专利名称：选择性癌症化疗方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤细胞毒性化疗方法。
在另一方面本发明涉及肿瘤细胞毒性化疗组合物。
更独特地，本发明涉及用来治疗人类宿主中癌症的肿瘤细胞毒性化疗方法和组合物化疗的有害的副作用可包括脱发、恶心和呕吐、心毒性和继发癌症。很多细胞毒性剂的最常见副作用毒性表现之一是骨髓抑制，骨髓抑制可以导致免疫抑制和造血功能不良。因为感染并发症是癌症患者死亡的主要原因之一，所以非常期望提供无毒性的没有免疫抑制副作用的肿瘤细胞毒性化疗组合物和方法。
具有维生素C活性的化合物，例如抗坏血酸(AA)和抗坏血酸盐衍生物，不是免疫抑制的，而是对多种癌症有效的静脉注射的细胞毒性化疗剂。Riordan等，医药假说(Medical Hypotheses)，1995，44，207-213。但是，在人类组织中没有维生素C的贮存机制，维生素C全部被代谢和/或排泄掉。进一步，由于胃肠道并发症，难以通过抗坏血酸的口服给药建立和维持维生素C的高血清水平。所以，通常认为为了建立和维持产生有效细胞毒性的血浆水平，必须通过静脉施用抗坏血酸。因此，提供含有非抗坏血酸形式的维生素C肿瘤化疗组合物是非常有优势的，可以用足以建立和维持血清维生素C肿瘤细胞毒性水平的剂量口服给药。
但是，由于如果血浆浓度足够高即使是维生素C也可以对正常人细胞有毒性，所以非常期望提供口服或静脉注射剂型的选择性维生素C肿瘤化疗组合物，其可在比抗坏血酸引起肿瘤细胞凋亡所需的血浆浓度更低的血浆浓度引起细胞凋亡。由于这种剂型给药的维生素C肿瘤细胞毒性浓度较低，建立和维持一种化疗上有效的血浆浓度是更可行的，其可比正常细胞的细胞凋亡维生素C血浆水平低。
Elvin等(欧洲癌症临床肿瘤学杂志(Eur.J.Cancer Clin.Oncol.)，17(7)759-65(1981))报告，抗坏血酸与醛(例如甲基乙二醛、乙酰丙烯醛)的加合物抑制小鼠中欧利希氏腹水瘤的生长。
EP-A-0086544提出抗坏血酸的缩酮和缩醛作为血管生成抑制剂的用途。(血管生成是指新血管生成的过程，在肿瘤生长中包括新血管的增生。)EP-A-0148094和美国专利5,032,610提出口服或静脉注射给药5，6-O-苯亚甲基-L-抗坏血酸及其盐和其与L-抗坏血酸的混合物表现出抗癌性质。
3-氨基-1，2，4-三唑的同时给予增强抗坏血酸对欧利希氏腹水肿瘤细胞的细胞毒性，维生素K3(甲萘醌重亚硫酸盐)的增加看来好像增加抗坏血酸的优先肿瘤细胞毒性。Benande等，肿瘤学(Oncology)，2333-43(1969)。
同样，以前的工作者提出Cu2+的催化浓度增加抗坏血酸对包括4种人源株在内的几种恶性黑素瘤细胞系的优先毒性。Bram等，自然(Nature)284629-631(1980)。
有报道，来源于患者的几种白血病、前白血病和骨髓瘤先祖细胞对体内可达到的对正常造血细胞无任何毒性的抗坏血酸浓度敏感。Park等，癌症研究，41062-65(1980)；美国临床营养学技术(Am.J.Clin.Nutr.)541241S-46S(1991)。
图2是相似的条形图，如试验1说明的，阐明在优选发明的实施使用的“无机抗坏血酸盐加代谢产物”组合物对不同肿瘤细胞类型相对于正常细胞的选择性。
在施行本发明方法中有用的本发明的新化疗组合物包含在药理学上可接受的静脉注射载体中的这样的化疗组合物成分。发明优选的实施方案上文描述的化疗组合物成分是以适当的比例简单地混合在一起的。准确的比例不是非常关键。可操作的和最佳的比例可以被决定和在一定限度内可以改变，这可以由那些本领域普通技术人员通过适当的试验来决定，例如通过体外试验(如下面描述的那些)。或者，按照本发明目前优选的实施方案，含有适当比例这些成分的合适的无机抗坏血酸盐代谢产物组合物是商业可得的，来自Inter-Cal公司，Prescott，Arizona，美国，注册商标ESTER-C。这些组合物在美国专利4,822,816；4,968,716；和5,070,085中被进一步描述，在这里引用作为参考。
通过本发明的化疗方法和组合物提供的细胞毒性有效的维生素C血浆浓度将根据被治疗的肿瘤细胞的特殊类型而变化，该浓度可以按照本领域周知的技术通过如下文描述的体外试验、动物试验和人体内试验来决定。
