人il－12抗体的制作方法

专利名称：人il－12抗体的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及IL-12抗体，更具体地涉及抗-人IL-12的多克隆和单克隆抗体。
白细胞介素-12(IL-12)以前被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子或天然杀伤细胞刺激因子，它是75-kDa(p75)的异二聚体细胞因子，由以二硫键连接的40-kDa(p40)和35-kDa(p35)亚单位组成。p40和p35亚单位分别是含有306个氨基酸残基和197个氨基酸残基的多肽(Gubler U等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,4143-4147(1991))。
p75异二聚体是IL-12的生物活性形式(Gubler U等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,4143;Wolf,S.F等，1991，免疫学杂志，146:3074)。IL-12p75异二聚体通过刺激Th1辅助细胞产生，刺激激活的T和天然杀伤(NK)细胞，增强NK/LAK细胞的裂解活性，并通过休眠和激活的T和NK细胞刺激IFN-γ的产生来激活和增强针对外源抗原的由细胞介导的免疫应答。
IL-12的p40亚单位产生的量超过p35亚单位，发现呈单体和二聚体形式中的p40亚单位(Podlaski,F.J等，1992,Arch.Biochem.Biophys.294:230；D’Andrea，A等，1992，实验医学杂志，176:1387)。IL-12 p40同二聚体是强有力的IL-12拮抗剂(Ling，P等，1995，免疫学杂志，154:116；Gillessen.S等，1995，欧洲免疫学杂志，25:200)。与p40亚单位形成对照的是，IL-12 p35亚单位的生物活性仍是未知的，仅发现p35蛋白作为IL-12 p75异二聚体的一部分与p40亚单位相连。因此，人IL-12提供了两种重要的表位类型(1)由p40亚单位提供的表位；和(2)由IL-12 p75异二聚体的三维构象提供的表位。因此，我们设计了识别IL-12 p75异二聚体蛋白质上提供的表位但不识别IL-12 p40亚单位蛋白质上提供的表位的抗体，即所谓的“异二聚体特异性”抗体。
现已发现已知的IL-12抗体在基本上中和IL-12生物活性方面不是最有效的。与p40亚单位免疫反应的IL-12抗体不能最理想地阻断人IL-12的生物活性。例如，由于IL-12 p75异二聚体的产生会导致过量的无活性p40亚单位(相对于生物活性的p75异二聚体而言)，与p40亚单位提供的表位反应的抗体的使用很成问题(Podlaski,F.J.,1992,Arch.Biochem.Biophys.294:230；D’Andrea,A.等，1992，实验医学杂志，176:1387)。结果，在减少IL-12的有害作用方面，p40抗体不如异二聚体特异性抗体那样有效，这是因为单独的p40亚单位是无生物活性的，p40抗体趋向于与无活性的p40亚单位而不是与那些是具有生物活性的p75异二聚体的一部分的p40亚单位结合。
甚至仅与p75异二聚体反应的已知抗体也不能有效地中和IL-12生物活性。例如，以前被鉴定的IL-12 p75异二聚体特异性抗体20C2(Chizzonite等，细胞因子，6:A82a(1994)和D’Andrea等，1992，实验医学杂志，176卷1387-1398)基本上不能阻断人IL-12刺激的PHA-激活的淋巴母细胞增殖和IFN-γ的产生。
需要能更有效地中和IL-12生物活性的异二聚体特异性抗体以减少IL-12的有害作用。已知，血清或组织中IL-12水平的增加与自身免疫病的发展进程相关，因此，IL-12抗体是控制具有由免疫机制介导之病理学的疾病，尤其是与异常Th1-型辅助细胞活性相关之疾病的有用的拮抗剂。所述自身免疫病的例子为多发性硬化，包括节段性回肠炎和溃疡性结肠炎的炎性肠疾病(IBD)，风湿性关节炎和自身免疫性糖尿病。施用IL-12抗体能治疗的其它疾病包括移植/移植物-抗宿主疾病和脓毒性休克。
根据本发明，发现从编码p35亚单位的基因和/或编码p40亚单位的基因有缺损的哺乳动物得到的IL-12抗体基本上能中和IL-12生物活性。
根据本发明，使用本文所述的方法首次产生了基本上能中和人IL-12生物活性的抗体。与其它IL-12 p75异二聚体特异性抗体不同的是，本发明的异二聚体特异性抗体至少能中和90％的人IL-12生物活性。另外，本发明的IL-12 p75异二聚体特异性抗体能与猕猴IL-12交叉反应。
本文所述的p75异二聚体特异性IL-12抗体是用于阻断IL-12生物活性以治疗由不需要的IL-12刺激的免疫学反应所介导的疾病的有效治疗剂。本文所述的高度中和的异二聚体特异性IL-12抗体是特别有用的抑制剂，它可抑制IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖并抑制PHA-激活的人淋巴母细胞产生IFN-γ。


图1图示了杂交瘤HIL-12F3-5F2(本文称之为“5F2”)，HIL-12F3-16F2(本文称之为“16F2”)，HIL-12F3-16G2(本文称之为“16G2”)，HIL-12F3-20E11(本文称之为“20E11”)和HIL-12F1-17E2(本文称之为“17E2”)上清液中所含的抗体对125I-标记的人IL-12的捕获(空心柱)。免疫沉淀反应过程中未经标记的人IL-12 p40亚单位的存在(实心柱)不能阻断单克隆抗体5F2,16F2,16G2和20E11捕获125I-标记的人IL-12，这表明这些抗体对单独的IL-12 p40亚单位不具有高的亲和性。
图2显示了p75异二聚体特异性抗人IL-12单克隆抗体20C2,16G2,16F2,20E11和5F2的等电聚焦模式。如图2所示，单克隆抗体20C2,20E11和5F2是独特的免疫球蛋白。等电聚焦显示出单克隆抗体16G2和16F2相同，但都与20C2,20E11和5F2不同。
图3图解显示出p75异二聚体特异性IL-12单克隆抗体20C2(+),16G2(△),16F2(○)，20E11(+)和5F2(▲)抑制天然人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖。测定对天然人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的抑制作用，图3中9940cpm处的水平虚线为缺乏IL-12抗体时0.25ng/ml人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖水平，1480cpm处的水平虚线为PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的背景水平(即缺乏IL-12和IL-12抗体时的水平)。如图3所示，IL-12单克隆抗体16G2(△),16F2(○)，20E11(+)和5F2(▲)至少90％抑制0.25ng/ml人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖。与之形成对照的是，如图3所示，以前已知的20C2(+)抗体基本上不能抑制IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖。
图4图解显示出本发明的p75异二聚体特异性IL-12单克隆抗体16G2(△),16F2(○),20E11(+)和5F2(▲)相对于以前已知的20C2(+)抗体而言抑制猕猴IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的情况。图上方的水平虚线为存在0.5ng/ml猕猴IL-12和缺乏IL-12抗体时淋巴母细胞的增殖水平。图下方的水平虚线为淋巴母细胞增殖的背景水平(即缺乏IL-12和IL-12抗体时的水平)。如图4所示，本发明的抗体是猕猴IL-12刺激的PHA-激活的淋巴母细胞增殖的强有力的抑制剂，相反，20C2(+)抗体对猕猴IL-12刺激的淋巴母细胞增殖仅有最小的抑制作用。
