一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)纳米粒的制备方法
【专利说明】
[0001]一、
技术领域
本发明为一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)纳米粒的制备方法，属于食品生物技术领域。
[0002]二、
【背景技术】
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种多酚类物质，具有降血脂、抗氧化、清除体内自由基等特殊生理功能功效。但由于EGCG不稳定，易受外界环境变化而降解或生成副产物，限制了其在各领域的应用。
[0003]目前国内外对叶酸偶联壳聚糖包埋EGCG的研宄较少，利用叶酸的靶向性，使叶酸偶联壳聚糖，利用离子凝胶法制备得到叶酸-壳聚糖-EGCG纳米微球，增加EGCG的稳定性，提高EGCG的生物利用率。
[0004]在人类疾病发展史上，全球范围内，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的主要疾病。目前的主要治疗方法药物选择性低，既杀伤肿瘤细胞，同时也会损害体内某些正常细胞，因而在治疗中常出现明显的毒性反应，影响疗效。所以，将靶向制剂用于肿瘤化疗具有明显的优势，且势在必行。
[0005]三、
【发明内容】
技术问题本发明主要针对恶性肿瘤的防治，制备新型分子靶向药物和传递药物载体的链接。
[0006]技术方案本发明提供了一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸(EGCG)纳米粒的制备方法，具体内容如下:
A、叶酸活性酯的制备:称取FA200-300mg，溶于5_10ml无水的DMSO中，加入DCC200-300mg和NHS100-200mg溶解，过夜后滤去DCU，滤液经减压蒸馏除去部分溶剂，搅拌中逐滴将滤液滴入冰冷的含30-40%丙酮的无水乙醚溶液中，得黄色沉淀DCU，滤液经旋转蒸发、真空冷冻干燥，得到叶酸活性酯；
B、壳聚糖的合成:称取CS100-200mg，溶于30_60ml醋酸-醋酸钠缓冲液(PH4.6)，得到壳聚糖醋酸水溶液，在磁力搅拌下以2-3ml/min的速度缓慢向溶液中加入8_15ml叶酸活性酯的DMSO溶液(20mg/ml)，30°C反应18_20h，离心，用蒸馏水洗涤沉淀数遍，重新将沉淀溶于2-4%的醋酸水溶液中，得到l_2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液；
C、叶酸壳聚糖的分离纯化:取适量叶酸偶联壳聚糖溶液，低速离心后取上清液，用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱进行分离，用2_4%醋酸溶液洗脱，流速1.5ml/min。在363nm波长检测洗脱，收集流出的第一个吸光峰值，冷冻干燥得叶酸偶联壳聚糖纯品；
D、叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液制备:将叶酸偶联壳聚糖溶于1-3%的冰醋酸溶液中，称取一定量的EGCG加入溶液中，用NaOH溶液调节pH值，制成EGCG含量为0.5-lmg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液；
E、纳米颗粒的制备:取一定量TPP用纯水溶解，保持叶酸偶联壳聚糖与TPP比例在4-6:1之间，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45 ym的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，得到载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。
[0007]本发明的主要优点和积极效果如下:
1、利用叶酸的靶向性，使叶酸偶联壳聚糖。
[0008]2、利用离子凝胶法制备得到叶酸-壳聚糖-EGCG纳米微球，增加EGCG的稳定性，提高EGCG的生物利用率。
[0009]四、【具体实施方式】实施例1
称取FA223mg，溶于5ml无水的DMSO中，加入DCC200mg和NHS133mg溶解，过夜后滤去DCU,滤液经减压蒸馏除去部分溶剂，搅拌中逐滴将滤液滴入冰冷的含30%丙酮的无水乙醚溶液中，得黄色沉淀DCU，滤液经旋转蒸发、真空冷冻干燥，得到叶酸活性酯；称取CS160mg，溶于40ml醋酸-醋酸钠缓冲液(PH4.6)，得到4mg/ml的壳聚糖醋酸水溶液，在磁力搅拌下以2ml/min的速度缓慢向溶液中加入8ml叶酸活性酯的DMSO溶液(20mg/ml )，30 °C反应18h，离心，用蒸馏水洗涤沉淀数遍，重新将沉淀溶于2%的醋酸水溶液中，得到叶酸偶联壳聚糖溶液浓度2mg/ml ;取适量叶酸偶联壳聚糖溶液，低速离心后取上清液，用S^hadexG-25葡聚糖凝胶层析柱进行分离，用2%醋酸溶液洗脱，流速1.5ml/min。在363nm波长检测洗脱，收集流出的第一个吸光峰值，冷冻干燥得叶酸偶联壳聚糖纯品；将叶酸偶联壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液中，称取一定量的EGCG加入溶液中，用1%的NaOH溶液调节pH值5，制成一定浓度的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液；取一定量TPP用纯水溶解，叶酸偶联壳聚糖与TPP比例为6:1，TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45 μ m的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，最后得到负载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。
[0010]实施例2
