰来修饰成熟分子(例如，糖基化模式或聚乙二醇化)而源自源抗体。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体包含共价连接的源自至少两个不同物种或抗体类型的蛋白区段的嵌合抗体。术语"嵌合"抗体涉及其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中相应的序列相同或同源，而所述链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中相应的序列相同或同源的构建体，以及这样的抗体的片段(U.S.P.N.4,816,567;Morrison等，1984，PMID:6436822)。在一些优选的实施方案中，本发明的嵌合抗体可包含与人轻链和重链恒定区可操作连接的所有或大部分的选择的鼠重链和轻链可变区。在其它特别优选的实施方案中，抗-RNF43抗体可“衍生”自本文公开的小鼠抗体。在其它实施方案中，本发明的嵌合抗体是"CDR移植"抗体，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定义)源自特定物种或属于特定抗体类型或亚型，而抗体的剩余部分源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体。对于在人中使用，一个或多个选择的啮齿动物CDR(例如，小鼠CDR)可移植至人受体抗体，替换一个或多个天然存在的人抗体的CDR。这些构建体一般具有以下优点：提供全长人抗体功能，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，同时减少受试者对抗体的不需要的免疫反应。在特别优选的实施方案中，CDR移植抗体包含掺入人框架序列的获自小鼠的一个或多个CDR。类似于CDR移植抗体的是“人源化”抗体。如本文所用的，“人源化”抗体是包含源自一种或多种非人抗体(供体或源抗体)的一个或多个氨基酸序列(例如CDR序列)的人抗体(受体抗体)。在某些实施方案中，“回复突变”可引入人源化抗体，其中在受体人抗体的可变区的一个或多个FR中的残基被来自非人物种供体抗体的相应残基置换。这样的回复突变可有助于维持移植CDR的合适的三维构型和从而改进亲和力和抗体稳定性。可使用来自各种供体物种的抗体，包括但不限于小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中不存在的新的残基，以例如进一步精修抗体性能。提供了适合于本发明的CDR移植抗体和人源化抗体，如下文实施例10所示。本领域公认的各种技术可用于确定按照本发明用作受体抗体以提供人源化构建体的人序列。合适的人种系序列和确定它们作为受体序列的合适性的方法的汇编公开于例如，Tomlinson，I.A.等(1992)J.Mol.Biol.227:776-798;Cook，G.P.等(1995)Immunol.Today16:237-242;Chothia，D.等(1992)J.Mol.Biol.227:799-817;和Tomlinson等(1995)EMBOJ14:4628-4638，其各自以其整体并入本文。V-BASE手册(VBASE2–Retter等，NucleicAcidRes.33;671-674，2005)，其提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合性手册(由Tomlinson，I.A.等编译，MRCCentreforProteinEngineering，Cambridge，UK)，也可用于鉴定合适的受体序列。另外，例如U.S.P.N.6,300,064中描述的共有人框架序列也可证明是可按照本发明的教导使用的合适的受体序列。一般而言，人框架受体序列根据与鼠源框架序列的同源性以及分析该源抗体和受体抗体的CDR典型结构进行选择。衍生抗体的经工程改造的重链和轻链可变区序列然后可使用本领域公知的技术合成。例如，CDR移植抗体和人源化抗体以及相关的方法描述于U.S.P.N.6,180,370和5,693,762。对于进一步的细节，参见例如Jones等，1986，PMID:3713831);和U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。CDR移植抗体或人源化抗体可变区与人受体可变区的序列同一性或同源性可按本文所述确定，和当如此测量时，优选地共有至少60%或65%序列同一性，更优选地至少70%、75%、80%、85%或90%序列同一性，甚至更优选地至少93%、95%、98%或99%序列同一性。优选地，不相同的残基位置不同之处在于保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基置换的氨基酸置换。一般而言，保守氨基酸置换基本上不改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守置换而彼此不同的情况下，序列同一性或相似度百分比可调整以校正置换的保守性质。应当理解，附图中提供的带注释的CDR和框架序列按Kabat等使用专有的Abysis数据库定义。然而，如本文所述的，本领域技术人员可按照Chothia等或MacCallum等提供的编号方案容易地鉴定CDR。F.位点特异性抗体本发明的抗体可经工程改造以利于与细胞毒素或其它抗癌症剂缀合(如下文更详细论述的)。关于细胞毒素在抗体上的位置和药物与抗体比率(DAR)，抗体药物缀合物(ADC)制剂包含同质群的ADC分子是有利的。根据本公开内容，本领域技术人员可容易地制造本文所述的位点特异性的经工程改造的构建体。如本文所用的“位点特异性抗体”或“位点特异性构建体”意指抗体或其免疫反应性片段，其中在重链或轻链中的至少一个氨基酸被缺失、改变或置换(优选地用另一种氨基酸)，以提供至少一个游离的半胱氨酸。同样地，“位点特异性缀合物”应意指包含位点特异性抗体和与未配对的半胱氨酸缀合的至少一个细胞毒素或其它化合物的ADC。在某些实施方案中，未配对的半胱氨酸残基将包含未配对的链内残基。在其它优选的实施方案中，游离的半胱氨酸残基包含未配对的链间半胱氨酸残基。经工程改造抗体可具有各种同种型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；和在这些类型中，抗体可具有各种亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。对于IgG1构建体，抗体的轻链可包含各自掺有C214的κ或λ同种型，在优选的实施方案中，其由于缺少IgG1重链中的C220残基而可以未被配对。在一个实施方案中，经工程改造抗体包含链内或链间半胱氨酸残基的至少一个氨基酸缺失或置换。如本文所用的“链间半胱氨酸残基”意指参与在抗体的轻链和重链之间或在抗体的两条重链之间的天然二硫键的半胱氨酸残基，而“链内半胱氨酸残基”是与在相同的重链或轻链中的另一半胱氨酸天然配对的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，缺失的或置换的链间半胱氨酸残基参与在轻链和重链之间形成二硫键。在另一个实施方案中，缺失的或置换的半胱氨酸残基参与在两条重链之间的二硫键。在代表性的实施方案中，由于抗体的互补结构，其中轻链与重链的VH和CH1结构域配对和其中一条重链的CH2和CH3结构域与互补重链的CH2和CH3结构域配对，在轻链或重链中的单个半胱氨酸的突变或缺失将在经工程改造抗体中产生两个未配对的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，链间半胱氨酸残基缺失。在其它实施方案中，链间半胱氨酸被置换为另一氨基酸(例如，天然存在的氨基酸)。例如，氨基酸置换可导致用中性(例如丝氨酸、苏氨酸或甘氨酸)或亲水性(例如甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)残基替换链间半胱氨酸。在一个特别优选的实施方案中，链间半胱氨酸用丝氨酸替换。在本发明预期的一些实施方案中，缺失或置换的半胱氨酸残基在轻链(κ或λ)上，从而在重链上留下游离的半胱氨酸。在其它实施方案中，缺失或置换的半胱氨酸残基在重链上，在轻链恒定区上留下游离的半胱氨酸。在装配时，应当理解在完整抗体的轻链或重链中的单个半胱氨酸的缺失或置换产生具有两个未配对的半胱氨酸残基的位点特异性抗体。在一个特别优选的实施方案中，IgG轻链(κ或λ)的位置214的半胱氨酸(C214)被缺失或置换。在另一个优选的实施方案中，IgG重链的220位的半胱氨酸(C220)被缺失或置换。在进一步的实施方案中，重链的226位或229位的半胱氨酸被缺失或置换。在一个实施方案中，重链的C220被丝氨酸置换(C220S)，以在轻链中提供需要的游离半胱氨酸。在另一个实施方案中，轻链的C214被丝氨酸置换(C214S)，以在重链中提供需要的游离半胱氨酸。这样的位点特异性构建体提供在实施例17中。这些优选的构建体的概述在下文紧接的表2中显示，其中所有编号按照如Kabat所示的EU索引进行，和WT代表“野生型”或没有改变的天然恒定区序列，和delta(Δ)表示氨基酸残基的缺失(例如，C214Δ表示214位的半胱氨酸已被缺失)。表2命名抗体组分变化ss1重链C220S轻链WTss2重链C220Δ轻链WTss3重链WT轻链C214Δss4重链WT轻链C214S如本文所公开的用于产生具有确定位点和化学计量的药物载荷的抗体-药物缀合物的策略可广泛适用于所有抗-RNF43抗体，因为其主要包括抗体的保守恒定结构域的工程改造。因为各类型和亚类的抗体的氨基酸序列和天然二硫桥已被详细记载，本领域技术人员可容易地制造各种抗体的经工程改造构建体，而无需过度实验，因此这样的构建体明确地预期在本发明的范围内。G.恒定区修饰和改变的糖基化本发明的选择的实施方案还可包含恒定区(即Fc区)的置换或修饰，包括而不限于氨基酸残基置换、突变和/或修饰，其产生具有优选特征的化合物，所述特征包括但不限于：改变的药代动力学、增加的血清半寿期、增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的Fc配体与Fc受体(FcR)的结合、提高或降低的ADCC或CDC、改变的糖基化和/或二硫键和改变的结合特异性。具有改进的Fc效应子功能的化合物可通过例如参与Fc结构域和Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII和FcRn)之间的相互作用的氨基酸残基的变化产生，其可导致细胞毒性增加和/或药代动力学改变，例如血清半寿期增加(参见例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capel等，Immunomethods4:25-34(1994);和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。在选择的实施方案中，体内半寿期增加的抗体可通过修饰(例如置换、缺失或添加)鉴定为参与Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基产生(参见，例如，国际公开号WO97/34631、WO04/029207、U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。关于这样的实施方案，Fc变体可提供在哺乳动物，优选地人中大于5天、大于10天、大于15天、优选地大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月的半寿期。增加的半寿期导致更高的血清滴度，其因此降低抗体的给药频率和/或降低待给予的抗体的浓度。与人FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血清半寿期可例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在给予具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定。WO2000/42072描述了具有提高的或减少的FcRn结合的抗体变体。亦参见例如Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。在其它实施方案中，Fc改变可导致提高或降低的ADCC或CDC活性。如本领域已知的，CDC是指在补体的存在下靶细胞溶解，和ADCC是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的FcR的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合带抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀死所述靶细胞。在本发明的情况下，提供具有"改变的"FcR结合亲和力的抗体变体，与母体或未修饰的抗体相比或与包含天然序列FcR的抗体相比，所述改变的FcR结合亲和力是提高或降低的结合。与天然序列相比，显示降低的结合的这样的变体可具有很少或没有可察觉的结合，例如，0-20%的FcR结合，例如通过本领域众所周知的技术所测定的。在其它实施方案中，与天然免疫球蛋白Fc结构域相比，变体将显示提高的结合。应理解，这些类型的Fc变体可有利地用于提高所公开的抗体的有效的抗肿瘤性质。在又一些实施方案中，这样的改变导致增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的糖基化和/或二硫键(例如对于缀合位点)、改变的结合特异性、增加的吞噬作用和/或细胞表面受体(例如B细胞受体、BCR)的减量调节等。还其它的实施方案包括一种或多种经工程改造的糖形，例如，包含与蛋白(例如，在Fc结构域中)共价连接的改变的糖基化模式或改变的碳水化合物组成的位点特异性抗体。参见例如Shields，R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。经工程改造的糖形可用于各种目的，包括但不限于提高或降低效应子功能、增加抗体对靶标的亲和力或促进抗体的产生。在需要降低效应子功能的某些实施方案中，该分子可经工程改造以表达非糖基化形式。可导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点从而消除该位点的糖基化的置换是众所周知的(参见例如U.S.P.N.5,714,350和6,350,861)。相反地，增强的效应子功能或改进的结合可能通过在一个或多个另外的糖基化位点上工程改造而被赋予包含Fc的分子。其它实施方案包括具有改变的糖基化组成的Fc变体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化的抗体或具有增加的二等分GlcNAc结构的抗体。已经证实这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。经工程改造的糖形可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用经工程改造或变体表达菌株，通过与一种或多种酶(例如N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子或通过在包含Fc区的分子已经表达后修饰碳水化合物(参见例如WO2012/117002)。H.片段不管选择实施本发明的抗体形式(例如嵌合、人源化等)如何，应理解免疫反应性片段，无论是自身还是作为所述免疫反应性片段的抗体药物缀合物的一部分，可按照本文的教导使用。“抗体片段"包含完整抗体的至少一部分。如本文所用的，术语抗体分子的"片段"包括抗体的抗原结合片段，和术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段免疫特异性地结合选择的抗原或其免疫原性决定子或与其反应，或与所述片段来自的完整抗体竞争特异性的抗原结合。示例性的位点特异性片段包括：可变轻链片段(VL)、可变重链片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。此外，活性位点特异性片段包含抗体的一部分，其保留其与抗原/底物或受体相互作用和以类似于完整抗体的方式修饰它们(尽管可能具有稍微较低的功效)的能力。这样的抗体片段可进一步经工程改造以包含一个或多个游离的半胱氨酸。在其它实施方案中，抗体片段是包含Fc区和保留当存在于完整抗体中时通常与Fc区有关的至少一种生物学功能(例如FcRn结合、抗体半寿期调节、ADCC功能和补体结合)的片段。在一个实施方案中，抗体片段是具有基本上类似于完整抗体的体内半寿期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与包含至少一个游离的半胱氨酸的Fc序列连接的抗原结合臂，所述游离的半胱氨酸能够赋予该片段体内稳定性。如本领域技术人员公认的，片段可通过分子工程改造或通过化学或酶处理(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全的抗体或抗体链或通过重组方式获得。对于抗体片段的更详细的描述，参见例如FundamentalImmunology，W.E.Paul编辑，RavenPress，N.Y.(1999)。I.多价构建体在其它实施方案中，本发明的抗体和缀合物可以是单价或多价的(例如，二价、三价等)。如本文所用的，术语"价"是指与抗体有关的潜在靶标结合位点数。每个靶标结合位点特异性结合一个靶标分子或靶标分子上的特定位置或部位。当抗体是单价的时，分子的每个结合位点特异性结合单个抗原位置或表位。当抗体包含超过一个靶标结合位点(多价)时，每个靶标结合位点可特异性结合相同或不同的分子(例如，可结合不同的配体或不同的抗原，或相同抗原上的不同的表位或位置)。参见例如U.S.P.N.2009/0130105。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其中两条链具有不同的特异性，如Millstein等，1983，Nature，305:537-539所述的。其它实施方案包括具有另外的特异性的抗体，例如三特异性抗体。其它更加复杂的合适的多特异性构建体和它们的制造方法描述于U.S.P.N.2009/0155255，以及WO94/04690;Suresh等，1986，MethodsinEnzymology，121:210;和WO96/27011。多价抗体可免疫特异性结合所需靶标分子的不同的表位，或可免疫特异性结合靶标分子以及异源表位(例如异源多肽或固体支持材料)两者。尽管优选的实施方案仅结合两个抗原(即双特异性抗体)，但具有另外的特异性的抗体例如三特异性抗体也包括在本发明中。双特异性抗体还包括交联或"杂缀合物"抗体。例如，杂缀合物中的抗体之一可与抗生物素蛋白偶联，另一个抗体与生物素偶联。已经提出这样的抗体例如将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(U.S.P.N.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。杂缀合物抗体可使用任何常规交联方法制备。合适的交联剂以及许多交联技术是本领域众所周知的，和公开于U.S.P.N.4,676,980。在又一个实施方案中，使用本领域普通技术人员众所周知的方法，将具有需要的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列(例如包含至少部分铰链区、CH2和/或CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。J.抗体的重组产生抗体和其片段可使用获自产生抗体的细胞的遗传物质和重组技术产生或修饰(参见，例如，Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymologyvol.152AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA;Sambrook和Russell(编辑)(2000)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版)，NY，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel等(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology，Wiley，John&Sons，Inc.;和U.S.P.N.7,709,611)。本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。核酸可以完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域众所周知的技术)与其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)分开时，核酸是“分离的”或基本上纯的。本发明的核酸可以是例如DNA(例如基因组DNA、cDNA)、RNA和其人工变体(例如肽核酸)，无论是单链或双链或RNA，RNA可包含或可不包含内含子。在优选的实施方案中，核酸是cDNA分子。本发明的核酸可使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，按下文进一步描述制备的杂交瘤)，编码抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于获自免疫球蛋白基因库的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码抗体的核酸可自该库回收。编码VH和VL区段的DNA片段可通过标准重组DNA技术进一步操作，例如以转化可变区基因为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，VL-或VH-编码DNA片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段可操作连接。该情况下使用的术语“可操作连接”意指两个DNA片段连接使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。编码VH区的分离的DNA可通过可操作连接VH-编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat等(1991)(同上))，包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选地是IgG1或IgG4恒定区。示例性的IgG1恒定区显示在SEQIDNO:2中。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA可与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作连接。编码VL区的分离的DNA可通过将VL-编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作连接，转换为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat等(1991)(同上))，包含这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但最优选地是κ恒定区。在该方面，示例性的合适的κ轻链恒定区显示在SEQIDNO:1中。本文预期显示与本发明的多肽具有“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如抗原或抗体)。“同源的”多肽可显示65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性。在其它实施方案中，“同源的”多肽可显示93%、95%或98%序列同一性。如本文所用的，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即，%同源性=相同位置数/位置总数×100)，其考虑了空位数和各空位的长度，它们需要引入以最佳比对两个序列。