图5图解显示出p75异二聚体特异性单克隆抗体16F2(○),16G2(■),20E11(▲)和5F2(●)和20C2(*)对IFN-γ产生的抑制作用。如图5所示，抗体16F2(○),16G2(■),20E11(▲)和5F2(●)至少90％抑制0.25ng/ml人IL-12刺激的IFN-γ产生。图下方的水平点划线表示缺乏IL-12时IFN-γ产生的背景水平。相反，20C2(*)单克隆抗体对0.25ng/ml人IL-12刺激的IFN-γ产生的抑制作用不超过65％。
图6是编码p75异二聚体特异性16G2抗体重链可变区部分的核苷酸序列及由此核苷酸序列推定的氨基酸序列。
图7是编码p75异二聚体特异性20E11抗体重链可变区部分的核苷酸序列及由此核苷酸序列推定的氨基酸序列。
根据本发明，发现当IL-12抗体由编码p35 IL-12亚单位之基因和/或编码p40 IL-12亚单位之基因有缺损的哺乳动物产生时，得到与IL-12 p75异二聚体的表位选择性地免疫反应的抗体，通过它们与人IL-12 p75异二聚体选择性免疫反应但不与单独的p40亚单位免疫反应的能力可鉴定这些抗体。
与以前已知的IL-12 p75抗体不同，本文所述方法产生的抗体基本上能中和人IL-12的生物活性，即至少中和约90％的人IL-12生物活性。另外，本发明的IL-12 p75异二聚体特异性抗体能与猕猴IL-12交叉反应。
本文所述的IL-12抗体通过在浓度至少约为0.5μg/ml时抑制至少约90％IL-12诱导的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖，和/或在浓度至少约为0.5μg/ml时抑制至少约90％IL-12刺激的由PHA-激活的人淋巴母细胞产生IFN-γ，从而至少中和约90％的人IL-12生物活性。另外，本文所述的抗体可特异性地抑制IL-12(而不是IL-2)诱导的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖。按下述制备PHA-激活的人淋巴母细胞。分离外周血单核细胞(PBMC)(Gately等，J.Natl.Cancer Inst.,69:1245(1982))并用0.1％PHA-P(Difco Labs.,Detroit,MI)刺激。3天后，按Gately,M.K.,Chizzonite,R.和Presky,D.H.，测定人和小鼠的白细胞介素12，免疫学最新方法，第1卷，J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编，John Wiley &Sons公司，纽约，1995,pp6.16.1-6.16.15所述，用新鲜培养基和重组的50U/ml人IL-2将培养物分成1∶1的两份。再保温1天之后，即可使用PHA-激活的淋巴母细胞。
根据本发明，鉴定出IL-12抗体选择性结合p75异二聚体提供的表位，而不与p40亚单位提供的任何表位进行免疫反应的能力。这种选择性是由下述事实所决定的，即本发明的IL-12抗体可在某个极低浓度时与给定量的p75异二聚体单独提供的表位反应，而在该浓度下不与相同给定量该p75二聚体的p40亚单位所提供的表位反应。通过这种方式，本发明的抗体对p75异二聚体单独提供的表位比对p40亚单位提供的任何表位具有更高的亲和性。可以使用任何常规的试验来鉴定抗体与p75异二聚体的选择性结合。通常，在这种试验中，将抗体与人IL-12 p75异二聚体一起保温以确定抗体是否与p75异二聚体结合。也在存在和缺乏p40亚单位时将抗体与人IL-12p75异二聚体一起保温以确定p40亚单位的存在是否阻断抗体结合或捕获p75异二聚体。例如，可使用竞争性免疫沉淀试验(见本文实施例7)来阐明本文所述的抗体与人IL-12 p75异二聚体选择性地免疫反应，而不与单独的p40亚单位进行免疫反应。
根据本发明，通过使用敲除(knock-out)哺乳动物可产生本文所述的IL-12抗体。在敲除哺乳动物中，编码p35亚单位的基因和/或编码IL-12 p40亚单位的基因有缺损，因此，不能表达IL-12 p75异二聚体。当用IL-12 p75异二聚体免疫时，IL-12 p35亚单位缺损和/或IL-12 p40亚单位缺损的敲除哺乳动物能将IL-12 p75异二聚体识别为外来物，从而产生针对其的抗体。优选地，敲除哺乳动物是小鼠。根据本发明，可根据本领域已知的方法产生敲除哺乳动物。通过常规方法，例如通过突变编码p35 IL-12亚单位和/或p40 IL-12亚单位的基因可产生敲除哺乳动物。例如，按Mattner,F.等，欧洲免疫学杂志，26:1553-1559(1996)所述可产生IL-12 p35亚单位基因中带有突变的小鼠。按Magram,J等，免疫力，4:471-481(1996)所述可产生IL-12 p40亚单位基因具有突变的小鼠。
根据本发明，通过本领域已知的任何常规方法，可由上述敲除哺乳动物的激活细胞产生与人IL-12 p75异二聚体选择性免疫反应的多克隆和单克隆抗体。一般地说，通过(a)用人p75异二聚体免疫p35亚单位和/或p40亚单位之编码基因缺损的“敲除”哺乳动物以产生抗体；(b)从经免疫的哺乳动物中得到抗体；和(c)筛选抗体选择性结合p75异二聚体所提供的表位的能力以得到选择性结合的抗体。
一般通过包括下列步骤的方法产生本发明的IL-12单克隆抗体，所述抗体能与人IL-12 p75异二聚体选择性地进行免疫反应(1)用人IL-12 p75异二聚体免疫敲除哺乳动物，例如IL-12 p35亚单位和/或IL-12 p40亚单位之编码基因缺损的小鼠；(2)从经免疫的已被激活的以表达IL-12抗体的敲除哺乳动物中选择细胞，例如脾细胞或淋巴结细胞；(3)将收集的细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；(4)通过例如使用标记或未标记的人IL-12采用ELISA或免疫沉淀法检测杂交瘤条件培养基中抗人IL-12抗体的存在，从而选择可分泌识别人IL-12之抗体的杂交瘤细胞；和(5)通过将抗体与人IL-12 p75异二聚体一起保温以确定抗体是否与p75异二聚体结合，然后在存在和缺乏p40亚单位时将抗体与人IL-12 p75异二聚体一起保温以确定p40亚单位的存在是否阻断抗体结合或捕获p75异二聚体，阐明抗体与p75 IL-12异二聚体之表位免疫反应而不与p40亚单位的任何表位免疫反应，从而测定抗体是否为p75异二聚体特异性的抗体。例如，可使用竞争性免疫沉淀试验(见本文实施例7)阐明本文所述的抗体与人IL-12 p75异二聚体选择性地免疫反应，而不与单独的p40亚单位进行免疫反应。
生产本发明的p75异二聚体特异性IL-12单克隆抗体的方法还可包括测定异二聚体特异性IL-12抗体在任何体外或体内IL-12生物活性检测系统中抑制人和猕猴IL-12生物活性之能力的步骤，所述检测系统如测定IL-12刺激的激活淋巴细胞增殖，IL-12刺激的IFN-γ产生或IL-12刺激的细胞溶解活性增强的试验。
通过本领域已知的标准方法，例如硫酸铵沉淀，亲和层析或离子交换层析可将本发明的抗人IL-12抗体分离成基本上纯的形式。
得到本发明抗体的方法的改变也包括在本发明范围之中。也可使用本领域已知的方法，例如Western印迹，竞争性免疫沉淀试验或交叉-阻断结合试验测定抗体是否为p75异二聚体特异性的抗体。
除小鼠外，也可用IL-12 p75异二聚体免疫IL-12 p35亚单位基因和/或IL-12 p40亚单位基因缺损的其它哺乳动物，如大鼠和兔以产生本文所述的抗体。IL-12 p35亚单位基因和/或IL-12 p40亚单位基因的缺损或突变可以是导致IL-12 p75异二聚体不能表达的任何缺损或突变。另外，可使用任何常规方法得到IL-12 p35亚单位基因和/或IL-12 p40亚单位基因发生突变从而导致IL-12 p75缺损表型的哺乳动物细胞。
