遗传修饰的自然杀伤细胞的制作方法

文档序号:20166238发布日期:2020-03-24 21:32阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种自然杀伤细胞群体,其中所述自然杀伤(nk)细胞经遗传修饰以使其缺乏nk抑制性分子的表达或呈现出降低的nk抑制性分子的表达。

2.权利要求1的群体,其中所述nk抑制性分子是选自cblb、nkg2a和tgfbr2的一种或多种nk抑制性分子。

3.权利要求1或2的群体,其中所述遗传修饰的nk细胞与其中所述nk抑制性分子的表达未被敲除或降低的nk细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。

4.权利要求3的群体,其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(aml)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(cml)细胞、多发性骨髓瘤(mm)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。

5.权利要求4的群体,其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。

6.权利要求5的群体,其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(gbm)细胞。

7.权利要求1的群体,其中所述nk抑制性分子的表达被敲除。

8.权利要求7的群体,其中所述nk抑制性分子的表达通过crispr/cas9系统、锌指核酸酶或talen核酸酶敲除。

9.权利要求7的群体,其中所述nk抑制性分子的表达通过crispr相关技术敲除。

10.权利要求1或2的群体,其中所述nk抑制性分子是cblb。

11.权利要求7-10任一项的群体,其中cblb表达的敲除产生在用icam-1和mica刺激时比其中cblb未被敲除的nk细胞具有更高的ifnγ分泌的nk细胞群体。

12.权利要求7-10任一项的群体,其中cblb表达的敲除产生在用icam-1和mica刺激时与其中cblb未被敲除的nk细胞相比具有更高的脱粒的nk细胞群体。

13.权利要求12的群体,其中所述脱粒通过cd107a的增加来测量。

14.权利要求7-10任一项的群体,其中cblb表达的敲除产生与其中cblb未被敲除的nk细胞相比具有gm-csf、可溶性cd137(scd137)、ifnγ、mip1α、mip1β、tnfα和穿孔素中一种或多种的分泌的变化的nk细胞。

15.权利要求1或2的群体,其中所述nk抑制性分子是nkg2a。

16.权利要求15-19任一项的群体,其中nkg2a表达的敲除产生在nkg2a激动剂抗体存在下用icam-1和mica刺激时与其中nkg2a未被敲除的nk细胞相比具有更高的脱粒的nk细胞群体。

17.权利要求16的群体,其中所述脱粒通过cd107a的增加来测量。

18.权利要求16或17的群体,其中nkg2a表达的敲除产生与其中nkg2a未被敲除的nk细胞相比具有gm-csf、可溶性cd137(scd137)、ifnγ、mip1α、mip1β、tnfα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的nk细胞群体。

19.权利要求1或2的群体,其中所述nk抑制性分子是tgbfr2。

20.权利要求19的群体,其中tgbfr2表达的敲除产生与其中tgfbr2未被敲除的nk细胞相比具有对于tgfβ介导的抗肿瘤细胞nk细胞细胞毒性的抑制的抗性的nk细胞群体。

21.一种自然杀伤细胞群体,其中所述自然杀伤(nk)细胞经遗传修饰以包含修饰的cd16。

22.权利要求21的群体,其中所述修饰的cd16比野生型cd16具有更高的对于igg的亲和力。

23.权利要求22的群体,其中所述修饰的cd16在cd16a的位置158处具有缬氨酸。

24.权利要求21的群体,其中所述修饰的cd16对adam17切割是抗性的。

25.权利要求24的群体,其中所述修饰的cd16在cd16a的位置197处具有脯氨酸。

26.权利要求21-25任一项的群体,其中所述修饰的cd16含有igk信号肽。

27.权利要求21-26任一项的群体,其中所述修饰的cd16含有cd16信号肽。

28.权利要求21-27任一项的群体,其中所述修饰的cd16通过病毒感染引入所述nk细胞中。

29.权利要求28的群体,其中所述修饰的cd16通过病毒感染引入造血细胞中,随后该造血细胞分化成nk细胞。

30.权利要求28-29的群体,其中所述修饰的cd16通过慢病毒载体引入。

31.权利要求30的群体,其中所述慢病毒载体具有cmv或ef1α启动子。

32.权利要求30或31的群体,其中所述慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。

33.权利要求28或29的群体,其中所述修饰的cd16通过逆转录病毒载体引入。

34.权利要求33的群体,其中所述逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。

35.权利要求1-34任一项的群体,其中所述nk细胞是胎盘来源的(pnk细胞)。

36.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法,包括将所述肿瘤细胞接触来自权利要求1-35或55-59任一项的群体的自然杀伤细胞。

