本发明属于药物新组合及其新用途领域，具体说的是一种小檗碱和地衣芽孢杆菌组合物在制备用于预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物中的应用。
背景技术：
轮状病毒(Rotavirus，RV)属呼肠孤病毒科，是导致婴幼儿严重腹泻的最主要的病原体，儿童感染RV后具有很高的发病率和死亡率，全世界每年5岁以下的婴幼儿有大约45.3万人因感染RV死亡。RV感染不仅引起肠炎腹泻，年龄较小的患儿常发生合并心肌及肝脏损伤，由于RV的主要发病人群为儿童，住院治疗费用和家庭疾病负担较高，而且，流行病学研究表明，经济水平的提高和卫生条件的改善并不能降低RV感染性腹泻的发病率。虽然目前已有多支轮状病毒疫苗开发，但是其严重的副作用和昂贵的使用费用限制了应用。
RV感染引起腹泻的机制有多种原因，对于婴幼儿和幼畜来说，感染RV后小肠上皮细胞脱落或者分布不规则，D-木糖醇吸收障碍以及双糖酶缺乏都可能造成肠细胞营养吸收障碍。RV首先感染宿主的肠上皮细胞，因此肠上皮细胞就成为了对抗轮状病毒的第一层物理屏障。肠上皮细胞除了屏障功能之外，还存在着各种免疫功能，这种免疫功能可以减少病毒和细菌感染的风险，肠上皮细胞的这些免疫机制包括粘液分泌、产生细胞因子/趋化因子以及Toll样受体(TLR)的表达。细菌性肠道致病菌可以引起小肠上皮细胞分泌包括白细胞介素-8(IL-8)在内的多种炎性细胞因子，感染RV后，IL-8mRNA的表达和IL-8分泌的增加。而血清中白细胞介素-6(IL-6)水平能够反映人或者悉生仔猪感染轮状病毒的严重程度。炎症因子白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)能够抵抗人类和其他动物感染性疾病，这些细胞因子可能是宿主保护性免疫的重要组成部分，可以介导机体抗病毒能力，并且帮助患者从RV感染中恢复过来。总之，这些细胞因子可以反映出轮状病毒感染后的临床症状或者疾病的严重程度，对于追踪评价轮状病毒的发生发展起着很重要的作用。
益生菌是有益于宿主的非病原微生物，可以通过刺激肠道内的免疫机能，将过低或过高的免疫活性调节至正常状态，同时还可以抑制有害菌在肠内的繁殖，促进肠道消化系统的健康。地衣芽孢杆菌为一种益生菌，中国专利92113318.9报道了地衣芽孢杆菌63516株及其治疗腹泻的用途。小檗碱是中药黄连、黄柏根茎中提取出的一种季铵型异喹啉类生物碱，具有治疗肠道感染和细菌性痢疾等作用。
目前临床上的抗轮状病毒治疗常采用利巴韦林等抗病毒药，但易产生耐药性，且不能长期用药。因此，研制开发一种新的高效低毒的预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物是目前亟待解决的新问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小檗碱和地衣芽孢杆菌组合物在制备用于预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物中的应用，该药物组合物具有高效低毒等特点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种小檗碱和地衣芽孢杆菌组合物在制备用于预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物中的应用；所述小檗碱选自小檗碱、小檗碱盐或小檗碱苷中的一种或几种，所述的小檗碱盐选自盐酸小檗碱、硫酸小檗碱、硝酸小檗碱、鞣酸小檗碱中的一种或几种，所述的小檗碱苷选自芒果苷小檗碱；所述的地衣芽孢杆菌选自地衣芽孢杆菌63516株；所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌原菌粉，所述地衣芽孢杆菌原菌粉含活菌数为10-1000亿CFU/克；所述的原菌粉为地衣芽孢杆菌63516菌泥加入稀释剂，经脱水干燥制成的单