一种靶向荧光磁性纳米探针及其制备方法与流程

本发明涉及磁性纳米探针的技术领域，具体涉及一种靶向荧光磁性纳米探针及其制备方法。

背景技术：

近几年来，利用纳米生物探针对肿瘤的靶向与治疗已经成为癌症检测与治疗的热门研究方向，良好的生物相容性和特异性使其在生物和医学领域具有广泛的应用前景。随着现代医学的推进和纳米技术的发展，磁性纳米材料在生物医学中的应用逐渐受到人们的重视并上升到了一个新的高度。尤其是随着纳米技术的不断发展，多功能磁性纳米探针在生物检测、靶向治疗、生物成像，以及磁热疗等领域均取得了理想的效果。

然而，目前所使用的磁性纳米探针具有功能单一、稳定性较差等问题，其主要原因是磁性纳米粒子的制备与修饰方面不尽如人意，其主要表现为：粒径分布不均一、分散性差、磁性能不强、胶体稳定性弱等特点，尤其在血液、细胞培养液等生物体系中常常发生团聚等问题，为后期的动物体内成像带来众多困扰。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种稳定性好、磁性能强的靶向荧光磁性纳米探针及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种靶向荧光磁性纳米探针，其特征在于，所述纳米探针包括磁性纳米粒子以及包覆在磁性纳米粒子外部的两亲性聚合物，所述磁性纳米粒子和两亲性聚合物的质量比为1:(2～5)，所述磁性纳米粒子包括CoFe₂O₄和MnFe₂O₄，CoFe₂O₄和MnFe₂O₄的质量比为1：(1～3)，所述两亲性聚合物上标记有荧光剂，且两亲性聚合物的表面偶联靶分子。

核壳结构的磁性纳米颗粒具有高分散性、粒径分布均一、较高的磁饱和强度和较强的磁弛豫率，是一种新型的理想的MRI成像应用的磁性纳米材料；利用荧光分子标记的双亲性聚合物对分散于有机相的磁性纳米材料进行包被后，既可实现纳米粒子的荧光标记，又可完成纳米粒子油相到水相的转换，而其聚合物表面的大量羧基又保证了纳米粒子的稳定性，使其在血液及组织器官中不易产生堆积；而利用靶分子进一步修饰后的纳米粒子可实现肿瘤组织的特异性识别，使其成为一种多功能的探针分子。

所述的两亲性聚合物通过以下步骤获得：将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、十二胺及荧光剂以(0.1～0.5)mol：(0.05～0.1)mol：(2～5)g的配比溶于四氢呋喃中，依次经过超声、加热和搅拌，蒸发四氢呋喃后将固体溶于氯仿中，得到浓度为0.05～0.2M的标记有荧光剂的双亲性聚合物。

所述的荧光剂包括Cy3、罗丹明衍生物、FITC或荧光素中的一种。

所述的靶分子选自多肽、抗体或叶酸中的一种，其中多肽优选TPA，抗体优选G8511。

一种如上所述靶向荧光磁性纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将铁前驱体、钴前驱体、油酸、油胺和十六烷二醇以(2～3)：(0.5～2)：(2～10)：(2～10)：(5～10)的摩尔比溶于反应溶剂中，N₂保护下反应，反应完毕后降温至室温，加入无水乙醇并离心沉淀，得到的沉淀物溶于正己烷中，得到分散于正己烷的CoFe₂O₄磁性纳米粒子；

(2)将铁前驱体、锰前驱体、油酸、油胺和十六烷二醇以(2～3)：(0.5～2)：(2～10)：(2～10)：(5～10)的摩尔比溶于反应溶剂中，并加入步骤(1)所得分散于正己烷的CoFe₂O₄磁性纳米粒子，CoFe₂O₄磁性纳米粒子的质量与所述锰前驱体的摩尔量之比为(20～80)g：(0.5～2)mol，真空排气去除正己烷后，在N₂保护下反应，反应完毕后降温至室温，加入无水乙醇并离心沉淀，得到的沉淀物溶于氯仿中，得到单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子；

(3)将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、十二胺及荧光剂以(0.1～0.5)mol：(0.05～0.1)mol：(2～5)g的配比溶于四氢呋喃中，依次经过超声、加热和搅拌，蒸发四氢呋喃后将固体溶于氯仿中，得到浓度为0.05～0.2M的标记有荧光剂的双亲性聚合物；

