本发明涉及干细胞分泌物，尤其是一种含有人间充质干细胞分泌物的滴眼液及其制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。它们具有自我更新能力、组织修复、免疫调节能力，可以向中胚层谱系分化，例如：脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等，此外还能够向及其它胚层谱系细胞分化，例如向表皮细胞\血管内皮细胞分化。
间充质干细胞培养体系中含有多种大量的活性成分，如：干细胞生长因子(scf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、内皮细胞生长因子(vegf)、表皮细胞生长因子(egf)、细胞集落刺激因子、白细胞介素(il)、胶原蛋白、透明质酸等80余种活性物质。目前，已经有将间充质干细胞应用于修复视网膜损伤、烧伤角膜等的报道。但是由于活性细胞的存活条件比较苛刻，很容易死亡因此由活细胞所起的作用也会大打折扣。
透明质酸具有抗炎抗菌、缓解眼部疲劳；治疗眼干眼燥症；添加透明质酸增加滴眼液的润滑性和舒适性。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种活性稳定的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液及其制备方法，利用干细胞分泌的多种细胞因子为治疗各种眼结膜及角膜溃疡疾病提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
(1)人间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的人间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；
(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；
(8)将步骤(7)中的备用上清，以0.22um滤膜过滤，在过滤后的上清中添加质量百分比1％-5％透明质酸，混匀后分装到无菌的一次性滴眼液瓶中，放到4℃冰箱中保存待用。
所述人间充质干细胞为人脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或月经血间充质干细胞。
上述制备方法制得的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液。
本发明的有益效果是：将间充质干细胞进行饥饿培养，使得细胞分泌的各种活性成分的浓度都得到了提高，并且在短时间内使用饥饿上清重复饥饿间充质干细胞，使细胞提取物浓度进一步增加，再配合添加的透明质酸有效成分，可促进眼结膜及角膜的修复，缩短眼结膜及角膜溃疡伤口的愈合时间，并起到消除炎症，促进经久不愈的溃疡愈合等作用，且滴眼液不含有防腐剂不会对眼睛造成伤害，一次性使用更加安全、方便。
附图说明
图1不同饥饿次数人脐带间充质干细胞提取物中有效因子分泌量比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液的制备方法，包括以下步骤：
(1)间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2-p6的间充质干细胞复苏，接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)第一批次细胞融合度达到70％-80％时，以生理盐水清洗细胞2次，用复方电解质注射液进行饥饿培养；
(3)饥饿培养12-24小时后，第一批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(4)取培养的第二批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(5)饥饿培养12-24小时后，第二批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清备用；
(6)取培养的第三批次细胞，当细胞融合度达到70％-80％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清进行饥饿培养；
(7)饥饿培养12-24小时后，第三批次细胞融合度达90％-95％，收取细胞培养上清，3000-4500g条件下离心5-8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。
(8)将步骤(7)中的备用上清，以0.22um滤膜过滤，在过滤后的上清中添加质量百分比1％-5％透明质酸，混匀后分装到无菌的一次性滴眼液瓶中，放到4℃冰箱中保存待用。
上述制备方法得到含人间充质干细胞分泌物的小型宠物滴眼液。
制备的滴眼液用于家庭小型宠物(犬、猫)的各种眼结膜及角膜溃疡的修复。
实施例1
(1)人脐带间充质干细胞培养：从细胞库中选取p2的人脐带间充质干细胞复苏，细胞总数4.2*107。接种批次记为第一批次、第二批次、第三批次，接种密度分别为最大融合度的60％(每瓶接种细胞数：9*106,接种细胞三瓶)、40％(每瓶接种细胞数：6*106，接种细胞两瓶)、20％(接种细胞数：3*106，接种细胞一瓶),培养体系均为40ml。培养细胞所用完全培养基为无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清，接种细胞瓶为t-175培养瓶。细胞接种完成，放于二氧化碳培养箱培养，温度37℃，二氧化碳体积比浓度5％；
(2)培养30小时,此时第一批次细胞融合度达到75％时，以生理盐水清洗细胞2次，每瓶用40ml复方电解质注射液(中国大冢制药有限公司生产的复方电解质葡萄糖mg3注射液)进行饥饿培养；
(3)饥饿培养18小时后，第一批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；
(4)取培养的第二批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第二批次细胞2次，用步骤(3)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；
(5)饥饿培养18小时后，第二批次细胞融合度达95％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用；
(6)取培养的第三批次细胞，此时细胞融合度达到70％，以生理盐水清洗第三批次细胞2次，用步骤(5)中细胞培养上清40ml进行饥饿培养；
(7)饥饿培养24小时后，第三批次细胞融合度达90％，收取细胞培养上清，4000g条件下离心8min除去沉淀，取离心后上清放于4℃备用。
(8)检测步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中的备用上清细胞因子含量，见(图1)。
(9)将步骤(3)、步骤(5)和步骤(7)中的备用上清，以0.22um滤膜过滤，在过滤后的上清中添加质量百分比3％透明质酸，混匀后分装到无菌的一次性滴眼液瓶中，放到4℃冰箱中保存待用，即分别得到饥饿一次、饥饿二次和饥饿三次人脐带间充质干细胞提取物的滴眼液。
(9)造模：选取7周龄的sd大鼠75只，随机分为①实验一组，②实验二组，③实验三组，并且每组选定右眼为实验眼，左眼为对照眼。①实验一组、②实验二组和③实验三组均为真菌性角膜溃疡组，每组25只，左右眼均接种镰刀菌。
根据大鼠角膜曲率利用封口膜制备角膜接触镜，75％酒精浸泡消毒24h；实验前用0.5％左氧氟沙星滴眼液滴双眼，3次/日，晚上涂用左氧氟沙星滴眼膏，连续3天；10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3ml/100g)，0.4％盐酸奥布卡因滴术眼，常规消毒、铺巾，眼科手术显微镜下用无菌手术刀完整刮除角膜中央直径3-4mm范围的上皮层，并用针头于角膜表面划痕，深达浅基质层。实验眼用接种环刮取直径3-4mm范围的培养菌落直接涂抹在刮除上皮的角膜面，然后盖上自制的角膜接触镜，对照眼以同样方式注入复方电解质葡萄糖mg3注射液。球结膜下注射0.5万u庆大霉素，行睑裂缝合。24h后打开睑裂取出角膜接触镜。
(10)①实验一组应用饥饿一次的人脐带间充质干细胞提取物的滴眼液点右眼，复方电解质葡萄糖mg3注射液点左眼，②实验二组饥饿二次的人脐带间充质干细胞提取物的滴眼液点右眼，复方电解质葡萄糖mg3注射液点左眼，③实验三组应用饥饿三次的人脐带间充质干细胞提取物的滴眼液点右眼，复方电解质葡萄糖mg3注射液点左眼，造模后第3d每10min点1次眼，共点眼5次，后改为每天点眼7次，并于造模后3d、5d、7d、10d、15d，用裂隙灯显微镜观察眼表情况，依据角膜溃疡裂隙灯检查分级表见(表1)详细记录。
(11)数据分析，分析滴眼液对眼角膜溃疡的修复作用。见(表1、2)为动物实验数据统计表。
表1角膜溃疡裂隙灯检查分级表
表2滴眼液对眼结膜溃疡的修复作用的动物实验数据统计表
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。