根据本发明，通过用天然人IL-12或重组IL-12免疫小鼠或其它哺乳动物可得到激活的哺乳动物细胞，该细胞能表达抗人IL-12 p75异二聚体的抗体。通过本领域已知的任何常规技术，如本文实施例中提供的技术可制备天然人IL-12或重组IL-12。
生产可分泌本发明IL-12抗体的杂交瘤所用的适当的骨髓瘤细胞系，即融合配对物包括本领域众所周知的骨髓瘤细胞系，如SP2/0和NS/O细胞系，优选SP2/0小鼠骨髓瘤细胞。优选骨髓瘤融合配对物和针对IL-12 p75异二聚体被激活的哺乳动物细胞得自相同的种。
通过本领域已知的任何常规方法可选择和分离产生本发明抗体的杂交瘤细胞。优选在含有能杀死骨髓瘤细胞但不能杀死淋巴细胞的选择剂的培养基中同时培养骨髓瘤细胞和针对IL-12 p75异二聚体被激活的淋巴细胞。骨髓瘤细胞与针对IL-12 p75异二聚体被激活的淋巴细胞融合，从而形成杂交瘤。这种杂交瘤细胞能在含有选择剂的培养基中生长，因为淋巴细胞的DNA为骨髓瘤细胞系提供了必需的编码酶的基因，所述酶通过用另一代谢途径替代被选择剂阻断的代谢途径而避免了选择剂的毒性作用。任何未融合的淋巴细胞都会死亡，因为它们未被转化，在体外的寿命短暂而有限。根据本发明，选出杂交瘤细胞所用的适当选择剂是氨基蝶呤。培养杂交瘤细胞的优选培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)，其中添加有10％FBS(Hyclone)，100单位/ml青霉素G(BioWhittaker)，100μg/ml链霉素(BioWhittaker)，250ng/ml Fungizone(BioWhittaker)，2mM谷氨酰胺(BioWhittaker)，100μg/ml硫酸双生霉素(BioWhittaker)，50μM 2-巯基乙醇(BioRad)，100μM次黄嘌呤(Sigma)，400nM氨基蝶呤(Sigma)，16μM胸苷(sigma)和2.5％P388D1上清液(按Nordan,R.P等，免疫学杂志，139:813(1987)所述制备)。
通过IL-12刺激的人淋巴母细胞增殖或IFN-γ产生试验测出IL-12抗体50％最大抑制IL-12生物活性时的浓度，以该浓度确定本发明IL-12抗体的效力。本发明的抗人IL-12抗体表现出比以前鉴定的异二聚体特异性IL-12抗体更高的效力。另外，通过测定对IL-12刺激的淋巴细胞增殖或IFN-γ产生的最大抑制程度，发现本发明的抗人抗体表现出比以前鉴定的异二聚体特异性IL-12抗体更高的效力。
通过本领域已知的任何常规试验，例如IL-12诱导的淋巴母细胞增殖试验或IFN-γ合成试验可测定本文所述抗体的效力和潜力。
根据本发明，可使用本领域已知的任何常规方法测定IL-12抗体对人IL-12刺激的淋巴母细胞增殖的抑制作用。一般地说，通过很多种方法可激活人淋巴细胞，包括单独或组合使用促分裂凝集素，如植物凝集素A(PHA)或其它激活剂，例如细胞因子，佛波酯和离子载体，针对细胞表面分子的抗体进行处理，或导致淋巴细胞激活的任何其它方法。在缺乏或存在抗体时，将激活的淋巴细胞与和不与IL-12一起保温，通过测定DNA中3H-胸苷的掺入以确定DNA合成的速率，通过计数多个处理阶段过后存在的细胞数目，或通过可用于监测细胞增殖速率的任何其它方法来测定淋巴细胞增殖的速率。通过在缺乏和存在多种浓度抗IL-12抗体时比较确定浓度的IL-12诱导的淋巴细胞的增殖来测定对增殖的抑制作用。
在标准的淋巴细胞增殖试验中，在没有加入任何抗体，也没有PHA-激活的人淋巴母细胞增殖背景水平，即在缺乏IL-12和抗体的情况下增殖时，针对人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的水平来测定对人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的抑制作用。一般说来，在我们的标准人淋巴细胞增殖试验中，IL-12刺激的增殖水平约产生10,000-80,000cpm，增殖的背景水平约产生5,000-20,000cpm。由于由IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞各批间固有的差异，只有其中经刺激的增殖与背景增殖的比率(即刺激指数)等于或大于3的试验才能有效测定IL-12刺激的增殖。
根据本发明，可使用任何常规方法测定IL-12抗体对IFN-γ产生的抑制作用。例如，在缺乏和存在抗体的情况下，将按本文所述制备的激活的人淋巴细胞，或激活的人外周血单核细胞(PBMC)与或不与IL-12和多种其它试剂，如IL-12和/或IL-1β一起保温，所述激活的人PBMC是通过单独或联合使用包括凝集素的促分裂剂，细胞因子，佛波酯，离子载体或针对细胞表面分子的抗体处理全血或分离的PBMC，或导致激活的人PBMC产生的任何其它方法制备的。然后通过例如对培养基取样并用ELISA或可定量检测IFN-γ的任何其它方法测定IFN-γ的浓度即可测定IFN-γ的产生。通过在缺乏和存在多种浓度的抗IL-12抗体的情况下比较确定浓度的IL-12下的IFN-γ产生来测定对IFN-γ产生的抑制作用。
在标准的IFN-γ合成试验中，针对IL-12刺激的IFN-γ产生和IFN-γ产生的背景水平，即存在或缺乏IL-12下的IFN-γ合成来测定对IFN-γ的抑制作用。一般说来，IL-12刺激的IFN-γ产生的水平约为7-220ng/ml，IFN-γ产生的背景水平约为1-3ng/ml。
本文所述的抗体中和猕猴IL-12生物活性的效力与抑制人IL-12生物活性的效力类似，因此使它们可用作猕猴体内研究的IL-12拮抗剂。这些抗人IL-12抗体增加的效力和潜能及其与猕猴IL-12的交叉反应性使其成为设计有效的人用IL-12拮抗剂时极好的候选者。
具体地说，本发明提供了4种抗体，即针对人IL-12 p75异二聚体的5F2,16F2,16G2和20E11。根据布达佩斯条约的规定，已于1997年12月11日将产生这些抗体的相应杂交瘤细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，它们的ATCC保藏号分别为HB-12446,HB-12447,HB-12449和HB-12448。然而，本发明并不仅限于这4种抗体。具有本文所述特性的任何抗体都包含在本发明中。
图6提供了编码p75异二聚体特异性16G2抗体的重链可变区部分的核苷酸序列和由此核苷酸序列推定的氨基酸序列。图7提供了编码p75异二聚体特异性20E11抗体的重链可变区部分的核苷酸序列和由此核苷酸序列推定的氨基酸序列。本领域技术人员应理解对本文所述异二聚体特异性IL-12抗体的恒定区可进行保守的氨基酸改变而不会显著影响抗原结合特异性/亲和性。可变框架区或更具体地为互补决定区中含有氨基酸变化的异二聚体特异性IL-12抗体有望对抗原结合特异性/亲和性产生更大的影响。
本发明的IL-12抗体可以是包括两个全长重链和两个全长轻链的完整抗体。或者，IL-12抗体也可以是构建体，例如保留与IL-12 p75异二聚体的一个或多个表位的结合活性的单链抗体或“微型”抗体。通过本领域已知的方法可制备这种构建体，所述方法如PCR介导的克隆和装配单链抗体以在大肠杆菌中表达(描述于抗体工程，实验方法系列，J.McCafferty,H.R.Hoogenboom和D.J.Chiswell编，牛津大学出版社，1996)。在这种类型的构建体中，抗体分子重链和轻链的可变区是由cDNA经PCR扩增得到的。然后在第二个PCR步骤中，通过编码由氨基酸GLY和SER组成的柔性蛋白质接头的接头DNA来装配所得的扩增子。该接头能使可变的重链和轻链部分以特定的方式折叠，从而使抗原结合袋再生，抗原结合亲和性经常与亲本全长二聚体免疫球蛋白分子差不多。
