专利名称：扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于海洋生物化妆品领域，特别是涉及一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其 制备方法。
背景技术：
脂质体自1962年发现以来，以其独特的结构和功能在化妆品、医药领域逐渐推 广。在化妆品领域中，脂质体作为活性成分的载体，利用磷脂双层膜与皮肤细胞的亲和性， 可以将一些有效营养物质传递至皮肤深层，从而促进了吸收，减少了刺激性。继1986年 Dior首次开发了商品名为Capture的脂质体化妆品以来，国外对脂质体在皮肤学和化妆品 学中的应用进行了大量的研究将保湿剂、维生素制成脂质体，可以利用其缓释特点，延长 功效时间；将防晒剂制成脂质体，可以增加渗透性，还具有防水效果。美国开发的GAI脂质 体产品，贮藏12个月后仍然保持有90 %的标准活性，85 %的脂质体保持稳定。在日本，神经 酰胺及其脂质体技术的研究和应用成果申请了大批的专利。在国内，北京同仁堂公司引进 德国专利技术，成功制备了质量稳定的纳米脂质体化妆品，为脂质体的大规模市场化迈出 了坚实的一步。抗氧化肽在护肤品中的应用也被认为是最有开拓希望的新领域，抗氧化肽的共同 特性是具有俘获各种反应所产生的活性高的自由基，使之成为惰性化合物。因此，抗氧化肽 应用于体外可抵抗紫外线对皮肤造成的老损，从而保护其结构功能；尤其作为特效添加剂 应用于各种高档日化产品中而风靡全球，堪称发展最快、效益最好的新兴产业，受到国内外 研究机构、制造厂商的重视。前期研究表明扇贝抗氧化肽是海洋活性多肽的一种，不仅具有 清除羟自由基和超氧阴离子的能力，还能延缓自然衰老动物皮肤老化。应用研究还表明，该 扇贝抗氧化肽能对抗紫外线和60Co-「射线对淋巴细胞的辐射损伤，有免疫增强作用等，美 容防晒效果显著。由于多肽对皮肤的修复和美白效果需要深入皮肤深层，才能被真皮层吸 收，对皮肤黑色素形成的关键酶才能起到抑制性作用。因此，选择合理有效的方法，对多肽 进行保护，使其达到作用的关键部位，成为最大限度的发挥其活性的关键。脂质体的发现， 为扇贝抗氧化肽的深入开发提供了思路。如果利用脂质体技术将多肽包裹起来，能够渗入 皮肤表层达到相应作用部位并维持一定时间，就能最大限度的发挥其活性，提高其利用率。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术有在不足，提供一种脂质体形态均一，粒径 200nm以下，包封率高，渗透率低，符合化妆品的透皮吸收要求的扇贝抗氧化肽纳米脂质体 (或称PCF纳米脂质体)及其制备方法。本发明提供的扇贝抗氧化肽的纳米脂质体，其特征在于由下列PH梯度法制备扇 贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97. 29%，粒子直径平均 分布在200nm以下，总含量在85%以上，平均Zeta电位为-21. 3mV，稳定性较强，包封率在 4°C下一个月内基本保持稳定；
所述pH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体，包括下列步骤①空白脂质体的制备。取大豆卵磷脂(卵磷脂)、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)溶解 于乙醚溶剂中，大豆卵磷脂重量配比为150-250份，优选为200份，胆固醇重量配比为30-90 份，优选为50份，吐温80重量配比为20-100份，优选为60份，恒温50°C减压旋转蒸发掉有 机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一层薄膜后，加入适量0. 3mol/L柠檬酸-柠檬酸 钠缓冲液，其中乙醚溶剂与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比1 1到5 1，优选 为3 1，调节pHl-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟，优选为30分钟后，用0.45微米滤膜 过滤后得到空白脂质体溶液；②扇贝抗氧化肽脂质体的制备在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉(见中国专利公开号 CN1660892制)，添加重量配比为5_40份，优选为20份，混合均勻后，再使用饱和Na2HPO4溶 液将PH调高3，pH梯度3-6后进行超声5-10分钟，得扇贝抗氧化肽纳米脂质体，4°C放置保存。按照本发明提供的扇贝抗氧化肽脂质体(简称脂质体)的制备方法中，所述扇贝 抗氧化肽脂质体的包封率按下列方法测定。取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质 体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Mi 11 ipore超滤杯中超滤，使用1万分子 量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的扇贝抗氧化肽(PCF)总量， 计算包封率。包封率的计算将脂质体与游离PCF分离，测定游离的PCF量，根据下式计算脂质 体包埋率(EE) =EE = (Ct-Cf) X 100% /Ct0其中Cf是游离PCF含量，Ct是总PCF含量。本发明提供的PCF纳米脂质体及其制备方法中，多种因素对脂质体包埋效果都具