37.权利要求36的方法,其中所述接触在体外进行。

38.权利要求36的方法,其中所述接触在体内进行。

39.权利要求38的方法,其中所述接触在人类个体中进行,优选选择来接受抗癌治疗的个体。

40.权利要求39的方法,其中所述方法包括将所述自然杀伤细胞施用于所述个体。

41.权利要求36-40任一项的方法,其中所述肿瘤细胞是多发性骨髓瘤细胞。

42.权利要求36-40任一项的方法,其中所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(aml)细胞。

43.权利要求42的方法,其中所述个体患有复发性/难治性aml。

44.权利要求42的方法,其中所述个体患有对于抗aml的至少一种非先天性淋巴样细胞(ilc)治疗失败的aml。

45.权利要求40的方法,其中所述个体为65岁或更大年龄,并且处于第一缓解期。

46.权利要求40-45任一项的方法,其中在施用所述自然杀伤细胞前,所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或两者进行了调理。

47.权利要求40-46任一项的方法,其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(aml)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(cml)细胞、多发性骨髓瘤(mm)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。

48.权利要求40-47任一项的群体,其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。

49.权利要求48的群体,其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(gbm)细胞。权利要求40-49任一项的方法,其中所述自然杀伤细胞与抗cd33抗体一起施用。

50.权利要求40-49任一项的方法,其中所述自然杀伤细胞与抗cd20抗体一起施用。

51.权利要求40-49任一项的方法,其中所述自然杀伤细胞与抗cd138抗体一起施用。

52.权利要求40-49任一项的方法,其中所述自然杀伤细胞与抗cd38抗体一起施用。

53.权利要求36-53任一项的方法,其中在所述接触或所述施用前,所述自然杀伤细胞冷冻保存。

54.权利要求36-53任一项的方法,其中在所述接触或所述施用前,所述自然杀伤细胞没有冷冻保存。

55.权利要求1-54任一项的群体,其中所述自然杀伤细胞是cd56+cd3-cd117+cd11a+,表达穿孔素和/或eomes,并且不表达rorγt、芳基烃受体和il1r1中的一种或多种。

56.权利要求55的群体,其中所述自然杀伤细胞表达穿孔素和eomes,并且不表达rorγt、芳基烃受体和il1r1中的任何一种。

57.权利要求55或56的群体,其中所述自然杀伤细胞另外表达t-bet、gzmb、nkp46、nkp30和/或nkg2d。

58.权利要求55-57任一项的群体,其中所述自然杀伤细胞表达cd94。

59.权利要求55-57任一项的群体,其中所述自然杀伤细胞不表达cd94。

60.源自胎盘或其部分,由此包含胎盘来源的nk细胞(pnk细胞)的自然杀伤细胞群体,其中所述pnk细胞进行遗传修饰,使得它们缺乏nk抑制性分子的表达或呈现出降低的nk抑制性分子的表达。

61.权利要求60的群体,其中所述nk抑制性分子是选自cblb、nkg2a和tgfbr2的一种或多种nk抑制性分子。

62.权利要求60或61的群体,其中所述遗传修饰的nk细胞与其中所述nk抑制性分子的表达未被敲除或降低的nk细胞相比具有更高的对抗肿瘤细胞的细胞毒性。

63.权利要求62的群体,其中所述肿瘤细胞选自多发性骨髓瘤细胞、急性髓性白血病(aml)细胞、乳腺癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、导管癌细胞、白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、慢性髓性淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病(cml)细胞、多发性骨髓瘤(mm)、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞性淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞和视网膜母细胞瘤细胞。