为了静脉注射给药，本发明的化疗组合物按照本领域周知的技术被制备，方法是使无机抗坏血酸和维生素C代谢产物成分包含在药理学上可接受的静脉注射载体中，即在一种载体中的成分的无菌、无毒溶液经配制以提供适当的渗透压浓度、pH等。例如，林格氏乳酸盐是一种合适的静脉注射载体。
在静脉载体中的维生素C的浓度为了适应治疗的需要可以在宽范围内变化。例如，当期望建立抗坏血酸当量(equivalent)血浆浓度在150-200mg/dL范围内时，一种适当的用于8小时，1000cc输注的剂量是无机盐提供的100-150mg抗坏血酸盐。在达到和维持期望的血浆浓度前有可能要求重复几次这样的输注，这取决于患者系统对抗坏血酸盐破坏、消除或排泄的能力。
使用含有无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物的口服剂型，建立有效引起一些类型肿瘤细胞凋亡的这些组合物的初始血浆浓度也是可能的。按照现有的信息，在每天大约12-15g抗坏血酸盐口服剂量范围，大约可以达到5mg/dL的血浆水平(AA当量)，这足以引起黑素瘤和肝细胞瘤细胞选择性细胞凋亡。
而且，一旦通过静脉注射给药获得选择性引起肿瘤细胞凋亡的血浆浓度，则可以通过口服剂型给药或口服和静脉注射给药的组合来维持浓度。
实施例提出下面的实施例是为了对本领域人员说明本发明的实施和确认目前优选的实施方案，不要被认为是对本发明的范围的限制。
检测几种肿瘤细胞系和相应的正常非恶性细胞系的细胞凋亡是通过Ester-C(抗坏血酸钙加代谢产物)，相对于4种其他试验组合物单独抗坏血酸钙(CA)，单独苏糖酸钙(CT)，抗坏血酸钙加苏糖酸钙(CA＋CT)和无菌水(sH2O)。
实施例1试验步骤细胞系Malme-3M 人黑素瘤(ATCC编号HTB-64)Malme-3正常人皮肤成纤维细胞(ATCC编号HTB-102)SK-Hep-1 人肝腺癌(ATCC编号HTB-52)WRL正常人肝细胞(ATCC编号CL-98)SK-N-MC人成神经细胞瘤(ATCC编号HTB-10)T-84 人结肠癌(ATCC编号CCL-248)贮存细胞在生长培养基中培养，如下细胞系生长培养基SK-Hep-1，SK-N-MC和在Earle氏盐中的Eagle氏最低必需培WRL 88 养基，补加上2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，10％胎牛血清(FBs)和抗生素(青霉素，链霉素，两性霉素B)Malme-3和Malme 3-M McCoy氏培养基，加上L-谷氨酰胺，15％FBs和抗生素T-84 Dulbecco氏改变的MEM和Ham氏F-12培养基1∶1混合，补加上L-谷氨酰胺，盐酸吡哆醛，25mM Hepes加5％FBS和抗生素所有培养物被维持在37℃5％CO2/95％空气的湿化空气中。培养基和培养试剂从Life Techonologies(Gibco/BRL，Long Island，NY)获得。FBS从Hyclone Labs(Logan，UT)获得。
试验材料从Inter-Cal公司(Prescott，AZ)获得，如下试验1 Ester-C无机抗坏血酸盐(见下文)试验2 抗坏血酸钙(USP级)，82.15％抗坏血酸(AA)当量试验3 苏糖酸钙，87.08％L-苏糖酸(TA)当量试验4 抗坏血酸钙(U.S.P.)＋U.S.P.钙，81.21％AA，1％TA当量试验5 抗坏血酸通过实验室分析，试验1材料含有如下物质抗坏血酸钙 78.4％AA当量苏糖酸钙 0.9％AA当量其它AA代谢产物110.4％AA当量结晶水 平衡注1醛糖酸，醛糖酸内酯，醛糖酸交酯和无毒的醛糖酸金属盐，脱氢抗坏血酸，苏糖，赤藓糖，4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮，3-羟基曲酸和5-羟基落叶松皮素抗坏血酸(组织培养级)从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)获得。对照组合物由适当的生长培养基，林格氏溶液或无菌水组成。
