融合蛋白文库的产生和筛选方法及其应用的制作方法

专利名称：：融合蛋白文库的产生和筛选方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及产生融合蛋白文库，尤其是免疫毒素文库的方法。本发明还涉及文库本身以及使用这些文库筛选对靶细胞，如癌细胞特异的融合蛋白。此外，本发明涉及免疫毒素亲和力成熟的方法以及获得的免疫毒素。
背景技术：
：融合蛋白，其包括与具有期望效应功能的蛋白质结合的耙细胞结合的蛋白质，有许多应用。当所述效应蛋白是检测试剂时，这样的融合蛋白可用于检测或诊断与靶细胞相关的疾病或在靶细胞上表达的蛋白质。当效应蛋白为治疗剂时，这样的融合蛋白可用于将治疗剂输送到靶细胞。治疗用融合蛋白的例子包括免疫毒素，所述免疫毒素包括与能够杀死癌细胞的毒素相连的癌症特异性的配体。在最近几年已经对许多免疫毒素进行了试验(KreitmanRJ(1999)Immunotoxinsincancertherapy.CurrOpinImmunol11:570-578;KreitmanRJ(2000)Immunotoxins.ExpertOpinPharmacother1:1117-1129;WahlRL(1994)Experimentalradioimmunotherapy.Abriefoverview.Cancer73:989-992;GrossbardML,FidiasP(1995)Prospectsforimmimotoxintherapyofnon-Hodgkin'slymphoma.ClinImmunolImm皿opathol76:107-114;JurcicJG,CaronPC,ScheinbergDA(1995)Monoclonalantibodytherapyofleukemiaandlymphoma.AdvPharmacol33:287-314;LewisJP,DeNardoGL,DeNardoSJ(1995)Radioimmunotherapyoflymphoma:aUCDavisexperience.Hybridoma14:115-120;UckunFM,ReamanGH(1995)Immunotoxinsfortreatmentofleukemiaandlymphoma.LeukLymphoma18:195-201;KreitmanRJ,WilsonWH,BergeronK,RaggioM,Stetler陽StevensonM,FitzGeraldDJ,PastanI(2001)Efficacyoftheanti-CD22recombinantimmunotoxinBL22inchemotherapy-resistanthairy-cellleukemia.NEnglJMed345:241-247)。目前为止试验的大多数抗体已经对已知的癌症标记物产生抗性，其为鼠单克隆抗体的形式，有时是通过分子工程"人源^;，的形式。遗憾地是，它们的靶通常还存在于正常细胞的亚群上，因此仍导致一些非特异性的作用。而且，这些抗体基本上是鼠蛋白，它们被人类患者的免疫系统视作外源蛋白。随后的免疫应答和抗体应答会导致功效丧失或副作用。两种策略通常被用于增强抗体的结合亲合力。一种方法是利用Ab-Ag复合物的结晶结构的分辨率来识别参与抗原结合的关键残基(DaviesD.R.,CohenG.H.1996.Interactionsofproteinantigenswithantibodies.ProcNatl.Acad.Sci.USA.93:7-12)。随后，对这些残基进行突变以增强所述相互作用。然而，如果抗原是未知的，这种方法不能使用。另一种方法是才套f方活体内的抗原刺激，其可促使由B细胞产生的免疫球蛋白的亲和力成熟。在免疫应答的成熟过程中，免疫球蛋白的可变区受到体细胞突变。(McHeyzer-WilliamsM.2003.B-cellsignalingmechanismandactivation.FundamentalImmunology,Fifthedition,pp:195-225).i亥方法只于免疫系统高度特异，其特征在于以非常高的频率引入点突变。其只发生于编码可变区的DNA片段中，并排除了保守区。表达体细胞突变的变异抗体的B细胞接着受到抗原介导的选择，获得更高亲和力的免疫球蛋白的选择。为了在活体外重复该现象，已使用几种方法通过随机的或有目的的过程来引进突变。可使用易错PCR，链改组或突变大肠杆菌抹引进随机突变。(ClacksonT.HoogenboomN.R.,GriffithsA.D.andWinterG.1991Makingantibodyfragmentsusingphagedisplaylibraries.Nature352:624-628;HawkinsR.E.,RussellS丄and"WinterG.1992.Selectionofphageantibodiesbybindingaffinity.Mimickingaffinitymaturation.J.Mol.Biol.226:889-896;LowN.,HolligerP.andWinterG.1996.Mimickingsomatichypermutation:affinitymaturationofantibodiesdisplayedonbacteriophageusingabacterialmutatorstrain.JMol.Biol.260:359-368)。该方法导致了大文库的产生，用显示技术如核糖体、噬菌体或酵母显示技术在其中选择活性克隆(MmL.2000.Applicationsofdisplaytechnologyinproteinanalysis.Nat.Biotechnol.18:1251-1256)。已表明轻链和重链的CDR，尤其是CDR3的耙突变，是增加抗体亲和力的一项有效的技术。CDR3的3~4个氨基酸段或被称为"热点区"的特异区被把向作用突变。Yang等人报导了通过突变4个CDR残基实现了抗-HIVgpl20Fab片段的420倍的增加。(YangW.P.,GreenK.,Pinz-SweeneyS.,BrionesA.T.,BurtonD.R.andBarbasC.F.III.1995.CDRwalkingmutagenesisfortheaffinitymaturationofapotenthumananti-HIV-1antibodyintopicomolarrange.J.Mol.Biol.254:392-403)。VLCDR3中的一个突变的结合C6.5scFv的VHCDR3中的三个突变产生了1230倍增加的亲禾o力(SchierR.,McCallA.,AdamsG.P"MarshallK.W.,MerritH.,YinM.,CrawfordR.S.,WeinerL.M.,MarksC.andMarksJ.D.1996.Isolationofpicomolaraffinityanti-c-erbB-2single-chainFvbymolecularevolutionofthecomplementarydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybindingsite.J.Mol.Biol.263:551-567)。通过靶向作用3~4个氨基酸的突变，2xl()5个克隆的小型文库足以覆盖所有可能的组合。所述文库的大小适合作为直4妄篩选的方法，在该方法中抗体片段可表达为可溶性蛋白并用于功能检测。因此需要有识别与靶细胞特异结合的融合蛋白的改进方法。特别地，需要更好的方法来提高免疫毒素的篩选以及功效。发明概述本发明人们已经研发出了含有编码融合蛋白的核酸序列的重组细胞的新文库，融合蛋白文库，构建所述文库的方法和所述文库的用途。所述融合蛋白包括1)能够与靶分子结合的配体蛋白，以及2)能够检测、作用靶细胞和/或处理含有目标分子的靶细胞的效应分子。产生可用于才全测或治疗疾病的融合蛋白文库大大地便利了有用的融合蛋白的篩选和选择。尤其是，可对整个融合蛋白而不是对融合蛋白的每一部分进行筛选。在一个优选的实施方式中，所述融合蛋白为免疫毒素。制备免疫毒素文库是有益的，因为其允许对完整的免疫毒素在肿瘤细胞结合和/或杀死的功效进行筛选。以前，篩选出紳瘤细胞结合的肺瘤特异性抗体，有用的抗体接着用于制备免疫毒素。然后需要篩选出杀死肿瘤细胞的免疫毒素。因此，免疫毒素库大大地方便了治疗上有用的免疫毒素的选择，并且允"i午方法自动化和适于高通量的方法。因此，本发明的一方面是产生重组细胞文库的方法，其中每个重组细胞包括编码融合蛋白的核酸序列，其包括如下步骤(a)构建一个载体文库，其中每个载体编码一种融合蛋白且包含1)核酸序列，其编码结合到耙分子的配体蛋白，所述靶分子连接到2)编码效应分子的一种核酸序列；和(b)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库。本发明也包括使用本发明的方法产生的重组细胞文库。本发明的另一个方面是构建融合蛋白文库的方法，其包括如下步骤(a)构建载体文库，其中每个载体编码一种融合蛋白且包含l)核酸序列，其编码结合到靶分子的配体蛋白，所述靶分子连接到2)编码效应分子的核酸序列；(b)用载体库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(c)克隆转化的宿主细胞；和(d)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白是宿主细胞表达的可溶蛋白。本发明也包括使用本发明的方法构建的融合蛋白文库。具体地i兌，本发明包括免疫毒素库，其包括来自研究对象的B细胞的多个重链可变区以及多个轻链可变区，并且其中所述文库中的每个免疫毒素具有一个重链可变区和一个轻链可变区，且所述轻链可变区或重链可变区连接到细胞毒素上。本发明进一步的方面筛选结合到靶分子的融合蛋白文库的方法，其包括如下步骤(a)提供本发明的融合蛋白库；(b)将融合蛋白与靶分子接触；以及(c)确定一个或多个融合蛋白分子对靶分子的结合。本发明另一方面是筛选对含有所述靶分子的靶细胞具有细胞毒性的融合蛋白的文库的方法，该方法包括如下步骤(a)提供本发明的融合蛋白的文库；(b)将所述融合蛋白与靶细胞接触；以及(c)确定一个或多个融合蛋白对靶细胞的细胞毒性。本发明还包括可用于检测、治疗或预防疾病如癌症的融合蛋白，其可通过本发明的方法进行识别。此外，本发明包括使用本发明的融合蛋白治疗或预防疾病如癌症的方法，以及使用融合蛋白来治疗或预防疾病力n癌症。本发明的附加方面是制备改良的融合蛋白的方法以用于预防或治疗疾病如癌症。在一个实施方式中，改进的融合蛋白对耙分子或耙细万包具有增加的结合和/或增加的细胞毒性。因此，本发明的一个实施方式是制备改进的融合蛋白的方法，其包括如下步骤(a)提供编码结合靶分子的配体蛋白的核酸序列；(b)在编码配体蛋白的核酸序列中引进至少一个点突变，以形成编石马变异配体蛋白的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码融合蛋白并且包括1)在步骤(b)中制备的变异配体蛋白核酸序列的一种，并连接到2)编码效应分子的核酸序列；(d)用所述载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(g)筛选出与未改性的融合蛋白相比，具有增加活性的融合蛋白的文库，其中增加的活性表示其是改良的融合蛋白。在另一个实施方式中，该方法用于制备改良的免疫毒素且其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码轻链可变区和/或重链可变区的核酸序列中引入至少一点突变，从而构建编码变异的轻链可变区和/或重链可变区的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有变异的轻《连可变区核酸序列中的一个和/或变异的重链可变区核酸序列中的一个，且其中变异的轻链可变区核酸序列和/或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接至编码细胞毒素的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达所述免疫毒素文库，其中所述免疫毒素是所迷宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(g)同步骤(a)中未改性的融合蛋白比较，筛选出对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本领域的技术人员将认识到重链和/或轻链可变区的耙突变可用来构建文库，例如，在轻链和/或重链的可变区的热点区。