位质量高活菌数菌粉，所述的稀释剂选自无水碳酸钙、乳糖或微晶纤维素中的一种或几种；所述的轮状病毒包括轮状病毒株Wa株；所述地衣芽孢杆菌原菌粉含活菌数为100-400亿CFU/克，优选的地衣芽孢杆菌原菌粉含活菌数为200亿CFU/克；所述地衣芽孢杆菌的活菌数与小檗碱质量的比例为200亿CFU:1.25克～200亿CFU:10克；所述地衣芽孢杆菌的活菌数与小檗碱质量的比例为200亿CFU:2.5克～200亿CFU:5克；所述的轮状病毒感染疾病包括由轮状病毒感染引起的腹泻；所述的小檗碱和地衣芽孢杆菌为小檗碱和地衣芽孢杆菌的药物组合物；所述的药物组合物选自口服剂型；所述的口服剂型选自胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂。
本发明的要点在于提供一种预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物组合，其原理是：地衣芽孢杆菌和小檗碱能够产生协同预防和治疗轮状病毒感染的作用，其效果显著优于单用地衣芽孢杆菌或小檗碱的效果。
一种小檗碱和地衣芽孢杆菌在制备用于预防或治疗轮状病毒感染疾病的药物中的应用与现有技术相比，具有高效、低毒等优点，适合于临床应用以及工业化大生产，将广泛地应用于轮状病毒感染疾病的治疗领域中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例有助于更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例一
本实例证明，一定剂量的地衣芽孢杆菌63516株原菌粉和盐酸小檗碱能够协同预防和治疗轮状病毒Wa病毒株感染，其效果显著优于单用地衣芽孢杆菌或盐酸小檗碱的效果。
1、细胞株和病毒株：
恒河猴胚肾细胞(MA-104)(ATTC#CRL-2378.1)，购自中国典型培养物保藏中心。人轮状病毒株Wa株购买自中国微生物菌种网，编号CVCCAV54。
2、MA-104细胞培养：
用含10％小牛血清、1％非必须氨基酸的低限基本培养基(MEM)培养MA-104，以细胞密度为5×105/ml接种于培养瓶中，置于37℃含5％CO2培养箱中静置培养48h，长成良好致密单层细胞后，供后续试验。
3、轮状病毒增殖和收获：
病毒液与终浓度为10μg/mL胰蛋白酶混合，37℃共孵育1h以激活病毒液。取状态良好的单层MA-104细胞，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次，接种病毒液。于37℃含5％CO2培养箱中静置2h。然后补加含1μg/mL胰蛋白酶的无血清MEM培养液继续培养48-60h。将病毒细胞培养物反复冻融3次，低温12000r/min离心5min，上清液即为轮状病毒液，收获待用。
4、轮状病毒50％细胞致死量(TCID50/ml)测定：
取10μg/mL胰蛋白酶预处理过的病毒液，10倍系列稀释后各取100μl接种于96孔板中处于对数生长期的单层MA-104细胞上，每个浓度设3个重复，于37℃含5％CO2培养箱中共孵育静置吸附1h。按100μl/孔加入含有0.5μg/ml胰蛋白酶的培养液孵育培养，同时设置正常细胞对照。72h后对病变细胞和非病变细胞分别计数，然后根据Reed-Muench计数法计算，结果为TCID50＝10-5.5/ml，后续动物试验采用105.5TCID50/ml。
5、地衣芽孢杆菌63516株原菌粉和盐酸小檗碱混合物对悉生仔猪感染RV的预防作用
地衣芽孢杆菌63516株原菌粉，其原菌粉含活菌数约200亿CFU/克，其中CFU为菌落形成单位(Colony-Forming Units)，原菌粉：即地衣芽孢杆菌63516 菌泥加入适量无水碳酸钙，经脱水干燥制成的单位质量高活菌数菌粉。其中的无水碳酸钙也可用其他稀释剂如乳糖或微晶纤维素替代。