本文所述的抗人IL-12抗体可被人源化以形成对IL-12 p75异二聚体的亲和性与哺乳动物抗人IL-12抗体相同或基本上类似，但对人基本上无免疫原性的抗体。例如，本发明的人源化IL-12抗体包括人抗体的重链和轻链构架区。优选人源化抗体构架区的氨基酸序列与供体构架区约60％至95％相同。通过本领域众所周知的重组技术可产生人源化抗体。产生人源化免疫球蛋白的方法描述于例如美国专利5530101中。
本发明的IL-12抗体是有用的拮抗剂，其可用于控制具有由免疫机制介导之病理学的疾病，尤其是与由导致异常Th1-型辅助细胞活性的增加的IL-12生物活性相关之疾病。根据本发明，IL-12抗体可用于治疗人或其它哺乳动物的自身免疫病，例如多发性硬化，风湿性关节炎，自身免疫性糖尿病和包括节段性回肠炎和溃疡性结肠炎的炎性肠疾病(IBD)。本文所述的抗体也可用于治疗其它疾病，包括例如移植/移植物-抗宿主疾病和脓毒性休克，这些疾病通过施用IL-12抗体是能治疗的。
本领域技术人员无需进行过度的实验即可确定施用本文IL-12抗体的剂量范围。通常，适当的剂量应大到足以能产生所需的效果，即中和至少90％IL-12生物活性。然而，剂量也不应大到导致不良副作用，如不需要的交叉反应，过敏性反应等的程度。一般说来，剂量随患者年龄，身体状况，性别和疾病严重程度，禁忌症，(如果有的话，还随)免疫耐受性和可由各个医生调整的其它这类变量的不同而不同。
可通过注射或逐渐灌流非肠道施用IL-12抗体。给药方式为静脉内，肌内或皮下。非肠道给药的制剂包括无菌或含水或不含水的溶液，悬浮液和乳化液。不含水溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液，乳化液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道给药的载体包括氯化钠溶液，林格葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化林格溶液或固定油。静脉内给药的载体包括流体和营养补充物，电解质补充物，如基于林格葡萄糖的那些补充物等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，惰性气体等。例见Remington药物科学，第16版，Mack编，1980。
本发明IL-12抗体的优选剂量约为0.1mg/kg至10mg/kg，每周2至3次。然而，施用本文IL-12抗体的剂量和剂量计划度将根据治疗的个体，施用的抗体和上文讨论的变量而变化。根据本发明，可单独或与其它治疗活性剂联合施用IL-12抗体。
实施例实施例1制备天然人IL-12用含有无防腐剂肝素(Sigma,St.Louis,MO,USA)的注射器从正常自愿供体体内抽血至终浓度约为5个单位肝素/ml血液。将1个体积的含肝素血液稀释到9个体积的培养基中，所述培养基由RPMI 1640和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基按1∶1混合而成，其中添加有0.1mM非必需氨基酸，60μg/ml精氨酸HCl，10mM HEPES缓冲液，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素(都得自GIBCO BRL,Grand Island,NY,USA)，50μM 2-巯基乙醇(Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ,USA)和1mg/ml葡萄糖(Fisher)。向此混合物中加入人干扰素-γ，20U/ml(PeproTech,Inc.,Rocky Hill,NJ,USA)和最终稀释度为1/4000的Pansorbin细胞(加福尔马林的金黄色葡萄球菌，Cowan菌株；Calbiochem,San Diego,CA,USA)。(使用前用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(GIBCO BRL)将Pansorbin细胞洗2次，并重建至与厂商提供的相同的体积)。将所得细胞悬浮液以80ml/瓶等分至162cm2组织培养瓶(Costar,Cambridge,MA,USA)中，37℃在含5％CO2/95％空气的潮湿空气中水平保温培养瓶24小时。然后离心收集培养物上清液，穿过0.22μm滤器(Costar)过滤除菌。通过免疫亲和层析从培养物上清液中纯化IL-12异二聚体+IL-12 p40，所述层析与下文所述的纯化猕猴IL-12的相同之处是都使用了2-4A1 G蛋白sepharose(PGS)柱，不同之处是本洗脱缓冲液含有0.01％明胶(Sigma)以使与表面非特异性吸附所致的蛋白质损失降至最小。将洗脱液对100至200体积的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水透析4至6小时，然后对相同体积的含有100μg/ml双生霉素的RPMI 1640透析过夜。使经透析的洗脱液穿过0.22μm滤器过滤除菌，通过ELISA检测IL-12异二聚体和IL-12 p40的含量(Gately,M.K.,Chizzonite,R和Presky,D.H.,测定人和小鼠的白细胞介素12，免疫学最新方法，第1卷，J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编，John Wiley &Sons公司，纽约，1995,p6.16.1-6.16.15)和IL-12生物活性(文献同上)。通常，由ELISA测定的IL-12 p40:IL-12异二聚体的重量比约为5∶1。
实施例2
生产重组人IL-12按美国专利5536657所述制备，鉴定和产生重组人IL-12。
实施例3产生猕猴IL-12使用标准方法(分子生物学最新方法，F.Ausubel编，J.Wiley和Sons,Inc.,纽约(1993))改造猕猴IL-12 p35和p40亚单位cDNA序列(F.Villinger等，免疫学杂志，155:3946-3954(1995))以在CHO-dhfr-细胞中，在两个独立的质粒上进行表达。克隆得自未扩增的细胞群体，通过IL-12特异性ELISA监测其IL-12的产生。选择最佳生产克隆，使其适应在CHO无血清培养基(Sigma)中的生长。随后以旋动培养生长细胞以生产蛋白质。通过抗体亲和层析从上清液中纯化猕猴IL-12。通过以1mg mAb/ml凝胶的密度将10mg抗人IL-12 p40 mAb 2-4A1(Chizzonite等，免疫学杂志，147:1548-1556(1991))与G蛋白Sepharose(Pharmacia Biotech)使用10mM二甲基pimelimidate(Pierce,Rockford,IL,USA)交联以产生亲和柱(Stern和Podlaski，蛋白质化学技术，Ⅳ,Acad.Press，纽约，353-360(1993))。穿过0.2μm滤器过滤含有猕猴IL-12的无血清CHO上清液，将其直接上样于10ml预先用PBS pH7.2平衡过的2-4 A1 PGS柱，流速为1ml/分钟，用10倍体积的PBS洗涤柱，用0.1M甘氨酸-HCl,0.15M NaCl,pH3.0洗脱柱。立即用3M Tris-HCl,pH9中和洗脱物，经Bradford和SDS-PAGE测定，亲和柱每轮能与约2mg猕猴IL-12，包括过量的p40单体结合。其它污染物为痕量水平。为了浓缩并进一步纯化猕猴IL-12，用20mM磷酸钠，pH7透析含有IL-12的洗脱物，将其上样于用相同缓冲溶液调整过的S-Sepharose柱，流速为1ml/分钟，所有蛋白质都被结合。用10倍体积的磷酸盐缓冲液洗涤柱，然后用含有0.3M NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱柱。使用LAL试剂盒(Biowittaker)检测洗脱收集物的内毒素，发现其＜10EU/mg蛋白质。使用mAb 2-4 A1作为检测试剂的Western印迹分析显示出约80KDa处的猕猴IL-12异二聚体以及40KDa处明显过量的p40单体。考马斯蓝染色的SDS-PAGE显示出在约70KDa处与p80异二聚体强度相同的另一种重要蛋白质。用2-巯基乙醇处理之后，80和70KDa蛋白质都还原为其单体形式，但后一蛋白质带不与mAb 2-4A1反应。