在对受体结合区发生受体配体突变的情况下或在形成复合物的蛋白的情况下，可进行二聚基序中的突变。在一个实施方式中，制备改良免疫毒素的方法包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核S臾序列；(b)识别轻链可变区中的热点区；(c)在热点区在编码轻链可变区的核酸序列$1进至少一个点突变，以形成编码变异的轻链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素，并且含有步骤(C)中制备的变异的轻链可变区核酸序列中的一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中所述变异的轻链可变区重链可变区核酸序列或所述变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接至编石马细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；①克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中所述免疫毒素宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(h)篩选出同步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素比较，具有对^fe细胞增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的4元体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。在另一种实施方式中，该方法包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和一个重《连可变区的核酸序列；(b)识别重链可变区中的热点区；(c)在热点区向编码重链可变区的核酸序列引进至少一个点突变，以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(c)中制备的变异的重链可变区核酸序列中的一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接至编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；Cf)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中所述免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(h)筛选出同步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素相比，对耙细月包具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明还包括上述方法所进行变化，例如，该方法可结合突变重4连可变区和轻链可变区。在一种实施方式中，重链可变区和轻链可变区可序贯地突变和筛选。在另一个实施方式中，重链可变区和轻链可变区可同时进行突变和筛选。因此，本发明的另一种实施方式是一种制备改良免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码轻链可变区的核酸序列中引进至少一个点突变，以形成编码变异的轻链可变区的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有步骤(b)中制备的变异的轻链可变区核酸序列的一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接至编码细胞毒素的核酸序列；(b)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(c)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(g)筛选出与步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素比较，对耙细月包具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(h)在编码重链可变区的核酸序列中引进至少一个点突变，以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(i)构建一个载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(h)中制备的变异的重链可变区核酸序列中的一个和/或在步骤(h)中识别的改良免疫毒素的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(j)用载体库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(k)克隆转化的宿主细胞；(l)表达免疫毒素库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(m)篩选出同未改性的抗体或免疫毒素相比，对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明进一步包括用于制备改良免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码重链可变区的核酸序列中引进至少一个点突变，以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(c)构建一个载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(b)中制备的变异的重链可变区核酸序列中的一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地接到编码细胞毒素的核酸序列；(d)用载体库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(g)筛选出与步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素比较，对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(h)在核酸序列编码的轻链可变区中引进至少一个点突变，以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(i)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(h)中制备的变异的轻链可变区核酸序列中的一个和/或在步骤(g)中识别的改良免疫毒素的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(j)用载体文库转化宿主细胞以产生重組细胞文库；(k)克隆转化的宿主细胞；(l)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(m)筛选同未改性的抗体或免疫毒素比较，对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。因此，本发明的另一种实施方式是制备改良免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别轻链可变区中的热点区；(c)在热点区向编码轻《连可变区的核酸序列引进至少一个点突变，以形成编码变异的轻链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(c)中制备的变异的轻链可变区核酸序列中的一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接至编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(h)筛选与步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素比较，对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(i)识别重链可变区中的热点区；(j)在编码重链可变区核酸序列的热点区中引进至少一个点突变，以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(k)构建一个载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(j)中制备的变异的重链可变区核酸序列的一个和/或在步骤(h)中识别的改良免疫毒素的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地链接到编码细胞毒素的核酸序列；(l)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(m)克隆转化的宿主细胞；(n)表达免疫毒素文库进行表达，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；并且(o)筛选与未改性的抗体或免疫毒素相比，对乾细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明进一步包括用于制备改良免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别重链可变区的热点区；(c)在热点区向编码重链可变区的核S臾序列引进至少一个点突变，以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(c)中制备的变异的重链可变区核酸序列中一个和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接至编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(h)筛选出同步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素相比，对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(i)识别轻链可变区中的热点区；(j)在编码轻链可变区的核酸序列的热点区中引进至少一个点突变，以形成编码变异的轻链可变区的核酸序列文库；(k)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有在步骤(j)中制备的变异的轻链可变区核酸序列中的一个和/或在步骤(h)中识别的改良免疫毒素的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地链接到编码细胞毒素的核酸序列；(l)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库；Cm)克隆转化的宿主细胞；(n)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；并且(o)筛选与未改性的抗体或免疫毒素比较，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明还包括改良的免疫毒素。此外，本发明包括使用改良的免疫毒素来治疗或预防疾病，如癌症，以及使用本发明改良的免疫毒素治疗或预防疾病^。癌症的方法。从下面详细的描述中，本发明的其它特性以及优点将变得显而易见。然而，应当理解的是，尽管指出了本发明的优选的实施方式，所述具体的描述和具体的实施例，只是通过说明的方式给出，因为从该详细描述，在本发明精神和范围内的各种变化和修改，对本领域技术人员是显而易见的。附图简述现对本发明相关的附图进行描述，其中图1是来自于患者B细胞群的未成熟B细胞的耗竭流程图。