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可使用数学算法实现，如下文的非限制性实例所描述的。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的已经并入ALIGN程序(版本2.0)的算法，使用PAM120加权残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用已经并入GCG软件包(可获自www.gcg.com)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定。另外或备选地，本发明的蛋白序列可进一步用作“质询序列”以针对公开的数据库进行检索，以例如鉴定相关的序列。这样的检索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST蛋白检索可用XBLAST程序、评分=50、字长=3进行，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得带空位的比对用于比较目的，可按Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。不相同的残基位置可由于保守氨基酸置换或通过非保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被具有类似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链的另一氨基酸残基置换的置换。一般而言，保守氨基酸置换基本上不改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列由于保守置换而彼此不同的情况下，序列同一性或相似度百分比可经调整以校正置换的保守性质。在存在用非保守氨基酸的置换的情况下，在优选的实施方案中，显示序列同一性的多肽将保留本发明的多肽(例如抗体)的需要的功能或活性。本文还预期显示与本发明的核酸具有“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”意指显示至少约65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其它实施方案中，核酸的“同源序列”可显示与参比核酸具有93%、95%或98%序列同一性。本发明还提供包含可与启动子可操作连接的上述核酸(参见例如WO86/05807、WO89/01036和U.S.P.N.5,122,464)和真核分泌途径的其它转录调节和加工控制元件的载体。本发明还提供包含这些载体和宿主表达系统的宿主细胞。如本文所用的，术语“宿主表达系统”包括可经工程改造以产生本发明的核酸或多肽和抗体的任何类型的细胞系统。这样的宿主表达系统系统包括但不限于用重组噬菌体DNA或质粒DNA转化或转染的微生物(例如，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)；用重组酵母表达载体转染的酵母(例如，酵母(Saccharomyces))；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3细胞)，所述构建体包含源自哺乳动物细胞或病毒的基因组的启动子(例如，腺病毒晚期启动子)。宿主细胞可用两种表达载体共转染，例如，编码重链衍生的多肽的第一载体和编码轻链衍生的多肽的第二载体。转化哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。宿主细胞还可经工程改造以允许产生具有各种特征(例如修饰的糖形或具有GnTIII活性的蛋白)的抗原结合分子。对于长期高收率产生重组蛋白，稳定的表达是优选的。因此，稳定表达选择的抗体的细胞系可使用本领域公认的标准技术经工程改造和形成本发明的一部分。并非使用包含病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可用受合适的表达控制元件(例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选择标记转化。可使用本领域众所周知的任何选择系统，包括谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)，其提供一种用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统整体或部分地结合EP0216846、EP0256055、EP0323997和EP0338841和U.S.P.N.5,591,639和5,879,936论述。用于开发稳定的细胞系的另一种优选的表达系统是Freedom™CHO-SKit(LifeTechnologies)。一旦本发明的抗体通过重组表达或任何其它公开的技术产生，其可通过本领域已知的方法纯化或分离，这意味着其自其天然环境鉴定和分离和/或回收，和自会干扰抗体的诊断或治疗用途的污染物分离。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。这些分离的制备物可使用本领域公知的各种技术纯化，例如离子交换和大小排阻色谱、透析、渗滤和亲和色谱，特别是蛋白A或蛋白G亲和色谱。K.生产后选择无论如何获得，产生抗体的细胞(例如，杂交瘤、酵母菌落等)可经选择、克隆和进一步筛选需要的特征，包括例如稳健生长、高抗体产量和需要的抗体特征，例如对于目的抗原的高亲和力。杂交瘤可在细胞培养物中体外扩增或在同基因免疫妥协动物中体内扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤和/或菌落的方法是本领域普通技术人员众所周知的。一旦鉴定了需要的抗体，相关的遗传物质可使用常用的、本领域公知的分子生物学和生物化学技术分离、操作和表达。通过幼稚文库(天然或合成的)产生的抗体可具有适度的亲和力(约106-107M-1的Ka)。为了增强亲和力，亲和力成熟可通过构建抗体文库(例如，通过使用易错聚合酶体外引入随机突变)和自这些第二文库(例如通过使用噬菌体或酵母展示)再选择具有对抗原的高亲和力的抗体，进行体外模拟。WO9607754描述了用于在免疫球蛋白轻链的CDR中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。各种技术可用于选择抗体，包括但不限于噬菌体或酵母展示，其中人组合抗体或scFv片段的文库在噬菌体或酵母上合成，所述文库用目的抗原或其抗体结合部分筛选，和结合抗原的噬菌体或酵母被分离，从中可获得抗体或免疫反应性片段(Vaughan等，1996，PMID:9630891;Sheets等，1998，PMID:9600934;Boder等，1997，PMID:9181578;Pepper等，2008，PMID:18336206)。用于产生噬菌体或酵母展示文库的试剂盒是市售可得的。也存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(参见U.S.P.N.5,223,409;WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690;和Barbas等，1991，PMID:1896445)。这样的技术有利地允许筛选大量的候选抗体和提供相对容易的序列操作(例如，通过重组改组)。IV.抗体的特征在选择的实施方案中，产生抗体的细胞(例如，杂交瘤或酵母菌落)可经选择、克隆和进一步筛选有利的性质，包括例如稳健生长、高抗体产量和如下文更详细论述的需要的位点特异性抗体特征。在其它情况下，抗体的特征可通过选择特定的抗原(例如，特定的RNF43同种型)或靶抗原的免疫反应性片段用于接种动物来产生。在还其它的实施方案中，选择的抗体可按上所述经工程改造以增强或精修免疫化学特征，例如亲和力或药代动力学。1.中和抗体在选择的实施方案中，本发明的抗体可以是“拮抗剂”或“中和”抗体，这意味着抗体可缔合决定子和直接或通过阻止决定子与结合配偶体例如配体或受体(例如，RSPO)的缔合来阻断或抑制所述决定子的活性，从而干扰否则将自所述分子的相互作用产生的生物学反应。当过量的抗体减少与决定子结合的结合配偶体的量达至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多时，中和或拮抗剂抗体将显著抑制决定子与其配体或底物的结合，例如，通过靶分子活性或在体外竞争结合测定法中测量的。将理解，改变的活性可使用本领域公知的技术直接测量，或可通过改变的活性在下游具有的影响(例如，肿瘤生成或细胞存活)测量。2.内化抗体有证据表明，大部分表达的RNF43蛋白保持与致瘤细胞表面缔合，从而允许所公开的抗体或ADC的定位和内化。在优选的实施方案中，所述抗体与在内化时杀死细胞的一种或多种药物缔合或缀合。在特别优选的实施方案中，本发明的ADC包含内化位点特异性ADC。如本文所用的，“内化”的抗体是在结合相关的抗原或受体时被细胞摄取(与任何细胞毒素一起)的抗体。对于治疗应用，内化优选地在有需要的受试者的体内发生。内化的ADC的数量可足以杀死表达抗原的细胞，特别是表达抗原的癌症干细胞。根据细胞毒素或ADC作为整体的效力，在一些实例中，单个抗体分子摄入细胞中足以杀死抗体所结合的靶细胞。例如，某些药物具有高的效力，以致于少量的与抗体缀合的毒素分子的内化足以杀死肿瘤细胞。抗体在与哺乳动物细胞结合时是否内化可通过本领域公知的各种测定法确定，包括下文实施例中描述的那些方法。检测抗体是否内化至细胞的方法还描述于U.S.P.N.7,619,068。3.耗竭抗体(depletingantibody)在其它实施方案中，本发明的抗体是耗竭抗体。术语“耗竭”抗体是指优选地结合在细胞表面上或附近的抗原并诱导、促进或导致细胞死亡的抗体(例如，通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)。在优选的实施方案中，选择的耗竭抗体与细胞毒素缀合。优选地，耗竭抗体能够在确定的细胞群中杀死至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的表达RNF43的细胞。在一些实施方案中，细胞群可包含富集的、分开的、纯化的或分离的致瘤细胞，包括癌症干细胞。在其它实施方案中，细胞群可包含整个肿瘤样品或包含癌症干细胞的异质肿瘤提取物。根据本文的教导，标准生物化学技术可用于监测和定量致瘤细胞的耗竭。4.结合亲和力本文公开了对特定的决定子例如RNF43具有高结合亲和力的抗体。术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数或表观亲和力。当解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时，本发明的抗体可免疫特异性结合其靶抗原。当KD≤5x10-9M时，抗体以高亲和力特异性结合抗原，和当KD≤5x10-10M时以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施方案中，抗体具有≤10-9M的KD和约1x10-4/秒的解离速率。在本发明的一个实施方案中，解离速率<1x10-5/秒。在本发明的其它实施方案中，抗体以约10-7M和10-10M之间的KD结合决定子，和在又一个实施方案中，其以KD≤2x10-10M结合。本发明的仍其它选择的实施方案包含具有小于10-6M、小于5x10-6M、小于10-7M、小于5x10-7M、小于10-8M、小于5x10-8M、小于10-9M、小于5x10-9M、小于10-10M、小于5x10-10M、小于10-11M、小于5x10-11M、小于10-12M、小于5x10-12M、小于10-13M、小于5x10-13M、小于10-14M、小于5x10-14M、小于10-15M或小于5x10-15M的KD(koff/kon)的抗体。在某些实施方案中，免疫特异性结合决定子例如RNF43的本发明的抗体可具有至少105M-ls-l、至少2x105M-ls-l、至少5x105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5x106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5x107M-ls-l或至少108M-ls-l的缔合速率常数或kon(或ka)速率(抗体+抗原(Ag)kon←抗体-Ag)。在另一个实施方案中，免疫特异性结合决定子例如RNF43的本发明的抗体可具有小于l0-ls-l、小于5xl0-ls-l、小于l0-2s-l、小于5xl0-2s-l、小于l0-3s-l、小于5xl0-3s-l、小于l0-4s-l、小于5xl04s-l、小于l0-5s-l、小于5xl0-5s-l、小于l0-6s-l、小于5xl0-6s-l小于l0-7s-l、小于5xl0-7s-l、小于l0-8s-l、小于5xl0-8s-l、小于l0-9s-l、小于5xl0-9s-l或小于l0-10s-l的解离速率常数或koff(或kd)速率(抗体+抗原(Ag)koff←抗体-Ag)。结合亲和力可使用本领域已知的各种技术测定，例如表面等离子体共振、生物层干涉测定、双重极化干涉测定、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析型超速离心和流式细胞术。5.框并(binning)和表位作图如本文所用的，术语“框并”是指用于根据抗体的抗原结合特征和它们是否彼此竞争而将抗体分组成“箱(bin)”的方法。箱的初始确定可通过表位作图和本文公开的其它技术进一步精修和证实。然而，应理解，根据经验将抗体指定至单个箱，提供了可指示所公开的抗体的治疗潜力的信息。如图5A所示的，公开的RNF43抗体位于标记为A、B、C、D、E和F的至少6个箱中。更具体地，通过使用本领域已知和本文实施例中提供的方法，可确定选择的参比抗体(或其片段)与第二种试验抗体是否竞争结合(即，在相同的箱中)。在一个实施方案中，参比抗体与RNF43抗原在饱和条件下缔合，然后使用标准免疫化学技术测定第二种或试验抗体结合RNF43的能力。如果试验抗体能够与参比抗-RNF43抗体同时显著结合RNF43，则所述第二种或试验抗体结合与第一种或参比抗体不同的表位。然而，如果试验抗体不能够同时显著结合RNF43，则试验抗体结合相同的表位、重叠表位或靠近(至少在空间上)第一种抗体结合的表位的表位。即是说，试验抗体竞争抗原结合，并在与参比抗体相同的箱中。术语“竞争”或“竞争性抗体”当在所公开的抗体的情况下使用时意指在抗体之间的竞争，如通过其中所测试的试验抗体或免疫学功能片段抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合的测定法所测定的。通常，所述测定法包括使用结合至固体表面或细胞的纯化抗原(例如，RNF43或其结构域或片段)、未标记的试验抗体和标记的参比抗体。竞争性抑制通过在试验抗体的存在下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，试验抗体过量存在，和/或允许首先结合。关于用于测定竞争结合的方法的其它细节在本文的实施例中提供。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制参比抗体与共同抗原的特异性结合达至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些实例中，结合被抑制达至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。相反地，当参比抗体结合时，其优选地抑制随后加入的试验抗体(即，抗-RNF43抗体)的结合达至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些实例中，试验抗体的结合被抑制达至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。通常，框并或竞争性结合可使用本领域公知的各种技术测定，例如免疫测定法，例如蛋白质印迹、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法。这样的免疫测定法是常规的和本领域众所周知的(参见，Ausubel等编辑(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork)。另外，可使用交叉封闭测定法(参见例如，WO2003/48731;和Harlow等(1988)Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane)。用于测定竞争性抑制(因此，“箱”)的其它技术包括：表面等离子体共振，使用例如BIAcore™2000系统(GEHealthcare)；生物层干涉测定，使用例如ForteBio®OctetRED(ForteBio)；或流式细胞术珠阵列，使用例如FACSCantoII(BDBiosciences)或多路LUMINEX™检测测定法(Luminex)。Luminex是一种基于珠的免疫测定平台，其能够大规模多路抗体配对。该测定法比较抗体对与靶抗原的同时结合模式。所述对的一个抗体(捕获mAb)与Luminex珠结合，其中各捕获mAb与不同颜色的珠结合。另一抗体(检测mAb)与荧光信号(例如藻红蛋白(PE))结合。该测定法分析了抗体与抗原的同时结合(配对)，和将具有类似配对特征的抗体分组在一起。检测mAb和捕获mAb的类似特征表明两种抗体结合相同或紧密相关的表位。在一个实施方案中，配对特征可使用Pearson相关系数测定，以鉴定在测试的抗体组中与任何特定抗体最紧密相关的抗体。在优选的实施方案中，如果抗体对的Pearson相关系数是至少0.9，则测试/检测mAb确定为处于与参比/捕获mAb相同的箱中。在其它实施方案中，Pearson相关系数是至少0.8、0.85、0.87或0.89。在进一步的实施方案中，Pearson相关系数是至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析获自Luminex测定法的数据的其它方法描述于U.S.P.N.8,568,992。Luminex同时分析100个不同类型的珠(或更多)的能力提供了几乎无限的抗原和/或抗体表面，导致经生物传感器测定法的抗体表位特征分析的改进通量和解析(Miller等，2011，PMID:21223970)。“表面等离子体共振”是指通过检测在生物传感器基质内的蛋白浓度的变化，允许分析实时特异性相互作用的光学现象。在其它实施方案中，可用于测定试验抗体是否与参比抗体“竞争”结合的技术是“生物层干涉测定”，一种分析自两个表面反射的白光的干涉模式的光学分析技术：生物传感器触点上的固定蛋白层和内部参比层。与生物传感器触点结合的分子数量的任何变化导致可实时测量的干涉模式的变化。这样的生物层干涉测定法可使用ForteBio®OctetRED机器如下进行。参比抗体(Ab1)被捕获到抗小鼠捕获芯片上，然后高浓度的非结合抗体用于封闭芯片，并采集基线。单体的重组靶蛋白然后被特异性抗体(Ab1)捕获，触点浸入具有相同抗体(Ab1)的孔中作为对照或浸入具有不同的试验抗体(Ab2)的孔中。如果未发生进一步的结合，如通过比较与对照Ab1的结合水平所测定的，则确定Ab1和Ab2为“竞争性”抗体。如果观察到与Ab2的另外的结合，则确定Ab1和Ab2不彼此竞争。该方法可扩展以在96-孔板中使用代表独特的箱的一整排抗体筛选大的独特抗体文库。在优选的实施方案中，如果参比抗体抑制试验抗体与共同抗原的特异性结合达至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，则试验抗体与参比抗体竞争。在其它实施方案中，结合被抑制达至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。一旦已经确定了包含一组竞争性抗体的箱，则可进行进一步的表征以确定箱中的抗体结合的抗原上的特定结构域或表位。结构域水平的表位作图可使用Cochran等，2004，PMID:15099763描述的方案的改良版进行。精细表位作图是确定抗原上构成抗体所结合的决定子的表位的特定氨基酸的方法。术语“表位”以其常用的生物化学含义使用，是指能够被特定抗体识别和特异性结合的靶抗原的一部分。在某些实施方案中，表位或免疫原性决定子包括分子的化学活性表面簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，和在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，当抗体优先识别在蛋白和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合抗原。当抗原是多肽例如RNF43时，表位可一般自通过蛋白的三维折叠紧靠的连续氨基酸和非连续氨基酸形成(“构象表位”)。在这样的构象表位中，相互作用点跨越蛋白的彼此线性分开的氨基酸残基而存在。自连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白变性时得到保留，而通过三维折叠形成的表位通常在蛋白变性时丢失。抗体表位通常以独特的立体构象包括至少3个和更通常至少5或8-10个氨基酸。表位确定或“表位作图”的方法是本领域众所周知的，可与本公开内容结合使用以鉴定与所公开的抗体结合的RNF43的表位。合适的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(Reineke(2004)MethodsMolBiol248:443-63)或肽裂解分析。此外，可使用方法例如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。其它合适的方法包括酵母展示方法。在其它实施方案中，修饰-辅助概况分析(Modification-AssistedProfiling，MAP)，亦称为基于抗原结构的抗体概况分析(ASAP)，提供了按照各抗体与化学或酶修饰的抗原表面的结合概况的相似性将针对相同抗原的大量的单克隆抗体分类的方法(U.S.P.N.2004/0101920)。该技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，使得表征可集中于遗传上不同的抗体。将理解，MAP可用于分选本发明的抗-RNF43抗体至结合不同的表位的抗体组。一旦抗原上需要的表位被确定，可产生抗该表位的抗体，例如，使用本发明描述的技术，通过用包含该表位的肽进行免疫。或者，在发现过程期间，抗体的产生和表征可阐明关于位于特定结构域或基序中的需要的表位的信息。根据该信息，则有可能竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现方法是进行竞争研究以发现竞争结合抗原的抗体。根据其交叉竞争的用于框并抗体的高通量方法描述于WO03/48731。框并或结构域水平或表位作图的其它方法，包括抗体竞争或在酵母上抗原片段表达，是本领域众所周知的。V.抗体缀合物在某些优选的实施方案中，本发明的抗体可与药学活性部分或诊断部分缀合以形成“抗体药物缀合物”(ADC)或“抗体缀合物”。术语“缀合物”广义使用，和意指任何药学活性部分或诊断部分与本发明的抗体的共价或非共价缔合，而不管缔合方法如何。在某些实施方案中，缔合通过抗体的赖氨酸或半胱氨酸残基实现。在特别优选的实施方案中，药学活性部分或诊断部分可通过一个或多个位点特异性游离半胱氨酸与抗体缀合。所公开的ADC可用于治疗和诊断目的。本发明的ADC可用于递送细胞毒素或其它有效负荷至靶位点(例如，致瘤细胞和/或表达RNF43的细胞)。如本文所用的术语“药物”或“弹头”可互换使用，和意指生物学活性或可检测分子或化合物，包括下文所述的抗癌剂。“有效负荷”可包含药物或弹头以及任选的接头化合物。缀合物上的弹头可包含肽、蛋白或体内代谢成活性剂的前药，聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子和放射性同位素。在有利的实施方案中，公开的ADC将结合的有效负荷以相对无活性、无毒的状态定位至靶位点，然后释放和激活有效负荷。