称取FA248mg，溶于6ml无水的DMSO中，加入DCC210mg和NHSHOmg溶解，过夜后滤去DCU,滤液经减压蒸馏除去部分溶剂，搅拌中逐滴将滤液滴入冰冷的含30%丙酮的无水乙醚溶液中，得黄色沉淀DCU，滤液经旋转蒸发、真空冷冻干燥，得到叶酸活性酯；称取CS180mg，溶于30ml醋酸-醋酸钠缓冲液(PH4.6)，得到6mg/ml的壳聚糖醋酸水溶液，在磁力搅拌下以3ml/min的速度缓慢向溶液中加入1ml叶酸活性酯的DMSO溶液(201^/1111)，40°〇反应18h，离心，用蒸馏水洗涤沉淀数遍，重新将沉淀溶于2%的醋酸水溶液中，得到叶酸偶联壳聚糖溶液浓度2mg/ml ;取适量叶酸偶联壳聚糖溶液，低速离心后取上清液，用S^hadexG-25葡聚糖凝胶层析柱进行分离，用2%醋酸溶液洗脱，流速1.5ml/min。在363nm波长检测洗脱，收集流出的第一个吸光峰值，冷冻干燥得叶酸偶联壳聚糖纯品；将叶酸偶联壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液中，称取一定量的EGCG加入溶液中，用1%的NaOH溶液调节pH值3，制成一定浓度的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液；取一定量TPP用纯水溶解，叶酸偶联壳聚糖与TPP比例为5:1，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45 ym的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，最后得到负载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。
【主权项】
1.一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)纳米粒的制备方法，其特征在于采取如下方法: A、叶酸活性酯的制备:称取叶酸(FA)200-300mg，溶于5_10ml无水的二甲基亚砜(DMSO)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)200-300mg和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 100_200mg溶解，过夜后滤去二环己基脲(DCU)，滤液经减压蒸馏除去部分溶剂，搅拌中逐滴将滤液滴入冰冷的含30-40%丙酮的无水乙醚溶液中，得黄色沉淀DCU，滤液经旋转蒸发、真空冷冻干燥，得到叶酸活性酯； B、壳聚糖的合成:称取壳聚糖(CS)100-200mg，溶于30_60ml醋酸-醋酸钠缓冲液(PH4.6)，得到壳聚糖醋酸水溶液，在磁力搅拌下以2-3ml/min的速度缓慢向溶液中加入8-15ml叶酸活性酯的DMSO溶液(20mg/ml )，30_40°C反应18_20h，离心，用蒸馏水洗涤沉淀数遍，重新将沉淀溶于2-4%的醋酸水溶液中，得到l_2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液； C、叶酸壳聚糖的分离纯化:取适量叶酸偶联壳聚糖溶液，低速离心后取上清液，用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱进行分离，用2_4%醋酸溶液洗脱，流速1.5ml/min ;在363nm波长检测洗脱，收集流出的第一个吸光峰值，冷冻干燥得叶酸偶联壳聚糖纯品； D、叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液制备:将叶酸偶联壳聚糖溶于1-3%的冰醋酸溶液中，称取一定量的EGCG加入溶液中，用NaOH溶液调节pH3_5，制成EGCG含量为0.5-lmg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液； E、纳米颗粒的制备:取一定量TPP用纯水溶解，保持叶酸偶联壳聚糖与TPP比例在4-6:1之间，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖EGCG溶液分别过0.45 ym的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，得负载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。
【专利摘要】本发明为一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）纳米粒的制备方法，属于食品生物技术领域。工艺关键在于，制备浓度为1-2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液，将叶酸偶联壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液中，加入一定量的EGCG，用1%的NaOH溶液调节pH值3-5，制成EGCG浓度为0.5-1mg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液。取一定量TPP用纯水溶解，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45μm的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，叶酸偶联壳聚糖与TPP的比例为4-6：1，最后得到负载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。
【IPC分类】A61P3/06, A61K31/353, A61P39/06, A61K47/36, A61K9/14
【公开号】CN104983689
【申请号】CN201510445312
【发明人】李春阳, 付琳
【申请人】南京飞马食品有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月27日