64.权利要求62的群体,其中所述肿瘤细胞是实体肿瘤细胞。

65.权利要求64的群体,其中所述实体肿瘤细胞选自肝肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肾肿瘤细胞和多形性胶质母细胞瘤(gbm)细胞。

66.权利要求60的群体,其中所述nk抑制性分子的表达被敲除。

67.权利要求66的群体,其中所述nk抑制性分子的表达通过crispr/cas9系统、锌指核酸酶或talen核酸酶敲除。

68.权利要求66的群体,其中所述nk抑制性分子的表达通过crispr相关技术敲除。

69.权利要求60或61的群体,其中所述nk抑制性分子是cblb。

70.权利要求69的群体,其中cblb表达的敲除产生在用icam-1和mica刺激时与其中cblb未被敲除的nk细胞相比具有更高的ifnγ分泌的nk细胞群体。

71.权利要求69的群体,其中cblb表达的敲除产生在用icam-1和mica刺激时与其中cblb未被敲除的nk细胞相比具有更高的脱粒的nk细胞群体。

72.权利要求71的群体,其中所述脱粒通过cd107a的增加来测量。

73.权利要求69-72任一项的群体,其中cblb表达的敲除产生与其中cblb未被敲除的nk细胞相比,在与多发性骨髓瘤细胞共培养时具有gm-csf、可溶性cd137(scd137)、ifnγ、mip1α、mip1β、tnfα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的nk细胞群体。

74.权利要求60或61的群体,其中所述nk抑制性分子是nkg2a。

75.权利要求74的群体,其中nkg2a表达的敲除产生在nkg2a激动剂抗体存在下用icam-1和mica刺激时与其中nkg2a未被敲除的nk细胞相比具有更高的脱粒的nk细胞群体。

76.权利要求75的群体,其中所述脱粒通过cd107a的增加来测量。

77.权利要求76的群体,其中所述cd107a的增加通过facs来测量。

78.权利要求74-77任一项的群体,其中nkg2a表达的敲除产生与其中nkg2a未被敲除的nk细胞,如天然存在的nk细胞,相比具有gm-csf、可溶性cd137(scd137)、ifnγ、mip1α、mip1β、tnfα和/或穿孔素中一种或多种的分泌的变化的nk细胞群体。

79.胎盘来源的自然杀伤细胞(pnk)的群体,其中所述pnk细胞经遗传修饰以包含修饰的cd16。

80.权利要求79的群体,其中所述修饰的cd16比野生型cd16具有更高的对于igg的亲和力。

81.权利要求80的群体,其中所述修饰的cd16在cd16a的位置158处具有缬氨酸。

82.权利要求79的群体,其中所述修饰的cd16对adam17切割是抗性的。

83.权利要求82的群体,其中所述修饰的cd16在cd16a的位置197处具有脯氨酸。

84.权利要求79-83任一项的群体,其中所述修饰的cd16含有igk信号肽或cd16信号肽。

85.权利要求79-84任一项的群体,其中所述修饰的cd16通过病毒感染引入所述nk细胞中。

86.权利要求85的群体,其中所述修饰的cd16通过病毒感染引入造血细胞中,随后该造血细胞分化成nk细胞。

87.权利要求85或86的群体,其中所述修饰的cd16通过慢病毒载体引入。

88.权利要求87的群体,其中所述慢病毒载体具有cmv或ef1α启动子。

89.权利要求85或86的群体,其中所述慢病毒载体包含一个或多个药物选择标记。

90.权利要求89的群体,其中所述选择标记包括编码赋予对选择剂的抗性的蛋白的基因,如puror基因、zeor基因、hygror基因、neor基因和/或杀稻瘟菌素抗性基因。

91.权利要求85或86的群体,其中所述修饰的cd16通过逆转录病毒载体引入。

92.权利要求91的群体,其中所述逆转录病毒载体包含一个或多个药物选择标记。

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