实施例4制备，鉴定和纯化杂交瘤抗体按Mattner，F.等，欧洲免疫学杂志，26:1553-1559(1996)所述生产在Balb/c背景上携有IL-12 p35亚单位基因突变的小鼠。用5微克溶于完全弗氏佐剂中的纯化的重组人IL-12腹膜内免疫IL-12 p35-缺损小鼠。在2.5个月期间，小鼠又接受了3次随后的腹膜内加强注射，每次为5微克溶于不完全弗氏佐剂中的人IL-12。脾摘除术前3和2天注射溶于PBS中的75微克人IL-12(50微克腹膜内，25微克静脉内)，脾摘除术前1天腹膜内注射50微克溶于PBS中的人IL-12。收集这些小鼠的脾细胞，根据Oi和Herzenberg，细胞免疫学选择方法，B.Mishell和S.Shiigi编，W.H.Freemanand Co.,纽约，1980,pp351-372中的方法，使用50％w/v聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)，按1∶1的比例将脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合。将融合细胞以60,000个总细胞/孔的密度铺于96孔聚簇板中的IMDM培养基内，所述培养基中添加有10％FBS(Hyclone)，100单位/ml青霉素G(BioWhittaker),100μg/ml链霉素(BioWhittaker),250ng/mlFungizone(BioWhittaker),2mM谷氨酰胺(BioWhittaker)，100μg/ml硫酸双生霉素(BioWhittaker)，50μM 2-巯基乙醇(BioRad)，100μM次黄嘌呤(Sigma)，400nM氨基蝶呤(Sigma)，16μM胸苷(Sigma)和2.5％P388D1上清液(按Nordan,R.P等，免疫学杂志，139:813(1987)所述制备)。通过下文所述的125I-标记的人IL-12抗体免疫沉淀试验检测杂交瘤上清液中特异性的抗人IL-12抗体。通过有限稀释克隆分泌抗人IL-12抗体的杂交瘤细胞系。通过按Reik,L.等，免疫学方法杂志，100:123-130(1987)所述依次用辛酸和硫酸铵处理，从腹水中纯化抗体。
实施例5制备125I-标记的人IL-12使用以前描述于Chizzonite等，免疫学杂志，147:1548-1556(1991)和Chizzonite等，免疫学杂志，148:3117-3124(1992)(皆列入本文作为参考)的Iodogen(Pierce Chemical Co.)改良方法放射性标记重组人IL-12，使其比活约为2200Ci/mmol。将Iodogen溶解于氯仿中，将0.05mg在12×15mm硼硅酸盐玻璃管中干燥。为了进行放射性标记，向含有0.05ml Tris-碘化缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.5,0.4M NaCl和1mM EDTA)的经Iodogen-包被的管中加入1.0mCi Na[125I](Amersham,Chicago,Ill.,USA)，并于室温下保温6分钟。将激活的125I溶液转移至含有0.1ml溶于Tris-碘化缓冲液的IL-12(31.5μg)的管中，室温下保温反应6分钟。保温结束时，加入0.05ml Iodogen终止缓冲液(含10mg/ml酪氨酸，10％甘油的Dulbecco氏PBS,pH7.40)并反应5分钟。然后用1.0ml含1％(w/v)BSA的Tris-碘化缓冲液稀释混合物，上样于Bio-Gel P10DG脱盐柱(BioRad Laboratories(BRL))进行层析。用含1％(w/v)BSA的Tris-碘化缓冲液洗脱柱，将含有峰量标记蛋白质的级分(1ml)混合，用含1％(w/v)BSA的Tris-碘化缓冲液稀释至1×108cpm/ml。TCA可沉淀的放射性(10％TCA终浓度)一般是总放射性的95％以上。重组人IL-12的放射性比活一般约为2200Ci/mmol。
实施例6125I标记的人IL-12的免疫沉淀试验通过在4℃下，与100μl/孔含5μg/ml兔抗小鼠IgG的碳酸盐包被缓冲液(15mM Na2CO3/35mM NaHCO3)，pH9.6保温18小时，籍此用针对小鼠IgG的兔亲和纯化抗体(Cappel,Durham,NC,USA)包被Nunc Maxisorp 96-孔break-apart培养板。用PBS/0.05％吐温-20/0.01％乙基汞硫代水杨酸钠洗涤经包被的孔，然后于37℃与200μl 1％(w/v)BSA/PBS/0.01％乙基汞硫代水杨酸钠保温4小时以封闭这些孔。向抗小鼠IgG-包被的孔中加入杂交瘤上清液(75μl)，在22℃保温3小时。用300μl PBS/0.05％吐温-20/0.01％乙基汞硫代水杨酸钠将孔洗涤3次，向含100μl抗体稀释缓冲液(PBS/1％BSA(w/v)/0.5MNaCl/0.05％吐温-20/0.01％乙基汞硫代水杨酸钠)的每个孔中加入100,000cpm125I-标记的人IL-12。4℃保温18小时后，用200μl PBS/0.05％吐温-20/0.01％乙基汞硫代水杨酸钠将孔洗涤3次，然后将孔分开，使用γ计数器测定与孔结合的放射性的量。在一些实验中，在兔抗小鼠IgG-包被的孔中保温杂交瘤上清液之后，37℃，将100μl按Gubler等，Proc.Natl.Acad.Sci.88:4143-4147(1991)所述制备的得自经人IL-12 p40-转染的COS细胞的调整(conditioned)上清液在孔中保温1小时，然后加入125I-标记的人IL-12以测定捕获的小鼠抗人IL-12抗体是否与人IL-12 p40亚单位结合。
实施例7鉴定单克隆的抗人IL-12抗体使用基于96孔培养板的免疫沉淀试验来鉴定分泌抗人IL-12抗体的杂交瘤。在缺乏和存在100μl含有上述人IL-12 p40亚单位的COS细胞上清液时保温杂交瘤上清液。加入125I-标记的人IL-12(100,000cpm/孔)，测定捕获至孔上的125I-标记的人IL-12的量。图1显示出捕获125I-标记的人IL-12的杂交瘤5F2,16F2,16G2,20E11和17E2上清液中所含的抗体。另外，免疫沉淀反应过程中未经标记的人IL-12 p40亚单位的存在不能阻断抗体5F2,16F2,16G2和20E11捕获125I-标记的人IL-12，这表明这些抗体对单独的IL-12 p40亚单位不具有高亲和性。与之形成对照的是，免疫沉淀反应过程中未经标记的人IL-12 p40亚单位的存在完全阻断了17E2捕获125I-标记的人IL-12，这表明17E2识别人IL-12的p40亚单位。
实施例8抗人IL-12单克隆抗体的分析等电聚焦使用Pharmacia Biotech的pH3.5-9.5 Ampholine PAGplate(编号为80-1124-80,Uppsala，瑞典)进行分析等电聚焦。根据厂商说明，使用1M磷酸和1N氢氧化钠电极溶液进行等电聚焦。将5个样品上样于凝胶，每份样品含有单个免疫球蛋白，即20E11,5F2,20C2,16G2和16F2。标准得自Pharmacia Biotech的等电聚焦pH3-10校准试剂盒(编号为17-0471-01)。电泳条件为1000伏，10瓦，2.5小时，4℃。使用Pharmacia Biotech的PlusOne蛋白质银染试剂盒(编号为17-1150-01)，根据厂商说明银染凝胶。图2显示出抗人IL-12单克隆抗体20C2,16G2,16F2,20E11和5F2的等电聚焦模式。