从淋巴节中提取的细胞混合物在耗竭前(上图)和耗竭后(下图)用抗-IgD-FITC缀合物进行标记。活细胞的门控识别出两个群，M1和M2，它们分别表示未标记和标记的细胞。标记的细胞的去除表示未成熟的B细胞的去除。图2是免疫文库的诱导克隆的蛋白印迹(Westernblot)分析。将在96孔板中生长并诱导的15个独立克隆的上清液16pL在非还原性条件下负荷到SDS-PAGE凝胶上并使用抗人k轻链-HRP抗体(1/1000)进行免疫印迹化。L和C分别对应于梯(ladder)和VB6-845-FAB-ETA(252—6Q8)的诱导上清液。箭头表示约在75kDa处迁移的全长抗体，其通过克隆表达。图3是亲和力成熟算法。图4是VB6-011-ETA(252-608)CDR-3轻链克隆的蛋白印迹。将分別在含l50ul和1ml的％孔板(W)或在5mL试管(T)中得到的上清液(1616ul)在非还原条件下负荷到SDS-PAGE凝胶中并用兔抗-假单胞菌外毒素A抗体接着用羊抗-兔HRP抗体进行免疫印迹。克隆13是在5ml试管或96孔板中生长和诱导的VB6-011-ETA(252-6Q8)野生型。箭头表示期望大小的全长蛋白。蛋白印迹分析显示13个克隆中有IO个表达了全长蛋白。在试管或孔中的表达水平与野生型的表达水平相似和相当。图5为FMAT筛选。A)VB6-011—ETA(252-6叫将来自诱导克隆和野生型的上清液5|ul加入到含有前一天每孔15000细胞接种的A-375细胞的FMAT板上。在室温下进行6小时温育后，用与AlexaFluor647R缀合的羊抗-人重链加轻链抗体检测VB6-011—ETA(252—608)的结合。孔、板3A1的图像通过FMAT系统技术鉴定为阳性，且野生型(WT)显示出不同的细胞膜染色。在以Y轴表示平均荧光(FL-1)和X轴表示事件数目的散点图显示，与野生型相比，板3的克隆Al的平均荧光和事件数目增加。通过将平均荧光与事件数目相乘计算总荧光。B)VB6-008-ETA(252-6Q8).使用FMAT系统检测另一个Fab-PE片段。将诱导克隆和野生型的上清液10(il加入到含有在前一天以每孔15000的数量接种的MB435S细胞的FMAT板上。在室温下进行6小时温育后，用含有AlexaFluor647@缀合的兔抗-假单胞菌外毒素A抗体以及羊抗-兔抗体的混合物检测VB6-008的结合。板分析表明板l孑LF4中的克隆显示了增加的平均荧光以及事件数目。图6是通过FMAT分析选择的克隆的MTS分析。MTS板用在50|ul体积的培养基中的5000个细胞/孔接种。A-375细胞和MB-435S细胞被分别用来测试VB6-011—ETA(252—608)和VB6-008—ETA(252—6Q8)。在37°C以及5%C02的下持续2小时后，将lO)il的大肠杆菌上清液以及40jil培养基加入孔，使得最终体积为100]Ld/孔。在37°C以及5%(302下用上清液对细胞培育72小时。温育后，向每个孔加入20|iil的MTS试剂(1:20的MTS溶液PMS溶液)，并在37。C以及5。/。CO2条件下显影另外2小时。然后在490nm下读取OD值来确定活性细胞的百分比。图7是流式细胞分析VB6-011-ETA(252—608)在A-375细胞上的亲和力成熟VL克隆的结合。Nl二未诱导的大肠杆菌上清液，3302-用pING3302转化的大肠杆菌，845-VB6-845-ETA(252-608)的阴性对照，WT-具有亲和力成熟轻链的原始VB6-011-ETA(252-6Q8),VL-1到VL-4VBG-Oll-ETA^^,。图8是与野生型和对照相比，通过亲和力成熟的轻链VB6-011-ETA(252-608)-VL2识别硫酸软骨素A的ELISA。图9是对VB6-011的亲和力成熟的结合的轻链和重链克隆的流式细胞计数。PBS阴性对照、VB3-011野生型亲代抗体、VL-2VB6-011-ETA(252.608)野生型重链和亲和力成熟的轻链、来自未诱导的VL-2克隆的N-l上清液、具有亲和力成熟的轻(VL-2)和各重链的20A10、2D3、11F11以及8E8各种克隆。图10是亲和力成熟VB6-011克隆2D3的氨基酸序列(SEQIDNOS:l和2)。图11是与亲代VB6-011和阳性对照VB6-845相比，缀合bouganin的优化的亲和力成熟的纯VB6-011克隆2D3在抗原高阳性(Cal-27)以及抗原低阳性(PANC-1)细胞系上的结合进行的流式细胞分析。，并作对照。具体实施方式(A)定义术语"氨基酸"包括所有的天然氨基酸和改性的氨基酸。这里使用的术语"抗体，，意在包括单克隆抗体，多克隆抗体，和嵌合抗体。抗体可来自重组源和/或在转基因动物内产生。这里所用的"抗体片段"意在包括Fab，Fab'，F(ab')2,scFv,dsFv，ds-scFv，二聚体，微抗体(minibody),双链抗体(diabody),和它们的多聚体以及双特异性的抗体碎片。抗体可采用传统技术破裂。例如，F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶处理抗体产生。对所得的F(ab')2片段进行处理还原二硫键，以产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可形成Fab片^:。Fab,Fab'和F(ab')2，scFv,dsFv，ds-scFv，二聚体，微抗体，双链抗体和双特异性抗体片段和其他片段也可通过重组技术合成。这里的使用的术语"B细胞或B淋巴细胞"指提供体液免疫的淋巴细胞。"成熟的B细胞"是指已被抗原刺激并成熟为产生抗原特异的抗体的浆细胞的B细胞。这里的使用的术语"疾病"指任何会导致具有可识别的迹象和/或症状的医疗病症或紊乱。在优选的实施方式中，所述疾病为癌症。这里使用的术语"融合蛋白"表示重组蛋白，其包括1)结合耙细胞的配体蛋白，其连接到2)效应分子。这里使用的术语"有效量"是指在获得期望结果所需的剂量和时间下的有效的量。融合蛋白的有效量可根据因素如动物的疾病状态、年龄、性别、体重改变。给药方案可调整以提供最佳的治疗应答。例如，可每日施用几次分次剂量或可根据治疗情况中的紧急事件的指示，适当地减少剂量。这里使用的术语"效应分子"表示任何期望能够连接到配体蛋白的分子，所述配体蛋白包括但不限于，治疗蛋白、诊断蛋白以及对辅助配体蛋白连接到效应分子的有用的蛋白或其片段。这里使用的术语"免疫毒素"表示含有轻链可变区和/或重链可变区的融合蛋白，其中轻链可变区或重链可变区被连接至细胞毒素。这里使用的术语"热点区"指在活体内发生体细胞超变的轻链可变区和重链可变区的特异核普酸序列。在一种实施方式中，热点区包括四核苦酸RGYW，其中R可为A或G,Y可为C或T以及W可为A或T。在另一种实施方式中，热点区包括核苦酸AGY。这里所用的术语"文库"指不同的但相关的项目的集合。例如，这里使用的"重组细胞文库"表示不同的重组细胞的集合。在一种优选的实施方式中，每个重组细胞包含编码融合蛋白的核酸序列。在另一个实施例中，"核酸序列文库"表示不同的核酸序列的集合。在优选的实施方式中，文库中的每个核酸序列编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区。这里^f吏用的术语"载体库"表示不同载体的集合。在优选的实施方式中，每个载体包括一个编码配体蛋白的核酸序列，所述配体蛋白可正常运转地连接到编码效应分子的核酸序列。这里使用的术语"融合蛋白文库"表示不同的融合蛋白的集合。在一种实施方式中，免疫毒素文库包括已突变用于亲和力成熟的轻链可变区和/或重链可变区。这里使用的术语"改性的bouganin"表示具有减少的激活免疫应答倾向的改性bouganin，如InternationalPublicationNO.WO/2005/090579和UnitedStatesPublicationNo.2005/0238642所述。在一个实施例中，改性的bouganin具有#^酸序列EFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKY正TEVVDRGLYVVNKVSQISPDMGILKFKSSK(SEQIDNO:88)。这里使用的术语"核酸序列"是指由天然碱基，糖和糖间(骨架)键构成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语也包括含有非天然单体或其部分的改性的或取代的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA),且可包括天然碱基，所述天然碱基包括腺噤呤，鸟噪呤，胞嘧咬，胸腺嘧咬和尿嘧咬。该序列还可含有修饰的碱基。这样的修饰的碱基的例子包括氮杂和脱氮的腺噪呤、鸟噤呤、胞嘧啶、胸腺嘧咬和尿嘧咬，以及黄嘌呤和次黄嘌呤。该术语包括双链或单链DNA或RNA。这里使用的术语"研究对象"表示动物界任何具有B细胞的成员。在优选的实施方式中中，研究对象是哺乳动物。在更加优选的实施方式中，研究对象是人。这里使用的术语"靶分子"表示结合到本发明配体蛋白上的分子。该分子可为靶细胞上的抗原或包括固定化抗原的分离的抗原。这里使用的术语"靶细胞"表示具有结合本发明配体蛋白的靶分子的任何细月包。在一种实施方式中，该细胞为癌细月包。这里使用的术语"治疗癌症"表示抑制癌症细胞的增殖、抑制癌症的扩散(转移)、抑制肿瘤生长、降低癌症细胞的数目或胂瘤生长、降低癌症的恶性程度(例如，增加分化)或改善癌症相关的症状。(B)重组细胞和融合蛋白文库如上所述，构建表达融合蛋白的细胞文库是有益的，因为其有利于筛选用于治疗或诊断应用的融合蛋白。本发明的一些优点包括但不限于下述优点1.使用融合蛋白而不是配体蛋白进行的筛选是有效的，因为其避免了在制备融合蛋白前首先筛选配体的步骤。2.改进了对配体蛋白如抗体的选择，其中在融合蛋白的形式中没有包括所述抗体的结合以及内化特性。3.由于效应分子即使在未纯化的情况下也是有效的，从而可对未纯化的上清液进行筛选。4.允许选择出结合到靶细胞上的未知抗原的融合蛋白。在这种情况下，效应分子可为毒素并且细胞死亡可作为篩选参数。因此，本发明的一方面是构建重组细胞文库的方法，其中每个重组细胞包括编码融合蛋白的核酸序列，其包括如下步骤(a)构建载体文库，其中每个载体编码融合蛋白且包含l)编码结合靶分子的配体蛋白的核酸序列，所述靶分子连接2)编码效应分子的核酸序列；以及(b)用载体文库转化宿主细胞从而产生重组细胞文库。配体蛋白可为能够结合靶分子的任意蛋白，它包括但不限于抗体、抗体片段、受体结合蛋白、转录因子以及复合物形成蛋白。在优选的实施方式中，配体为抗体或抗体片段。可使用的抗体片段包括来自于重组源的Fab,Fab',F(ab'》，scFv以及dsFv片段。抗体或片段可来源于包括小鼠、大鼠、兔、仓鼠以及人的任何物种。嵌合抗体衍生物，即结合非人类动物可变区以及人的恒定区的抗体分子也预期在本发明的范围内。例如，嵌合抗体分子可含有人源化抗体，其包含来自于小鼠、大鼠或其它物种的抗原结合区和人的恒定区。融合蛋白的配体部分可以是免疫球蛋白，其衍生于，即追溯到是免疫球蛋白(或抗体)的起始分子。例如，配体蛋白可通过使用本领域已知的标准技术对免疫球蛋白支架进行改性产生。在另一个非限制性实施例中，免疫球蛋白结构域(如可变重和/或轻链)可连接到非免疫球蛋白支架上。免疫毒素的配体部分不必是免疫球蛋白基的。例如，配体可包括特异地结合至靶细胞的Affibody⑧或其变异体。这样的非免疫球蛋白多肽配体可设计成结合到靶肿瘤相关的分子上。而且，非免疫球蛋白多肽配体可设计为期望的亲和力或亲合力，并可被设计为耐受各种物理条件，包括极限pH范围以及相对高的温度。在生理条件下(如存在肽酶时的37。C下)具有相对较长的半衰期的非免疫球蛋白多肽的设计是有益的。此外，这样的分子或其变异体可显示出良好的溶解度、分子小、合适的折叠和可在易得的、低费用的细菌系统中表达，因此可以商业合理的数量生产。设计非免疫球蛋白多肽的能力在本领域技术人员的技术范围内。参见如U.S.PatentNos.5,831,012和6,534,628，从中获得适用于设计、生产以及选择期望的结合伴侣。配体可为结合靶细胞上的表位的蛋白。表位结合多肽的例子包括-f旦不限于，含有纤连蛋白III型结构域的配体(如参见InternationalPublicationNos.WO01/64942，WO00/34784,WO02/32925)。