新生小猪在无菌环境下剖腹产出生，并且在无菌环境下饲养。所有的小猪都是无特定病原，并且没有RV抗体。选取1周龄悉生仔猪，随机分成十一组，每组十二头。在试验第1-5天，按表1分组给药(用10ml生理盐水溶解)，第1、2组悉生仔猪喂食10ml生理盐水。第6-10天，除1组外，其他各组悉生仔猪均进行1ml的105.5TCID50/ml口服攻毒。
表1分组给药情况
6、地衣芽孢杆菌63516株和盐酸小檗碱混合物对悉生仔猪感染RV的治疗作用
地衣芽孢杆菌63516株原菌粉，其原菌粉含活菌数约200亿CFU/克。
新生小猪在无菌环境下剖腹产出生，并且在无菌环境下饲养。所有的小猪都是无特定病原，并且没有RV抗体。选取1周龄悉生仔猪，随机分成十一组，每组十二头。在试验第1-5天，除1组外，其他各组悉生仔猪均进行1ml的105.5TCID50/ml口服攻毒。第6-10天，按表1分组给药(用10ml生理盐水溶解)，第1、2组悉生仔猪喂食10ml生理盐水。
7、悉生仔猪血清中IL-2、IL-6、IL-8、INF-γ含量和轮状病毒抗体水平检测
以上每组采集第1天，第6天，第11天和第16天血清，ELISA法检测。试验结果见表2-A、2-B和3-A、3-B。结果表明地衣芽孢杆菌63516株原菌粉和盐酸小檗碱重量比例为1:1.25-1:10时，对RV感染有协同预防和治疗效果。地衣芽孢杆菌63516株原菌粉和盐酸小檗碱重量比例为1:2.5-1:5时，协同效果最佳，其效果显著优于单用地衣芽孢杆菌或小檗碱的效果。
表2-A悉生仔猪血清因子含量和轮状病毒抗体水平检测(治疗作用)
表2-B悉生仔猪血清因子含量和轮状病毒抗体水平检测(治疗作用)
表2-A，2-B中，A为与组1的显著性差异；B为与组2的显著性差异；C为与组3的显著性差异；D为与组4的显著性差异；E为与组5的显著性差异；F为与组6的显著性差异；G为与组7的显著性差异；*为显著性差异P小于0.05；**为显著性差异P小于0.01；***为显著性差异P小于0.001。
表3-A悉生仔猪血清因子含量和轮状病毒抗体水平检测(预防作用)
表3-B悉生仔猪血清因子含量和轮状病毒抗体水平检测(预防作用)
表3-A,表3-B中，A为与组1的显著性差异；B为与组2的显著性差异；C为与组3的显著性差异；D为与组4的显著性差异；E为与组5的显著性差异；F为与组6的显著性差异；G为与组7的显著性差异；*为显著性差异P小于0.05；**为显著性差异P小于0.01；***为显著性差异P小于0.001。
实施例二
取20g原菌粉，25g盐酸小檗碱，30g淀粉，10g乳糖和2.5g羧甲基淀粉钠充分混匀，加适量水制成软材，将软材过40目筛，制得湿颗粒，用箱式干燥法干燥湿颗粒，即得。
实施例三
取15g原菌粉，75g盐酸小檗碱，60g微晶纤维素，35g乳糖和7g低取代羟丙基纤维素充分混匀，加适量水制成软材，将软材过40目筛，制得湿颗粒，用箱式干燥法干燥湿颗粒，即得。
实施例四
取10g原菌粉，100g盐酸小檗碱，40g微晶纤维素，52g淀粉，5g羧甲基纤维素钠和11g交联羧甲基纤维素钠充分混匀，加适量水制成软材，将软材过40目筛，制得湿颗粒，用箱式干燥法干燥湿颗粒，即得。
实施例五
取30g原菌粉，75g盐酸小檗碱，106g改性淀粉，50g乳糖和3.5g硬脂酸镁充分混匀，过40目筛，制备成菌粉混合物，填入空胶囊中，即得。
实施例六
取20g原菌粉，35g盐酸小檗碱，80g淀粉，65g蔗糖和4g硬脂酸镁充分混匀，过40目筛，制备成菌粉混合物，填入空胶囊中，即得。
实施例七
取10g原菌粉，16g盐酸小檗碱过40目筛，与33g乳糖和56g淀粉混匀，用10％淀粉浆制成软材，干燥后于12目筛整粒，加入4.5g干淀粉和0.6g硬脂酸镁混匀后，压片，即得。
实施例八
取5g原菌粉，45g盐酸小檗碱过40目筛，与24g乳糖和60g微晶纤维素混匀，用15％淀粉浆制成软材，干燥后于12目筛整粒，加入4.5g干淀粉和5.3g滑石粉混匀后，压片，即得。
菌种：地衣芽孢杆菌63516株(中国医学细菌保藏中心的菌株编号CMCC63516)。