有效负荷的这种靶向释放优选地通过有效负荷的稳定缀合(例如，通过抗体上的一个或多个半胱氨酸)和ADC制备物的相对均质的组合物进行，这使得过度缀合的毒性物质最小化。与经设计一旦被递送至肿瘤位点则大量释放有效负荷的药物接头偶联，本发明的缀合物可显著降低不需要的非特异性毒性。这有利地提供在肿瘤位点上相对高水平的活性细胞毒素，同时使非靶向的细胞和组织的暴露最小化，从而提供提高的治疗指数。将理解，尽管本发明的优选的实施方案包含治疗部分的有效负荷(例如，细胞毒素)，其它有效负荷例如诊断剂和生物相容性调节剂可自所公开的缀合物提供的靶向释放获益。因此，涉及示例性的治疗有效负荷的任何公开内容也适用于包含本文所论述的诊断剂或生物相容性调节剂的有效负荷，除非上下文另外指明。选择的有效负荷可与抗体共价或非共价地连接，和显示各种化学计量的摩尔比，至少部分地取决于用于实现缀合的方法。本发明的缀合物可由下式表示：Ab-[L-D]n或药学上可接受的盐，其中a)Ab包含抗-RNF43抗体；b)L包含任选的接头；c)D包含药物；和d)n是1-20的整数。本领域技术人员将理解，按照上式的缀合物可使用多种不同的接头和药物制造，和缀合方法根据组分的选择而不同。因此，与所公开的抗体的反应性残基(例如，半胱氨酸或赖氨酸)缔合的任何药物或药物接头化合物适合于本文的教导。同样地，允许选择的药物与抗体的位点特异性缀合的任何反应条件在本发明的范围内。虽然前述内容，但本发明的特别优选的实施方案包括使用稳定剂与本文所述的温和还原剂组合的药物或药物接头与游离半胱氨酸的选择性缀合。这样的反应条件趋于提供更均质的制备物，具有较少的非特异性缀合物和污染物，和相应较少的毒性。适合于本文的教导的示例性的有效负荷在下文提供。1.治疗剂本发明的抗体可与药物活性部分缀合、连接或融合或以其它方式缔合，所述药物活性部分是治疗部分或药物，例如抗癌剂，包括但不限于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减灭剂(debulkingagent)、化学治疗剂、放射治疗剂、靶向抗癌剂、生物反应调节剂、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。优选的示例性的抗癌剂(包括其同系物和衍生物)包括1-去氢睾甾酮、氨茴霉素、放线菌素D、博来霉素、刺孢霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、细胞松弛素B、更生霉素(以前称为放线菌素)、二羟基炭疽菌素、二酮、依米丁、表柔比星、溴化乙锭、依托泊苷、糖皮质激素、短杆菌肽D、利多卡因、美登木素例如DM-1和DM-4(Immunogen)、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、紫杉醇、普鲁卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、替尼泊苷、丁卡因及任何上述药剂的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。另外，合适的细胞毒素包括多拉司他汀和阿里他汀(auristatin)，包括单甲基阿里他汀E(MMAE)和单甲基阿里他汀F(MMAF)(SeattleGenetics)、鹅膏菌素例如α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素或ε-鹅膏菌素(HeidelbergPharma)、DNA小沟结合剂如多卡霉素衍生物(Syntarga)、烷化剂如修饰或二聚吡咯并苯并二氮杂䓬类(PBD)、氮芥，塞替派，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂，剪接抑制剂例如meayamycin类似物或衍生物(例如，如U.S.P.N.7,825,267中所述的FR901464)，微管结合剂例如埃坡霉素类似物和紫杉醇和DNA损伤剂例如刺孢霉素和艾司帕霉素，抗代谢物如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶氨烯咪胺，抗有丝分裂剂如长春花碱和长春新碱和蒽环类如柔红霉素(以前称道诺霉素)和多柔比星及任何上述药剂的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。在某些选择的实施方案中，所公开的抗体与一种或多种刺孢霉素缀合。如本文所用的术语“刺孢霉素”是指刺孢霉素γ1I、刺孢霉素β1Br、刺孢霉素γ1Br、刺孢霉素α2I、刺孢霉素α3I、刺孢霉素β1i和刺孢霉素δ1的任一种以及其n-乙酰基衍生物和硫化物类似物。在某些实施方案中，所公开的抗体药物缀合物的刺孢霉素组分包含N-乙酰基刺孢霉素γ1I。在一个实施方案中，本发明的抗体可与抗-CD3结合分子缔合，以募集细胞毒性T细胞并使它们靶向致瘤细胞(BiTEtechnology;参见例如，Fuhrmann等(2010)AnnualMeetingofAACRAbstractNo.5625)。在进一步的实施方案中，本发明的ADC可包含使用合适的接头缀合的治疗性放射性同位素。可适合于所述实施方案的示例性的放射性同位素包括但不限于碘(131I，125I，123I，121I)、碳(14C)、铜(62Cu，64Cu，67Cu)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In，113In，112In，111In)、铋(212Bi，213Bi)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、225Ac、76Br和211At。其它放射性核素也可用作诊断和治疗剂，特别是能量范围为60-4,000keV的那些。在某些优选实施方案中，本发明的ADC可以包含PBD和其药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物作为弹头。PBD是通过与小沟中的DNA共价结合并抑制核酸合成而发挥抗肿瘤活性的烷化剂。已经显示PBD具有有效的抗肿瘤性质，同时表现出最小的骨髓抑制。适合于本发明的PBD可以使用几种类型的接头(例如，包含具有游离巯基的马来酰亚胺部分的肽基接头)连接到抗体，并且在某些实施方案中是二聚体形式(即PBD二聚体)。可以与所公开的抗体缀合的合适的PBD(和任选的接头)描述于例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157和PCT申请WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616和WO2014/057074。本发明的抗体还可以与生物反应修饰剂缀合。例如，在特别优选的实施方案中，药物部分可以是具有所需生物活性的多肽。这样的蛋白质可以包括例如毒素，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、Onconase(或另一种细胞毒性核糖核酸酶)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素；细胞凋亡剂例如肿瘤坏死因子TNF-α或TNF-β、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、AIMI(WO97/33899)、AIMII(WO97/34911)、Fas配体(Takahashi等人，1994，PMID：7826947)和VEGI(WO99/23105)、血栓形成剂、抗血管生成剂例如血管抑素或内皮抑素；淋巴因子例如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，或生长因子例如生长激素(GH)。2.诊断或检测剂在其它优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段或衍生物与诊断或可检测试剂、标记或报告物缀合，其可以是例如生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、荧光团或放射性同位素。标记的抗体可用于监测过度增殖性疾病的发生或进展或作为临床测试程序的一部分，以确定包括所公开的抗体(即，治疗诊断剂)的特定治疗的功效或确定未来的治疗过程。此类标记或报告物也可用于纯化选择的抗体，用于抗体分析(例如表位结合或抗体框并)，分开或分离致瘤细胞或在临床前程序或毒理学研究中。这种诊断、分析和/或检测可以通过将抗体偶联到可检测物质来实现，所述可检测物质包括但不限于各种酶，包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性材料，例如但不限于碘(131I，125I，123I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In，113In，112In，111In)和锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属，非放射性顺磁金属离子和放射性标记或缀合至特定放射性同位素的分子。在这样的实施方案中，适当的检测方法是本领域公知的，并且可以从许多商业来源容易地获得。在其它实施方案中，抗体或其片段可以融合或缀合到标记序列或化合物，例如肽或荧光团，以促进纯化或诊断或分析程序，例如免疫组织化学，生物层干涉测量，表面等离子体共振，流式细胞术，竞争性ELISA，FAC等。在优选的实施方案中，标记包括组氨酸标签，例如由pQE载体(Qiagen)提供的标签，其中许多是可商购的。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于：血凝素“HA”标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell37：767)；和“flag”标签(USPN4,703,004)。3.生物相容性调节剂在选择的实施方案中，本发明的抗体可以与生物相容性调节剂缀合，所述调节剂可用于根据需要调整、改变、改善或调节抗体特征。例如，具有增加的体内半寿期的抗体或融合构建体可以通过连接相对高分子量的聚合物分子例如市售的聚乙二醇(PEG)或类似的生物相容性聚合物产生。本领域技术人员将理解，PEG可以以许多不同的分子量和分子构型获得，其可以被选择以赋予抗体特定的性质(例如可以定制半寿期)。PEG可以通过PEG与抗体或抗体片段的N-或C-末端缀合或通过赖氨酸残基上存在的ε-氨基与具有或不具有多功能接头的所述抗体或抗体片段或衍生物连接。可以使用导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀合的程度，以确保PEG分子与抗体分子的最佳缀合。未反应的PEG可以通过例如大小排阻或离子交换色谱从抗体-PEG缀合物中分离。以类似的方式，所公开的抗体可以与白蛋白缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半寿期。这些技术是本领域公知的，参见例如，WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137;和EP0413,622。其它生物相容的缀合物对普通技术人员是显而易见的，并且可以根据本文的教导容易地鉴定。4.接头化合物许多接头化合物可用于将本发明的抗体与相关弹头缀合。接头仅需要与抗体上的反应性残基(优选半胱氨酸或赖氨酸)和所选药物化合物共价结合。因此，与所选抗体残基反应并且可用于提供本发明的相对稳定的缀合物(位点特异性或其它)的任何接头与本文的教导相容。许多相容的接头可以有利地结合亲核的还原半胱氨酸和赖氨酸。涉及还原的半胱氨酸和赖氨酸的缀合反应包括但不限于硫醇-马来酰亚胺、硫醇-卤代(酰卤)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯砜、硫醇-双砜、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇–吡啶基二硫化物和硫醇-对氟反应。如本文进一步讨论的，由于其快速的反应速率和温和的缀合条件，硫醇-马来酰亚胺生物缀合是最广泛使用的方法之一。该方法的一个问题是反向迈克尔反应以及马来酰亚胺基连接的有效负载从抗体到血浆中的其它蛋白质(例如人血清白蛋白)的损失或转移的可能性。然而，在优选实施方案中，如本文实施例13中所述的选择性还原和位点特异性抗体的使用可用于稳定缀合物，并减少这种不期望的转移。硫醇-酰卤反应提供不能经历反向迈克尔反应并因此更稳定的生物缀合物。然而，与基于马来酰亚胺的缀合相比，硫醇-卤化物反应通常具有较慢的反应速率，因此在提供不期望的药物与抗体比率方面不那么有效。硫醇-吡啶基二硫化物反应是另一种常用的生物缀合途径。吡啶基二硫化物与游离硫醇进行快速交换，导致混合二硫化物和吡啶-2-硫酮的释放。混合的二硫化物可以在还原性细胞环境中裂解，释放有效负载。在生物缀合中获得更多关注的其他方法是硫醇-乙烯砜和硫醇-双砜反应，其每一个与本文的教导相容并且明确包括在本发明的范围内。在优选的实施方案中，相容的接头将赋予细胞外环境中的ADC稳定性，防止ADC分子的聚集并保持ADC在水性介质和单体状态下易于溶解。在运输或递送到细胞中之前，ADC优选是稳定的并保持完整，即抗体保持与药物部分连接。虽然接头在靶细胞外是稳定的，但它们被设计成在细胞内以某一有效速率裂解或降解。因此，有效的接头将：(i)保持抗体的特异性结合特性;(ii)允许细胞内递送缀合物或药物部分;(iii)保持稳定和完整，即不裂解或降解，直到缀合物已经被递送或转运到其靶位点;和(iv)维持药物部分的细胞毒性、细胞杀伤效应或细胞抑制效应(在一些情况下包括任何旁观者效应)。可以通过标准分析技术如HPLC/UPLC、质谱、HPLC和分离/分析技术LC/MS和LC/MS/MS测量ADC的稳定性。如上所述，抗体和药物部分的共价连接需要接头具有两个反应性官能团，即反应性意义上的二价。用于连接两个或更多个功能或生物活性部分(例如MMAE和位点特异性抗体)的二价接头试剂是已知的，并且已经描述了提供其所得缀合物的方法。与本发明相容的接头可以广泛地分类为可裂解和不可裂解接头。可包括酸不稳定接头、蛋白酶可裂解接头和二硫化物接头的可裂解接头优选内化到靶细胞中，并在细胞内的内体-溶酶体途径中裂解。细胞毒素的释放和激活依赖于促进酸不稳定化学键如腙或肟的裂解的内体/溶酶体酸性区室。如果溶酶体特异性蛋白酶裂解位点被工程化到接头中，则细胞毒素将在其细胞内靶附近被释放。或者，含有混合二硫化物的接头提供了细胞毒性有效负荷在细胞内释放的一种方法，因为它们在细胞的还原环境中选择性裂解，而不是在血流中的富氧环境中裂解。相比之下，含有酰胺连接的聚乙二醇或烷基间隔物的相容的不可裂解接头在靶细胞内ADC的溶酶体降解过程中释放毒性有效负荷。在一些方面，接头的选择将取决于缀合物中使用的具体药物、特定适应症和抗体靶标。因此，本发明的某些实施方案包含可通过存在于细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或细胞膜穴样内陷中)中的裂解剂裂解的接头。接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基接头。在一些实施方案中，肽基接头是至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D和纤溶酶，其中已知每一种水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内的释放。可由硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的示例性肽基接头是包含Phe-Leu的肽，因为已发现组织蛋白酶-B在癌性组织中高度表达。这种接头的其它实例描述于例如U.S.P.N.6,214,345。在一个具体的优选实施方案中，可通过细胞内蛋白酶裂解的肽基接头是Val-Cit接头、Val-Ala接头或Phe-Lys接头，例如在U.S.P.N.6,214,345中所述。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是，所述试剂当缀合时通常被减弱，并且缀合物的血清稳定性通常较高。在其他实施方案中，可裂解接头是pH敏感的。通常，pH敏感性接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如腙、肟、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见例如USPN5,122,368;5,824,805;5,622,929)。此类接头在中性pH条件下(例如在血液中的)相对稳定，但在低于pH5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下是不稳定的。在其它实施方案中，接头在还原条件下是可裂解的(例如二硫化物接头)。各种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)形成的那些。在其它具体实施方案中，接头是丙二酸酯接头(Johnson等人，1995，AnticancerRes.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰基接头(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在特别优选的实施方案中(U.S.P.N.2011/0256157中所示)，相容的肽基接头包含：其中星形表示药物的连接点，CBA是抗-RNF43抗体，L1是接头，A是连接L1与抗体上的反应性残基的连接基团(任选包含间隔物)，L2是共价键或与-OC(=O)-一起形成自断裂接头，L1或L2是可裂解接头。L1优选地是可裂解接头，和可称为用于激活裂解接头的触发剂。若存在时，L1和L2的性质可广泛不同。这些基团根据它们的裂解特征进行选择，所述特征可由将缀合物递送至的部位的条件指示。通过酶的作用裂解的那些接头是优选的，但也可使用可通过pH(例如酸或碱不稳定的)、温度或在照射时(例如光不稳定的)的变化裂解的接头。本发明也可使用在还原或氧化条件下可裂解的接头。L1可包含连续的氨基酸序列。氨基酸序列可以是酶裂解的靶标底物，从而允许释放药物。在一个实施方案中，L1可通过酶的作用裂解。在一个实施方案中，酶是酯酶或肽酶。在一个实施方案中，L1包含二肽。二肽可由-NH-X1-X2-CO-表示，其中-NH-和-CO-分别代表氨基酸基团X1和X2的N-和C-端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。在接头是组织蛋白酶不稳定的接头时，二肽可以是组织蛋白酶-介导的裂解的作用位点。另外，对于具有羧基或氨基侧链官能性的那些氨基酸基团，例如分别为Glu和Lys，CO和NH可表示侧链官能性。在一个实施方案中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-和-Trp-Cit-，其中Cit是瓜氨酸。优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-。最优选地，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。在一个实施方案中，L2存在并与-C(=O)O-一起形成自断裂接头。在一个实施方案中，L2是酶活性的底物，从而允许释放药物。在L1可通过酶的作用裂解和L2存在的一个实施方案中，酶裂解L1和L2之间的键。若存在时，L1和L2可通过选自以下的键连接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。与L2连接的L1的氨基可以是氨基酸的N-端，或可以源自氨基酸侧链的氨基，例如赖氨酸氨基酸侧链。与L2连接的L1的羧基可以是氨基酸的C-端，或可以源自氨基酸侧链的羧基，例如谷氨酸氨基酸侧链。与L2连接的L1的羟基可源自氨基酸侧链的羟基，例如丝氨酸氨基酸侧链。术语“氨基酸侧链”包括以下氨基酸中存在的那些基团：(i)天然存在的氨基酸，例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；(ii)次要氨基酸，例如鸟氨酸和瓜氨酸；(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然存在的氨基酸的合成类似物和衍生物；和(iv)所有对映异构体、非对映异构体、异构体富集的、同位素标记的(例如2H、3H、14C、15N)、受保护的形式和其外消旋混合物。在一个实施方案中，-C(=O)O-和L2一起形成基团：其中星形表示药物或细胞毒性剂的连接点(任选通过间隔物)位置，波浪线表示与接头L1的连接点，Y是-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，和n是0-3。亚苯基环被本文所述的一个、两个或三个取代基任选取代。在一个实施方案中，Y是NH。在一个实施方案中，n是0或1。优选地，n是0。在Y是NH和n是0时，自断裂接头可称为对氨基苄基羰基接头(PABC)。在另一个特别优选的实施方案中，接头可包括自断裂接头，并和二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其由下式表示：其中星形表示选择的细胞毒性部分的连接点，和波浪线表示与可与抗体缀合的接头的剩余部分的连接点(例如，间隔物-抗体结合区段)。在酶裂解二肽时，当远距离位点被激活时，自断裂接头允许完全释放受保护的化合物(即细胞毒素)，沿下文所示的路线进行：其中L*是接头的剩余部分的活化形式，包含当前裂解的肽基单元。药物的完全释放确保它们保持需要的毒性。在另一个优选的实施方案中，接头包含-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在一个实施方案中，A是共价键。因此，L1和抗体直接连接。例如，在L1包含连续的氨基酸序列时，序列的N-端可与抗体残基直接连接。在另一个实施方案中，A是间隔物基团。因此，L1和抗体间接连接。L1和A可通过选自以下的键连接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-和-NHC(=O)NH-。如下文更详细论述的，本发明的药物接头优选地与半胱氨酸(包括游离的半胱氨酸)上的反应性硫醇亲核基团连接。为此，通过用各种还原剂例如DTT或TCEP或本文所示的温和还原剂处理，可使抗体的半胱氨酸对与接头试剂的缀合具有反应性。在其它实施方案中，本发明的药物接头优选地与赖氨酸连接。优选地，接头包含与抗体上的亲核官能团反应的亲电子官能团。抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N-端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)在抗体被糖基化时的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基是亲核的，并能够与接头部分上的亲电子基团反应形成共价键，接头试剂包括：(i)马来酰亚胺基团，(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯例如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物，(iv)烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；和(v)醛、酮、羧基，和其中的一些举例如下：在特别优选的实施方案中，位点特异性抗体和药物-接头部分之间的连接是通过位点特异性抗体的游离半胱氨酸的硫醇残基和接头上存在的末端马来酰亚胺基团进行的。在这样的实施方案中，抗体和药物-接头之间的连接是：其中星形表示与药物-接头的剩余部分的连接点，和波浪线表示与抗体的剩余部分的连接点。在该实施方案中，S原子优选地源自位点特异性游离半胱氨酸。关于其它相容的接头，结合部分包含末端碘乙酰胺，其可与活化的残基反应以提供需要的缀合物。