蛋白A基的亲和力文库也已被用于鉴别表位结合多肽(参见如U.S.PatentNos.5,831,012和6,534,628)并且这样的文库可用于根据本发明来选择那些选择性结合到靶细胞上的多肽。本领域所知的其它类型的结合分子包括但不限于，基于装配重复蛋白结构域的结合分子(如参见Forreretal.,2003,"Anovelstrategytodesignbindingmoleculesharnessingthemodularnatureofrepeatproteins."FEBSLett.539:2-6;Kohletal.，2003,"Designedtobestable:crystalstructureofaconsensusankyrinrepeatprotein."ProcNatlAcadSciUSA.100:1700-1705)。根据本发明，具有随机装配的重复结构域的文库可用于选择选择性结合靶细月包的配体。几种非免疫球蛋白基的、表位结合的多肽和制备和使用这样的多肽的方法为本才支术领i或已知(如参见Eklundetal.,2002，"Anti-idiotypicproteindomainsselectedfromProteinA-basedaffibodylibraries."Prot.Struct.Funct.Gen.48:454-462;Gunneriussonetal.,1999,"AffinitymaturationofaTaqDNApolymerasespecificaffibodybyhelixshuffling."Prot.Eng.12:873-878;Hanssonetal.,1999,"Aninvitroselectedbindingprotein(affibody)showsconformation-dependentrecognitionoftherespiratorysyncytialvirus(RSV)Gprotein"Immunotechnol.4:237-252;Henningetal.,2002,"Geneticmodificationofadenovirus5tropismbyanovelclassofligandsbasedonathree-helixbundlescaffoldderivedfromstaphylococcalproteinA."HumanGeneTherapy13:1427-1439;H6gbometal.,2003,"Structuralbasisforrecognitionbyaninvitroevolvedaffibody.ProcNatlAcadSciUSA.100(6):3191陽3196;Nordetal.,1997,"Bindingproteinsselectedfromcombinatoriallibrariesofan-helicalbacterialreceptordomain"NatureBiotechnol.15:772-777;Nordetal.,2000,"LigandsselectedfromcombinatoriallibrariesofproteinAforuseinaffinitycaptureofapolipoproteinA-IMandTaqDNApolymerase"J.Biotechnol.80:45-54;Nordetal.,1995,"Acombinatoriallibraryofanalpha-helicalbacterialreceptordomain."Prot.Eng.8:601-608;Nordetal,,2001,"RecombinanthumanfactorVlll-specificaffinityligandsselectedfromphage-displayedcombinatoriallibrariesofproteinA."Eur.丄Biochem.268:1-10;Nygrenetal.,1997,"Scaffoldsforengineeringnovelbindingsitesinproteins."Curr.Opin.Struct.Biol.7:463-469;R加nmarketal.,2002,"HumanimmunoglobinA(IgA)-specificligandsfromcombinatorialengineeringofproteinA."Eur.J.Biochem.269:2647-2655;R6nnmarketal.,2002,"Constructionandcharacterizationofaffibody-FcchimerasproducedinEscherichiacoli."J.Immunol.Meth.261:199-211;Wahlbergetal.,2003,"Anaffibodyincomplexwithatargetprotein:structureandcoupledfolding"ProcNatlAcadSciUSA.100(6):3185-3190;Gotzetal.,2002,"Ultrafastelectrontransferinthecomplexbetweenfluoresceinandacognateengineeredlipocalinprotein,aso-calledanticalin"Biochemistry.41:4156-4164;Skerra,2001,"Anticalins:anewclassofengineeredligand-bindingproteinswithantibody-likeproperties."JBiotechnol.200174:257-275;Skerra,2000,"Lipocalinsasascaffold."BiochimBiophysActa.1482:337-350;Skerraetal.,2000,"Engineeredproteinscaffoldsformolecularrecognition."JMolRecognit.13:167-187;Schlehuberetal.,2000,"Anoveltypeofreceptorprotein,basedonthelipocalinscaffold,withspecificityfordigoxigenin."JMolBiol.297:1105-1120;Besteetal.,1999,"Smallantibody-likeproteinswithprescribedligandspecificitiesderivedfromthelipocalinfold."ProcNatlAcadSciUSA.96:1898-1903;PCTInternationalPublicationNo.W097/45538entitled"NovelSyntheticProteinStructuralTemplatesForTheGeneration,ScreeningAndEvolutionOfFunctionalMolecularSurfaces"(relatingtoproductionoflibrariesofpeptidesequencesintheframeworkofastructuraltemplatederivedfromPleckstrin-Homology(PH)domains)。效应分子优选为在靶分子或细胞上具有期望作用的任何蛋白。效应分子的例子包括但不限于，对检测或治疗靶分子或细胞有用的蛋白。诊断蛋白可为能够在合适的测定中检测靶分子的任何蛋白。诊断蛋白的例子包括但不限于，荧光蛋白如焚光素酶或绿色焚光蛋白。使用已知的技术可分析它们的存在，如显微镜或带有合适滤器的扫描荧光板读IW义。治疗蛋白可为在靶细胞上具有期望治疗效果的任何蛋白。治疗蛋白的包括但不限于，毒素、细胞因子、生长激素、酶、肿瘤抑制因子、转录调控因子和核香酸结合蛋白。除了诊断和治疗分子，附加的残基可加到配体蛋白的末端，如带有活性基团的半胱氨酸或重组多肽(KaufmannandWeberskirch,2006,Flennickenetal2005;UnitedStatesPatentNo.6,747,135Nolan等)，以用于加入放射性同位素、荧光标记物或抗癌药物的简单化学修饰。可根据加入的标记物的化学要求进行选择添加的残基。分析包括上述用于放射性的荧光或闪烁计数分析或用于抗癌药物的细胞生长/细胞死亡的分析。本发明的一方面是构建重组细胞文库的方法，其中每个重组细胞包括编码免疫毒素的核酸序列，包括如下步骤(c)构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且包含所述核酸序列文库中的一个轻链可变区核酸序列和/或一个重链可变区核酸序列，且其中所述轻链可变区核酸序列或重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；以及(b)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库。编码轻链和/或重链可变区的核酸序列可从合适的源如B细胞获得。B细胞源可来自有疾病的研究对象或没有疾病的研究对象。在优选的实施方式中，B细胞是来自于患有疾病如癌症的研究对象。在一种实施方式中，所述B细胞源来自患有任何类型癌症的研究对象。在一种实施方式中，癌症包括但不限于，胃癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌(例如导管癌、小叶癌、和乳头癌)肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性'淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和急性髓性白血病)、脑癌、成神经细月包瘤、肉瘤、直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤或黑素瘤。B细胞可从来自于研究对象的样品中分离得到。样品可为来自于研究对象的含有B细胞的液体、细胞或组织样品。在一种实施方式中，样品为'淋巴结组织、'淋巴液或全血。在本发明的另一个实施方式中，成熟B细胞被用作源来构建文库。本领域技术人员将认识到可使用多种方法将成熟的B细胞从研究3于象的样品中分离出来。例如，成熟B细胞可通过不合需要的细胞的阴性选才李或目的细胞的阳性选择从样品中分离出来。在本发明的一种实施方式中，B细胞用对CD19特异性的抗体选择。在本发明的另一种实施方式中，<吏用对IgD特异的抗体将稚B细胞从样品中去除。在进一步的实施方式中，使用对CD38特异性的抗体选择成熟B细胞。为了确保有足够的数目的B细胞用于本发明的方法，可对B细胞定量。例如，如果使用成熟的B细胞，那么可使用CD38的特异性抗体，其是成熟B细胞强烈表达的表面标记物。在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用了超过106个B细胞。可能混合来自于超过一个研究对象的B细月包，以确保在本发明的方法中使用足够的起始数目的B细胞。在本发明的方法中，构建了载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有核酸序列文库中的一个轻链可变区核酸序列和/或一个重链可变区核酸序列。本领域的技术人员将认识到所述轻链可变区核酸序列可以在与重链可变区核酸序列相同的载体或不同的载体上。免疫毒素包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区或重链可变区可正常运转地连接到治疗试剂，如细胞毒素，其或为细胞毒性的、细胞^抑制的或在其它情况下阻止或降低细胞分裂和/或转移能力。正常运转地连接意以保持其轻链可变区或重链可变区和细胞毒素的功能的方式，将轻链可变区或重链可变区连接到细胞毒素。细胞毒素可正常运转地直接或间接地连接到轻链可变区或重链可变区。在一种实施方式中，细胞毒素为具有核糖体-失活活性的多肽，其包括-但不局限于多花白树毒蛋白、bouganin、皂草毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻蛋白A链、异林泻根毒蛋白(bryodin)、白喉毒素、局限毒素、假单胞菌外毒素A及其变异体。当细胞毒素为核糖体-失活蛋白时，免疫毒素必须在结合到癌症细胞时被内化，以为了使蛋白对细胞具有毒性。因此，在本发明的实施方式中，免疫毒素可以被细胞内化。在本发明的一种实施方式中，毒素为bouganin或假单胞菌外毒素A及它们的变异体。