(4)将步骤(2)所得CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子和步骤(3)所得标记有荧光剂的双亲性聚合物按摩尔比1：(1～5)(的比例混合，蒸发掉氯仿后，溶于SBB12缓冲溶液中，离心得到包被聚合物；SBB12为50mM的硼酸溶液用NaOH调至pH12后得到的溶液；

(5)将步骤(4)所得包被聚合物与NH₂-PEG-NH₂以1：(100～200)的摩尔比进行混合，加入EDC溶液进行偶联反应，然后离心得到沉淀物；

(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于SBB9.0缓冲溶液中，加入靶分子，靶分子与沉淀物的摩尔比为(400～600)：1，反应即得靶向荧光磁性纳米探针。SBB9.0为50mM的硼酸溶液用NaOH调至pH9.0后得到的溶液。

所述的铁前驱体选自氯化铁、氯化亚铁、氧化铁或乙酰丙酮铁(III)中的一种或多种；

所述钴前驱体选自氯化钴、乙酰丙酮钴(II)或氧化钴中的一种或多种；

所述锰前驱体选自氯化锰、乙酰丙酮锰(II)或氧化锰中的一种或多种；

所述反应溶剂选自二苯醚、二辛醚、十八烯或二苄醚中的一种或多种。

步骤(1)所述的反应包括两个阶段，第一阶段的反应温度为180～220℃，反应时间为1～2h，第二阶段的反应温度为280～320℃，反应时间为0.5～1h；

步骤(2)所述的反应包括两个阶段，第一阶段的反应温度为180～220℃，反应时间为0.5～1h，第二阶段的反应温度为280～320℃，反应时间为0.5～1h；

步骤(1)和步骤(2)所述离心的转速为1000～5000rpm，离心时间为8～15min。

步骤(3)所述超声时间为10～20s，加热至温度50～80℃，搅拌时间为8～12h。

步骤(4)所述离心转速为10000～30000rpm，离心时间为0.5～2h；

步骤(5)所述离心转速为800～3000rpm，离心时间为10～20min；

步骤(6)所述反应温度为20～50℃，反应时间为8～12h。

所述NH₂-PEG-NH₂的分子量为2～10kDa。

以上所有条件的使用保证了磁性纳米材料的可控制备和水相转化，能使纳米材料在水相过程中具有较高稳定性，构建的纳米材料探针靶向性好。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：

1.制得的核壳型磁性纳米粒子分散性高，粒径分布均匀，性能稳定，磁弛豫率高。

2.双亲性聚合物包被的纳米粒子在不同pH值和高盐浓度下稳定性好，荧光稳定不易猝灭。

3.包被后的纳米粒子表面携带大量羧基(-COOH)基团，稳定性好，可进行进一步的偶联修饰。

4.带有靶分子的纳米探针对肿瘤组织的靶向性好，弛豫率高，适合生物医学应用。

附图说明

图1为核壳型磁性纳米粒子的透射电镜图片；

图2为核壳型磁性纳米粒子的高分辨透射电镜图片；

图3为核壳型磁性纳米探针的紫外可见光吸收光谱和荧光光谱图；

图4为核壳型磁性纳米探针的体内MRI成像图；

图5为核壳型磁性纳米探针的体内荧光成像图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将3mmol的乙酰丙酮铁、1.5mmol的乙酰丙酮钴、8mmol的油酸、8mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和25mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至沸腾并保持该温度1h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：5000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：3mmol的氧化铁、1.5mmol的氯化锰、8mmol的油酸、8mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和20mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入30mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

所得CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子的透射电镜图如图1所示，单个磁性粒子的高分辨透射电镜图如图2所示，可以看出粒径分布均匀，尺寸大约在15nm。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.1mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.05mmol十二胺及2mg的荧光染料溶解在装有15mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:3混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(10000rpm，0.5h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:100混合后，加入5mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(1500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的多肽溶液，反应过夜。由此，多肽分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

图3为所得肿瘤特异性标记的核壳型磁性纳米探针的紫外-可见光光谱和荧光光谱，从图中可知，靶分子在250～400nm处有可见光吸收峰，表明其已共价偶联于纳米粒子表面；荧光染料在575nm处有较强的荧光吸收峰，表明带有黄色荧光的染料分子已共价偶联于核壳型磁性纳米探针上，可用于动物体内的荧光标记。