所有工作液在使用前从母液新鲜配制。AA的60mM贮存母液在无血清的培养基中配制，贮存在-15℃。工作液用生长培养基从10倍浓度贮存液稀释配制。30mM(1gm/％)苏糖酸钙贮液用林格氏液(Fay和Verlangieri，生命科学(Life Sciences)，491377(1991))或温无菌水配制。工作液制备为1×贮液(在林格氏液中)或10×贮液(在sH2O中)，这取决于治疗的性质，也就是说短期还是连续的(见下文)。
为评价试验1的材料，1-1.3％试验材料贮存母液在温无菌水中配制。工作贮存液(10倍浓度)在使用前用无菌水新鲜配制。为比较性评价，试验2和试验4贮存液用无菌水制备，被标化成含有与试验1贮液相同AA当量。这些贮液贮存在室温用于评价。
实施例2用抗坏血酸和/或苏糖酸钙处理细胞培养物在新鲜配制的补充物由抗坏血酸(AA)或抗坏血酸钙(CA)组成的递增浓度存在下，0.25-1.0×105肿瘤来源的细胞或正常肝细胞系的细胞被接种和培养在24孔板的单个孔中。培养物被周期地添加各自的补充物，依所示有或没有培养基的改变。对照由接受没有添加补充物的生长培养基的细胞组成。
为了用苏糖酸钙处理，细胞被允许通过过夜温育附着。第二天，使用二种方案中的一种开始苏糖酸盐处理。
在一种方案中(短期暴露)，洗涤单层细胞，在37℃直接短时期暴露于1ml/孔的7.5-30mM苏糖酸盐(在林格氏液中配制)，如Fay和Verlangieri所述(上文作为参考)。对照用相同间隔暴露于1ml/孔的单独的林格氏液中。暴露后，溶液被移除，用生长培养基替代。
在另一种方案中(连续暴露)，十分之一体积的10×苏糖酸盐(在无菌水中制备)被加入到培养基中，在37℃继续温育。这一相同处理通过每天的添加新鲜工作液来重复。
实施例3抗坏血酸加苏糖酸钙处理细胞培养物如实施例2，细胞用苏糖酸钙(CT)在37℃处理60分钟，接下来加入在林格氏液中的抗坏血酸(AA)，连续温育30分钟。在处理期结束时，溶液被移除，用1ml/孔的生长培养基替代。
实施例4用试验1(Ester-C抗坏血酸钙加代谢产物)和试验4(抗坏血酸钙加苏糖酸钙)处理细胞培养物被接种在24孔板中的细胞培养物的不全融合单层，经补充十分之一体积工作贮液，达到在试验1中的终浓度在0.006-0.06％范围内(相当于0.28mM-2.8mM抗坏血酸当量)。孔的平行组被相似地用CA＋CT和单独CA贮液处理，贮液含有如试验1的AA相当量。对照培养物被用等体积无菌水处理。以1-2天间隔用这些组合物周期性处理通过直接加新鲜溶液(无生长培养基的改变)重复。
实施例5细胞存活和细胞死亡(细胞凋亡)的分析通过使用Nuebauer血细胞计数器进行存活细胞计数，以预先决定的间隔处理后评估细胞存活。有存活力的细胞是指如以前描述的(Harakeh和Jariwalla，美国临床营养学杂志541231S-1235S(1991))能排除台盼蓝的那些。数据被用于绘制有活力细胞培养物(每毫升细胞的数目)相对于试验溶液浓度的图，以评价细胞存活效果。
用Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)开发的一种酶联免疫法(ELISA)评价不同肿瘤细胞类型经实施例1中描述的试验组合物和对照处理后的细胞凋亡发生。这种分析特异性地筛选和检测出现在被处理细胞胞浆中相对于未被处理对照的组蛋白结合DNA复合物(核小体片段)。使用Boehringer-Mannheim提供的细胞死亡检测ELISA试剂盒中指定的步骤，确定不同处理后胞浆裂解物中核小体片段的存在和水平。
简单地说，ELISA分析如下进行。在用试验组合物处理的不同间隔，吸出培养基，细胞膜用200-500μl裂解液室温温育30分钟裂解。细胞裂解物被收集在Eppendorf离心管中，2500转/分离心10分钟，以分离核级分。含有胞浆级分的上清液等份被用于用分光光度计在410nm的酶标仪上定量核小体片段。
数据被如下处理410nm平均吸收值相对于试验化合物浓度作图，以比较每一处理确定的相对引起细胞凋亡的剂量，且数据进行比较。最小的引起细胞凋亡的剂量被定义为引起对于未处理的对照而言细胞凋亡(也就是核蛋白的水平)2倍改变所需的剂量。最大细胞凋亡被定义为相对于对照的细胞凋亡的最大倍数的改变。