在另一种实施方式中，毒素为改性的bouganin或缺少细胞结合区的截短形式的假单胞菌外毒素A。在进一步的实施方式中，毒素为基本缺失T细胞表位的bouganin或截短形式的假单胞菌外毒素A，其由氨基酸252-608以及内质网保留序列构成。在优选的实施方式中，治疗试剂为具有很强毒性的细胞毒素以致在本发明的筛选方法中只需要有限量的免疫毒素来检测其对细胞的细胞毒性。例如，在优选的实施方式中使用了假单胞菌外毒素A,更优选地使用丧失能力的细胞结合区或缺少细胞结合区的假单胞菌外毒素A。在进一步的实施方式中，所述毒素为由氨基酸252-608组成的截短形式的假单胞菌外毒素A。在本发明的方法中使用了重组方法。例如重组方法可用于分离编码轻链可变区和重链可变区编码的核酸序列，并可用于构建载体文库，其中每个载体编码免疫毒素并且含有一个轻链可变区核酸序列和一个重链可变区核酸序列，且或轻链可变区核酸序列或重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列。此外，使用所述载体文库，重组方法可用于构建重组细3包文库。重组方法还可用于构建本发明的融合蛋白文库。例如，本发明的重组细胞可被克隆，然后由细胞编码的融合蛋白可被表达。在优选的实施方式中，融合蛋白被表达为可溶蛋白。本发明的核酸分子可通过已知的方式并入适合的表达载体中，这确保了融合蛋白的良好表达。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒或改性的病毒(例如复制缺陷型逆转录酶病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与使用的宿主细胞相容即可。表达载体"适合宿主细胞的转化"，其表示表达载体含有本发明的核酸分子以及在宿主细胞的基础上进行选冲李以用于表达的核酸分子调控序列，其正常运转地连接到所述核酸分子上。正常运转地连接表示以允许所述核酸表达的方式将核酸连接到调控序列上。此，本发明预期了本发明的重组表达载体，其含有在本发明中使用的核酸分子以及融合蛋白的转录和翻译所必需的调节序列。适合的调节序列可来自各种来源，其包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物，或昆虫基因(例如参见在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述的调节序歹寸)。如以下讨论的那样，合适的调节序列的选择取决于所选择的宿主细胞，这可由本领域技术人员轻易地完成。这样的调节序列的例子包括转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核醣体结合序列，其包4舌翻译起始信号。此外，根据选择的宿主细胞和釆用的载体，其他的序列，如复制起点、附加的DNA限制位点、增强子，和给予转录可诱导性的序列可并入到表达载体中。本发明的重组表达载体也可含有可选择的标记基因，以便于选4奪用本发明方法中使用的核酸序列转化或转染的宿主细胞。可选择的标记基因的例子是编码对某些药物产生抗性的蛋白如G418和潮霉素、P-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光虫荧光素酶，或免疫球蛋白或其部分如免疫J求蛋白优选为IgG的Fc部分，。通过可选择的标记蛋白如p-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或荧火虫荧光素酶的浓度变化监控可选择的标记基因的转录。如果可选择的标记基因编码产生抗生素抗性如新霉素抗性的蛋白，则可用G418选择转化细胞。已插入可选择的标记基因中的细胞会存活，而其它的细胞死亡。这就使得观察和分析本发明的重组表达载体的表达成为可能，特别是确定突变对表达和表型的影响成为可能。应理解的是，可选择的标记可从目的核酸中引入到单独的载体上。该重组表达载体也可含有编码融合部分的基因，该融合部分提供了重组蛋白的增强的表达、重组蛋白的增加的溶解度和通过作为亲和纯化的配体帮助靶重组蛋白的纯化。例如，可在靶重组蛋白中加入蛋白水解裂解位点，以允许在融合蛋白纯化后从融合部分分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括pGEX(AmradCorp.,Melbourne,Australia)、pMal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到重组蛋白上。重组表达载体可被《I入到宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语"用...转化"、"用…转染"、"转化"和"转染"意在包括通过本
技术领域：
中已知的许多可能技术中的一种将核酸(如载体)引入细胞。这里使用的术i吾"转化的宿主细胞"也意在包括能够进行糖基化的细胞，其已经用本发明的重组表达载体进行了转化。原核细胞可用核酸通过如电穿孔或氯化4丐介导的转化进行转化。例如，可通过常规的技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染试剂、电穿孔或纟效注射将核酸引入到哺乳动物细胞中。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)以及其它实验教科书中找到。合适的宿主细胞包括大量的各种真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白质可在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞可在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1991)中找到。此外，本发明的蛋白可在原核细胞如大肠杆菌(Esc/2e/7c/2/aco/,)(Zhangetal.,Science303(5656):371-3(2004))中表达。另外，可使用假单胞菌CPw^fo7woMoy)基的表达系统例如荧光布支单！包菌(i^eM(i6W7o"(aw^/7woresce"力(USPatentApplicationPublicationNo.US2005/0186666,Schneider,JaneCetal)。适用于本发明操作的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(&c由r謂戸scerev函e)/毕赤酵母属或克鲁维酵母(A7w，vera附少ce'力属以及曲霉菌类的各个种。用于在酵母酿酒酵母(S.ce固.w力e)中表达的载体包括pYepSecl(Baldari.etal.,Embo丄6:229-234(1987》、pMFa(KurjanandHerskowitz,Cell30:933-943(1982))、pJRY88(Schultzetal.,Gene54:113-123(1987》和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。酵母和真菌转化的实验方案为本领域技术人员熟知(参见Hinnenetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929(1978);Itoetal.,J.Bacteriology153:163(1983),和Cullenetal.(BiolTechnology5:369(1987))。适用于进行本发明的哺乳动物细胞包括但不限于COS(例如，ATCC号CRL1650或1651)、BHK(例如，ATCC号CRL6281)、CHO(ATCC号CCL61)、HeLa(例如，ATCC号CCL2)、293(ATCC号1573)和NS-1细胞。用于指导哺乳动物细胞中的表达的适合的表达载体通常包括启动子(例如来自病毒材料如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以及其它的转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,B.,Nature329:840(1987》和pMT2PC(Kaufmanetal.,E認OJ.6:187-195(1987》。根据这里提供的教导，也可以轻松地实现启动子、终止子和用于将合适类型的表达载体引入植物，禽类，和昆虫细胞内的方法。例如，在一种实施方式中，本发明的蛋白质可由植物细胞表达(参见Sinkaretal.,J.Biosci(Bangalore)11:47-58(1987),该文综述了发根土壤杆菌(XgraMc^vwm)载体的使用；也可见Zambryskietal.,GeneticEngineering,PrinciplesandMethods,HollaenderandSetlow(eds.),Vol.VI,pp.253-278,PlenumPress,NewYork(1984),该文描述了用于植物细胞的表达载体的使用，包括但不限于PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034)。适合于进行本发明的昆虫细胞包括来自家蚕(Sowx)、粉紋夜蛾(7hc/K^/i^a)或斜紋夜蛾(spwfo&ra)种的细胞和细胞系。可获得的用于在培养的昆虫细胞中表达蛋白的杆状病毒栽体包括pAc系列(Smithetal.,Mol.CellBiol.3:2156-2165(1983))和pVL系列(Luckow,V.A.,andSummers,M.D.,Virology170:31-39(1989》。一些适合本发明的重组蛋白质表达的杆状病毒-昆虫细胞表达系统在PCT/US/02442中进行了描述。单个重组细胞中存在多个载体是效率低下的并且可《)起文库的简并，因此优选地避免。因此，在优选的实施方式中，在本发明的重组细胞文库中的大部分重组细胞每个重组细胞含有来自于载体文库的一个载体，且轻链和重链可变区在同一个载体中。如果轻链和重链可变区在单独的载体中，那么优选地，在本发明的重组细胞文库中的大部分重组细胞，每个重组细胞含有来自于载体文库的两个载体，其中一个载体含有编码重链可变区的核酸序列，另一个载体含有编码轻链可变区的核酸序列。本领域技术人员将认识到可进行常规的测试来最优化转化方法中的每个宿主细胞的载体比例，而该比例将根据DNA、宿主细胞和使用的转化方法而变化。重组细胞文库可用来产生融合蛋白文库。在一种实施方式中，根据本发明的方法构建出了免疫毒素文库。在另一种实施方式中，本发明包括免疫毒素文库，其包括从研究对象的B细胞得到的多个重链可变区以及多个轻链可变区，并且其中文库中的每个免疫毒素具有一个重链可变区以及一个轻链可变区，且轻链可变区或重链可变区与编码细胞毒素的核酸序列相连接。本发明另一方面是结合靶分子的融合蛋白文库的方法，其包括如下步骤(a)提供本发明的融合蛋白文库；(b)将融合蛋白与靶分子进行接触；以及(c)确定一个或多个融合蛋白分子与耙分子的结合。融合蛋白与靶分子的结合可使用本领域已知的技术来确定，这些技术包括但不局限于，流式细胞术、荧光微体积测定技术(FMAT)或酶联免疫吸附试验(ELISA)。可根据效应分子的活性或功能篩选融合蛋白文库。例如，当效应分子为毒性分子时，可筛选出杀死靶细胞的融合蛋白。本发明另一方面是篩选对靶细胞具有毒性的融合蛋白的文库的方法，其包括如下步骤(a)提供本发明的融合蛋白的文库；(b)将融合蛋白与靶细胞进行接触；以及(c)确定一个或多个融合蛋白对耙细胞的细胞毒性。融合蛋白对靶细胞的细胞毒性可使用本领域已知的技术确定，其包括但不局限于，铬-51释放分析、MTS分析、膜连蛋白V细胞凋亡分析或细胞增殖分析如BrDu结合ELISAS。根据效应分子的性质可研发其它合适的分析方法。对诱导细胞生长的分子，可使用细胞生长或增殖分析。对诊断分子如荧光蛋白，可使用已知的分析技术检测这些这些分子。靶细胞可为任何被融合蛋白结合的细胞。所述把通常表达融合蛋白的配体部分识别的靶分子或抗原，，例如疾病相关的抗原。在本发明优选的实施方式中，靶细胞为表达疾病相关的抗原的疾病细胞，在更加优选的实施方式中，靶细胞为癌细胞。