喜树碱在制备抗溶裂期eb病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及喜树碱应用技术领域，具体涉及喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] EB (Epstein-Barr)病毒是疱疫病毒科Y亚科成员中唯一能引起人类感染的淋 巴滤泡病毒（Iymphocrypovirus)，是一种在人群中分布广泛的感染因子。EB病毒具有嗜B 淋巴细胞的特征，能够在B淋巴细胞中建立隐形感染，刺激细胞的增生和转化，主要以多拷 贝环状DNA形式游离于胞浆中，并整合至宿主染色体内，在一定的信号通路刺激下可导致B 淋巴细胞转化成桨细胞，使EB病毒产生具有感染性的病毒颗粒，最终导致宿主细胞的溶解 和死亡。近年来发现，在人类的腮腺管、口咽部及宫颈外口处上皮细胞表面均发现类似EB 病毒受体的结构。EB病毒是传染性单核细胞增多症的病原体，EB病毒科引起单核细胞增多 症，鼻咽癌，Burkitt'氏淋巴瘤，霍奇金病（Hodgkin'sdisease，HD)，口腔腺体肿瘤，胸腺瘤， 器官移植后B细胞淋巴瘤等。
[0003] EB病毒在感染细胞中的生活周期可以分为潜伏期和溶裂期，其中溶裂期又分为立 即早期、早期、病毒DNA复制期和晚期。在溶裂期感染时，环状的病毒基因组解环形成线状 的DNA，病毒立即早期基因 BZLFl最先表达生产出Zta蛋白，Zta可与DNA特异序列结合，其 转录激活作用是通过与顺式作用元件中的Z反应元件（Zeta response element, ZRE) DNA 结合蛋白基序结合而反式激活大量的EB病毒早期基因，从而引发EB病毒溶裂复制的连锁 效应，使EB病毒进入溶裂期，综上所述，Zta蛋白在溶裂期感染基因组的转录和表达过程中 起着重要作用。而Zta蛋白在与复制起始位点（OriLyt) DNA结合的过程中，受到拓扑异构 酶I的调节。
[0004] 喜树碱是一种从喜树（Camptotheca acuminata)中分离出来的生物碱，它是一种 针对细胞核内拓扑异构酶I的一种很有前景的抗肿瘤药物（Bomgaars et al，2001)。喜树 碱通过作用于拓扑异构酶I来抑制DNA复制、转录和有丝分裂。现有技术中，喜树碱类抗癌 药物有许多优点，如抗肿瘤谱广、与其它抗肿瘤药物无交叉耐药性，对肺癌、前列腺癌、乳腺 癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌以及皮肤癌等都有抑制肿瘤细胞的作用。但喜树碱在制备 抗溶裂期EB病毒药物中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供喜树碱在制备抗溶裂期EB病 毒药物中的应用及喜树碱在制备预防EB病毒感染引起的癌症的药物中的应用。
[0006] 具体地，本发明的技术方案包括：喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物中的应用。 优选的实施例中，EB病毒在感染细胞中处于早期；或者EB病毒在感染细胞中处于立即早 期。
[0007] 优选的实施例中，感染细胞5X IO5-IOX IO5个/毫升时，喜树碱的使用量可以 0. 1-2. O纳摩尔，进一步优选为I. 0-2. O纳摩尔；或者为0. l-o. 9纳摩尔，进一步优选为 0. 3-0. 9纳摩尔，更进一步优选为0. 3纳摩尔。
[0008] 本发明的技术方案还包括：喜树碱在制备预防EB病毒感染引起的癌症的药物中 的应用。优选的实施例中，所述EB病毒感染引起的癌症为鼻咽癌、Burkitt'氏淋巴瘤、霍 奇金病、胃癌或胸腺瘤。
[0009] 本发明的技术要点是：
[0010] 步骤1、ZK0-293细胞的培养
[0011] ZK0-293细胞于37°C，5%二氧化碳，PH7. 2-7. 4环境中，加入含有10%胎牛血清和 100 μ g/ml潮霉素 RPMI血清中培养；
[0012] 步骤2、立即早期EB病毒感染细胞和早期EB病毒感染细胞的构建
[0013] Zta真核载体转染：将Hp-荧光素酶质粒与p3xFLAG_Zta共转入ZK0-293细胞中 转化6h，并以Hp-荧光素酶质粒与p3xFLAG质粒共转入ZK0-293细胞作为对照，对荧光素酶 进行检测判断真核载体是否转染成功；
[0014] 挑选上述Zta蛋白免疫印迹阳性、mDBP蛋白免疫印迹阳性、VCA蛋白免疫印迹阴性 的ZK0-293细胞作为早期EB病毒感染细胞；
[0015] 挑选上述Zta蛋白免疫印迹阳性、mDBP蛋白免疫印迹阴性、VCA蛋白免疫印迹阴性 的ZK0-293细胞作为立即早期EB病毒感染细胞；
[0016] 步骤3、加入喜树碱处理
[0017] 将上述早期EB病毒感染细胞或立即早期EB病毒感染细胞调整细胞密度为 5 X IO5-IOX IO5个/毫升，加入不同浓度的喜树碱进行处理；
[0018] 步骤4、Zta蛋白表达量检测及Zta蛋白和OriLyt DNA片段结合量检测
[0019] Zta蛋白表达量检测：使用免疫印迹法，收集经喜树碱处理的细胞，将收集的细胞 溶解在SDS-PAGE加样缓冲液中煮沸lOmin，再通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，随后将凝 胶转移至醋酸纤维膜上，用Zta蛋白多克隆抗体进行特异性结合反应，对抗原固化基质膜 进行检测和分析；