在任何事件中，根据本公开内容，本领域技术人员可容易地将各个所公开的药物-接头化合物与合适的抗-RNF43抗体(例如，位点特异性抗体)缀合。5.缀合应当理解，可以使用许多本领域公知的不同反应来将药物部分和/或接头连接到所选择的抗体上。例如，利用半胱氨酸的巯基的各种反应可以用于缀合所需部分。特别优选的实施方案将包括如下详细讨论的包含一个或多个游离半胱氨酸的抗体的缀合。在其它实施方案中，本发明的ADC可以通过药物与存在于所选抗体中的赖氨酸残基的暴露于溶剂的氨基的缀合而产生。还有其它实施方案包括N-末端苏氨酸和丝氨酸残基的活化，然后可用于将所公开的有效负荷连接到抗体。所选择的缀合方法将优选被定制以优化与抗体连接的药物的数量并提供相对高的治疗指数。用于将治疗化合物与半胱氨酸残基缀合的多种方法是本领域已知的，并且对于本领域技术人员是显而易见的。在碱性条件下，半胱氨酸残基将被去质子化以产生硫醇酯亲核体，其可以与软的亲电子试剂例如马来酰亚胺和碘乙酰胺反应。通常用于这种缀合的试剂可以与半胱氨酸的半胱氨酸硫醇直接反应以形成缀合的蛋白质或与接头-药物反应以形成接头-药物中间体。在接头的情况下，使用有机化学反应、条件和试剂的几种途径是本领域技术人员已知的，包括：(1)本发明的蛋白质的半胱氨酸基团与接头试剂反应，经由共价键形成蛋白质–接头中间体，随后与活化的化合物反应；和(2)化合物的亲核基团与接头试剂反应，经由共价键形成药物-接头中间体，然后与本发明的蛋白质的半胱氨酸基团反应。根据前述，对于本领域技术人员显而易见的是，双官能接头可用于本发明。例如，双官能接头可以包含用于与半胱氨酸残基共价连接的硫醇修饰基团和用于与化合物共价或非共价连接的至少一个连接部分(例如第二硫醇修饰部分)。在缀合之前，可以通过用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧基乙基)膦(TCEP)处理使抗体活化，用于与接头试剂缀合。在其它实施方案中，可以通过赖氨酸与试剂(包括但不限于2-亚氨基四氢噻吩(Traut试剂)、SATA、SATP或SAT(PEG)4)反应，将另外的亲核基团引入抗体，导致胺转化为硫醇。关于这样的缀合，半胱氨酸硫醇或赖氨酸氨基是亲核的，并且能够反应以与接头试剂或化合物-接头中间体或药物上的亲电子基团形成共价键，包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤;(ii)烷基和苄基卤化物，如卤代乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团;和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，通过硫化物交换。化合物或接头上的亲核基团包括但不限于能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫代缩氨基脲、肼羧酸盐和芳基酰肼基团。优选的缀合试剂包括马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、磺酰氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯和亚磷酰胺，但也可以使用其它官能团。在某些实施方案中，方法包括例如使用马来酰亚胺、碘乙酰亚胺或卤代乙酰基/烷基卤化物、氮丙啶、丙烯酰基衍生物与半胱氨酸的硫醇反应以产生与化合物反应的硫醚。游离硫醇与活化的吡啶基二硫化物的二硫化物交换也可用于产生缀合物(例如使用5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB))。优选使用马来酰亚胺。如上所述，赖氨酸也可以用作反应性残基以实现本文所述的缀合。亲核赖氨酸残基通常通过胺反应性琥珀酰亚胺酯靶向。为了获得最佳数量的去质子化赖氨酸残基，水溶液的pH必须低于赖氨酸铵基团的pKa，其为约10.5，因此反应的典型pH为约8和9。用于偶联反应的常用试剂是NHS-酯，其通过赖氨酸酰化机理与亲核赖氨酸反应。经历类似反应的其它相容性试剂包括异氰酸酯和异硫氰酸酯，其也可以与本文的教导结合使用以提供ADC。一旦赖氨酸已经被激活，许多上述连接基团可以用于将弹头共价结合到抗体。用于将化合物与苏氨酸或丝氨酸残基(优选N-末端残基)缀合的方法也是本领域已知的。例如已经描述了羰基前体衍生自丝氨酸或苏氨酸的1,2-氨基醇的方法，其可以通过高碘酸盐氧化选择性地和快速地转化为醛形式。醛与连接本发明的蛋白质的化合物的半胱氨酸的1,2-氨基硫醇的反应形成稳定的噻唑烷产物。该方法对于在N端丝氨酸或苏氨酸残基处标记蛋白质特别有用。在特别优选的实施方案中，可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个游离半胱氨酸残基将反应性硫醇基团引入所选择的抗体(或其片段)(例如，制备包含一个或多个游离非天然半胱氨酸氨基酸残基的抗体)。这种位点特异性抗体或工程改造抗体允许显示增强的稳定性和基本上同质性的缀合物制剂，至少部分归因于提供本文所述的工程改造的游离半胱氨酸位点和/或新的缀合方法。与完全或部分地减少链内或链间抗体二硫键中的每一个以提供缀合位点(并且与本发明完全相容)的常规缀合方法不同，本发明另外提供了选择性还原某些制备的游离半胱氨酸位点和将药物-接头定位至所述游离半胱氨酸位点。由工程改造位点和选择性还原促进的缀合特异性允许在期望位置的高百分比的位点定向缀合。显著地，这些缀合位点中的一些，例如存在于轻链恒定区末端区域的那些，通常难以有效地缀合，因为它们倾向于与其它游离半胱氨酸交叉反应。然而，通过分子工程改造和所得到的游离半胱氨酸的选择性还原，可以获得有效的缀合速率，其显著减少了不希望的高DAR污染物和非特异性毒性。更一般地，工程改造构建体和公开的包括选择性还原的新的缀合方法提供具有改善的药代动力学和/或药效学和可能的改善的治疗指数的ADC制剂。位点特异性构建体存在游离半胱氨酸，其在还原时包含亲核的并能够与接头部分上的亲电子基团(例如上文所公开的那些)反应形成共价键的硫醇基团。本发明的优选抗体将具有可还原的非配对链间或链内半胱氨酸，即提供此类亲核基团的半胱氨酸。因此，在某些实施方案中，还原的未配对半胱氨酸的游离巯基与所公开的药物-接头的末端马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基团的反应将提供所需的缀合。在这种情况下，抗体的游离半胱氨酸可以通过用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或(三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理而活化，用于与接头试剂缀合。各游离半胱氨酸因此理论上存在反应性硫醇亲核基团。尽管这些试剂是相容的，但应当理解，可以使用本领域技术人员已知的各种反应、条件和试剂来实现位点特异性抗体的缀合。此外，已经发现，工程改造抗体的游离半胱氨酸(无论是引入的还是源自天然链间或链内二硫键)可以被选择性地还原以提供增强的定点缀合和减少不需要的潜在毒性污染物。更具体地，已经发现“稳定剂”例如精氨酸调节蛋白质中的分子内和分子间相互作用，并且可以与所选择的还原剂(优选相对温和的)一起用于选择性地还原游离半胱氨酸和促进本文所述的位点特异性缀合。如本文所用，术语“选择性还原”或“选择性地还原”可以互换使用，并且应意指减少游离半胱氨酸而基本上不破坏工程改造抗体中存在的天然二硫键。在选择的实施方案中，这可能受某些还原剂的影响。在其它优选的实施方案中，工程改造构建体的选择性还原将包括使用稳定剂与还原剂(包括温和还原剂)的组合。应当理解，术语“选择性缀合”是指已经选择性还原的工程改造抗体与本文所述的细胞毒素的缀合。在这方面，使用这种稳定剂与选择的还原剂组合可以显著地提高位点特异性缀合的效率，如通过重链和轻链抗体链上的缀合程度和制剂的DAR分布所确定的。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但是这种稳定剂可以起作用以调节静电微环境和/或调节所需缀合位点处的构象变化，从而允许相对温和的还原剂(其不实质上减少完整的天然二硫键)以促进在所需的游离半胱氨酸位点的缀合。已知这些试剂(例如，某些氨基酸)形成盐桥(通过氢键和静电相互作用)，并且可以调节蛋白质-蛋白质相互作用以赋予可引起有利的构象变化的稳定作用，和/或可减少不利的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，这样的试剂可以在还原后起作用以抑制不期望的分子内(和分子间)半胱氨酸-半胱氨酸键的形成，从而促进期望的缀合反应，其中工程改造的位点特异性半胱氨酸与药物(优选通过接头)结合。由于选择性还原条件不提供完整的天然二硫键的显著还原，因此随后的缀合反应自然地被驱动至游离半胱氨酸上相对少的反应性硫醇(例如，优选每个抗体2个游离硫醇)。如前所述，这显著降低了如本文所述制备的缀合物制剂中非特异性缀合和相应杂质的水平。在选择的实施方案中，与本发明相容的稳定剂通常包括具有至少一个具有碱性pKa的部分的化合物。在某些实施方案中，所述部分将包含伯胺，而在其它优选的实施方案中，所述胺部分将包含仲胺。在其它优选实施方案中，胺部分将包含叔胺或胍鎓基。在其它选择的实施方案中，胺部分将包含氨基酸，而在其它相容的实施方案中，胺部分将包含氨基酸侧链。在其它实施方案中，胺部分将包含蛋白原性氨基酸。在其它实施方案中，胺部分包含非蛋白原性氨基酸。在特别优选的实施方案中，相容的稳定剂可以包括精氨酸、赖氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。此外，相容的稳定剂可以包括具有碱性pKa的胍和含氮杂环。在某些实施方案中，相容的稳定剂包括具有至少一个pKa大于约7.5的胺部分的化合物，在其它实施方案中，所述胺部分的pKa大于约8.0，在其它实施方案中，胺部分的pKa大于约8.5，在其它实施方案中，稳定剂将包含pKa大于约9.0的胺部分。其它优选的实施方案将包括稳定剂，其中胺部分的pKa大于约9.5，而某些其它实施方案将包含显示至少一个pKa大于约10.0的胺部分的稳定剂。在其它优选实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约10.5的胺部分的化合物，在其它实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约11.0的胺部分的化合物，而在在其它实施方案中，稳定剂将包含pKa大于约11.5的胺部分。在其它实施方案中，稳定剂将包含具有pKa大于约12.0的胺部分的化合物，而在其它实施方案中，稳定剂将包含pKa大于约12.5的胺部分。本领域技术人员将理解，相关pKa可以容易地使用标准技术计算或测定，并用于确定使用所选化合物作为稳定剂的适用性。所公开的稳定剂显示出当与某些还原剂组合时对靶向与游离位点特异性半胱氨酸缀合特别有效。对于本发明的目的，相容的还原剂可以包括产生用于缀合的还原的游离位点特异性半胱氨酸而不显著破坏工程改造抗体天然二硫键的任何化合物。在通过选择的稳定剂和还原剂的组合提供的这种条件下，活化的药物接头主要限于结合所需的游离位点特异性半胱氨酸位点。特别优选相对温和的还原剂或在相对低浓度下使用以提供温和条件的还原剂。如本文所用，术语“温和还原剂”或“温和还原条件”应理解为由还原剂(任选在稳定剂存在下)产生的任何试剂或状态，其在游离半胱氨酸位点提供硫醇，而基本上不破坏工程改造抗体中存在的天然二硫键。也就是说，温和的还原剂或条件能够有效地还原游离半胱氨酸(提供硫醇)而不显著破坏蛋白质的天然二硫键。期望的还原条件可以通过多种基于巯基的化合物提供，其为选择性缀合建立适当的环境。在优选的实施方案中，温和还原剂可以包括具有一个或多个游离硫醇的化合物，而在特别优选的实施方案中，温和还原剂将包括具有单一游离硫醇的化合物。与本发明相容的还原剂的非限制性实例包括谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、2-氨基乙烷-1-硫醇和2-羟基乙烷-1-硫醇。应当理解，上述选择性还原方法在与游离半胱氨酸的靶向缀合中特别有效。在这方面，可以通过各种本领域接受的技术确定在位点特异性抗体中与所需靶位点缀合的程度(在此定义为“缀合效率”)。药物与抗体的位点特异性缀合的效率可以通过评估相对于所有其它缀合的靶缀合位点(在本发明中在轻链的c-末端上的游离半胱氨酸)的缀合百分比来确定。在某些实施方案中，本文的方法提供有效地将药物与包含游离半胱氨酸的抗体缀合。在一些实施方案中，缀合效率为至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更高，如通过相对于所有其它缀合位点的靶缀合百分比测量的。还将理解，能够缀合的工程改造抗体可以含有包含巯基的游离半胱氨酸残基，当产生或储存抗体时，其被封闭或加帽。这种帽包括小分子、蛋白质、肽、离子和与巯基相互作用并防止或抑制缀合物形成的其它物质。在一些情况下，未缀合的工程改造抗体可以包含结合在相同或不同抗体上的其他游离半胱氨酸的游离半胱氨酸。如本文所讨论的，这种交叉反应性可能在制造程序期间导致各种污染物。在一些实施方案中，工程改造抗体可能需要在缀合反应之前脱帽。在具体实施方案中，本文的抗体脱帽并显示能够缀合的游离巯基。在具体实施方案中，本文的抗体经受不扰乱或重排天然存在的二硫键的脱帽反应。应当理解，在大多数情况下，脱帽反应将在正常还原反应(还原或选择性还原)期间发生。6.DAR分布和纯化与本发明的位点特异性抗体缀合的优点之一是产生包含窄DAR分布的相对均匀的ADC制剂的能力。在这方面，就药物和工程改造抗体之间的化学计量比而言，所公开的构建体和/或选择性缀合提供了样品中ADC种类的同质性。如上简要讨论的，术语“药物与抗体的比率”或“DAR”是指药物与抗体的摩尔比。在一些实施方案中，缀合物制剂在其DAR分布方面可以是基本上同质的，这意味着具有特定DAR(例如，2或4的DAR)的位点特异性ADC的主要种类在制剂内，其在加载位点(即，在游离半胱氨酸上)方面也是均匀的。在本发明的某些实施方案中，有可能通过使用位点特异性抗体和/或选择性还原和缀合来实现期望的同质性。在其它优选实施方案中，可以通过使用位点特异性构建体与选择性还原组合来实现所需的同质性。在其它特别优选的实施方案中，可以使用分析或制备型色谱技术进一步纯化制备物。在这些实施方案的每一个中，可以使用本领域已知的各种技术分析ADC样品的均质性，包括但不限于质谱法、HPLC(例如大小排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛细管电泳。关于ADC制剂的纯化，应当理解，可以使用标准药物制备方法以获得所需的纯度。如本文所讨论的，液相色谱法例如反相(RP)和疏水相互作用色谱(HIC)可以通过药物装载值分离混合物中的化合物。在一些情况下，离子交换(IEC)或混合模式色谱(MMC)也可用于分离具有特定药物负载的物质。所公开的ADC及其制备物可以包括取决于抗体的构型和至少部分地基于用于实现缀合的方法的各种化学计量摩尔比的药物和抗体部分。在某些实施方案中，每个ADC的药物负载可以包含1-20个弹头(即n为1-20)。其他选择的实施方案可以包括具有从1至15个弹头的药物负载的ADC。在其他实施方案中，ADC可以包括1-12个弹头，或者更优选地包括1-10个弹头。在某些优选实施方案中，ADC将包含1至8个弹头。虽然理论药物负载可能相对高，但是由于聚集体和其他污染物，实际限制例如游离半胱氨酸交叉反应性和弹头疏水性倾向于限制包含这种DAR的均匀制剂的产生。也就是说，较高的药物负载，例如>6，可能导致某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性或细胞通透性的丧失。考虑到这些问题，本发明提供的实际药物负载优选为每个缀合物1至8个药物，即其中1、2、3、4、5、6、7或8个药物共价连接至每个抗体(例如，对于IgG1，其他抗体可以具有不同的负载能力，这取决于二硫键的数目)。优选地，本发明的组合物的DAR将为约2、4或6，在特别优选的实施方案中，DAR将包含约2。尽管本发明提供了相对高水平的均质性，但公开的组合物实际上包含具有1至8个(在IgG1的情况下)的药物化合物范围的缀合物的混合物。因此，所公开的ADC组合物包括缀合物的混合物，其中大多数组成抗体与一个或多个药物部分共价连接，并且(尽管具有选择性还原的缀合物特异性)其中药物部分可以通过各种巯基连接到抗体。也就是说，在缀合后，本发明的ADC组合物将包含具有各种浓度的不同药物负载(例如，每个IgG1抗体1至8个药物)的缀合物(以及主要由游离半胱氨酸交叉反应性引起的某些反应污染物)的混合物。使用选择性还原和制造后纯化，可以将缀合物组合物驱动到它们主要含有相对低水平的其它ADC种类(例如，药物装载量为1、4、6等)的单个主要所需的ADC种类(例如，具有2的药物负载)的点。平均DAR值表示组合物作为整体(即，所有ADC种类一起)的药物负载的加权平均值。由于所使用的定量方法的固有不确定性和在商业环境中完全去除非优势ADC种类的困难，可接受的DAR值或规格通常表示为平均值、范围或分布(即，平均DAR为2+/-0.5)。优选包含在该范围内(即1.5至2.5)的测量平均DAR的组合物将用于药用设定中。因此，在某些优选的实施方案中，本发明将包括具有平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8的组合物，各自+/-0.5。在其它优选实施方案中，本发明将包括2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最后，在选择的优选实施方案中，本发明将包括2+/-0.5的平均DAR。应当理解，在某些优选实施方案中，范围或偏差可以小于0.4。因此，在其它实施方案中，组合物将包含各自+/-0.3的1、2、3、4、5、6、7或8的平均DAR，2、4、6或8+/-0.3的平均DAR，甚至更优选2或4+/-0.3的平均DAR或甚至2+/-0.3的平均DAR。在其它实施方案中，IgG1缀合物组合物将优选包含平均DAR为1、2、3、4、5、6、7或8各自+/-0.4的组合物，和相对低水平(即，小于30%)的非主要ADC种类。在其它优选实施方案中，ADC组合物将包含2、4、6或8各自+/-0.4的平均DAR，并具有相对低水平(<30%)的非主要ADC种类。在特别优选的实施方案中，ADC组合物将包含2+/-0.4的平均DAR和相对低水平(<30%)的非主要ADC种类。在其它实施方案中，当针对其他DAR物种测量时，主要的ADC种类(例如，2的DAR)将以大于65%的浓度、大于70%的浓度、大于75%的浓度、大于80%的浓度、大于在大于85%的浓度、在大于90%的浓度、在大于93%的浓度、在大于95%的浓度或甚至在大于97%的浓度存在。如下文实施例中详述的，可以通过常规方法如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、质谱法、ELISA和电泳表征来自缀合反应的ADC制剂中每个抗体的药物分布。还可以确定ADC对于每个抗体的药物的定量分布。通过ELISA，可以测定ADC的特定制剂中每个抗体的药物的平均值。然而，通过ELISA的抗体-抗原结合和检测限制不能辨别药物/抗体值的分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定法不确定药物部分连接于抗体的位置，例如重链或轻链片段或特定氨基酸残基。VI.诊断和筛选1.诊断本发明提供用于检测、诊断或监测增殖性疾病的体外或体内方法和从患者中筛选细胞以鉴定包括致瘤细胞(例如CSC)的肿瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定具有癌症的个体用于治疗或监测癌症的进展，包括使患者或从患者获得的样品(即在体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中是否存在抗体结合的或游离的靶分子或其缔合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报告分子。在一些实施方案中，抗体与样品中特定细胞的缔合可以表示样品表达作为本发明抗体的靶标(例如RNF43)的蛋白质，从而表明具有癌症的个体可以有效地用如本文所述的抗体或抗体药物缀合物治疗。可以使用多种测定法，例如放射免疫测定法、酶免疫测定法(例如ELISA)、竞争结合测定法、荧光免疫测定法、免疫印迹测定法、蛋白质印迹分析和流式细胞术测定法来分析样品。合适的体内治疗诊断或诊断测定可包括本领域公知的成像或监测技术，例如磁共振成像、计算机断层摄影(例如CAT扫描)、正电子断层摄影(例如PET扫描)、放射照相术、超声等，如本领域技术人员已知的。在另一个实施方案中，本发明提供了在体内分析癌症进展和/或发病的方法。在另一个实施方案中，体内癌症进展和/或发病的分析包括确定肿瘤进展的程度。在另一个实施方案中，分析包括肿瘤的鉴定。在另一个实施方案中，对原发性肿瘤进行肿瘤进展的分析。在另一个实施方案中，根据本领域技术人员已知的癌症类型，随时间进行分析。在另一个实施方案中，在体内分析源自原发肿瘤的转移细胞的继发性肿瘤的进一步分析。在另一个实施方案中，分析继发性肿瘤的大小和形状。在一些实施方案中，进行进一步的离体分析。在另一个实施方案中，本发明提供了一种体内分析癌症进展和/或发病的方法，包括测定细胞转移或检测和定量循环肿瘤细胞的水平。在另一个实施方案中，细胞转移的分析包括测定与原发性肿瘤不连续的部位处的细胞的进行性生长。在另一个实施方案中，细胞转移分析位点包括肿瘤扩散的途径。在一些实施方案中，细胞可以通过血管系统、淋巴管、在体腔内或其组合分散。在另一个实施方案中，鉴于细胞迁移、传播、外渗、增殖或其组合进行细胞转移分析。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于检测和定量患者样品(例如血浆或血液)中的RNF43水平，其可以进而用于检测、诊断或监测RNF43相关病症，包括增殖疾病。在相关实施方案中，本发明的抗体可以用于体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞(WO2012/0128801)。在其他实施方案中，循环肿瘤细胞可以包含致瘤细胞。在本发明的某些实施方案中，可以在治疗或方案之前使用所公开的抗体来评价或表征受试者中的致瘤细胞或来自受试者的样品以建立基线。在其他实例中，可以从衍生自被治疗的受试者的样品评估致瘤细胞。在一些实例中，在受试者开始或终止治疗后至少约1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6个月、9个月、12个月或>12个月，自受试者获取样品。在某些实例中，在一定剂量之后(例如，1、2、3、4、5、10、20、30或更多个治疗剂量后)评价或表征致瘤细胞。在其他实例中，在接受一次或多次治疗后1周、2周、3周、1个月、6周、2个月、1年、2年、3年、4年或更长后，表征或评估致瘤细胞。另一方面，如下文更详细讨论的，本发明提供了用于检测、监测或诊断过度增殖性疾病，鉴定具有这种疾病的个体以用于可能治疗或监测患者的疾病进展(或消退)的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本文所述的抗体和用于检测所述抗体对样品的影响的试剂。本发明的又一方面包括使用标记的抗RNF43抗体用于免疫组织化学(IHC)。在这方面，IHC可以用作诊断工具以帮助诊断各种增殖性疾病，并监测对包括抗RNF43抗体治疗在内的治疗的潜在反应。可以对已经化学固定(包括但不限于：甲醛、戊二醛、四氧化锇、重铬酸钾、乙酸、醇、锌盐、氯化汞、四氧化铬和苦味酸)和包埋(包括但不限于：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蜡和树脂)或通过冷冻保存的组织进行合适的诊断测定法。这样的测定法可用于指导治疗决定并确定给药方案和时间。2.筛选在某些实施方案中，抗体可用于筛选样品，以鉴定通过与决定子相互作用而改变肿瘤细胞的功能或活性的化合物或试剂(例如抗体或ADC)。在一个实施方案中，使肿瘤细胞与抗体或ADC接触，并且抗体或ADC可用于筛选表达某种靶标(例如RNF43)的细胞的肿瘤，以便鉴定所述细胞用于以下目的，包括但不限于：诊断目的、监测此类细胞以确定治疗功效或富集这种靶标表达细胞的细胞群。