在一种实施方式中，癌症包括但不限于，胃癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌，鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌(如导管的癌、小叶癌和乳头癌)、肺癌，非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和急性髓性白血病)、脑癌、成神经细胞瘤，肉瘤、直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤或黑素瘤。在上述方法中可使用合适的对照来确定融合蛋白是否对靶细胞具有包括结合和/或杀死靶细胞的特异性作用。对照可以是任何已知的不表达目的抗原的细胞。例如，如果靶细胞是一癌细胞，则对照可以是非癌细胞。一旦选定一种特定的融合蛋白，有可能用另一种效应分子取代该效应分子。本发明包括使用本发明中的筛选方法识别的融合蛋白，以及使用融合蛋白来预防或治疗疾病，如癌症，或通过施用本发明的融合蛋白来治疗或预防疾病如癌症的方法。本发明还包括使用本发明的筛选方法识别的免疫毒素，以及使用免疫毒素来预防或治疗疾病，如癌症，或通过使用本发明的免疫毒素来治疗或预防疾病如癌症的方法。(C)亲和力成熟本发明的另一方面是改良融合蛋白的方法。本发明人们已经研发出一种新的方法，利用本发明的文库，使用亲和力成熟来增加免疫毒素的结合和/或细胞毒性。本发明的方法包括突变编码融合蛋白免疫毒素的结合区的核香酸序列的步骤。对融合蛋白如免疫毒素而不仅仅是结合配体进行亲和力成熟是有益的，并有利于改良融合蛋白的制备。在本发明之前，制备免疫毒素要进行亲和力成熟抗体，接着用亲和力成熟的抗体制备免疫毒素。本发明有利于该方法，因为其避免了在制备融合蛋白前的筛选抗体或结合配体的额外步骤。此外，突变融合蛋白本身是更有效的，因为其避免了对本身正常工作但在融合蛋白如免疫毒素中不起作用的配体进行选择，。此外，如前所述，本发明的方法不需要靶抗原的先有知识并且允许使用未纯4匕的上清液。在一种实施方式中，配体蛋白是突变的。因此，本发明包括制备改良融合蛋白的方法，其包括如下步骤(a)提供编码编码结合靶分子的配体蛋白的核酸序列；(b)在编码配体的核酸序列中引进至少一个点突变，以形成编码变异配体蛋白的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码融合蛋白并且包括一种在步骤(b)中制备的变异配体蛋白核酸序列，其连接到编码效应分子的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；e)克隆转化的宿主细胞；f)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(g)筛选比未改性的融合蛋白具有增加活性的融合蛋白的文库，其中与未改性的融合蛋白相比，增加的活性表示其是改良的融合蛋白。融合蛋白的增加活性包括但不局限于，融合蛋白对靶分子的增加的结合和/或效应分子的改善的功能。如前所述，测试的效应功能取决于融合蛋白中使用的^:应分子。对诱导细胞生长的效应分子，可使用细胞生长或增殖分析。对抑制细胞生长的效应分子，可如上所述使用细胞生长分析。对在具体的实施方式中，轻链可变区或重链可变区在本发明的方法中被随机突变。在优选的实施方式中，互补决定区在本发明的方法被随机突变。在更优选的实施方式中，轻链可变区和/或重链可变区中的热点区在本发明的方法中被随机突变。在本发明的一种实施方式中，轻链可变区在本发明的方法中被随机突变。因此，本发明包括制备改良的免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码核酸序列的轻链可变区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(b)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到对一种细胞毒素编码的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(g)筛选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。在另一种实施方式中，制备改良的免疫毒素的方法包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别轻链可变区中的热点区；(c)在编码核酸序列的轻链可变区的热点区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(C)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核S臾序列；(e)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(h)篩选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。在本发明的另一种实施方式中，重链可变区在本发明的方法中发生随机突变。在另一种实施方式中，该方法包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码核酸序列的重链可变区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(b)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(g)筛选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明另一种实施方式为一种方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别重链可变区中的热点区；(c)在编码核酸序列的重链可变区的热点区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(c)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(h)，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对乾细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明还包括对上述方法的变动，例如，所述方法可结合变异的重链可变区和变异的轻链可变区。在一种实施方式中，重链可变区和轻链可变区可被序贯突变和筛选。在另一种实施方式中，重链可变区和轻链可变区可同时-故突变和篩选。因此，本发明的另一种实施方式是一种制备改良的免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码核酸序列的轻链可变区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(b)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；Ce)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(g)篩选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对耙细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(h)在编码核酸序列的重链可变区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(i)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(h)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或在步骤(g)中识别的改良的免疫毒素的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连4妄到编码细胞毒素的核酸序列；(j)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(k)克隆转化的宿主细胞；(l)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(m)筛选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对乾细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明进一步包括用于制备改良的免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)在编码核酸序列的重链可变区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(C)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(b)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(d)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(g)筛选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(h)在编码核酸序列的轻链可变区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(i)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(h)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或在步骤(g)中识别的改良的免疫毒素的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(j)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(k)克隆转化的宿主细胞；(l)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(m)篩选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。因此，本发明的另一种实施方式是一种制备改良的免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别轻链可变区中的热点区；(c)在编码核酸序列的轻链可变区的热点区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(c)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(h)篩选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对乾细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(i)识别重链可变区中的热点区；(j)在编码核酸序列的重链可变区的热点区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核S臾序列文库；(k)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(j)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或在步骤(h)中识别的改良的免疫毒素的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(l)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(m)克隆转化的宿主细胞；(n)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；以及(0)篩选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。