实施例9抗人IL-12单克隆抗体的等电聚焦模式如图2所示，单克隆抗体20C2(Chizzonite等，细胞因子，6:A82a(1994))，20E11和5F2是独特的免疫球蛋白。单克隆抗体16G2和16F2的等电聚焦模式相同，但它们与20C2,20E11和5F2都不同。这些抗体的pI范围为pH5-6。
实施例10产生PHA-激活的淋巴母细胞使用PHA-激活4天的人外周血单核细胞(PBMC)测定天然人IL-12-诱导的和猕猴IL-12-诱导的增殖。分离PBMC(Gately等，J.Natl.Cancer Inst.,69:1245(1982))并用0.1％PHA-P(Difco Labs.,Detroit,MI,USA)进行刺激。3天后，按上述用新鲜培养基和重组50U/ml人IL-12将培养物按1∶1分开(Gately,M.K.,Chizzonite,R.和Presky,D.H.,测定人和小鼠的白细胞介素12，免疫学最新方法，第1卷，J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编，John Wiley & Sons公司，纽约，1995,p6.16.1-6.16.15)。细胞培养所用的补加培养基为先前所述的用于产生天然人IL-12的培养基加上5％人AB血清(Irvine scientific,Santa Ana,CA,USA)。
实施例11淋巴细胞增殖试验通过基于M.K.Gately等人(Gately,M.K.,Chizzonite,R.和Presky,D.H.,测定人和小鼠的白细胞介素12，免疫学最新方法，第1卷，J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编，John Wiley &Sons公司，纽约，1995,p6.16.1-6.16.15)的方法测定多种抗人IL-12单克隆抗体对IL-12-和IL-2-刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖的作用。收集按上述制备的PHA-激活4天的淋巴母细胞，将其洗涤并重新悬浮于补加培养基中至4×105个细胞/ml，在96孔培养板中(2×104个细胞/孔)与纯化的单克隆抗人IL-12抗体和相关细胞因子，即人或猴IL-12保温。将25μl天然人IL-12(1ng/ml)或猴IL-12(2ng/ml)的等分试样与25μl多种稀释度的抗人IL-12单克隆抗体(mAb)等分试样混合。孔中最终的抗体浓度为0.0005μg/ml至0.5μg/ml。制备独立的相同套的含有多种抗人IL-12 mAb和重组IL-2的孔以测定抗人IL-12 mAb对IL-2-刺激的增殖的作用作为抑制特异性的量度。还包括分别为250pg或500pg至0pg(未加入抗体)/孔人或猴IL-12的标准剂量反应曲线以测定IL-12的反应性。37℃将含有细胞因子和抗体之混合物的培养板保温30分钟，然后向每孔中加入50μl细胞悬浮液等分试样。将培养板维持在37℃，含5％CO2的潮湿空气氛中达48小时，然后进行3H-胸苷脉冲。向每孔中加入50μl 10μCi/ml3H-胸苷(用含5％FCS而不是5％人AB血清的补加培养基稀释)。37℃再保温6小时之后，经由细胞收集器将孔中的内容物收集至玻璃纤维滤器上，使用液体闪烁计数器测定细胞DNA中掺入的3H-胸苷。图3和4中所示的数值是3个平行试验孔中的平均值。
实施例12通过单克隆抗人IL-12抗体抑制细胞因子-刺激的PHA-激活的淋巴母细胞增殖抗体5F2,16F2,16G2和20E11以依赖于剂量的形式抑制0.25ng/ml IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母细胞增殖(图3)。这些抗人抗体的效力，定义为对0.25ng/ml IL-12刺激的增殖产生50％最大抑制作用(IC50)的浓度为5F2 0.03μg/ml,16F2 0.01μg/ml,16G2 0.01μg/ml和20E11 0.01μg/ml。淋巴母细胞增殖的最大(9440cpm)和背景(1480cpm)水平分别由图中上方和下方的水平虚线表示。如图3所示，5F2,16F2,16G2和20E11抗体能够至少90％抑制人IL-12刺激的PHA-激活的人淋巴母细胞增殖。与之形成对照的是，如图3所示，以前鉴定的抗人IL-12p75特异性抗体20C2(Chizzonite等，细胞因子，6:A82a(1994))基本上不能抑制人IL-12生物活性。
另外，如图4所示，5F2,16F2,16G2和20E11能有效抑制0.5ng/ml猕猴IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母细胞增殖，其IC50与在人IL-12-刺激的增殖中所见的类似。与之形成对照的是，20C2对猕猴IL-12-刺激的增殖仅有极小的抑制作用。因此，抗体5F2,16F2,16G2和20E11对猕猴IL-12表现出良好的交叉反应性，而20C2的交叉反应性则低得多。这些单克隆抗体都不能抑制IL-2诱导的增殖，这表明它们对IL-12-刺激的增殖的作用是IL-12特异性的，而不是由于对细胞增殖的一般性抑制作用。
实施例13γ干扰素合成试验使用按上述制备的PHA-激活4天的人淋巴母细胞诱导γ干扰素(IFN-γ)合成。所用培养基为RPMI1640和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基1∶1的混合物，其中的添加物与上述制备天然人IL-12所用的相同，另外还含有5％热-灭活(56℃,30分钟)胎牛血清(Hyclone,Logan,UT,USA)以替代人AB血清。在24孔组织培养板(Costar)的孔中建立双份1ml培养物。向每孔中加入5×105个PHA-激活的淋巴母细胞，0.25ng/ml纯化的天然人IL-12,20单位/ml重组人IL-12,1ng/ml重组人IL-1β(由Dr.R.Chizzonite,Hoffmann-La Roche提供)，和指定浓度的抗人IL-12抗体。起初将除淋巴母细胞外的所有试剂加入孔中并于37℃保温30分钟，接着加入淋巴母细胞。于37℃，在含5％CO2的潮湿空气氛中将培养物保温24小时。保温结束时，离心收集培养物上清液，使用ELISA检测其IFN-γ含量。含有淋巴母细胞与IL-2+IL-1而不是IL-12的培养物中产生的IFN-γ量总是比除了含有IL-2+IL-1还含有0.25ng/ml IL-12的培养物产生的IFN-γ量低15％，通常低5％。
检测人IFN-γ的ELISA使用了Endogen(Woburn,MA)的单克隆抗人IFN-γ抗体。4℃，用100μl/孔含1μg/ml抗人IFN-γ(Endogen #M-700A)的包被缓冲液(含15mM Na2CO3+35mM NaHCO3的蒸馏水，pH9.6)将Nunc EIA板(Fisher)包被过夜。第2天早晨，从孔中弹出(flicked out)包被缓冲液，每孔加入200μl含有1％牛血清白蛋白(Sigma)的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS；Fisher)以封闭孔。室温下保温1小时之后，用含有0.05％吐温20(Sigma)的D-PBS洗涤板，向孔中加入100μl重组人IFN-γ标准(Endogen)或用检测缓冲液(D-PBS+0.5％牛血清白蛋白+0.05％吐温20)稀释的培养物上清液等分试样。室温下将培养板振荡保温2小时，然后再次洗涤板，向每孔中加入100μl含有300ng/ml生物素化抗人IFN-γ(Endogen #M-701-B)的检测缓冲液。37℃保温培养板1小时，接着进行洗涤。然后向每孔中加入100μl用检测缓冲液按1∶1000稀释的链霉亲和素-过氧化物酶(Sigma)等分试样，37℃将培养板保温30分钟。再次洗涤培养板，然后加入100μl TMB过氧化物酶底物和过氧化物酶B溶液(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD,USA)的1∶1的混合物等分试样以显色。约12分钟之后通过加入50μl/孔1M H3PO4而终止反应，减去650nm处的背景读出450nm处的吸收值。