在又一个实施方案中，方法包括直接或间接地使肿瘤细胞与测试剂或化合物接触，并确定测试剂或化合物是否调节与决定子相关的肿瘤细胞的活性或功能，例如细胞形态或存活力的改变、标记物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、存活力、细胞凋亡或细胞死亡。直接相互作用的一个实例是物理相互作用，而间接相互作用包括例如组合物对中间分子的作用，所述中间分子继而作用于涉及的实体(例如细胞或细胞培养物)。筛选方法包括高通量筛选，其可以包括任选地在预定位置，例如在培养皿、管、烧瓶、滚瓶或板上定位或放置的细胞阵列(例如微阵列)。高通量机器人或人工处理方法可以探测化学相互作用并在短时间内确定许多基因的表达水平。已经开发了利用分子信号的技术，例如通过荧光团或微阵列(Mocellin和Rossi，2007，PMID：17265713)和以非常快的速率处理信息的自动化分析(参见例如Pinhasov等人，2004，PMID：15032660)。可以筛选的文库包括例如小分子文库、噬菌体展示文库、完全人抗体酵母展示文库(Adimab)、siRNA文库和腺病毒转染载体。VII.药物制备和治疗用途1.制剂和给药途径本发明的抗体或ADC可以使用本领域公知的技术以各种方式配制。在一些实施方案中，本发明的治疗组合物可以单独或以最少量的其它组分施用，而其它实施方案可以任选地配制成含有合适的药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括本领域熟知的且可从商业来源获得用于药物制备的赋形剂、溶媒、助剂和稀释剂(参见例如Gennaro(2003)Remington：TheScienceandPracticeofPharmacywithFactsandComparisons：DrugfactsPlus，第20版，MackPublishing;Ansel等人(2004)PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems，第7版，LippencottWilliamsandWilkins;Kibbe等人(2000)HandbookofPharmaceuticalExcipients，第3版，PharmaceuticalPress)。合适的药学上可接受的载体包括相对惰性的并且可以促进抗体的施用或可以有助于将活性化合物加工成药学优化用于递送至作用部位的制剂的物质。这种药学上可接受的载体包括可以改变制剂的形式、一致性、粘度、pH、张力、稳定性、渗透压、药代动力学、蛋白质聚集或溶解度的试剂，包括缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包封剂和皮肤渗透促进剂。载体的某些非限制性实例包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠及其组合。用于全身给药的抗体可以配制用于肠内、胃肠外或局部给药。实际上，所有三种类型的制剂可以同时使用以实现活性成分的全身给药。赋形剂以及用于胃肠外和非肠外药物递送的制剂在Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(2000)第20版，MackPublishing中提供。用于肠内施用的合适制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂及其控释形式。适合于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括其中活性成分溶解、悬浮或以其它方式提供(例如在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如，溶液、悬浮液)。这样的液体可另外含有其它药学上可接受的载体，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其它相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于这种制剂的合适的等渗药学上可接受的载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格注射液。用于胃肠外施用(例如，静脉内注射)的合适制剂可以包含约10μg/mL至约100mg/mL的ADC或抗体浓度。在某些选择的实施方案中，抗体或ADC浓度将包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其它优选实施方案中，ADC浓度将包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。本发明的化合物和组合物可以通过各种途径在体内给予有需要的受试者，包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、胃肠外、鼻内、肌内、心脏内、心室内、气管内、含服、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮和鞘内，或另外通过植入或吸入。所述组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。可以根据预期的应用和治疗方案来选择合适的制剂和给药途径。2.剂量具体的剂量方案，即剂量、时间和重复，将取决于具体的个体，以及经验考虑，例如药代动力学(例如半衰期、清除率等)。给药频率的确定可以由本领域技术人员例如主治医师，基于所治疗的病症的状况和严重程度、所治疗的受试者的年龄和一般健康状况等来进行。基于对所选组合物的功效和给药方案的评估，可以在治疗过程中调整给药频率。这种评估可以基于特定疾病、病症或病况的标记物进行。在个体患有癌症的实施方案中，这些包括通过触诊或目视观察直接测量肿瘤大小；通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查评估的改善；间接肿瘤标记物(例如，前列腺癌的PSA)或根据本文所述方法鉴定的抗原的测量；减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少；减少肿瘤细胞的增殖；或延迟转移的发展。本发明的RNF43抗体或ADC可以以各种范围施用。这些包括每剂约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其它范围包括每剂约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在某些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重、至少约250μg/kg体重、至少约750μg/kg体重、至少约3mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约10mg/kg体重。在选择的实施方案中，将以每剂约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/kg体重施用(优选静脉内)RNF43抗体或ADC。其它实施方案可以包括以每剂约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg体重施用ADC。在其它优选的实施方案中，所公开的缀合物将以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10mg/kg施用。在仍其它实施方案中，缀合物可以以每剂12、14、16、18或20mg/kg体重施用。在仍其它实施方案中，缀合物可以以每剂25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg/kg体重施用。利用本文的教导，本领域技术人员可以基于临床前动物研究、临床观察和标准医学和生物化学技术和测量，容易地确定各种RNF43抗体或ADC的合适剂量。其它给药方案可以基于体表面积(BSA)计算来预测，如美国专利号7,744,877所公开的。众所周知，使用患者的身高和体重来计算BSA，并且其提供由他或她的身体的表面积表示的受试者尺寸的度量。在某些实施方案中，缀合物可以以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2的剂量、100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量施用。还应当理解，本领域公知的和经验技术可用于确定适当的剂量。抗RNF43抗体或ADC可以以特定的时间表施用。通常，向受试者施用有效剂量的RNF43缀合物一次或多次。更具体地，将有效剂量的ADC每月一次、每月多于一次或每月少于一次施用给受试者。在某些实施方案中，可以多次施用有效剂量的RNF43抗体或ADC，包括至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年或几年的时期。在另外其他实施方案中，在施用所公开的抗体或ADC之间可以停药几天(2、3、4、5、6或7)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至一年或几年。在某些优选的实施方案中，涉及缀合的抗体的治疗过程将包括在数周或数月的时间内的多个剂量的所选药物产品。更具体地，本发明的抗体或ADC可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每月、每六周、每两个月、每十周或每三个月施用一次。在这方面，应当理解，基于患者反应和临床实践，可以改变剂量或者可以调整间隔。在已经给予一次或多次施用的个体中，所公开的治疗组合物的剂量和方案也可以凭经验确定。例如，个体可以给予增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选择的实施方案中，剂量可以分别基于经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减弱。为了评估所选组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病况的标记物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查评估的改善；间接肿瘤标记物(例如，前列腺癌的PSA)或根据本文所述方法鉴定的致瘤性抗原的测量，疼痛或麻痹的减轻；改善与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能；增加食欲；或通过接受的测试或存活延长测量的生活质量的提高。对本领域技术人员显而易见的是，剂量将根据个体、肿瘤病症的类型、肿瘤病症的阶段、肿瘤病症是否已经开始转移到个体中的其他位置以及过去和同时使用的治疗而改变。3.组合疗法组合疗法可用于预防或治疗癌症和预防癌症的转移或复发。本文所用的“组合疗法”是指施用包含至少一种抗RNF43抗体或ADC和至少一种治疗部分(例如抗癌剂)的组合，其中所述组合优选具有治疗协同作用，或与以下方面相比，改善癌症治疗中的可测量的治疗效果：(i)单独使用的抗RNF43抗体或ADC，或(ii)单独使用的治疗部分，或(iii)治疗部分与另一治疗部分组合使用而不添加抗RNF43抗体或ADC。本文所用的术语“治疗协同作用”是指抗RNF43抗体或ADC与一种或多种治疗部分的组合，其具有大于抗RNF43抗体或ADC和一个或多个治疗性部分的组合的加和效果的治疗效果。所公开的组合的期望结果通过与对照或基线测量进行比较来量化。如本文所使用的，诸如“改善”、“增加”或“减少”的相对术语指示相对于对照的值，所述对照例如在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量，或在不存在本文所述的抗RNF43抗体或ADC的情况下，但在其它治疗部分(例如护理治疗标准)的存在下对照个体(或多个对照个体)中的测量。代表性对照个体是患有与所治疗个体相同形式的癌症的个体，其与所治疗个体的年龄大致相同(以确保治疗个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的。)对治疗的反应的改变或改善通常是统计学显著的。如本文所使用的，术语“显著性”或“显著的”涉及在两个或更多个实体之间存在非随机关联的概率的统计分析。为了确定关系是否是“显著的”或具有“显著性”，可以计算“p值”。低于用户定义的截止点的p值被认为是显著的。小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001的p值可以被认为是显著的。协同治疗效果可以是比单一治疗部分或抗RNF43抗体或ADC引起的治疗效果，或者抗RNF43抗体或ADC或给定组合的单个治疗部分引起的治疗效果的总和的至少约两倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约50倍、或至少约一百倍大的效果。当与单一治疗部分或抗RNF43抗体或ADC引起的治疗效果，或者由抗-TNF43抗体或ADC或给定组合的单一治疗部分引起的治疗效果的总和相比，治疗效果增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多时，也可以观察到协同治疗效果。协同效果还是当组合使用时允许减少治疗剂的给药的效果。在实施组合治疗中，抗RNF43抗体或ADC和治疗性部分可以使用相同或不同的施用途径同时以单一组合物或作为两个或更多个不同组合物施用于受试者。或者，用抗RNF43抗体或ADC的治疗可在治疗部分治疗之前或之后，例如，以从数分钟到数周的间隔。在一个实施方案中，治疗部分和抗体或ADC在彼此约5分钟至约两周内施用。在另外其他实施方案中，在施用抗体和治疗部分之间可以停药几天(2、3、4、5、6或7)，几周(1、2、3、4、5、6、7或8)或几个月(1、2、3、4、5、6、7或8)。可以施用组合疗法，直到在各种时间表上治疗、缓解或治愈病症，例如每天一次、两次或三次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次，或可连续施用。抗体和治疗性部分可以间隔几天或几周施用；或给定抗RNF43抗体或ADC治疗的顺序，然后用另外的治疗部分进行一次或多次治疗。在一个实施方案中，抗RNF43抗体或ADC与一个或多个治疗性部分组合施用用于短治疗周期。在其它实施方案中，组合治疗施用用于长的治疗周期。组合疗法可以通过任何途径施用。本发明还提供抗RNF43抗体或ADC与放射疗法的组合。本文所用的术语“放射疗法”是指在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射等。也考虑使用放射性同位素到肿瘤细胞的定向递送的组合疗法，并且可以与本文公开的抗RNF43抗体组合使用，或作为本文公开的抗RNF43抗体的缀合物使用。通常，在约1至约2周的时间段内以脉冲施用放射疗法。任选地，放射疗法可以作为单一剂量或作为多个序贯剂量施用。在其他实施方案中，抗RNF43抗体或ADC可以与一种或多种下述化疗剂组合使用。4.抗癌剂本文使用的术语“抗癌剂”或“化疗剂”是“治疗部分”的一个子集，其又是描述为“药物活性部分”的药剂的子集。更具体地，“抗癌剂”是指可用于治疗细胞增殖性疾病例如癌症的任何试剂，包括但不限于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减灭剂、化疗剂、放射治疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂、生物反应调节剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、抗转移剂和免疫治疗剂。应当理解，在如上所述的选择的实施方案中，这样的抗癌剂可以包含缀合物，并且可以在施用前与抗体缔合。在某些实施方案中，所公开的抗癌剂将与抗体连接以提供本文公开的ADC。术语“细胞毒性剂”，其也可以是抗癌剂，是指对细胞有毒性并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。通常，物质是来源于活生物体的天然存在的分子(或合成制备的天然产物)。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如白喉毒素、假单胞菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌(例如α-帚曲霉素、局限曲菌素)、植物(例如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白、蒴莲根素、槲寄生毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜毒蛋白、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐蛋白质、石竹素蛋白、商陆植物蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、皮质激素、肥皂草抑制剂、mitegellin、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢菌毒素)或动物(例如细胞毒性RNA酶、例如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I、包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶活性毒素。抗癌剂可包括抑制或设计为抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤性后代的细胞(例如致瘤细胞)的任何化学试剂。这种化学试剂通常针对细胞生长或分裂所必需的细胞内过程，因此对通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱解聚微管，从而抑制细胞进入有丝分裂。这种试剂通常联合给药，并且通常是最有效的，例如在制剂CHOP中。再次，在选择的实施方案中，这样的抗癌剂可以与所公开的抗体缀合。可以与本发明的抗体组合使用(或与其缀合)的抗癌剂的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸酯、阿那曲唑、鹅膏菌素、氮丙啶、乙烯亚胺和methylamelamines、多聚乙酰类、喜树碱、BEZ-235、硼替佐米、苔藓抑素、callystatin、CC-1065、ceritinib、crizotinib、cryptophycins、多拉司他汀、duocarmycin、eleutherobin、厄洛替尼、pancratistatin、sarcodictyin、spongistatin、氮芥、抗生素、enediynedynemicin、双磷酸盐、埃斯帕霉素、chromoproteinenediyneantiobioticchromophores、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、canfosfamide、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、chromomycinis、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依西美坦、氟尿嘧啶、氟维司群、吉非替尼、伊达比星、拉帕替尼、来曲唑、lonafarnib、马赛洛霉素、醋酸甲地孕酮、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、帕唑帕尼、培霉素、博替霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、雷帕霉素、罗多比星、索拉非尼、链黑菌素、链佐星、他莫昔芬、他莫昔芬柠檬酸盐、替莫唑胺、替泊替尼、替比法尼、杀结核菌素、乌苯美司、凡德他尼、伏洛唑、XL-147、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂诸如frolinicacid、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比生群、依达曲沙、defofamine、秋水仙胺、地吖醌、elfornithine、依利醋铵、epothilone、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、类美登素、米托胍腙、米托蒽醌、mopidanmol、nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、多糖复合物、雷佐生、根霉素、SF-1126、西佐喃；锗螺胺、细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢霉烯(T-2毒素、verracurinA、杆孢菌素A和anguidine)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌血生；gacytosine;阿糖胞苷；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，chloranbucil;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;铂类似物，长春碱;铂;依托泊苷;异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺消灵;替尼泊苷;依达曲沙;柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达;伊班膦酸盐;伊立替康，拓扑异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸;类视黄醇;卡培他滨;考布他汀;甲酰四氢叶酸;奥沙利铂;XL518，减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂和任何上述药剂的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。在该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体抗体，抑制调节肾上腺中雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗雄激素;以及曲沙他滨(一种1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸，核酶例如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂;疫苗，PRILUKIN®rIL-2;LURTOTECAN®拓扑异构酶1抑制剂;ABARELIX®rmRH;长春瑞滨和埃斯波霉素以及任何上述药剂的药学上可接受的盐或溶剂合物、酸或衍生物。另外的抗癌剂包括商业上或临床上可用的化合物，例如厄洛替尼(TARCEVA®，Genentech/OSIPharm.)，多西他赛(TAXOTERE®，Sanofi-Aventis)，5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CASNo.51-21-8)，吉西他滨(GEMZAR®，Lilly)，PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)，顺铂(顺式二胺，二氯铂(II)，CAS号15663-27-1)，卡铂(CASNo.41575-94-4)，紫杉醇(TAXOL®，Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，N.J.)