本发明进一步包括用于制备改良的免疫毒素的方法，其包括如下步骤(a)提供抗体或免疫毒素的轻链可变区和重链可变区的核酸序列；(b)识别重链可变区中的热点区；(c)在编码核酸序列的重链可变区的热点区中引进至少一个点突变以形成编码变异的重链可变区的核酸序列文库；(d)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(c)中制备的变异的重链可变区核酸序列和/或一个在步骤(a)中制备的变异的轻链可变区核酸序列，且其中变异的重链可变区核酸序列或变异的轻链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(e)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(f)克隆转化的宿主细胞；(g)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；(h)以步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素为参照，篩选出对乾细胞具有改良结合和/或改良细胞毒性的免疫毒素库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素；(1)识別轻链可变区中的热点区；(j)在编码核酸序列的轻链可变区的热点区中引进至少一个点突变以产生编码变异的轻链可变区的核酸序列的文库；(k)构建载体文库，其中每个载体编码一种免疫毒素并且含有一个在步骤(j)中制备的变异的轻链可变区核酸序列和/或在步骤(h)中识别的改良的免疫毒素的变异的重链可变区核酸序列，且其中变异的轻链可变区核酸序列或变异的重链可变区核酸序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列；(l)用载体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(m)克隆转化的宿主细胞；(n)表达免疫毒素文库，其中免疫毒素是宿主细胞表达的可溶蛋白；并且(o)筛选出比步骤(a)中未改性的抗体或免疫毒素对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性的免疫毒素文库，其中与未改性的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有增加的结合和/或增加的细胞毒性表示其是改良的免疫毒素。在一种优选的实施方式中，在重链可变区发生突变并筛选前，轻链可变区净皮突变和筛选。因为在一轮突变内对所有可能的组合进行筛选在统计学上是不可能的，本发明预期多轮突变和筛选。在一种实施方式中，混合第一轮筛选中的所有阳性克隆，接着进行可变区的突变形成筛选用的二级文库，其中二文级库要显著地小于一级文库。例如，可进行改組步骤来产生用于筛选的二级文库，其中可变区从阳性克隆中进行随机组合来创建二级文库。在本发明的方法中多个步骤可进行自动化并且与高的生产能力匹配。例如，克隆转化的宿主细胞的步骤、表达免疫毒素文库的步骤以及筛选免疫毒素库的步骤可自动化。一旦改良的融合蛋白或免疫毒素被制备，它可进行改性从而用另一种效应分子来取代该效应分子。例如，对于免疫毒素来讲，该毒素可被实施例4中描述的另一种毒素取代。(D)改良的融合蛋白及其应用本发明还包括使用本发明的方法制备的改良的融合蛋白。具体地说，如实施例4中所述，发明人们用本发明的亲和力成熟方法制备了改良的免疫毒素。一种亲和力成熟抗体的序列见图10(SEQIDNOS:l和2)。因此，在一种实施方式中，免疫毒素包含SEQIDNO:2中所示的轻链可变区和SEQIDNO:1中所示的重链可变区。本发明包括使用改良的融合蛋白来治疗或诊断疾病以及使用本发明的改良的融合蛋白来治疗或诊断疾病的方法。在一种实施方式中，本发明提供一种治疗或预防癌症的方法，包括向患有或怀疑患有癌症的研究对象施用有效量的本发明的融合蛋白。在另一种实施方式中，本发明提供了施用有效量的本发明的融合蛋白用于制造治疗或预防癌症的药物。此外，本发明提供了有效量的本发明的融合蛋白的应用，进一步包括使用另外的癌症治疗剂制造用于同时、单独或序贯治疗或预防癌症的药物。本发明还提供了使用有效量的本发明的融合蛋白来治疗或预防癌症。而且，本发明提供了有效量的本发明的融合蛋白的应用，进一步包括使用另外的癌症治疗剂来同时、单独或序贯治疗或预防癌症。在本发明的一种实施方式中，癌症包括但不限于，胃癌、结肠癌、前列腺癌和宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌(例如导管癌、小叶癌和乳头癌)肺癌非霍奇金氏淋巴瘤多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性'淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和急性髓性白血病)、脑癌、成神经细胞瘤、肉瘤、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。本发明的融合蛋白还可以配制成药物组合物，以适合活体给药的生物相容的形式给予研究对象。这些物质可向包括人和动物的活的有机体施用。治疗有效量的本发明的药物组合物的给药定义为在获得期望结果所必需的剂量和时间下的有效的量。例如，物质的治疗有效量可根据各种因素而变化，例如个体的疾病状况、年龄、性别和体重，以及本发明的重組蛋白质诱发个体期望应答的能力。给药方案可调整以提供最佳的治疗应答。例如，可每日施用几个分次剂量或可根据治疗情况中出现的紧急事件而适当地减少剂量。因此，本发明提供了用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含本发明的融合蛋白和药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一种优选的实施方式中，药物组合物中融合蛋白的效应分子是癌症治疗剂，更优选为毒素。包含本发明的融合蛋白的药物制剂可全身给药。药物制剂可直接向癌症位点施用。根据给药途径，融合蛋白被包衣在材料中，以保护化合物免受酶，酸和可使化合物失去活性的其他天然条件的作用。根据本发明的一个方面，融合蛋白通过直接给药输送到患者。本发明预期以至少足以获得治疗终点的量进行施用的药物组合物，且如果需要，包括药学上可接受的载体。本发明还提供了用于降低手术后并发症危险的方法，该方法包括在治疗癌症的手术之前、过程中或之后施用有效量的本发明的融合蛋白。这里描迷的组合物可通过制备可施用于研究对象的药学上可接受的组合物的已知方法制备，这样有效量的活性物质与药学上可接受的载体在混合物中组合。合适的载体例如在Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington'sPharmaceuticalSciences,20thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,USA,2000)中被描述。在此基础上，单独组合物包括但不限于含在具有所述物质与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂组合的溶液，其包含在与生理流体组成的具有合适pH和等渗的緩冲液中。药物组合物包括但不限于，冻千粉或水的或非水的无菌可注射溶液或悬浮液，其可进一步含有抗氧化剂緩冲液、抑菌剂和使组合物与预期的受体的组织或血液基本相容的溶质。可存在于这样的组合物中的其它成分包括如7Jc、表面活性剂(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。临时酉己制的注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒、片剂或浓缩溶液或悬浮液制备。融合蛋白可以作为例如包括但不限于冻干粉的形式供给，其在给予患者前用无菌水或盐水重建。本发明的药物组合物可含有药学上可接受的载体。合适的药学上可々姿受的载体包括基本上为化学惰性和无毒的组合物，它们不干扰药物组合物的生物活性的有效性。合适的药物载体的例子包括但不限于，水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(l(2,3-二油酰氧基)丙基)N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和脂质体。这些组合物应当舍有治疗有效量的化合物和合适量的载体，从而提供可向患者直接施用的形式。组合物可以是药学上可接受的盐的形式，其包括但不限于与自由氨基形成的盐，例如那些衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与自由羧基形成的盐，例如那些衍生自钠、钾、铵、4丐、氢氧化4失、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。在本发明的各种实施方式中，药物组合物是直接全身地施用或直接向肿瘤区施用。该药物组合物可用于治疗患有癌症的动物包括哺乳动物，优选为人的方法当中。^皮施用的融合蛋白的剂量和类型将取决于各种因素，这些因素在人类研究对象中可以容易地监控。这样的因素包括癌症的病因和严重禾呈度(等级和阶段)。使用本发明的融合蛋白的癌症治疗的临床结果可容易由相关领域内的技术人员，如医师所辨别。例如，用于测量癌症的临床标记的标准医学检测可作为治疗功效的强有力的指示物。这样的检测可包括但不限于身体检查、操作量表、疾病标记、12-导联心电图、肺瘤测量、組织活检、细胞检查、细胞学、肿瘤最长直径计算、射线照相术、肿瘤的数字成像、生命体征、体重、不利事件的记录、传染性发作的评估、伴随药物治疗的评Y介、疼痛的品家、血液或血清化学、尿分析、CT扫描以及药物动力学分析。另外，包含融合蛋白和另一种癌症治疗剂的联合疗法的协同效果可通过比较研究进行单一疗法的患者确定。本发明的另一种实施方式是用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含有效量的本发明的融合蛋白，以及使用这种融合蛋白来治疗癌症的说明。以下非限制性的实施例对本发明是说明性的实施例实施例1:免疫文库的构建和筛选使用可溶性表达体系构建文库。通过RT-PCR，使用从癌症患者分离出的淋巴节组织进行VH和V^CL片段的扩增。来自于正常的研究对象或患有其它医学疾病的研究对象的样品是期望的，这取决于需要鉴定的抗体类型或细胞表面耙。当文库是从浆细胞获得时，淋巴结组织是合适的B细胞源，因为它是B细胞成熟为浆细胞的位点，所述浆细胞在暴露于抗原后，活跃分泌抗体。来自浆细胞的mRNA的RT-PCR扩增产生cDNA，其编码应答肿瘤而产生的抗体的可变区。用于文库筛选所选择的重组布置为VB6-变异的假单胞菌外毒素A(ETA(252-6Q8))形式，其是Fab形式的抗体片段，其连接到截短的假单胞菌外毒素A细胞毒素，其被附加改性以包括KDEL内质网保留序列。Fab是具有高度官能的稳定实体。ETA提供了这类构建物通常观察到的表达水平的合适的敏受性，可允许选择内化的克隆，与细胞毒素或细胞增殖分析如MTS和AnnexinV相容并且也适合于正常组织和肺瘤組织的微阵列(TMA)。1.在扩增前从患者样品中去除稚B细胞B细J包分化和成熟的过程包4舌几个阶段(MolecularImmunology,SecondEdition.EditedbyHamesB.D.andGloverD.M.IRLPress)。早期的阶段发生在骨髓中，在这里前-B细胞成熟为处女型B细胞，在其表面存在非常大的非抗原诱导的、基本上是随机的所有表面Ig。这些细胞迁移到脾和淋巴结，在这里它们暴露于抗原并且相关的克隆被扩大，最终成熟为到浆细胞。获得可进行更为有效篩选的较小文库的一种方法是对来源于浆细胞的mRNA进行扩增。这些浆细胞参与抗体的主动产生，其中抗体来自于抗原攻击的B细胞的克隆增殖。对来自在它们的表面存在非抗原谤导的抗体群的稚B细胞群进行mRNA扩增会产生很大的文库，其需要更长的时间来进行筛选并且可能产生更多不相关的克隆。尽管有时期望筛选这才羊的"非诱导"文库，但要被用作扩增模板的样品中去除稚B细胞会产生更高比例的抗原诱导克隆。稚B在它们的表面表达IgD，其可用作标记(FundamentalImmunology,FifthEdition,W.E.Paul,LippincottWilliams&Wilkinspublishers,pi26)。当细胞成熟为活性B细胞并随后成熟为浆细胞时，该标记就会失去。因此，通过使用可商业获得的生物素化抗-IgD单克隆抗体和随后的捕获步骤抗^原去除稚B细胞。