表1数据总结最小细胞凋亡剂量最大细胞凋亡倍数增加组合物细胞株剂量浓度处理 剂量浓度 处理最大细胞凋(％) 次数(％)次数亡倍数增加[抗坏血 Malme-30.025 20.033 2 3.58酸钙＋代 Malme-3M 0.006 10.025 2 116谢产物] WRL-68 0.006-0.012 30.025 2 2.04SK-Hep-1 0.006 30.033 3 14.9SK-N-MC0.008 20.033 4 13.6T-84 0.015 30.02-0.03 4 4[抗坏血 Malme-30.025 20.025 2 2.16酸钙＋苏 Malme-3M 0.012 20.025 2 65.7糖酸钙] WRL-68＞0.05 30.0125 2 1.68SK-Hep-1 0.006 30.033 3 9.31SK-N-MC0.015 40.033 4 7.02T-84 ＞0.06 30.033 3 1.5抗坏血酸 Malme-30.025 20.025 2 2.16钙Malme-3M 0.012 20.025 2 92.8WRL-68 0.012 30.012 3 2.22SK-Hep-1 0.006 30.033 3 12.04SK-N-MC0.015 40.015 4 5.03T-84 ＞0.06 30.033 3 1.77在上面的表1中“最小细胞凋亡剂量”是引起相对于对照的细胞凋亡2倍改变所需的组合物的浓度。“处理的次数”是用组合物处理的总次数。“最大细胞凋亡倍数增加”是相对于对照的细胞凋亡的最大倍数改变，“最大剂量”是与对照相比引起“最大倍数细胞凋亡”的组合物浓度。
结论上文描述的试验结果引出以下的结论由试验1组合物说明的无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物以一种剂量依赖的方式引起多种肿瘤细胞类型的选择性细胞死亡(细胞凋亡)。
无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物(如由试验1组合物说明的)引起细胞凋亡(也就是说细胞死亡率最小2倍增加)，是在比单独用无机抗坏血酸盐(如由试验2组合物说明的)或者单独用无机抗坏血酸引起这种降低所需的更低的浓度下。
用无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物(如试验1组合物说明的)引起的针对特异细胞类型之细胞凋亡最大水平比单独用无机抗坏血酸盐或单独用抗坏血酸引起的高。
引起肿瘤细胞细胞凋亡所需的无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物(如试验1组合物说明的)的AA当量的浓度比正常细胞所需的低，正常细胞中细胞死亡的量明显少于肿瘤细胞中的情况。
用抗坏血酸(AA)和/或苏糖酸钙(如实施例2说明的)处理细胞培养物，与他们的各自正常细胞对应物相比，引起肝细胞瘤和黑素瘤中选择性的剂量依赖性细胞死亡(细胞凋亡)。
肝细胞瘤细胞用CT预处理后应用AA处理，引起比相应剂量的单独AA或CT处理更高的细胞凋亡水平。
为使本领域技术人员理解和使用本发明，在这里描述了本发明，而且，描述了它的目前优选的实施方案。
权利要求
1.一种包括使肿瘤细胞与一种组合物接触的步骤的选择性化疗方法，所述组合物包含(a)一种血浆可溶的抗坏血酸的金属盐；和(b)一种或者多种维生素C代谢产物，选自(i)醛糖酸，醛糖酸内酯，醛糖酸交酯和其无毒的金属盐，和(ii)脱氢抗坏血酸，苏糖，赤藓糖，4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮，3-羟基曲酸和5-羟基落叶松皮素。
2.一种组合物，其包含在药理学上可以接受的静脉注射载体中的权利要求1的化疗组合物。
全文摘要
一种选择性化疗方法,包括使肿瘤细胞与一种无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物接触的步骤。一种化疗组合物,其包含一种在药理学上可以接受的静脉注射的载体中的无机抗坏血酸盐/维生素C代谢产物组合物。
文档编号A61K31/7004GK1329489SQ99813918
公开日2002年1月2日 申请日期1999年8月30日 优先权日1999年8月30日
发明者R·J·贾里瓦拉 申请人:奥克斯可尔实验室公司