，曲妥单抗(HERCEPTIN®，Genentech)，替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂二环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，TEMODAR®，TEMODAL®，ScheringPlough)，他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]–N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)和多柔比星(ADRIAMYCIN®)。其它市售或临床可用的抗癌剂包括奥沙利铂(ELOXATIN®，Sanofi)，硼替佐米(VELCADE®，MillenniumPharm.)，sutent(SUNITINIB®，SU11248，Pfizer)，来曲唑(FEMARA®，Novartis)，甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC®，Novartis)，XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)，ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，ArrayBioPharma，AstraZeneca)，SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)，BEZ-235(PI3K抑制剂,Novartis)，XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)，PTK787/ZK222584(Novartis)，氟维司群(FASLODEX®，AstraZeneca)，甲酰四氢叶酸(亚叶酸)，雷帕霉素(西罗莫司，RAPAMUNE®，Wyeth)，lapatinib(TYKERB®，GSK572016，GlaxoSmithKline)，lonafarnib(SARASAR™，SCH66336，ScheringPlough)，索拉非尼(NEXAVAR®，BAY43-9006，BayerLabs)，吉非替尼(IRESSA®，AstraZeneca)，伊立替康(CAMPTOSAR®，CPT-11，Pfizer)，tipifarnib(ZARNESTRA™，Johnson&Johnson)，ABRAXANE™(无克列莫佛)，紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg，Il)，vandetanib(rINN，ZD6474，ZACTIMA®，AstraZeneca)，chloranmbucil，AG1478，AG1571(SU5271;Sugen)，替西罗莫司(TORISEL®，Wyeth)，帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)，canfosfamide(TELCYTA®，Telik)，塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN®，NEOSAR®);长春瑞滨(NAVELBINE®);卡培他滨(XELODA®，Roche)，他莫昔芬(包括NOLVADEX®；柠檬酸他莫昔芬，FARESTON®(托瑞米芬柠檬酸盐)MEGASE®(乙酸甲地孕酮)，AROMASIN®(依西美坦;Pfizer)，formestanie，法倔唑，RIVISOR®(vorozole)，FEMARA®(来曲唑;Novartis)和ARIMIDEX®(阿那曲唑;AstraZeneca)。术语“药学上可接受的盐”或“盐”是指分子或大分子的有机或无机盐。酸加成盐可以与氨基形成。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(即，1,1'亚甲基双-(2-羟基3-萘酸盐)。药学上可接受的盐可涉及包含另一分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电原子。当多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分时，该盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与分子或大分子的缔合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。在其它实施方案中，本发明的抗体或ADC可以与目前在临床试验中或可商购的许多抗体(或免疫治疗剂)中的任一种组合使用。所公开的抗体可与选自以下的抗体组合使用：阿巴伏单抗、阿德木单抗、afutuzumab、阿仑单抗、阿妥莫单抗、amatuximab、麻安莫单抗、阿西莫单抗、巴士昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐单抗、比代单抗、blinatumomab、brentuximab、美坎珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、citatuzumab、cixutumumab、clivatuzumab、conatumumab、daratumumab、drozitumab、duligotumab、dusigitumab、detumomab、dacetuzumab、dalotuzumab、ecromeximab、elotuzumab、ensituximab、ertumaxomab、etaracizumab、farletuzumab、ficlatuzumab、figitumumab、flanvotumab、futuximab、ganitumab、吉妥珠单抗、girentuximab、glembatumumab、替伊莫单抗、igovomab、imgatuzumab、indatuximab、inotuzumab、intetumumab、依匹单抗、iratumumab、labetuzumab、lambrolizumab、lexatumumab、lintuzumab、lorvotuzumab、lucatumumab、mapatumumab、马妥珠单抗、milatuzumab、minretumomab、mitumomab、moxetumomab、narnatumab、naptumomab、necitumumab、尼妥珠单抗、nivolumab、nofetumomabn、obinutuzumab、ocaratuzumab、奥法木单抗、olaratumab、olaparib、onartuzumab、oportuzumab、oregovomab、帕尼单抗、parsatuzumab、patritumab、pemtumomab、帕妥珠单抗、pidilizumab、pintumomab、pritumumab、racotumomab、radretumab、ramucirumab、rilotumumab、利妥昔单抗、robatumumab、satumomab、selumetinib、sibrotuzumab、siltuximab、simtuzumab、solitomab、tacatuzumab、taplitumomab、tenatumomab、替妥木单抗、替加珠单抗、托西莫单抗、曲妥单抗、tucotuzumab、ublituximab、维妥珠单抗、vorsetuzumab、伏妥莫单抗、扎妥木单抗、CC49、3F8、MDX-1105和MEDI4736以及它们的组合。其它特别优选的实施方案包括批准用于癌症治疗的抗体的用途，所述抗体包括但不限于利妥昔单抗、吉妥珠单抗奥佐格霉素、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕利单抗、奥法木单抗、依匹单抗和brentuximabvedotin。本领域技术人员将能够容易地鉴定与本文教导相容的另外的抗癌剂。5.放射疗法本发明还提供了抗体或ADC与放射疗法(即，在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射、X射线、UV-照射、微波、电子发射等)的组合。也考虑使用放射性同位素到肿瘤细胞的定向递送的组合疗法，并且所公开的抗体或ADC可以与靶向抗癌剂或其它靶向手段联合使用。通常，在约1至约2周的时间段内以脉冲施用放射疗法。可以向患有头颈癌的受试者施用放射疗法约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单一剂量或作为多个序贯剂量施用。VIII适应症本发明提供了本发明的抗体和ADC用于诊断、治疗诊断、治疗和/或预防各种疾病，包括肿瘤性、炎性、血管生成和免疫性疾病和由病原体引起的疾病的用途。特别地，治疗的关键目标是包括实体瘤的肿瘤病症，但血液恶性肿瘤在本发明的范围内。在某些实施方案中，本发明的抗体将用于治疗表达特定决定子(例如RNF43)的肿瘤或致瘤细胞。优选地，待治疗的“受试者”或“患者”将是人，但如本文所使用的，该术语明确地包括任何哺乳动物物种。根据本发明进行治疗的肿瘤病症可以是良性的或恶性的;实体瘤或其他血液肿瘤;并且可以选自：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、肺泡软部肉瘤、星形细胞瘤、自主神经节瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、囊胚性病症、骨癌(釉质细胞瘤、动脉瘤骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞肿瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤因氏肿瘤、骨骼外骨髓样软骨肉瘤、纤维发生不全骨症、骨骼的纤维性发育异常、胆囊和胆管癌、胃癌、胃肠癌、妊娠滋养层细胞疾病、胚细胞瘤、腺病症、头颈癌、下丘脑癌、肠癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、巨噬细胞疾病、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后色素层黑素瘤、罕见血液系统疾病、肾转移癌、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、间质疾病、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。在其他优选的实施方案中，所公开的抗体和ADC在治疗肺癌方面特别有效，所述肺癌包括以下亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)。在选择的实施方案中，可以将抗体和ADC施用于表现出有限分期疾病或广泛分期疾病的患者。在其它优选的实施方案中，将公开的缀合抗体施用于难治性患者(即，在初始治疗过程中或完成不久后疾病复发的那些患者)；敏感性患者(即在初次治疗后复发超过2-3个月的患者)；或患者显示对基于铂的药剂(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂)和/或紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛或卡巴他赛)有抗性的患者。在其它特别优选的实施方案中，本发明的ADC可以用于治疗结肠直肠癌。如本文所用，术语“结肠直肠癌”意在包括公知的医学定义，其将结肠直肠癌定义为特征在于小肠下方肠道(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)细胞的癌症的医学病症。此外，如本文所使用的，术语“结肠直肠癌”意在进一步包括以十二指肠和小肠(空肠和回肠)的细胞的癌症为特征的医学病症。本文使用的结肠直肠癌的定义比常规医学定义更广泛，但是如此提供是由于十二指肠和小肠的细胞也可以适用于本发明的方法。此外，本发明的化合物可用于治疗I期结肠直肠癌、II期结肠直肠癌、III期结肠直肠癌或IV期结肠直肠癌。本发明还提供了预防性治疗患有良性或癌前期肿瘤的受试者。没有特定类型的肿瘤或增殖性疾病被排除在使用本发明的抗体的治疗之外。IX.制品本发明包括包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其中容器可包含一个或多个剂量的本发明的抗体或ADC。在某些实施方案中，包装或试剂盒含有单位剂量，意指预定量的包含例如本发明的抗体或ADC的组合物，其含有或不含一种或多种另外的试剂，以及任选的一种或多种抗癌剂。本发明的试剂盒通常在合适的容器中含有本发明的抗体或ADC的药学上可接受的制剂，以及任选的在相同或不同容器中的一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以包含用于诊断或组合疗法的其它药学上可接受的制剂或装置。诊断装置或仪器的实例包括可用于检测、监测、量化或分析与增殖性疾病相关的细胞或标记志物的那些(关于这些标记物的完整列表，参见上文)。在特别优选的实施方案中，所述装置可用于在体内或体外检测、监测和/或定量循环肿瘤细胞(参见例如WO2012/0128801)。在其他优选实施方案中，循环肿瘤细胞可以包含致瘤细胞。本发明考虑的试剂盒还可以包含合适的试剂以将本发明的抗体或ADC与抗癌剂或诊断剂组合(例如，参见美国专利7,422,739)。当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液可以是非水性的，然而，优选水溶液，特别优选无菌水溶液。试剂盒中的制剂还可以作为干燥粉末或冻干形式提供，其可以在加入适当的液体后重构。用于重构的液体可以包含在单独的容器中。这样的液体可以包括无菌的、药学上可接受的缓冲液或其它稀释剂，例如注射用抑菌水、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。当试剂盒包含本发明的抗体或ADC与其它治疗剂或试剂的组合时，可以以摩尔当量组合或以超过其它组分的一种组分预混合溶液。或者，本发明的抗体或ADC和任何任选的抗癌剂或其它试剂可以在施用于患者之前分别保持在不同的容器中。试剂盒可以包括一个或多个容器和在容器中、上或与容器相关联的标签或包装说明书，指示所包装的组合物用于诊断或治疗所选择的疾病状况。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器可包括无菌入口，例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。在一些实施方案中，试剂盒可以含有向患者施用抗体和任何任选的组分的装置，例如一个或多个针或注射器(预填充或空的)、滴眼器、移液管或其它类似装置，从中可以将制剂注射或引入受试者或施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳小瓶等的装置和用于商业销售的紧密限制的其它组分，例如吹塑成型的塑料容器，其中放置所需的小瓶和其它装置并保留。X.其它方面除非本文另有定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。另外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有点。因此，2.0到3.0的范围包括2.0、3.0，和在2.0和3.0之间的所有点。通常，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和化学的技术是本领域公知和常用的。本文中使用的与这些技术相关的命名法也是本领域常用的。本发明的方法和技术通常根据本领域公知的和如在本说明书中引用的各种参考文献中描述的常规方法进行，除非另有说明。XI.参考文献本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及电子可获得材料(包括例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF和来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译中的氨基酸序列提交)的完整公开内容通过引用并入，不管短语“通过引用并入”是否与具体的参考文献相关使用。前述详细描述和以下实施例仅是为了清楚理解而给出的。从中应理解无不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节。对于本领域技术人员显而易见的变化包括在由权利要求限定的本发明中。本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。XII.XV.序列表概述本申请附加的是包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表3提供了所包括的序列的概述。表3SEQIDNO.描述1κ轻链恒定区蛋白2IgG1重链恒定区蛋白3RNF43的ECD的氨基酸序列4ZNRF3的ECD的氨基酸序列5全长RNF43的氨基酸序列6全长ZNRF3的氨基酸序列7-20省略21SC37.1VLDNA22SC37.1VL蛋白23SC37.1VHDNA24SC37.1VH蛋白25-252另外的鼠克隆253-270人源化克隆271-281人源化克隆的全长蛋白序列282、283、284hSC37.2CDRL1、CDRL2、CDRL3285、286、287hSC37.2CDRH1、CDRH2、CDRH3288、289、290hSC37.17CDRL1、CDRL2、CDRL3291、292、293hSC37.17CDRH1、CDRH2、CDRH3294、295、296hSC37.39CDRL1、CDRL2、CDRL3297、298、299hSC37.39CDRH1、CDRH2、CDRH3300、301、302hSC37.67CDRL1、CDRL2、CDRL3303、304、305hSC37.67CDRH1、CDRH2、CDRH3306hSC37.67v1CDRL3注意，衍生自人源化抗体hSC37.67的变体hSC37.67v1仅与hSC37.67在其轻链可变区的CDRL3中的单个氨基酸不同。hSC37.67和hSC37.67v1的重链是相同的。下面的实施例10更详细地描述了这些抗体的产生。XII.实施例通过参考以下实施例，将更容易地理解如上一般性所述的本发明，所述实施例通过举例说明的方式提供并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一的实验。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。PDX肿瘤细胞类型由缩写表示，其后是表示特定肿瘤细胞系的数字。测试样品的传代数由附加到样品名称的p0-p＃表示，其中p0表示直接从患者肿瘤获得的未传代样品，p＃表示试验前肿瘤通过小鼠已经传代的次数。如本文所用，肿瘤类型和亚型的缩写如下表4所示：表4实施例1使用全转录组测序来鉴定RNF43表达为了表征实体肿瘤当存在于癌症患者中时的细胞异质性并鉴定临床相关的治疗靶标，使用本领域公知的技术开发和维持大的PDX肿瘤库。包含大量离散的肿瘤细胞系的PDX肿瘤库在免疫受损的小鼠中通过多次传代最初从患有多种实体瘤恶性肿瘤的癌症患者获得的肿瘤细胞进行增殖。低传代PDX肿瘤代表了其天然环境中的肿瘤，提供了驱动肿瘤生长和对当前疗法的抗性的潜在机制的临床相关洞察。肿瘤细胞可以广泛分为两种类型的细胞亚群：非致瘤细胞(NTG)和肿瘤起始细胞(TIC)。当植入免疫受损小鼠中时，TIC具有形成肿瘤的能力。癌症干细胞(CSC)是肿瘤起始细胞的子集，并且能够无限地自我复制，同时保持多谱系分化的能力。肿瘤祖细胞(TProg)也是TIC的子集，并且类似于CSC，具有在原代移植物中刺激肿瘤生长的能力。然而，与CSC不同，它们不能重现亲本肿瘤的细胞异质性，并且在随后的移植中重新开始肿瘤发生时效率较低，这是因为TProg通常仅能够进行有限次数的细胞分裂。为了进行全转录组分析，来自肿瘤库的PDX肿瘤在它们达到800-2,000mm3后从小鼠切除。使用本领域公知的酶消化技术将切除的PDX肿瘤解离成单细胞悬浮液(参见例如美国专利2007/0292414)。将解离的大块肿瘤细胞与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起孵育以检测死细胞，与抗小鼠CD45和H-2Kd抗体一起孵育以鉴定小鼠细胞，和与抗人EPCAM抗体一起孵育以鉴定人类细胞。此外，将肿瘤细胞与荧光缀合的抗人CD46和/或CD324抗体孵育，并且在一些情况下与CD66c孵育，以鉴定CD46+CD324+CSC和CD46-CD324-NTG，然后使用FACSAria细胞分选仪(BDBiosciences)分选(参见USPN2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。在CR4的情况下，TProg群被鉴定为CD46+/CD324+/CD66c+，而CSC群被鉴定为CD46+/CD324+/CD66c-。通过在补充有1%2-巯基乙醇的RLTplusRNA裂解缓冲液(Qiagen)中裂解细胞，在-80℃下冷冻裂解物，然后使用RNeasy分离试剂盒(Qiagen)解冻裂解物用于RNA提取，从肿瘤细胞或正常组织提取RNA。使用Nanodrop分光光度计(ThermoScientific)和/或Bioanalyzer2100(AgilentTechnologies)对RNA进行定量。通过基因测序和基因表达分析评估所得的总RNA制备物。使用两种不同的系统进行高质量RNA的全转录组测序。使用AppliedBiosystems(ABI)Sequencing，通过OligoLigation/Detection(SOLiD)4.5或SOLiD5500xl下一代测序系统(LifeTechnologies)分析一些样品。使用IlluminaHiSeq2000或2500下一代测序系统(Illumina)分析其他样品。使用来自ABI的设计用于低输入总RNA的修饰的全转录组方案或OvationRNA-SeqSystemV2TM(NuGENTechnologies)，从来自大块肿瘤样品的1ngRNA产生的cDNA进行SOLiD全转录组分析。将得到的cDNA文库片段化，并加入条形码衔接头，以允许在测序运行期间合并来自不同样品的片段文库。由SOLiD平台产生的数据映射到34,609个基因，如RefSeq版本47所注释的，使用NCBI版本hg19.2的已公布的人类基因组，并提供了大多数样品中RNA水平的可验证测量。来自SOLiD平台的测序数据名义上表示为使用映射到基因的外显子区域的度量RPM(读数/百万)或RPKM(读数/千碱基/百万)的转录物表达值，使得基础基因表达分析被归一化并枚举为RPM_转录物或RPKM_转录物。与所测试的所有正常细胞的平均值相比，RNF43mRNA在以下CRPDX肿瘤细胞系中升高：CR4、CR42和CR43(图1A)。测试的正常组织是结肠、心脏、肝脏、肺、肾、胰腺和卵巢。与相同CRPDX细胞系中的NTG细胞相比，CSC中的RNF43mRNA也有较高的表达。此外，CR4PDX系包含也表达RNF43mRNA的TProg细胞亚群(图1A)，观察到其在CSC和NTG细胞中观察到的水平的中间。使用从CR和LUPDX肿瘤细胞提取的5ng总RNA产生的cDNA进行Illumina全转录组分析。将肿瘤细胞分选用于CSC和NTG细胞群，并如针对SOLiD全转录组分析所述提取RNA。使用TruSeqRNA样品制备试剂盒v2(Illumina)产生文库。将所得cDNA文库片段化并加条形码。来自Illumina平台的测序数据名义上表示为片段表达值，使用映射到基因的外显子区域的度量FPM(片段/百万)或FPKM(片段/千碱基/百万)，使得基础基因表达分析被归一化并枚举为FPM_转录物或FPKM_转录物。与NTG群相比，LU-SCC(LU128)、LU-Ad(LU123)和CRPDX肿瘤细胞系(CR16、CR43、CR67、CR78)的CSC肿瘤细胞亚群中RNF43mRNA的表达升高(图1B)。与食管、气管、胃、脾、皮肤、胰腺、肺、肝、肾、心脏和结肠中的相关正常组织相比，CSC中的RNF43mRNA表达也更高(图1B)。在CR、LU-Ad和LU-SCC肿瘤中升高的RNF43mRNA表达的鉴定表明RNF43值得进一步评价作为潜在的诊断和/或免疫治疗靶标。