(6)取0.1mL的步骤(5)制得的核壳型磁性纳米探针通过尾部静脉注射注射到带有肿瘤组织的裸鼠体内，定期观察其体内荧光分布变化及肿瘤组织的核磁成像变化，同时以静脉注射有同等量PBS的小鼠做对照组。

图4为注射前(A)及注射24h(B)后肿瘤组织的核磁成像变化图及信号强度对比图，从图中可清楚的看到，注射前后肿瘤部位信号强度发生较大变化。

图5为注射前(A)及注射2d(B)后小鼠的荧光成像对比图，从图中可清楚的看到，注射2d后，荧光强度在肿瘤组织部位变强，表面磁性纳米探针在肿瘤部位出现富集。

实施例2

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将2mmol的氯化亚铁、1mmol的氯化钴、4mmol的油酸、4mmol的油胺、10mmol的十六烷二醇和10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热2h，之后继续加热至沸腾并保持该温度1h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：3000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：2mmol的氯化亚铁、1mmol的氯化锰、2mmol的油酸、2mmol的油胺、6mmol的十六烷二醇和10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入30mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.5mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.08mmol十二胺及5mg的荧光染料溶解在装有10mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照米偶尔比1:2混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(30,000rpm，1h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:200混合后，加入3mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(2500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的叶酸溶液，反应过夜。由此，叶酸分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

实施例3

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将1mmol的乙酰丙酮铁、0.5mmol的乙酰丙酮钴、6mmol的油酸、5mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和20mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至沸腾并保持该温度0.5h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：4000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：1mmol的乙酰丙酮铁、0.5mmol的乙酰丙酮锰、3mmol的油酸、3mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和20mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入50mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.5mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.1mmol十二胺及5mg的荧光染料溶解在装有10mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:2混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(20,000rpm，1h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:200混合后，加入2mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(2500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的抗体溶液，反应过夜。由此，抗体可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

实施例4

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将2mmol的氯化铁、0.5mmol的乙酰丙酮钴、6mmol的油酸、5mmol的油胺、10mmol的十六烷二醇和20mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至沸腾并保持该温度0.5h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：4000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：2mmol的氯化铁、0.5mmol的乙酰丙酮锰、4mmol的油酸、4mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入50mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.8mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.1mmol十二胺及5mg的荧光染料溶解在装有10mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:2混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(10,000rpm，1h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:300混合后，加入2mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(2500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的叶酸溶液，反应过夜。由此，叶酸分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

实施例5

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将3mmol的乙酰丙酮铁、1.5mmol的氧化钴、8mmol的油酸、8mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和25mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至沸腾并保持该温度1h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：5000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：3mmol的氧化铁、1.5mmol的氧化锰、8mmol的油酸、8mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和20mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入30mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.09mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.06mmol十二胺及2mg的荧光染料溶解在装有15mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:3混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(10000rpm，0.5h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:100混合后，加入5mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(1500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的多肽溶液，反应过夜。由此，多肽分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

实施例6

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将1mmol的乙酰丙酮铁、0.5mmol的氯化钴、6mmol的油酸、5mmol的油胺、8mmol的十六烷二醇和20mL的二辛醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至200℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至沸腾并保持该温度0.5h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：4000rpm,10min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：1mmol的乙酰丙酮铁、0.5mmol的氯化锰、6mmol的油酸、6mmol的油胺、6mmol的十六烷二醇和20mL的二辛醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入50mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至200℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至沸腾，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.5mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.1mmol十二胺及3mg的荧光染料溶解在装有15mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至65℃并搅拌过夜，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于5mL氯仿中获得含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:2混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入5mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(20,000rpm，1h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:200混合后，加入5mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(2500rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，并加入1mg活化好的抗体溶液，反应过夜。由此，抗体可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