实施例14通过单克隆抗人IL-12抗体抑制细胞因子-刺激的IFN-γ产生抗体5F2,16F2,16G2和20E11以依赖于剂量的形式抑制0.25ng/ml人IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母细胞产生IFN-γ(图5)。这些抗人抗体的效力，定义为对0.25ng/ml人IL-12刺激的IFN-γ产生具有50％最大抑制作用(IC50)的浓度为5F2 0.02μg/ml,16F2 0.02μg/ml,16G2 0.01μg/ml和20E110.02μg/ml。当以浓度为0.5μg/ml使用时，这些抗人异二聚体特异性IL-12抗体抑制大于90％IL-12刺激的IFN-γ产生。与之形成对照的是，以前鉴定的抗人IL-12 p75特异性抗体20C2(Chizzonite等，细胞因子，6:A82a(1994))效力较差，在浓度低于或等于0.5μg/ml时，对IL-12刺激的IFN-γ产生的抑制作用不超过65％。
实施例15产生抗人IL-12抗体的杂交瘤细胞系中存在的抗体重链可变区的编码基因的序列分析使用Ultraspec RNA分离系统，根据厂商说明(Biotecx,Houston,TX,USA)从杂交瘤细胞中提取总RNA。在20μl体积中由10μg总RNA和寡-dT引物合成第一链cDNA。将4μl cDNA反应混合物等分试样用作PCR扩增小鼠IgG重链可变区时所用的模板，所述PCR使用的引物是根据Dattamajumdar等(A.K.Dattamajumdar等，免疫遗传学43:141-151(1996))报道的构架1和4的序列资料设计的。使用50℃为退火温度进行30轮PCR反应。苯酚提取，乙醇沉淀整个PCR反应产物，在1％低融点琼脂糖凝胶上进行以分离扩增子。从凝胶上切下DNA片断，于70℃融化，取5μl再次在30轮PCR反应中进行扩增以产生更多的产物。凝胶纯化再次扩增的扩增子，使用基于荧光的Sanger测序法，用Applied Biosystems Incorporated自动测序仪进行测序。
实施例16单克隆抗人IL-12抗体重链可变区的核苷酸序列和推定的氨基酸序列由杂交瘤细胞系HIL-12F3-16G2和HIL-12F3-20E11产生IL-12抗体，包含该抗体的构架区(FR)1，互补决定区(CDR)1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4的免疫球蛋白重链基因可变区部分的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列分别示于图6和图7。下划线的是CDR序列。可利用的序列资料的比较显示出杂交瘤HIL-12F3-16G2和HIL-12F3-20E11产生的抗体的重链在DNA水平上表现出94％的同源性，在氨基酸水平上表现出93％的相似性。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名F.Hoffmann-La Roche AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)州BS(E)国家瑞士(F)邮政编码(ZIP)CH-4002(G)传真061-6881395(H)电报962292/965542 hlr ch(ⅱ)发明题目抗人IL-12抗体(ⅲ)序列数4(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release # 1.0,Version # 1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1.321(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CTG GAG GAG TCA GGA CCT AGC CTC GTG AAA CCT TCT CAG ACT CTG TCC 48Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser1 5 10 15CTC ACC TGT TCT GTC ACT GGC GAC TCC ATC ACC AGT GGT TAC TGG AAC 96Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn20 25 30TGG ATC CGG AAA TTC CCA GGG AAT AAA TTT GAG TAC ATG GGA TTC ATA 144Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Phe Glu Tyr Met Gly Phe Ile35 40 45AGT TAT AGT GGT AGC ACT TAC AAT AAT CCA TCT CTC AAA AAT CGA GTC 192Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val50 55 60TCC ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAT AAC CAG TAC TAC CTG CAG TTG AGT 240Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Ser65 70 75 80TCT GTG ACT ACT GAG GAC TCA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA TCT TCG 288Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser85 90 95GAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC GCA GGG ACC ACG 321Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr100 105(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Leu Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser15 10 15Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn20 25 30Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Phe Glu Tyr Met Gly Phe Ile35 40 45Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val50 55 60Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln Leu Ser65 70 75 80Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser85 90 95Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr100 105(2)SEQ ID NO:3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度308个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..306(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3GAG