有一定影响。PCF载量对脂质体包埋效果的影响。从图1中可以看出，随着PCF载量的提高，PCF纳米脂质体的包封率出现了下降的 趋势。当多肽添加重量配比小于20份时，包封率维持在一个很高的水平(超过90%)，但 多肽添加重量配比大于20份时，包封率便出现了下降的趋势，包封率随着载量的增加反而 会下降，PCF纳米脂质体的多肽添加重量配比为5-40份，优选为20份。胆固醇对PCF纳米脂质体包埋效果的影响PCF纳米脂质体双分子层一般是由卵磷脂和胆固醇分子相互间隔、定向排列的双 分子层所组成。当胆固醇嵌在脂双层中时，疏水部分夹在脂双层的“栅栏”之间，头部却在 极性区，可以调节双分子层的流动性和通透性。胆固醇具有调节膜流动性及稳定卵磷脂双 分子膜的功能，能够适当提高的包封率和稳定性。固定卵磷脂的加量为200份，改变胆固醇 添加量可以影响脂质体的包封率，结果如图2所示。PCF纳米脂质体的包封率随着胆固醇的 量的增加出现了先增加后减少的趋势，胆固醇嵌入到脂质膜中增强了膜的刚性和致密度， 水合过程中提高了 PCF纳米脂质体膜的稳定性，使得PCF纳米脂质体的包封率增加。但当 胆固醇的嵌入量超过一定范围后，胆固醇会干扰脂双分子层结构，使胶液的相变温度降低，使囊泡内容物快速渗出，降低了包封率。当胆固醇添加重量配比为30-90份，优选为50份， 卵磷脂重量配比为200份时，PCF纳米脂质体的包封率最高，达到了 91. 9%。吐温80对PCF纳米脂质体包埋效果的影响表面活性剂能使PCF纳米脂质体混悬液中存在胶团和乳剂，其疏水端插入双分子 膜，亲水端使PCF纳米脂质体高度亲水，防止PCF纳米脂质体间相互聚集融合和沉淀，它还 改变了 PCF纳米脂质体卵磷脂分子的排列方式和运动方式，导致膜纵向有序性(卵磷脂分 子碳氢链间的紧密情况)增大，流动性降低，稳定性提高。结果如图3所示。在一定范围内 提高吐温80的含量可以提高PCF纳米脂质体的包封率，但当吐温80的浓度达到一定值时， 卵磷脂将被逐渐增溶成混合胶束，PCF纳米脂质体的双分子层结构遭到破坏。考虑到吐温 80在工业中添加有一定的限制，如果胆固醇添加重量配比为30-90份，优选为50份，卵磷脂 重量配比为200份时，吐温80的添加量为20-100份，优选为60份。乙醚与柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液体积比对PCF纳米脂质体包埋效果的影响有机溶剂可以溶解卵磷脂和胆固醇，使其易于成膜，但有机溶剂的用量会影响PCF 纳米脂质膜的形成以及PCF纳米脂质体贮藏过程的稳定性，乙醚与柠檬酸_柠檬酸钠缓冲 液体积比对PCF纳米脂质体包封率的影响结果如图4所示。乙醚的用量在一定范围内时， 乙醚能够溶解卵磷脂以及胆固醇，促进脂质膜的形成，提高膜的通透性，使PCF易于进入膜 内，对包封率的提高具有促进作用。但乙醚用量大，体系中残留的乙醚就会多，残留的乙醚 会破坏脂质体膜，使得包容物容易泄露，而且乙醚用量过多对人体也会造成伤害。乙醚与柠 檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比从1 1到5 1，优选为3 1。pH梯度对PCF纳米脂质体包埋效果的影响根据Henderson-Hasselbalch理论，每个pH单位的变化会产生浓度10倍之差。如 果制造PCF纳米脂质体内外pH梯度差为3个单位时，理论上就会造成内外浓度的1000倍 之差。不同PH梯度(pHl-4，pH2-5，pH3_6，pH4_7)对PCF纳米脂质体包封率的影响，发现 PH4-7梯度制备的PCF纳米脂质体都具有较高的包封率，为91. 39%，而pH3-6梯度的包封 率为88. 27%。但是pH4-7梯度制得的PCF纳米脂质体稳定性较差，容易分层，因而确定制 备PCF纳米脂质体的pH梯度范围为pH3-6。
PH梯度pHl-4pH2-5pH3-6pH4-7包封率(％)47. 2468. 0788. 2791. 39此外PCF纳米脂质体的制备过程中，需要控制水合温度高于卵磷脂的相变温度， 这样才能使其在水溶液中分散均勻。经试验确定，水合温度定为50°C较合适，低于50°C时 制备的PCF纳米脂质体包封率迅速降低，而高于50°C时，卵磷脂容易氧化水解。在制备PCF纳米脂质体的过程中，通常需要通过外加能量使体系中的粒子再分 散，以获得粒径小且分布均勻的PCF纳米脂质体，增加体系的稳定性，本发明采用超声处 理，超声处理可以减小PCF纳米脂质体的颗粒度，使其分散更加均勻，有利于肽的跨膜运 动，提高包封率，但是超声强度过大会破坏PCF纳米脂质体膜从而引起芯材的泄露，会产生 大量的热，也容易引起磷脂的氧化。因此，超声强度确定为200W，超声时间为5-lOmin(间歇 超声)。本发明提供了 PCF纳米脂质体及其制备方法，优选确定了 pH梯度法制备脂质体工艺和配方为胆固醇重量配比为50份，卵磷脂重量配比为200份，吐温80重量配比为60份， 海洋PCF添加重量配比为20份，乙醚与0.3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比3 1， 旋转蒸发温度50°C，水合时间30min，pH梯度3_6，超声时间5min。按照上述配方和工艺制 得的海洋活性PCF脂质体的包封率能达到97. 