[0020] OriLyt DNA片段结合量检测：用染色质免疫沉淀结合实时荧光定量PCR的方法， 转染了 Zta蛋白cDNA的ZK0-293细胞中Zta蛋白会与EB病毒基因组中的复制起始位点 (OriLyt) DNA结合，形成Zta-OriLyt ;用甲醛对ZK0-293细胞进行固定；将固定后的细胞 进行裂解，其中细胞裂解缓冲液为l%SDS、10mM EDTA、50mM Tris-HCl (pH8. 0);随后进行超 声波破碎处理；加入免疫沉淀反应稀释缓冲液，缓冲液包括：〇. 01%SDS、1. l%Triton X-100、 1.2mMEDTA、20mM Tris (pH8. 0)、167mM NaCl ;加入Zta蛋白多克隆抗体IgG，形成抗原抗体 沉淀，即IgG-Zta-OriLyt沉淀，收集所得沉淀；将IgG-Zta-OriLyt进行解交联，收集OriLyt DNA片段；随后对收集的OriLyt DNA片段进行实时荧光定量PCR(正向引物为SEQ ID No. 1， 反向引物为SEQ ID No. 2)，以ZK0-293细胞中的β-Actin基因作为内参基因进行实时荧光 定量PCR (正向引物为SEQ IDNo. 3,反向引物为SEQ ID No. 4)反应，计算OriLyt DNA片段 PCR值与β-Actin基因 PCR值的比值，以此表示Zta蛋白与OriLyt DNA的结合量。
[0021] 本发明的有益效果在于，本发明对喜树碱发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的 应用领域；本发明的喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物中的应用，能够明显抑制溶裂期EB 病毒Zta蛋白与OriLyt的结合，预示着较好的药用前景。喜树碱抑制EB病毒复制效率 高，可以在无细胞毒性剂量下有强效抑制EB病毒复制作用。制成的含喜树碱的，用于预防 EB病毒感染引起的癌症的药物无副作用，同时也是广谱抗癌药物。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例1的Zta蛋白免疫印迹电泳图；
[0023] 图2是本发明实施例1的不同浓度喜树碱处理的OriLyt DNA片段实时荧光定量 PCR结果比较图；
[0024] 图3是本发明实施例2的Zta蛋白免疫印迹电泳图；
[0025] 图4是本发明实施例2的不同浓度喜树碱处理的OriLyt DNA片段实时荧光定量 PCR结果比较图。
【具体实施方式】
[0026] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施 例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。
[0027] EB病毒在感染细胞中的生活周期可以分为潜伏期和溶裂期，其中溶裂期又分为立 即早期、早期、病毒DNA复制期和晚期。表1为EB病毒在溶裂期不同时期的标志基因。
[0028] 表1EB病毒溶裂期标志基因
[0029]
【主权项】
1. 喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EB病毒在感染细胞中处于早期。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，EB病毒在感染细胞中处于立即早期。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，感染细胞5 X IO5-IO X IO5个/毫升，喜树 碱的使用量〇. 1-2. 0纳摩尔。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，感染细胞5 X IO5-IO X IO5个/毫升，喜树 碱的使用量1. 0-2. 0纳摩尔。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，感染细胞5 X IO5-IO X IO5个/毫升，喜树 碱的使用量〇. 1-0. 9纳摩尔。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，感染细胞5 X IO5-IO X IO5个/毫升，喜树 碱的使用量〇. 3-0. 9纳摩尔。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，感染细胞5 X IO5-IO X IO5个/毫升，喜树 碱的使用量〇. 3纳摩尔。
9. 喜树碱在制备预防EB病毒感染引起的癌症的药物中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述EB病毒感染引起的癌症为鼻咽癌、 Burkitt'氏淋巴瘤、霍奇金病、胃癌或胸腺瘤。
【专利摘要】本发明涉及抗病毒药物领域，具体公开喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物中的应用及喜树碱在制备预防EB病毒感染引起的癌症的药物中的应用。本发明构建了早期EB病毒感染细胞及立即早期EB病毒感染细胞，并用喜树碱对其进行处理。本发明对喜树碱发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；本发明的喜树碱在制备抗溶裂期EB病毒药物中的应用，能够明显抑制溶裂期EB病毒Zta蛋白与OriLyt的结合，预示着较好的药用前景。
【IPC分类】A61P35-00, A61K31-4745, A61P31-22
【公开号】CN104666301
【申请号】CN201310616433
【发明人】王蒲, 唐超, 邹军辉, 万晓春
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月27日