GAG TCA GGA CCT AGC CTC GTG AAA CCT TCT CAG ACT CTG TCC CTC 48Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu1 5 10 15ACC TGT TCT GTC ACT GGC GAC TCC ATC ACC AGT GGT TAC TGG AAC TGG 96Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn Trp20 25 30ATC CGG AAA TTC CCA GAT AAT ACA CTT GAG TAC ATG GGA TAC ATA AGT 144Ile Arg Lys Phe Pro Asp Asn Thr Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Ile Ser35 40 45TAC AGT GGT AGT ACT TAC TAC AAT CCA TCT CTC AGA AGT CGA ATC TCC 192Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Ile Ser50 55 60ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAG AAC CAG TAC TCC ATG CAG TTG AAT TCT 240Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Met Gln Leu Asn Ser65 70 75 80GTG ACT ACT GAG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA AGA TCC TCG GAT 288Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Asp85 90 95GCT ATG GAC TAC TGG GGC GC 308Ala Met Asp Tyr Trp Gly100(2)SEQ ID NO:4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度102个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Glu Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu1 5 10 15Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Trp Asn Trp20 25 30Ile Arg Lys Phe Pro Asp Asn Thr Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Ile Ser35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Ile Ser50 55 60Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Met Gln Leu Asn Ser65 70 75 80Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Asp85 90 95Ala Met Asp Tyr Trp Gly100
权利要求
1．由p35亚单位和p40亚单位组成的人IL-12 p75异二聚体抗体，其中所述抗体(a)与人IL-12 p75异二聚体提供的表位发生免疫学反应，但不与所述p40亚单位提供的任何表位发生免疫学反应；和(b)由哺乳动物产生，优选由编码IL-12的所述p35亚单位或p40亚单位之基因缺损的小鼠产生。
2．由形成p75异二聚体的p35亚单位和p40亚单位组成的人IL-12单克隆抗体，其中所述单克隆抗体(a)与人IL-12 p75异二聚体提供的表位发生免疫学反应，但不与所述p40亚单位提供的任何表位发生免疫学反应；和(b)中和至少约90％人IL-12的生物活性。
3．权利要求2的抗体，其中抗体通过抑制IL-12刺激的PHA激活的人淋巴母细胞增殖而至少中和约90％人IL-12的生物活性，其中所述抗体的浓度为0.5μg/ml，所述人IL-12的浓度为0.25ng/ml。
4．权利要求2的抗体，其中抗体通过抑制IL-12刺激的IFN-γ产生而至少中和约90％人IL-12的生物活性，其中所述抗体的浓度为0.5μg/ml，所述人IL-12的浓度为0.25ng/ml。
5．权利要求1至4之任一项的抗体，其中抗体与猕猴IL-12交叉反应。
6．权利要求1至5之任一项的抗体，其中抗体由小鼠的细胞系产生。
7．权利要求1至6之任一项的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
8．权利要求1至7之任一项的抗体，其中抗体由杂交瘤产生，尤其是ATCC保藏号为HB-12446,HB-12447,HB-12448或HB-12449的杂交瘤产生。
9．权利要求1至8之任一项的抗体，其中抗体是人源化的。
10．产生权利要求1至9之任一项所述抗体的杂交瘤。
11．含有权利要求1至9之任一项所述抗体中的至少一种的药物组合物。
12．产生与由p35亚单位和p40亚单位组成的人IL-12 p75异二聚体选择性免疫反应之抗体的方法，所述方法包括步骤(a)用人IL-12 p75异二聚体免疫编码所述p35亚单位或所述p40亚单位之基因缺损的哺乳动物以产生抗体；(b)从经免疫的哺乳动物中得到抗体；(c)筛选所述抗体选择性结合由p75异二聚体所提供的表位的能力以得到所述的选择性结合的抗体。
13．产生与由p35亚单位和p40亚单位组成的人IL-12 p75异二聚体选择性免疫反应之单克隆抗体的方法，所述方法包括步骤(a)用人IL-12 p75异二聚体免疫编码所述p35亚单位或所述p40亚单位之基因缺损的哺乳动物；(b)从经免疫的哺乳动物中收集产生抗体的细胞；(c)由所述细胞形成生产单克隆抗体的杂交瘤并得到所述单克隆抗体；(d)筛选由所述杂交瘤产生的所述单克隆抗体选择性结合到p75异二聚体所提供的表位上的能力以得到所述的选择性结合的单克隆抗体。
14．权利要求13的方法，其中进一步筛选和选择杂交瘤所产生的抗体与猕猴IL-12交叉反应的能力。
15．由权利要求12至14中任一项所述方法或包含权利要求12至14中任一项所述方法之方法所产生的权利要求1至9中任一项所述的抗体。
16．权利要求1至9中任一项所述的抗体为治疗活性剂。
17．权利要求1至9中任一项所述的抗体在制备药物中的用途，所述药物可控制具有由免疫机制介导之病理学的疾病，尤其是与导致异常Th1-型辅助细胞活性的IL-12生物活性增加相关之疾病，如自身免疫病，例如多发性硬化，风湿性关节炎，自身免疫性糖尿病，包括节段性回肠炎和溃疡性结肠炎的炎性肠疾病(IBD)。
18．上文所述的本发明。
全文摘要
本发明涉及p75异二聚体特异性抗人IL－12抗体;其特征在于中和人IL－12生物活性的潜力比已知的异二聚体特异性IL－12单克隆抗体更高,效力比其更大。异二聚体特异性抗体识别人IL－12p75异二聚体的一个或多个表位,但不与单独的p40亚单位结合。异二聚体特异性IL－12抗体中和猕猴IL－12生物活性的效力与中和人IL－12生物活性的效力相似,这使得它们成为有用的IL－12拮抗剂。
文档编号A61P25/00GK1288468SQ99802310
公开日2001年3月21日 申请日期1999年1月15日 优先权日1998年1月23日
发明者莫尔西·K·盖特利, 戴维·H·普雷斯基 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司