29%，所制得脂质体为圆球形单室脂质体(图 5)，由马尔文电位仪NanO-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，结果显示，优 化工艺所得脂质体的粒径平均分布在200nm以下，Zeta电位结果表明，抗氧化肽脂质体带 负电荷，平均Zeta电位为-21. 3mV，具有较强的稳定性。粒径小于200nm，占总含量的85% 以上(图6)，作为化妆品的活性成分符合透皮吸收的要求，可以直接作为化妆品原料作用。 将扇贝抗氧化肽脂质体分别置于室温和低温环境下(4 6°C)，每隔一段时间测量其包封 率。一般来说，长期存放后的脂质体局部会形成较大的膜块，在贮存过程中，脂质体会发生 絮凝，所包容的活性成分也会逐渐泄漏。但低温环境可以延缓这一变化，故包封率的衰减得 到明显控制(图7)，稳定性有所加强，本发明中的扇贝抗氧化肽脂质体在4°C下一个月内基 本保持稳定，包封率保持在95%以上。本发明提供了一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法，采用本发明获得的扇 贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97. 29%，粒子直径平均 分布在200nm以下，总含量在85%以上，平均Zeta电位为-21. 3mV，稳定性较强，包封率在 4°C下一个月内基本保持稳定。
图1为PCF载量对脂质体包埋效果的影响图2为胆固醇加量对脂质体包封率的影响图3为吐温80对脂质体包封率的影响图4为乙醚与柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液体积比对脂质体包封率的影响图5为扇贝抗氧化肽脂质体的单层膜结构电镜图像图6为扇贝抗氧化肽脂质体的粒径分布7扇贝抗氧化肽脂质体的稳定性
具体实施例方式本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明保护范围并非限于下列实施 例。实施例1取大豆卵磷脂200mg、胆固醇50mg和吐温8060mg，溶解于30ml乙醚中，恒温50°C 减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0. 3mol/L柠檬酸-柠檬 酸钠缓冲液(PH = 3) 10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0. 45微米滤膜过滤后得到空 白脂质体溶液。取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质 体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量为20mg，混合均勻，使用饱和Na2HP04 溶液将PH调高3，使pH到6，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4°C放置保存。
取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子 量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为 97. 29%，使用马尔文电位仪NanO-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子 直径平均为194nm，带负电位，具有较强稳定性，4°C下贮存包封率在一个月内维持在95% 以上。实施例2取大豆卵磷脂150mg、胆固醇30mg和吐温80为20mg，溶解于30ml乙醚中，恒 温50°C减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0. 3mol/L柠檬 酸_柠檬酸钠缓冲液(PH = 3) 10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0. 45微米滤膜过滤 后得到空白脂质体溶液。取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质 体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量10mg，混合均勻，使用饱和Na2HP04溶 液将PH调高3，使pH到6，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4°C放置保存。取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子 量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为 90. 33%，使用马尔文电位仪NanO-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子 直径平均为205nm，带负电位，具有较强稳定性，4°C下贮存包封率在一个月内维持在85% 以上。实施例3取大豆卵磷脂250mg、胆固醇90mg和吐温80100mg，溶解于30ml乙醚中，恒温50°C 减压旋转蒸发掉有机溶剂，使磷脂在蒸发瓶底形成一层薄膜。加入0. 3mol/L柠檬酸-柠檬 酸钠缓冲液(PH = 4) 10ml，继续旋转蒸发水合30min后，使用0. 