实施例7

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将3mmol的乙酰丙酮铁、2mmol的乙酰丙酮钴、2mmol的油酸、2mmol的油胺、5mmol的十六烷二醇和50mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至180℃并于该温度持续加热2h，之后继续加热至280℃并保持该温度1h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：5000rpm,8min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：3mmol的氧化铁、2mmol的氯化锰、2mmol的油酸、2mmol的油胺、5mmol的十六烷二醇和50mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入20mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至180℃并于该温度持续加热2h，之后再升温至280℃，并持续反应1h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.1mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.1mmol十二胺及2mg的荧光染料溶解在装有15mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声20s后，加热至50℃并搅拌12h，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于氯仿中获得浓度为0.05M含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:1混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(10000rpm，0.5h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:100混合后，加入5mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(800rpm,20min)除去EDC和未偶联的PEG，其中NH₂-PEG-NH₂的分子量为2kDa。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，按靶分子与沉淀物的摩尔比为400:1的量加入活化好的多肽溶液，20℃下反应12h。由此，多肽分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

经检测，最终得到的纳米探针中磁性纳米粒子和两亲性聚合物的质量比为1:2，所述磁性纳米粒子包括CoFe₂O₄和MnFe₂O₄，CoFe₂O₄和MnFe₂O₄的质量比为1：1，所述两亲性聚合物上标记有荧光剂，且两亲性聚合物的表面偶联靶分子。

实施例8

一种靶向荧光磁性纳米探针的制备，具体包括以下步骤：

(1)将2mmol的乙酰丙酮铁、0.5mmol的乙酰丙酮钴、10mmol的油酸、10mmol的油胺、10mmol的十六烷二醇和50mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，混合物经过真空排气后，在氮气保护下加热至220℃并于该温度持续加热1h，之后继续加热至320℃并保持该温度0.5h，直至反应终止降至室温，所得黑色液体在加入无水乙醇后离心沉淀(离心条件：1000rpm,15min)并将沉淀重悬于正己烷中，该清洗方法重复一次后，最终所得CoFe₂O₄磁性纳米粒子分散于正己烷中。

合成核壳型的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子具体步骤为：2mmol的氧化铁、0.5mmol的氯化锰、10mmol的油酸、10mmol的油胺、10mmol的十六烷二醇和50mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中加入80mg分散于2mL氯仿中的CoFe₂O₄磁性纳米粒子。混合物与100℃条件下真空排气去除氯仿后，在氮气保护下升温至220℃并于该温度持续加热1h，之后再升温至320℃，并持续反应0.5h，最终反应结束降至室温。将所得样品利用上述步骤进行清洗，并最终分散于氯仿中。所得样品即为单分散的CoFe₂O₄@MnFe₂O₄磁性纳米粒子。

(2)荧光标记的双亲性聚合物合成方法为：取0.5mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)、0.05mmol十二胺及5mg的荧光染料溶解在装有15mL四氢呋喃的圆底烧瓶中，超声10s后，加热至80℃并搅拌8h，次日将四氢呋喃蒸发掉后，粉红色聚合物定溶于氯仿中获得浓度为0.2M含有1％荧光分子的双亲性聚合物。

(3)将步骤(1)所得磁性纳米粒子与步骤(2)所得荧光标记的双亲性聚合物按照摩尔比1:5混合于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪作用下缓慢蒸发掉溶剂，随后加入10mL的SBB 12缓冲溶液，在磁力搅拌作用下固体逐渐溶解于缓冲液中，最终所得样品通过超滤管浓缩至2mL，并利用超速离心机(30000rpm，2h)除去未包被的聚合物。

(4)将纯化后的水溶性纳米粒子与PEG(NH₂-PEG-NH₂)按照摩尔比1:200混合后，加入5mg EDC溶液进行共价偶联，溶液反应过夜，将所得样品放置于超滤管中离心(3000rpm,10min)除去EDC和未偶联的PEG，其中NH₂-PEG-NH₂的分子量为10kDa。

(5)将步骤(4)制得的样品溶解于SBB 9.0缓冲溶液中，按靶分子与沉淀物的摩尔比为600:1的量加入活化好的多肽溶液，50℃下反应8h。由此，多肽分子可以共价偶联到PEG末端，从而最终形成以核壳型磁性纳米粒子为中心即具有荧光又能特异的靶向于肿瘤组织的多功能生物探针。

经检测，最终得到的纳米探针中磁性纳米粒子和两亲性聚合物的质量比为1:5，所述磁性纳米粒子包括CoFe₂O₄和MnFe₂O₄，CoFe₂O₄和MnFe₂O₄的质量比为1：3，所述两亲性聚合物上标记有荧光剂，且两亲性聚合物的表面偶联靶分子。