此外，与CR、LU-Ad和LU-SCC肿瘤中的NTG相比，CSC中RNF43的表达增加表明RNF43是这些肿瘤类型中致瘤细胞的良好标记物。实施例2使用qRT-PCR表达肿瘤中的RNF43mRNA为了证实肿瘤细胞中RNF43的mRNA表达，使用FluidigmBioMarkTMHD系统根据工业标准方案对多种PDX细胞系进行qRT-PCR。如实施例1所述从大量和分选的PDX肿瘤细胞中提取RNA。使用HighCapacitycDNAArchive试剂盒(LifeTechnologies)根据制造商的说明书将1ngRNA转化为cDNA。使用RNF43特异性Taqman测定法预扩增的cDNA材料然后用于随后的qRT-PCR实验。在正常组织(脂肪、脑、黑素细胞、PBMC和分选的B、单核、NK和T细胞，正常骨髓、唾液腺、睾丸、胸腺、甲状腺、肾上腺、动脉、静脉、结肠、背根神经节、食管、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、气管和血管平滑肌细胞)中的RNF43的表达低于以下PDX肿瘤细胞系的亚群中的表达：BR、CR、EM、GA、LU-Ad、LU-SCC、PA和OV(图2A)。此外，如上所述，对如实施例1中所述已经针对CSC和NTG细胞分选的CR、GA、LU和PAPDX肿瘤细胞系进行qRT-PCR分析。被测试的CR(CR91、CR67、CR2)、GA(GA9)、LU-SCC(LU22)和PA(PA33、PA55)PDX系与NTG相比表现出在CSC中增加的mRNA表达，证实了实施例1中的发现，即RNF43是致瘤性癌细胞的良好的生物标记物(图2B)。总之，这些数据表明，RNF43在许多肿瘤中表达，并且可能是在这些适应症中基于抗体的治疗剂的开发的良好靶标。实施例3使用微阵列测定肿瘤中RNF43mRNA的表达使用微阵列分析确定RNF43表达，以确认通过qRT-PCR和全转录组分析获得的结果。基本上如实施例1中所述，从包含多种癌症类型的PDX细胞系得到1-2微克全肿瘤总RNA。使用AgilentSurePrintGEHuman8x60v2微阵列平台分析样品，其包含针对人类基因组中27,958个基因和7,419个lncRNA设计的50,599个生物探针。使用标准工业实践来标准化和转化强度值以量化每个样品的基因表达。将每个样品中RNF43表达的归一化强度绘制在图3中，并且每个肿瘤类型得到的几何平均值由水平条指示。图3显示与CR中的正常组织(胃、脾、皮肤、PBMC、胰腺、卵巢、肺、肝、肾、心、结肠和乳腺)以及EM、GA、KDY、LU-Ad、LU-SCC、PA和OV的子集相比，RNF43mRNA表达升高。在各种PDX肿瘤细胞系中观察到升高的RNF43表达证实了实施例1和2的结果。这些发现进一步支持了所观察到的RNF43表达水平与肿瘤细胞之间的关联，特别是在CR中，以及GA、LU-Ad、LU-SCC、OV和PA肿瘤中。实施例4在使用癌症基因组图谱得到的肿瘤中的RNF43表达使用称为癌症基因组图谱(TCGA)的原代肿瘤和正常样品的大的可公开获得的数据集来证实RNF43mRNA在各种肿瘤中的过表达。来自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平台和IlluminaHiSeq_RNASeq平台的RNF43表达数据下载自TCGA数据门户(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)，并被解析以聚集来自各基因的个体外显子的读数，以产生每百万映射读数的每千碱基外显子的单个读数值(RPKM)。图4显示，相对于在TCGA数据库中发现的正常组织，RNF43在原代LU-Ad、LU-SCC、CR、GA以及PR肿瘤中的表达升高。这些数据证实了实施例1-3中的结果，这意味着存在高于正常组织的良好的治疗指数，因此抗RNF43抗体和ADC可以是用于治疗这些肿瘤的有用的治疗剂。实施例5重组RNF43蛋白的克隆和表达以及过表达细胞表面RNF43蛋白的细胞系的工程改造编码人RNF43蛋白的DNA片段为了产生属于人RNF43(hRNF43)蛋白(GenBank登录号NP_060233)的所有细胞材料，购买了编码全长hRNF43开放阅读框的cDNA克隆(RC214013;Origene)。该cDNA克隆用于表达成熟hRNF43蛋白或其片段的构建体的所有后续工程改造。为了产生编码hRNF43蛋白的慢病毒载体质粒，使用PCR从上述模板扩增hRNF43开放阅读框，将所得PCR产物亚克隆到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(SystemBiosciences)的多克隆位点(MCS)中，其已经被预先修饰以引入编码Igκ信号肽及随后的MCS上游的DDDK表位标签的核苷酸序列。MCS下游的T2A序列促进肽键缩合的核糖体跳跃，导致两种独立蛋白的表达：在T2A肽上游编码的DDDK标记的细胞表面蛋白的高水平表达，与在T2A肽的下游编码的GFP标记蛋白的共表达。该克隆步骤产生慢病毒载体质粒pL120-hRNF43-NFlag。编码大鼠和食蟹猴RNF43蛋白的DNA片段为了产生本发明涉及大鼠RNF43蛋白(rRNF43)所需的所有分子和细胞材料，设计了编码与大鼠RefSeqRNF43蛋白(GenBank登录号NP_001129393)相同的蛋白的合成cDNA克隆，并购自GeneWiz。为了产生本发明涉及食蟹猴(Macacafascicularis)RNF43蛋白(cRNF43)所需的所有分子和细胞材料，首先如下推断了cRNF43开放阅读框序列：在NCBI中对编码hRNF43蛋白的DNA序列与食蟹猴全基因组鸟枪重叠群序列数据库进行BLAST分析，观察到外显子/内含子边界在人和食蟹猴基因之间是保守的，并且组装编码cRNF43的推定的食蟹猴开放阅读框。结果分析表明hRNF43和cRNF43蛋白是96.2%相同的。设计了编码该预测的cRNF43蛋白的合成DNA克隆并购自GeneWiz。大鼠和食蟹猴DNA克隆用作各种PCR反应的模板，以产生rRNF43或cRNF43ECD和组氨酸标签或人IgG2Fc标签的嵌合融合基因。简言之，通过PCR扩增通过数据库注释或通过与hRNF43蛋白的序列比对推导的编码rRNF43或cRNF43的预测ECD结构域的DNA。使用标准分子技术将这些PCR产物亚克隆入CMV驱动的表达载体的框内，并在Igκ信号肽序列的下游和组氨酸标签或人IgG2FccDNA的上游。这些CMV驱动的表达载体允许在HEK293T细胞中的高水平瞬时表达。使用聚乙烯亚胺聚合物作为转染试剂，用这些表达构建体转染HEK293T细胞的悬浮或贴壁培养物。转染后3至5天，使用AKTA探测器和镍-EDTA(Qiagen)或MabSelectSuReTMProteinA(GEHealthcareLifeSciences)柱，分别从澄清的细胞上清液中纯化重组His-标记的或Fc-标记的蛋白质。细胞系工程改造使用如上所述的pL120-hRNF43-NFlag慢病毒载体构建过表达hRNF43蛋白的工程改造细胞系，以使用本领域技术人员熟知的标准慢病毒转导技术转导HEK293T细胞系。使用高表达的HEK293T亚克隆(例如，对GFP和DDDK表位标签都是强阳性的细胞)的FACS选择表达hRNF43的细胞。实施例6抗RNF43抗体的产生如下在两种不同的免疫中产生抗RNF43鼠抗体。在第一种免疫中，用在TiterMax和CpG佐剂中乳化的10微克重组人RNF43-Fc蛋白(rhRNF43-Fc，R＆DSystems;＃7964-RN)，经足垫接种一只雌性Balb/c小鼠。在初始接种后，用在明矾、PBS和CpG中乳化的5微克rhRNF43-Fc蛋白注射小鼠七次(每周两次)。最终接种包含PBS中的5微克rhRNF43-Fc蛋白。在第二种免疫中，用10微克hRNF43-His蛋白(Sino)每周两次免疫六只小鼠(下列品系各两只：BALB/c、CD-1、FVB)，持续4周，接着两周后的最后一次接种。处死小鼠，解剖引流淋巴结(腿弯部、腹股沟和髂中间)并用作抗体产生细胞的来源。将B细胞的单细胞悬浮液(60×106个细胞)与非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC＃CRL-1580)以1：1的比例使用型号BTXHybrimmune系统(BTXHarvardApparatus)通过电细胞融合进行融合。将细胞重悬浮于杂交瘤选择培养基中，所述杂交瘤选择培养基由补充有重氮丝氨酸、15%胎儿克隆I血清、10%BMcondimed、1mM非必需氨基酸、1mMHEPES、100IU青霉素-链霉素和50微摩尔2-巯基乙醇的DMEM培养基组成，并在T225烧瓶中在100mL选择培养基中培养。将烧瓶置于含有5%CO2和95%空气的湿润的37℃培养箱中6天。在融合后第6天，从烧瓶收集杂交瘤文库细胞，并将文库储存在液氮中。将冷冻的小瓶解冻到T75烧瓶中，第二天将杂交瘤细胞以在90微升补充的杂交瘤选择培养基(如上所述)中每孔一个细胞(使用FACSAriaI细胞分选仪)铺板到12个Falcon384孔板。将杂交瘤培养10天，并使用如下进行的流式细胞术筛选上清液中hRNF43特异性的抗体。用25微升杂交瘤上清液，将每孔1×105个用hRNF43稳定转导的HEK293T细胞孵育30分钟。用PBS/2%FCS洗涤细胞，然后用每样品25微升的DyeLight649标记的山羊抗小鼠IgGFc片段特异性第二抗体孵育15分钟，该抗体在PBS/2%FCS中1:300稀释。用PBS/2%FCS洗涤细胞两次，并重悬浮于含有DAPI的PBS/2%FCS中，并通过流式细胞术分析超过用同种型对照抗体染色的细胞的荧光。剩余的未使用的杂交瘤文库细胞在液氮中冷冻用于将来的文库测试和筛选。实施例7抗RNF43抗体的特征在实施例6中产生的抗RNF43抗体根据(i)同种型、(ii)对RNF43的亲和力和(iii)与ZNRF3的交叉反应性进行表征。此外，基于它们是否彼此竞争与人RNF43蛋白的结合，将抗体分组在箱中。使用Milliplex小鼠免疫球蛋白同种分型试剂盒(Millipore)根据制造商的方案确定代表性数目的抗体的同种型。基于根据本领域标准方法的序列分析，将那些没有获得明确信号的抗体命名为同种型。独特的RNF43特异性抗体的同种分型分析的结果可见于图5A。使用BIAcore2000(GEHealthcare)机器，使用表面等离子体共振确定选择抗体对hRNF43蛋白的亲和力。使用抗小鼠抗体捕获试剂盒将小鼠抗RNF43抗体固定在CM5生物传感器芯片上。在每个抗原注射周期之前，0.05-1微克/mL的浓度的鼠抗体捕获在表面上，接触时间为1分钟，流速为5微升/min。从基线捕获的抗体负荷为80-140个响应单位。抗体捕获后和1分钟基线，在实施例5中产生的单体hRNF43-His抗原在10-200nM范围内的浓度下在表面上流动1.5分钟的缔合期，然后流速为10微升/min的5分钟的解离期。除了使用抗人抗体捕获试剂盒之外，使用类似的方案测量人源化抗体的结合亲和力。通过从特异性抗体表面应答减去对照非结合抗体表面应答来处理数据，并将数据截短至缔合和解离期。使用得到的应答曲线拟合1:1Langmuir结合模型，并使用BiaEvaluation软件3.1(GEHealthcare)使用计算的kon和koff动力学常数产生表观亲和力。所选择的抗体显示在纳摩尔范围内的hRNF43亲和力(图5A)。使用MesoScaleDiscovery平台进行ELISA测定，以测试实施例6中产生的选择的抗RNF43抗体结合ZNRF3(RNF43的功能同源物)的能力。尽管ZNRF3与RNF43功能上同源，但是总体上只有20%的序列同源性(图5B)，因此不期望抗RNF43抗体与ZNRF3的交叉反应性。用PBS中的0.5微克/mL的人ZNRF3或RNF43(两者，R＆DSystems)包被平板，并在4℃孵育过夜。在用PBS，0.05%吐温20(PBST)洗涤平板后，用35微升的3%(w/v)BSA的PBS溶液在室温下封闭平板60分钟。将板在PBST中洗涤，并将10微升的在PST，0.05%吐温，1%BSA(w/v)(PBSTA)中稀释的滴定的抗RNF43抗体(500ng/ml-0.032ng/ml)加入板中，并孵育60分钟。用PBST洗涤后，在室温下加入10微升/孔的在PBSTA中的0.5微克/ml的磺基标签标记的山羊抗小鼠IgG(MesoScaleDiscovery，＃R32AC-5)，持续30分钟。MSDSULFO-TAGNHS-酯是胺反应性的N-羟基琥珀酰亚胺酯，其在轻度碱性条件下容易与蛋白质的伯胺基团偶联以形成稳定的酰胺键。将板在PBST中洗涤，将具有表面活性剂的MSDRead缓冲液T在水中稀释1倍，并向每个孔中加入35微升。板在MSDSectorImager2400上读出。所有测试的抗体(例如SC37.2、SC37.4、SC37.8、SC37.10、SC37.17、SC37.28、SC37.39、SC37.226和SC37.236)结合RNF43，但显示不与ZNRF3结合。此外，阴性对照、小鼠IgG1不结合任一蛋白质。相比之下，与人FC融合或与鼠抗人FC抗体融合的RNF43或ZNRF3蛋白显示与两种蛋白质的结合(阳性对照)。使用多重竞争免疫测定(Luminex)将抗体分组成箱。将浓度为10μg/mL的100μl的每种独特的抗RNF43抗体(捕获mAb)与已经与抗小鼠κ抗体缀合的磁珠(Luminex)孵育1小时(Miller等，2011，PMID：21223970)。捕获mAb/缀合的珠复合物用PBSTA缓冲液(含有0.05%Tween20的PBS中的1%BSA)洗涤，然后合并。除去残余洗涤缓冲液后，将珠与2μg/mLhRNF43-His蛋白孵育1小时，洗涤，然后重悬于PBSTA中。将合并的珠混合物分配到96孔板中，每个孔含有独特的抗RNF43抗体(检测mAb)，并在振荡下孵育1小时。洗涤步骤后，以5μg/ml的浓度向孔中加入与PE缀合的抗小鼠κ抗体(与上文所用相同)，并孵育1小时。再次洗涤珠并重悬于PBSTA中。使用LuminexMAGPIX仪器测量平均荧光强度(MFI)值。将抗体配对显现为根据抗体对的Pearson相关系数计算的距离矩阵的树状图。基于树状图和抗体对的MFI值的分析确定框并。图5A所示的结果证明了，筛选的示例性抗体可以分组成至少六个独特的箱(A-F)，其中每个箱的成员彼此竞争与hRNF43蛋白的结合。实施例8抗RNF43抗体对WNT信号传导的影响WNT途径是调节细胞生长和分化的关键的发育和干细胞相关的信号途径。在典型的WNT/β-连环蛋白信号传导途径(图6A)中，WNT配体结合Frizzled(FZD)受体和LRP5/6共受体的复合物，引发信号传导级联，导致蛋白GSK3的抑制，其一个结果是在细胞质中发现的通常不稳定的β-连环蛋白的稳定化。稳定的β-连环蛋白然后能够积累，进入细胞核，并与TCF/LEF转录因子形成复合物，以激活含有这些转录激活物的结合位点的基因。典型的WNT途径在受体-配体水平上广泛调节，具有包含各种可溶性诱饵受体(例如，SFRP和FRZB)、结合WNT本身或调节其生物活性的因子(例如，WIF和NOTUM)或调节FZD受体周转的因子(例如，RNF43，ZNRF3)的多个激活和抑制性反馈环，以及包含调节这些调节剂的蛋白质(例如LGR和RSPO)的更精细的环。这些激动剂、拮抗剂和抗拮抗剂网络一起能够精确控制强力和多效信号传导途径的强度和持续时间。与本发明特别相关的是两种拮抗剂和抗拮抗剂相互作用：第一，拮抗相互作用，其中RNF43通过其促进FZD受体的内吞作用的能力下调WNT介导的含有TCF/LEF结合位点的基因的激活，即减少WNT信号传导;第二，抗拮抗相互作用，其中R-spondin与RNF43的相互作用导致RNF43的膜清除，其促进增加的FZD在细胞表面的驻留，从而上调或增加WNT信号传导。使用ELISA测定来测试实施例6中产生的抗RNF43抗体阻断RNF43与人R-spondin(RSPO)结合的能力。功能性阻断R-spondin与RNF43相互作用的抗体在图6A中表示为组II。用PBS中的0.25微克/mL的人RSPO3(R＆DSystems，＃3500RS/CF)(其是RSPO蛋白家族的代表性成员)包被平板，并在4℃孵育过夜。在用PBS，0.05%吐温20(PBST)洗涤板之后，将它们用在PBS中的3%(w/v)BSA在37℃封闭90分钟。在封闭过程中，将5ng/mlrhRNF43Fc(R＆DSystems;＃7964-RN)与或不与10微克/mL抗RNF43抗体在PBS中的1%(w/v)BSA+0.05%吐温20(PBSA)中孵育60分钟。将板在PBST中洗涤，将100微升抗体/蛋白质混合物加入板中并孵育90分钟。用PBST洗涤后，在室温下加入50微升/孔在PBSA中1:2000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG，持续1小时。洗涤平板，并通过加入100微升/孔的TMB底物溶液(ThermoScientific)在室温下显色5分钟。加入等体积的1MH2SO4以停止底物显色。然后通过分光光度计在OD450下分析样品。示例性RNF43特异性抗体的结果可以以图5A中的表格形式看到。可以看出，在该测定中，抗体可以观察到大范围的阻断活性。为了确定本发明的抗RNF43抗体是否调节典型的WNT信号传导途径，在抗体功能的各种研究中使用含有用于激活典型WNT信号传导途径的报告基因的稳定细胞群。通过用慢病毒载体pGreenFire1-TCF(SystemBiosciences)转导HEK293T细胞产生这些称为293.TCF细胞的细胞，所述载体在连接到四个串联重复的TCF家族的转录因子的转录应答元件(例如，WRE)的最小CMV报告基因的控制下编码双功能GFP和萤光素酶报告盒。因此，这些细胞中经典WNT信号传导途径的激活将导致β-连环蛋白在与TCF/LEF转录因子的复合物中的稳定化，导致萤光素酶报告基因的激活，随后在加入合适的萤光素酶底物和辅因子后产生发光。将293.TCF细胞如下用于WNT3A典型信号传导测定：将2.5×104个293.TCF细胞接种在96孔组织培养板的每个孔中的50μL无血清DMEM培养基中。24小时血清饥饿后，将25μL来自L/WNT3A细胞(ATCCCRL-2647;Willert，2003)的各种稀释度的条件培养基(CM)或来自亲本L细胞(ATCCCRL-2648)的未稀释CM以及25μLDMEM+0.2%FBS加入到每个孔中。加入CM后18小时，向每个孔中加入100μLOne-Glo溶液(ProMegaCorp)。然后将每个孔的内容物充分混合以裂解细胞，将100μL裂解物转移到黑色96孔板中，并在5分钟后使用WallacVictor3Multilabel计数器(Perkin-ElmerCorp)读取每个孔中的发光。暴露于不同浓度的含有WNT3A的CM的细胞通常显示相对于暴露于L-细胞对照CM的细胞的2至6倍的萤光素酶信号诱导(图6B中所示的代表性数据)。此外，293.TCF细胞在下述处理之后如预期的那样反应：(1)将WNT3A+CM培养基从25%稀释至3%，这导致WNT报告基因激活的减少和发光的减少，或(2)用20mmLiCl(已知非常有效地抑制GSK3并因此激活典型的WNT信号传导应答基因的化学物质)处理，其表明相对于用L细胞对照CM处理，发光增加12倍(数据未显示)。通过使用上文实施例5中所述的pL120-hRNF43-NFlag慢病毒载体转导293.TCF细胞，进一步修饰293.TCF细胞以产生293.TCF.37细胞系。293.TCF.37细胞系过表达RNF43。然后用WNT3A+CM或对照CM处理大量的293.TCF.37细胞群。如对于RNF43的生物学功能所预期的，相对于亲本293.TCF细胞，阻断了WNT3A活化的萤光素酶报告基因表达(图6B)。用20mMLiCl处理293.TCF.37细胞能够刺激萤光素酶报告基因表达高于对照CM所观察到的(数据未显示)。如下测定各种抗RNF43抗体调节WNT信号转导活性的能力。将在50μL无血清DMEM培养基中的2.5×104个293.TCF.37细胞铺板在96孔组织培养板的每个孔中。24小时血清饥饿后，向细胞中加入5μg/ml的抗RNF43抗体(在WNT3A+CM中)。图5A以表格形式显示抗体处理后相对于单独的WNT3A+CM的萤光素酶报告基因活性的倍数增加。本发明的一些抗体导致WNT3A介导的萤光素酶信号的升高(例如SC37.231，其导致萤光素酶信号的3倍增加)，而其它抗体减少WNT3A介导的萤光素酶信号(例如SC37.77，其导致萤光素酶信号的约2倍的减少)，而还有其它抗体不改变WNT3A介导的萤光素酶信号(例如SC37.170)。总之，这些数据表明获得了具有不同功能效应的多种抗RNF43抗体。实施例9抗RNF43抗体的测序如上所述产生抗RNF43抗体，然后测序。使用RNeasyMiniprep试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书从选择的杂交瘤细胞纯化总RNA。每个样品使用104至105个细胞。通过在1%琼脂糖凝胶中分离3微升来确定RNA制备物的质量，然后在-80℃下储存备用。使用包含设计为靶向完整小鼠VH谱的三十二个小鼠特异性前导序列引物的5'引物混合物，与对所有小鼠Ig同种型特异的3'小鼠Cγ引物组合，扩增每个杂交瘤的Ig重链的可变区。类似地，包含设计用于扩增每个Vκ小鼠家族的32个5'Vκ前导序列的引物混合物与对小鼠κ恒定区特异的单个反向引物组合使用，以扩增和测序κ轻链。使用QiagenOneStepRT-PCR试剂盒如下从100ng总RNA扩增VH和VL转录物。对于每个杂交瘤，总共进行8个RT-PCR反应，4个用于Vκ轻链，4个用于Vγ重链。对于含有λ轻链的抗体，使用设计为在Vλ前导序列上引发的三个5'引物与对小鼠λ恒定区特异性的一个反向引物组合进行扩增。PCR反应混合物包括3微升RNA、0.5微升100微摩尔重链或轻链引物(由IDT定制合成)、5微升5×RT-PCR缓冲液、1微升dNTP、1微升含有逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物和0.4微升核糖核酸酶抑制剂RNasin(1单位)。热循环仪程序为：RT步骤50℃30分钟，95℃15分钟，随后是30个循环(95℃30秒、48℃30秒、72℃1分钟)。然后在72℃下最终孵育10分钟。使用与上述用于扩增可变区的相同的特异性可变区引物对提取的PCR产物进行测序。为了制备用于直接DNA测序的PCR产物，使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案纯化它们。使用50微升无菌水从离心柱洗脱DNA，然后直接从两条链测序。使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析核苷酸序列，以鉴定具有最高序列同源性的种系V、D和J基因成员。通过使用专有抗体序列数据库将VH和VL基因与小鼠种系数据库比对，将衍生的序列与IgV-区和J-区的已知种系DNA序列进行比较。图7A描述了来自抗RNF43抗体的许多新的鼠轻链可变区和衍生自代表性鼠抗RNF43抗体的可变轻链的示例性人源化轻链可变区的连续氨基酸序列。图7B描述了来自相同抗RNF43抗体的新的鼠重链可变区和衍生自提供人源化轻链的相同鼠抗体的人源化重链可变区的连续氨基酸序列。独特的鼠轻链和重链可变区氨基酸序列提供于SEQIDNO：22-252，偶数，而人源化轻链和重链可变区氨基酸序列提供于SEQIDNO：254-270，偶数。总之，图7A和7B提供了许多独特的鼠抗-RNF43抗体的带注释的序列。然而，产生了许多重复抗体，具有与图7A和7B所列的独特抗体相同的可变区轻链和可变区重链，并列在相关独特抗体后的括号中。