45微米滤膜过滤后得到空 白脂质体溶液。取空白脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子量超滤膜截留脂质 体，滤出液中检测不到磷含量，说明超滤膜对脂质体能够完全截留。在空白脂质体溶液中加入PCF干粉，添加量为40mg，混合均勻，使用饱和Na2HP04 溶液将PH调高3，使pH到7，超声5min左右，即得PCF纳米脂质体样品，4°C放置保存。取制备好的扇贝抗氧化肽脂质体5ml至Millipore超滤杯中超滤，使用1万分子 量超滤膜截留脂质体，收集一定体积的滤出液，测定其中游离的PCF总量，计算包封率为 77. 21 %，使用马尔文电位仪NanO-ZS90对所制脂质体粒径主要分布及电位进行测定，粒子 直径平均为218nm，带负电位，具有较强稳定性，4°C下贮存包封率在一个月内维持在75% 以上。
权利要求
1.一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体，其特征在于由下列PH梯度法制备扇贝抗氧化肽的 纳米脂质体，扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高达97. 29 %， 粒子直径平均分布在200nm以下，总含量在85%以上，平均Zeta电位为-21. 3mV，稳定性较 强，包封率在4°C下一个月内基本保持稳定；所述PH梯度法制备扇贝抗氧化肽纳米脂质体，包括下列步骤①空白脂质体的制备取大豆卵磷脂、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯溶解于乙醚溶剂中，大豆卵磷 脂重量配比为150-250份，胆固醇重量配比为30-90份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量 配比为20-100份，恒温50°C减压旋转蒸发掉有机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一 层薄膜后，加入适量0. 3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙醚溶剂与0. 3mol/L柠檬酸-柠 檬酸钠缓冲液体积比从1 1到5 1，调节pHl-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟后，用 0. 45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液；②扇贝抗氧化肽脂质体的制备在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉重量配比为5-40份，混合均勻 后，再使用饱和Na2HPO4溶液将pH调高3，pH梯度为3_6，后进行超声5_10分钟，得扇贝抗 氧化肽纳米脂质体，4 V放置保存。
2.根据权利要求1扇贝抗氧化肽纳米脂质体，其特征在于所述乙醚溶剂与0.3mol/L柠 檬酸-柠檬酸钠缓冲液体积比为3 1，大豆卵磷脂重量配比为200份，胆固醇重量配比为 50份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量配比为60份，扇贝抗氧化肽重量配比为20份。
3.权利要求1或2扇贝抗氧化肽纳米脂质体制备方法，其特征在于pH梯度法制备扇贝 抗氧化肽纳米脂质体包括下列步骤①空白脂质体的制备取大豆卵磷脂、胆固醇和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯溶解于乙醚溶剂中，大豆卵磷 脂重量配比为150-250份，胆固醇重量配比为30-90份，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯重量 配比为20-100份，恒温50°C减压旋转蒸发掉有机溶剂，使大豆卵磷脂在蒸发溶器底形成一 层薄膜后，加入适量0. 3mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙醚溶剂与0. 3mol/L柠檬酸-柠 檬酸钠缓冲液体积比从1 1到5 1，调节pHl-4，继续旋转蒸发水合20-40分钟后，用 0. 45微米滤膜过滤后得到空白脂质体溶液；②扇贝抗氧化肽脂质体的制备在步骤①的空白脂质体溶液中加入扇贝抗氧化肽干粉重量配比为5-40份，混合均勻 后，再使用饱和Na2HPO4溶液将pH调高3，pH梯度为3_6，后进行超声5_10分钟，得扇贝抗 氧化肽纳米脂质体，4 V放置保存。
全文摘要
本发明涉及一种扇贝抗氧化肽纳米脂质体及其制备方法，该扇贝抗氧化肽纳米脂质体通过pH梯度法由扇贝抗氧化肽、大豆卵磷脂、胆固醇和吐温80制备而成。本发明扇贝抗氧化肽纳米脂质体为球形单室脂质体，形态均一，包封率高，使用性能稳定，粒子直径平均分布在200nm以下，符合化妆品的透皮吸收要求，可直接作为化妆品材料应用。
文档编号A61Q19/00GK102085157SQ201110029749
公开日2011年6月8日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者刘均忠, 孙谧, 王伟, 王海英, 盛军, 纪晓峰, 郑兰红, 郑媛 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所