所述抗体称为：SC37.1、SC37.2、SC37.3、SC37.4、SC37.6、SC37.7、SC37.8、SC37.9(与SC37.59和SC37.69相同)、SC37.10、SC37.11、SC37.12、SC37.13、SC37.15、SC37.16、SC37.17、SC37.19(与SC37.33、SC37.35、SC37.52、SC37.55、SC37.58和SC37.71相同)、SC37.20(与SC37.30、SC37.34、SC37.36、SC37.38、SC37.50、SC37.60和SC37.66相同)、SC37.21(与SC37.53、SC37.54和SC37.68相同)、SC37.22、SC37.23、SC37.28(与SC37.32相同)、SC37.29、SC37.37(与SC37.78相同)、SC37.39、SC37.40、SC37.41、SC37.44(与SC37.46相同)、SC37.45(与SC37.67相同)、SC37.47(与SC37.57相同)、SC37.48、SC37.51、SC37.72、SC37.75、SC37.77、SC37.108、SC37.122、SC37.127、SC37.136(与SC37.208相同)、SC37.141、SC37.150、SC37.160、SC37.163、SC37.169、SC37.170、SC37.177、SC37.185、SC37.191、SC37.193、SC37.196、SC37.202、SC37.212、SC37.223、SC37.226、SC37.231、SC37.233、SC37.236、SC37.239、SC37.243和SC37.244；和人源化抗体，称为hSC37.2、hSC37.17、hSC37.39、hSC37.67和hSC37.67v1。除了前面段落中相关抗体后的括号中所示的具有相同的轻链和重链可变区的抗体之外，还有许多共享相同的轻链可变区的抗体，如下：SC37.17(与SC37.21、SC37.53、SC37.54、SC37.68相同的轻链)、SC37.23(与SC37.28和SC37.32相同的轻链)、SC37.208(与SC37.217、SC37.232、SC37.136和SC37.172相同的轻链)、SC37.122(与SC37.198相同的轻链)。此外，一些抗体共享相同重链可变区，如下：SC37.20(与SC37.30、SC37.34、SC37.36、SC37.38、SC37.50、SC37.60、SC37.66和SC37.74相同的重链)、SC37.23(与SC37.36相同的重链)、SC37.47(与SC37.57和SC37.75相同的重链)、SC37.122(与SC37.127相同的重链)、SC37.160(与SC37.198相同的重链)。值得注意的是，许多上述独特的鼠抗体包含λ轻链。在图7A和7B中仅给出了独特的序列，即7A和7B不包含重复的序列。注释氨基酸序列以鉴定根据Kabat定义的框架区(即FR1-FR4_)和互补决定区(即图7A中的CDRL1-CDRL3或图7B中的CDRH1-CDRH3)。使用专有版本的Abysis数据库分析可变区序列，以提供CDR和FR指定。尽管CDR是根据Kabat定义的，但是本领域技术人员将理解，相同的数据库可以用于提供如Chothia或McCallum的CDR和FR指定。图7C是显示编码图7A和7B所示的重链和轻链可变区的氨基酸序列的核酸序列的表。实施例10嵌合和人源化抗RNF43抗体的产生使用本领域公知的技术如下产生嵌合抗RNF43抗体。如实施例1所述从杂交瘤中提取总RNA，并进行PCR扩增。关于以下鼠抗体的VH和VL链的V、D和J基因区段的数据：SC37.2、SC37.17、SC37.39和SC37.67，获自所述核酸序列的分析(对于核酸序列，参见图7C)。使用以下限制性位点，设计抗体的VH和VL链的框架序列特异性引物组：VH片段的AgeI和XhoI，VL片段的XmaI和DraIII。PCR产物用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，随后用限制性酶AgeI和XhoI(对于VH片段)和XmaI和DraIII(对于VL片段)消化。纯化VH和VL消化的PCR产物，并分别连接到IgH或Igκ表达载体中。用200UT4-DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)、7.5微升消化和纯化的基因特异性PCR产物和25ng线性化载体DNA在总体积为10微升中进行连接反应。在42℃下用3微升连接产物通过热休克转化感受态大肠杆菌DH10B细菌(LifeTechnologies)，并以100微克/mL的浓度铺板在氨苄青霉素平板上。在纯化和消化扩增的连接产物后，将VH片段克隆到包含HuIgG1的pEE6.4表达载体(Lonza)的AgeI-XhoI限制性位点中，并将VL片段克隆到包含Hu-Kappa轻链恒定区的pEE12.4表达载体(Lonza)的XmaI-DraIII限制性位点。通过HEK293T细胞与pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-Kappa表达载体的共转染来表达包含完整鼠重链和轻链可变区和人恒定区的嵌合抗体。在转染前，将HEK293T细胞在标准条件下在补充有10%热灭活的FCS、100微克/mL链霉素和100U/mL青霉素G的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中在150mm板中培养。为了瞬时转染，将细胞生长至80%汇合。将12.5微克每种pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-Kappa载体DNA加入到在1.5mLOpti-MEM中的50微升HEK293T转染试剂中。将混合物在室温下孵育30分钟并铺板。转染后3至6天收获上清液。通过在800×g离心10分钟从细胞碎片中澄清含有重组嵌合抗体的培养物上清液，并在4℃下储存。用蛋白A珠纯化重组嵌合抗体。使用专有的计算机辅助的CDR-移植方法(AbysisDatabase，UCLBusiness)和如下的标准分子工程技术，将鼠抗RNF43抗体进行CDR移植或人源化。基于人种系抗体序列的框架序列和CDR典型结构与相关小鼠抗体的框架序列和CDR之间的最高同源性，设计可变区的人框架区。为了分析的目的，将氨基酸指定到每个CDR结构域根据Kabat等人编号进行。在这方面，图7E至7H显示使用鼠抗体SC37.2、SC37.17、SC17.39和SC37.67的各种分析方案得到的重和轻CDR。一旦设计了包含鼠KabatCDR和选定的人框架的可变区，就从合成基因区段(IntegratedDNATechnologies)产生它们。然后使用上述用于嵌合抗体的分子方法克隆和表达人源化抗体。人源化抗体hSC37.2、hSC37.17、hSC17.39、hSC37.67和hSC37.67v1(图7A和7B;SEQIDNO：254-270，偶数)的VL和VH氨基酸序列衍生自相应鼠抗体的VL和VH序列(例如hSC37.2源自SC37.2)。VL和VH的相应核酸序列示于图7C中(SEQIDNO：253-271，奇数)。表5显示需要非常少的框架改变以维持所选抗体的有利性质。对于一个人源化克隆，将保守突变引入CDR中以解决稳定性问题。在这点上，hSC37.67的轻链的CDRL3(N91Q)中的单个氨基酸改变导致hSC37.67变体1(hSC37.67v1)。对于每个人源化构建体，检查抗体的结合亲和力以确保它们等同于相应的嵌合抗体或鼠抗体。在上述选择的抗体人源化后，分析所得的VH和VL链氨基酸序列，以确定它们与鼠供体和人受体轻链和重链可变区的同源性。如下表6所示的结果表明，人源化构建体相对于人受体序列一致地显示比鼠供体序列更高的同源性。与人源化抗体和供体杂交瘤蛋白序列的同源性77%-88%相比，鼠重链和轻链可变区显示与最接近匹配的人种系基因的相似的总体百分比同源性82%-91%。表6mAb与人(CDR受体)的同源性与鼠亲本(CDR供体)的同源性hSC37.2HC91%85%hSC37.2LC86%82%hSC37.17HC83%82%hSC37.17LC82%85%hSC37.39HC90%81%hSC37.39LC85%77%hSC37.67HC85%80%hSC37.67LC84%88%实施例11位点特异性抗RNP43抗体的产生构建包含天然轻链(LC)恒定区和重链(HC)恒定区的工程改造人IgG1/κ抗RNF43位点特异性抗体，其中与LC中的半胱氨酸214(C214)形成链间二硫键的HC的上铰链区中的半胱氨酸220(C220)被丝氨酸取代(C220S)。当组装时，HC和LC形成包含两个游离半胱氨酸(在轻链上的位置214)的抗体，所述半胱氨酸适合与治疗剂缀合。除非另有说明，所有恒定区残基的编号均符合Kabat等人所述的编号方案。如下产生工程改造抗体。编码人源化抗RNF43抗体hSC37.17HC(SEQIDNO：274)或hSC37.39HC(SEQIDNO：277)的表达载体用作PCR扩增和定点诱变的模板。使用Quick-change®系统(AgilentTechnologies)根据制造商的说明书进行定点诱变。将编码hSC37.17(SEQIDNO：275)或hSC37.39(SEQIDNO：278)的突变体C220SHC的载体分别与hSC37.17的天然IgG1κLC(SEQIDNO：273)或hSC37.39的κLC(SEQIDNO：276)共转染CHO-S细胞，并使用哺乳动物瞬时表达系统表达。含有C220S突变体的工程改造抗RNF43位点特异性抗体称为hSC37.17ss1和hSC37.39ss1。hSC37.17ss1(SEQIDNO：273和275)和hSC37.39ss1(SEQIDNO：276和278)位点特异性抗体的全长LC和HC的氨基酸序列显示在图7D中。通过SDS-PAGE表征工程改造的抗RNF43抗体，以确认已产生正确的突变体。在存在和不存在还原剂例如DTT(二硫苏糖醇)的情况下，在来自lifetechnologies的预制的10%Tris-甘氨酸微凝胶上进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用胶体考马斯溶液染色。在还原条件下，观察到对应于游离LC和游离HC的两条带。这种模式是IgG分子在还原条件下典型的。在非还原条件下，条带模式不同于天然IgG分子，表明在HC和LC之间不存在二硫键。观察到对应于HC-HC二聚体的约98kD的条带。另外，观察到对应于游离LC的弱带，和对应于LC-LC二聚体的约48kD的主带。由于每个LC的C末端上的游离半胱氨酸，预期形成一定量的LC-LC物质。实施例12抗RNF43抗体-药物缀合物的制备制备具有Ab-[L-D]结构的抗RNF43抗体药物缀合物(ADC)，其中Ab指抗RNF43抗体，L指接头(例如具有游离巯基的末端马来酰亚胺部分)，D指药物或细胞毒素(例如阿里他汀、刺孢霉素等)。每个ADC包含与接头-药物共价连接的抗RNF43抗体。ADC使用本领域已知的技术合成和纯化，例如基本上如下。抗RNF43抗体的半胱氨酸键通过加入在20℃下在具有5mMEDTA的磷酸缓冲盐水(PBS)中的预定摩尔的三(2-羧乙基)膦(TCEP)/mol抗体90分钟而部分还原。以3mol/mol抗RNF43抗体的比例加入溶解在二甲基乙酰胺(DMA)中的接头-药物。使反应进行30分钟。使用在水中制备的10mMN-乙酰半胱氨酸储备溶液(NAC)，通过向接头-药物中加入过量的NAC猝灭反应。在20分钟的最小猝灭时间后，通过加入0.5M乙酸将pH调节至6.0，并使用30kDa膜通过渗滤将缓冲液交换成渗滤缓冲液。然后将经渗滤的抗RNF43ADC与蔗糖和聚山梨酯-20配制成目标最终浓度。通过反相HPLC(RP-HPLC)和体外细胞毒性分析所得抗RNF43ADC的蛋白质浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物与抗体的比率(DAR)。实施例13使用选择性还原过程进行的位点特异性抗RNF43抗体的缀合制备具有如上文实施例12中所述的Ab-[L-D]结构的抗RNF43抗体药物缀合物(ADC)，其中Ab部分是位点特异性抗体，例如hSC37.17ss1或hSC37.39ss1，如按实施例11所述产生。期望的产物是这样的ADC，在每个LC恒定区上在未配对的半胱氨酸(在IgG1位点特异性抗体的情况下为C214，或IgG4位点特异性抗体上为C127)最大限度缀合并且使具有大于2(DAR>2)或小于2(DAR<2)的药物与抗体比率(DAR)的ADC最小化，同时使DAR为2(DAR=2)的ADC最大化。为了进一步改善最终位点特异性ADC的缀合的特异性和同质性，使用例如包括稳定剂(例如L-精氨酸)和温和还原剂(例如谷胱甘肽)的方法选择性还原位点特异性抗体(例如“hSC37.17ss1”或“hSC37.39ss1”)，然后与接头-药物缀合，然后是用于分离不同DAR物质的制备型疏水相互作用色谱(HIC)。上述方法例如基本上如下所述进行。在含有1ML-精氨酸/5mM谷胱甘肽、还原型(GSH)/5mMEDTA，pH8.0的缓冲液中，在室温下将位点特异性抗体的制剂部分还原至少1小时。然后使用30kDa膜(MilliporeAmiconUltra)将所有制剂缓冲液交换成20mMTris/3.2mMEDTA，pH8.2缓冲液，以除去还原缓冲液。然后将所得到的部分还原的制剂通过接头(例如马来酰亚胺接头)与细胞毒素(例如阿里他汀、刺孢霉素等)在室温下缀合至少30分钟。然后使用在水中制备的10mMNAC储备溶液，通过加入过量的NAC至接头-药物来猝灭反应。在20分钟的最小猝灭时间后，通过加入0.5M乙酸将pH调节至6.0。使用30kDa膜将位点特异性ADC缓冲液交换成渗滤缓冲液。然后用高盐缓冲液稀释位点特异性ADC制剂，以提高电导率，促进与树脂的结合，然后装载在丁基HP树脂色谱柱(GELifeSciences)上。然后使用降低的盐梯度以基于疏水性分离不同的DAR物质，其中首先洗脱DAR=0物质，然后是DAR=1、DAR=2，然后是更高的DAR物质。使用RP-HPLC分析最终的ADC“HIC纯化的DAR=2”制剂，以确定HC和LC上的缀合百分比和DAR分布。还使用分析型HIC来分析样品，以确定相对于不需要的DAR>2和DAR<2物质的DAR=2物质的量。实施例14在肿瘤中的RNF43蛋白表达鉴于与实施例1-3中描述的各种肿瘤相关的升高的RNF43mRNA转录物水平，进行工作以测试在PDX肿瘤中的RNF43蛋白表达是否也升高。为了检测和定量RNF43蛋白表达，使用MSD发现平台(MesoScaleDiscovery)开发电化学发光RNF43夹心ELISA测定。从小鼠切下PDX肿瘤，并在干冰/乙醇中快速冷冻。将蛋白质提取缓冲液(BiochainInstitute)加入到解冻的肿瘤块中，使用TissueLyser系统(Qiagen)将肿瘤粉碎。通过离心(20,000g，20分钟，4℃)澄清裂解物，并使用二辛可宁酸定量每种裂解物中的总蛋白浓度。将蛋白裂解物标准化至5mg/mL，并储存在-80℃直至测定。正常组织购自商业来源并如上所述进行处理。通过内插来自使用具有组氨酸标签的纯化的重组RNF43蛋白(SinoBiologicalcat＃16108-H08H)产生的标准蛋白质浓度曲线的值来确定来自裂解物样品的RNF43蛋白质浓度。RNF43蛋白标准曲线和蛋白质定量测定如下进行：MSD384孔标准板在4℃下用15微升在PBS中的2微克/mL的抗RNF43捕获抗体包被过夜。将板在PBST中洗涤并在35微升MSD3%BlockerA溶液中封闭1小时，同时振荡。将板再次在PBST中洗涤。将10微升在含有10%蛋白质提取缓冲液的MSD1%BlockerA中的5x稀释的裂解物或连续稀释的重组RNF43标准物加入到孔中，并在振荡下孵育2小时。将板再次在PBST中洗涤。然后根据制造商的方案使用MSD®SULF0-TAGNHSEster对抗RNF43检测抗体进行磺基标记。将10微升在MSD1%封闭剂A中的0.5微克/mL带标签的抗RNF43检测抗体在室温下在振荡下加入到洗涤过的平板中1小时。将板在PBST中洗涤。将具有表面活性剂的MSD读出缓冲液T在水中稀释1倍，并向每个孔中加入35微升。在MSDSectorImager2400上使用集成软件分析程序读取板，以通过从标准曲线内插获得裂解物样品中的RNF43浓度。然后将值除以总蛋白浓度，得到每毫克总裂解物蛋白质的纳克RNF43。结果示于图8，其中每个斑点代表源自单个PDX肿瘤系的RNF43蛋白浓度。虽然每个斑点衍生自单个PDX系，但在大多数情况下，从相同的PDX系测试多个生物样品，并且将值平均以提供数据点。图8显示与正常组织相比，代表性GA和CRPDX肿瘤细胞系显示出高RNF43蛋白表达。测试的正常组织包括肾上腺、动脉、结肠、食道、胆囊、心脏、肾脏、肝脏、肺、外周和坐骨神经、胰腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、气管、红细胞和白细胞和血小板、膀胱、脑、乳腺、眼、淋巴结、卵巢、脑垂体、前列腺和脊髓。在以下PDX系中，RNF43蛋白表达和mRNA表达(通过微阵列或qPCR确定)之间存在良好的相关性：CR88、CR64、CR104、CR76和CR99。这些数据与上文所述的RNF43表达的mRNA转录数据组合，强烈地加强了RNF43决定子为治疗性干预提供有吸引力的靶标的见解。实施例15使用原位杂交在肿瘤表面上检测RNF43使用RNAscope®2.0Reagent试剂盒(AdvancedCellDiagnostics;Wang等，2012，PMID：22166544)进行RNF43mRNA的RNA原位杂交。用于RNF43的RNAscope探针设计在核苷酸3451-4489之间。使用对于肽基脯氨酰异构酶B(PPIB)(位于所有细胞的内质网内的环孢菌素结合蛋白质)特异性的RNAscope探针，对每个样品进行RNA完整性的质量控制(数据未显示)。使用对DiAminoPimelate(dapB)RNA特异的探针测定背景染色(数据未显示)。简言之，在与RNF43寡核苷酸探针杂交之前，用热和蛋白酶预处理21个原发性患者结肠直肠肿瘤样品的5微米甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)组织切片。然后将前置放大器、放大器和HRP标记的寡核苷酸依次杂交，随后用3,3'-二氨基联苯胺显色产色沉淀。特异性RNA染色信号被鉴定为棕色、点状点。将FFPE载玻片用Gill's苏木精复染色并在光学显微镜下分析。以0至4的等级手动评分染色，其中0=无染色或每10个细胞小于1个点;1=每个细胞1-3个点;2=每个细胞4-10个点;3=每个细胞多于10个点，并且小于10%的阳性细胞具有在簇中发现的点;4=每个细胞多于10个点，并且超过10%的阳性细胞在簇中具有点。图9显示测试的所有21个PDX细胞系在一定程度上表达RNF43，其中52.3%的肿瘤表现4分。实施例16使用流式细胞术，抗RNF43抗体检测肿瘤上的RNF43蛋白表达流式细胞术用于评估本发明的抗RNF43抗体特异性检测CRPDX肿瘤细胞系表面上抗RNF43蛋白的存在的能力。收获CRPDX肿瘤细胞，并使用本领域公知的酶组织消化技术解离以获得单细胞悬浮液(参见例如美国专利2007/0292414)。将肿瘤细胞与小鼠全IgG(在2%FCS/PBS中10微克/ml)孵育10分钟，以阻断非特异性抗体结合，然后用荧光缀合的市售抗小鼠CD45和H-2Kd抗体、抗人EpCAM和抗人CD46和/或CD324共染色以鉴定NTG(CD46-细胞)和CSC/TIC(CD46hi/CD324+细胞)群(参见USPN2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。然后将肿瘤细胞与生物素化的抗RNF43抗体(生物素-SC37.67,10微克/ml，在2%FCS/PBS中)或与IgG同种型匹配的对照抗体孵育30分钟，并在PBS/2%FCS中洗涤两次。将细胞与APC标记的链霉亲和素(1微克/ml，在2%FCS/PBS中)孵育15分钟，用1mLPBS/2%FCS洗涤两次，并重悬浮于含有DAPI的PBS/2%FCS中(以检测死细胞)。结合活的人细胞的抗体被解释为APC信号在mCD45-H2kd-EpCAM+DAPI-事件上保留，如在BDFACSCantoII流式细胞仪上分析的。图10显示本发明的抗RNF43抗体(黑线)能够以比IgG同种型对照抗体(灰色填充直方图)明显更高的强度特异性结合活人CRCREX肿瘤细胞(CR14、CR81、CR91、CR99、CR104、CR115)。此外，在测试的大多数PDX系中，与NTG(黑色虚线)相比，CSC(实线黑线)中的RNF43表达较高，表明RNF43表达与致瘤群相关。图10包括比较抗RNF43抗体的染色强度与对照抗体的染色强度的表，其中表达被计数为几何平均荧光强度减去用同种型对照抗体观察到的强度(ΔMFI)。实施例17抗RNF43抗体促进细胞毒性剂的递送为了确定本发明的抗RNF43抗体是否能够内化以介导细胞毒性剂递送至细胞，使用选择的抗RNF43抗体和与第二抗小鼠抗体FAB片段连接的皂草素进行体外细胞杀伤测定。皂草素是使核糖体失活的植物毒素，从而抑制蛋白质合成并导致细胞死亡。皂草素仅在细胞内具有细胞毒性，其中它接近核糖体，但是不能自己内化。因此，这些测定中的皂草素介导的细胞毒性指示抗小鼠FAB-Saporin构建体在结合和内化相关鼠或人源化抗RNF43抗体至靶细胞中时内化的能力。将过表达hRNF43的HEK293T细胞的单细胞悬浮液以每孔500个细胞铺板到BD组织培养板(BDBiosciences)中。一天后，将各种浓度的纯化的抗RNF43抗体(鼠或人源化的)与固定浓度的2nM抗小鼠IgGFAB-皂草素缀合物(AdvancedTargetingSystems)(用于测试小鼠抗体)或2nM抗人IgGFAB-皂草素缀合物(用于测试人源化抗体)一起加入到培养物中。孵育96小时后，使用CellTiter-Glo®(Promega)根据制造商的说明书计数活细胞。使用含有仅用第二FAB-皂草素缀合物孵育的细胞的培养物的原始发光计数设定为100%参考值，所有其它计数计算为参考值的百分比。浓度为250pM的抗RNF43鼠抗体的大子集有效地以不同的功效杀死了过表达hRNF43的HEK293T细胞(图5A)，而相同浓度的小鼠IgG2b同种型对照抗体(mIgG2b)没有(数据未显示)。此外，抗RNF43人源化抗体(hSC37.2、hSC37.17、hSC37.39和hSC37.67v1)有效杀死了过表达RNF43的HEK293T细胞。人源化抗体显示与它们衍生自的嵌合抗体(在hSC37.2、hSC37.17和hSC37.39的情况下)或鼠抗体(在hSC37.67v1的情况下)相当的功效(图11)。上述结果证明抗RNF43抗体介导内化的能力及其递送细胞毒性有效负荷的能力，支持了抗RNF43抗体可具有作为ADC的靶向部分的治疗效用的假设。实施例18通过抗RNF43抗体-药物缀合物减少肿瘤引发细胞频率如上文实施例1所示，RNF43表达与癌症干细胞相关。因此，为了证明用抗RNF43ADC进行的治疗降低了已知是耐药的并刺激肿瘤复发和转移的肿瘤引发细胞(TIC)的频率，进行体内有限稀释测定(LDA)，例如，基本上如下所述。在免疫缺陷小鼠中皮下生长PDX肿瘤(例如结肠直肠)。当肿瘤体积平均为150mm3-250mm3时，将小鼠随机分成两组。一组用与药物缀合的人IgG1作为阴性对照腹膜内注射;而另一组用抗RNF43ADC(例如，如实施例16和18中制备的)腹膜内注射。给药后一周，将来自每组的两个代表性小鼠安乐死，并收获它们的肿瘤并分散到单细胞悬浮液中。然后如前面实施例1所述收获、合并和解聚来自每个治疗组的肿瘤细胞。用FITC缀合的抗小鼠H2kD和抗小鼠CD45抗体标记细胞以检测小鼠细胞；EpCAM以检测人类细胞；和DAPI以检测死细胞。然后通过FACS使用BDFACSCantoII流式细胞仪分选所得悬浮液，分离并收集活的人肿瘤细胞。用来自用抗RNF43ADC处理的肿瘤的1250、375、115或35个分选的活的人类细胞注射四组小鼠。作为阴性对照，用来自用对照IgG1ADC处理的肿瘤的1000、300、100或30个分选的活的人类细胞移植四组小鼠。每周测量受体小鼠的肿瘤，并且在肿瘤达到1500mm3之前对个体小鼠实施安乐死。受体小鼠评分为具有阳性或阴性肿瘤生长。阳性肿瘤生长定义为超过100mm3的肿瘤生长。泊松分布统计(L-Calc软件，StemcellTechnologies)用于计算每个群体中TIC的频率。本领域技术人员将进一步理解，在不脱离本发明的精神或中心属性的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应当理解，其他变化被认为在本发明的范围内。因此，本发明不限于本文已经详细描述的特定实施方案。更确切地，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。当前第1页1 2 3