该步骤的功效可使用缀合到FITC上的抗-IgD抗体通过流式细胞4义进行纟企验。2.对患者样品中可用浆细胞文库大小的评估在对浆细胞文库进行实际扩增步骤前，通过定量用作模板的临床样品中的可用浆细胞的文库大小估计预期产生的文库大小。例如，通过流式细胞仪用作为一抗的抗-CD38标记的细胞可完成该过程。CD38是由浆细月包强烈表达的表面标记(HaradaH.H.,KawanoM.M.,HuangN.,HaradaY.,IwatoK.,TanabeO.,TanakaH.,SakaiA.,AsaokuH.andKuramatoA.1993Blood81:2658-2663)。产生大浆细胞群的临床样品是最有用的。^106菌落形成单位的最终的文库大小是期望的，因此类似大小的用作模板的样品浆细胞文库是期望的。为了得到期望数目的浆细胞，也可能将几个癌症患者的样品混合到一起。如果样品是从几个癌症患者混合得到，这也会使筛选不含有对肿瘤免疫应答产生的抗体文库的机会最小。3.扩增来自患者样品的VH和VlCl片段，接着进行克隆通过使用RT-PCR，使用提取的临床样品mRNA作为模板，使用在5，和3，端含有限制位点的特异引物，扩增每条轻链(k和X)和重链(力。使用合适的限制酶将得到的片段随机克隆到Xoma栽体。文库的大小是重要的。对于标准文库筛选实验方案来讲，具有^106CFU(菌落形成单位)是期望的。为了达到此目的，进行几个步骤。将扩增的材料连接到载体中该步骤通常是文库创建中的瓶颈(DirectedEvolution,LibraryCreation,MethodsandProtocols.MethodsinMolecularBiology,vol.231,editedbyFrancesHArnoldandGeorgeGeorgiu,2003,HumanaPress)。因此，需要高效的连接以及仔细的优化。试验消化的插入片段/载体的几个比率。用于库构建的连接反应在最佳条件下进行温育(ArnoldandGeorgiu,2003)。连接的效率使用琼脂糖凝胶电泳进行半定量评价和通过电穿孔进入大肠杆菌以及平板计数转化的细落来进行定量评价。连接的DNA转化进大肠杆菌电穿孔是一种有效和快速的转化方法。参数如波形、电压以及阻抗能够容易被最优化。对于该方案，使用商业获得的电转感受态细胞。电穿孔过程中连接的DNA/电转感受态细胞的比率每次转化使用最少量的DNA是期望的，同时任然能够获得合适大小的文库，进行合理次数的单次电穿孔。对连接的DNA/电转感受态细胞的比率进行优化直到获得对每个测序的菌落来说具有清楚和明确的序列。接着通过比较大约20个不同的菌落序列，可能评价最终文库的简并度，如果有的话。(这不适用于前述的期望出现简并的重新涂板的菌落)。在这个阶段，评价该方法的效率并且确定是否已经构建了有代表性的以及合适大的文库。4.筛选文库通过用自动菌落挑取仪，接着将菌落接种到微孔中含有的液体生长培养基中，对库进行有效的筛选。可使用自动液体处理仪对液相进行有岁史处理。在这个阶段，确定每个板上不会引起过度拥挤的平板接种的细月包数量是重要的。确定出给定大小的文库有效平板接种所需的平板数目。使用T形的一次性的无菌环进行平板接种。期望的筛选速率为104克隆/天。因此，对106CFU的全库进行筛选需要45个月。在筛选过程中，VB6-845ETA(252-608)被用作阳性对照，没有插入物的pING3302载体作为阴性对照。文库构建和筛选方法的一个重要特征就在于能够获得随机配对的扩增的可变区，其随后一皮克隆到所选择的载体中，在本例中载体为pING3302XOMA。因为可能的组合这能够构建出非常多样性的文库。几乎不可能在一轮中筛选所有的组合。因此，在一轮后选择的阳性克隆不可能为VH和Vl区的最佳可得組合。进行重新重组步骤可创建和选择扩增区的最好组合。这可通过如下过程获得将第一轮篩选出来的所有阳性克隆混合在一起，随后对可变区进行扩增和随机克隆至可能显著小于一级文库的二级文库。如果克隆产生比阴性对照更强的信号则被认为是阳性，其中阴性对照为最小的阀值。如果获得大量的阳性体，则对克隆进行分级并才兆出最好的。筛选过程可在几个阶段内进行。首先，通过FMAT分析对整个文库进行筛选以获得细胞系内细胞凋亡的有效诱导，其中细胞系与原始文库中的癌症类型相匹配。对第一轮FMAT筛选的作为阳性的克隆再通过第二次FMAT分析进行筛选。对通过两4仑FMAT'歸选后仍在选择的阳性细月包系上保持阳性的克隆，再通过针对阳性细胞系的FMAT筛选阳性细胞系，选择阴性细胞系作为癌症无关的指示。^接着通过对肿瘤细胞的流式细月包术结合，和随后通过针对正常细胞的筛选，筛选通过第三轮的每个克隆。通过MTS确定所选择细胞的效价，然后在肺瘤组织;欽阵列(TMA)上筛选4寻到最终效价的克隆。通过MTS测试没有发现的效价但具有高的癌症选捐:性的克隆仍可以保留以用于不同的研发途径如癌症诊断或癌症抗原发现。实施例2:克隆免疫文库的构建使用大肠杆菌可溶性显示构建出适用于高通量筛选的免疫文库。该方法是基于抗体可变区的RT-PCR扩增，使用的是来自于结肠癌患者的-淋巴结的浆B细胞富集群。y和k链中可变区的cDNA被随机克隆到XomapING3302载体中，成为Fab-ETA(252-6()8)构建物并且被转化到大肠杆菌细胞中。通过对100%的测试克隆中的每条链的PCR扩增验证了构建出的2.105克隆的文库。此外，序列显示所有的克隆均具有唯一的CDR环，这确l呆了免疫应答被多样性的递呈。此外，在使用L-阿拉伯糖进行诱导后，在96孔板内生长的克隆上清液中检测到合适的表达水平。与截短的假单月包菌外毒素A的融合将允许通过细胞凋亡的测量来选择内化克隆，并且将适合于TMA的筛选方法。1.来自结肠癌患者淋巴结的桨b细胞的富集浆B细胞产生抗原特异性的抗体并因此是构建免疫文库的目的群。结合到IgD细胞表面标记的抗-IgD抗体被用来耗竭稚B细胞。从结肠癌患者转移的三个冷冻的淋巴结-故用作浆B细^/源。在37。C水浴条件下对併:存在DMSO中的淋巴结的冷冻细胞进行快速解冻并将其稀释在47mL的DMEM+10%FBS中。在2000RPM进行3分钟的离心后，使用20mL的DMEM+10%FBS对细胞进行洗涤并将其重新悬浮于1mL的相同培养基中。与生物素进行缀合的两种抗体抗-IgDmAb(250ng)(1)和抗-THY-lmAb(50ng)(2)被分别用来耗竭稚B细胞和T细胞。在置于水上1.5小时后，细胞被离心并重悬浮1mL新鲜新鲜的DMEM+10%FBS中。将等体积的涂有链霉亲和素的磁珠(使用lmL的PBS緩沖液预洗3次)加入到细胞中，在偶尔搅拌(3)的条件下在水上温育1小时。在温育时间结束时，磁分离连接到珠上的稚B细胞和T细胞，并收集富集的浆B细胞的上清液，将其保存于水上。在单独的实验中，在耗竭前和耗竭后通过流式细胞仪用抗IgD-生物素化抗体来评估耗竭效率。如图1A所示，在耗竭前确定出两个群体，IgD阴性(Ml,66.34%)和IgD阳性(M2,33.75%)。在4毛竭后，IgD阴性群的比例从66.34%增加到99.35%，这表明在耗竭后没有细胞被标记。2.mRNA提取和cDNA合成使用01igotexTMkit(》从具有S0。/o生存力的2.6x106细胞的库中提取浆B细胞的mRNA。简单地说，在4。C以2000rpm离心细胞3分钟并重新悬浮在600pL的裂解緩冲液中。然后将细胞裂解产物与17.5的预热01igotexTM颗粒在室温下温育10分钟。然后用洗涤緩冲液洗涤01igotexTM颗粒并在50nL洗脱li冲液中洗脱结合的mRNA。使用SuperScriptlll逆转录酶试剂盒按提供的指示合成第一链cDNA。简单地说，将8fiL提取的mRNA、1随机六聚体混合物以及1的dNTP在65。C条件下温育5分钟。cDNA合成混合物含有下面的成4分2nL10XRT緩冲液、4MgCl2、2pLDTT、1RNAseOut以及1pLSuperScriptm酶，将该混合物加入到RNA/引物混合物并在25。C下温育10分钟。第一链cDNA在50。C下合成50分钟时间。然后在85。C下5分钟停止反应，在冰上进行冷却并进行离心。随后在37。C下对RNAseH处理20分钟，将cDNA储存在-20。C。3.文库的构建为了创建Fab-ETA(252.608)结肠免疫文库，通过PCR设计PelB-VH和Vl-QXk)的片段，随后通过亚克隆步骤与PelB前导顺序融合(VH)并分别使用EcoRI/ApaI和SfiI/XhoI限制性位点插入到EcoRI-ApaI-CH-ETA(252-6-8)-PelB-SfI-XhoI/3302质粒中。为了捕获淋巴结中发生的大部分免疫应答，在pcr反应中使用对应于不同亚类的k和y链的的5'引物的混合物。用于y和k链的3'引物被设计成分别退火进入链的恒定区和链的3，末端。使用从浆B细胞中提取的cDNA，通过PCR对Vh和Vx,CL(k)片段进行扩增。引物含有用于Vl-C"k)片段克隆的限制性位点。扩增的NcoI-VII-ApaI片段被向下游融合至含于亚克隆载体内含有的EcoRI-ETA(252-608)IV-NcoI区。通过该处理，生成了适用于克隆的带有五coMM/mI末端的PelB-Vn片段。PCR扩增的NcoI-Vh-I片段不能直4妄克隆入通用克隆载体(UniversalCloningVector),EcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PeIB-SfiI-XhoI/3302中，这是由于在该载体内Ncol位点是两个。然而，该位点已经从亚克隆载体中去除。PelB-VH和VL-Cl(k)这两个片段均可以通过在EcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PeIB-SfiI-XhoI/3302DNA质粒中的EcoRI和SfiI/XhoI限制性位点连接，并且该连接反应被转化到10B细胞。轻链和重链的连接的转化体的数目均为2xl05。相反，同前述相比，没有插入物的同样的连接反应具有少于10%的转化体。中对最终的质粒群进行转化，含有被随机克隆成Fab-ETA(252—6q8)的重链和k链的质粒群被转化到JM109中，使用从10B细胞纯化的2pL超螺旋DNA的每一个单独的电穿孔产生约0.5'105克隆(29)。VH和VL-djc区的PCR扩增a.PelB-Vu片段使用两步法对PelB-VH片段进行组装，该法涉及PCR扩增Vh区，再通过亚克隆步骤融合PelB前导序列y引物混合物1.5'Vh:CCAGCCATGGCGCAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG(SEQIDNO:3)2.5,VH:(SEQIDNO:4)3.5，VH:(SEQIDNO:5)4.5，VH:(SEQIDNO:6)5.5，VH:(SEQIDNO:7)6.5,VH:(SEQIDNO:8)7.5,VH:(SEQIDNO:9)8.5'CCAGCCATGGCGSAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGGCCAGCCATGGCGCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGCCAGCCATGGCGSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCCAGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGGCCAGCCATGGCGCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCCAGCCATGGCGCAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGGVh-CCAGCCATGGCGCAGGARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQIDNO:10)9.5，VH:CCAGCCATGGCGCAGCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG(SEQIDNO:11)10.3'CH:注意为了使用单一引物分离出尽可能多的变异体，对某些共有引物使用了混合的;絲R=A+G,D=A+T+G,Y=C+T,H-A+C+T,V=A+C+G，K-T+G,S=C+G,W=A+T。Wcol和的限制性位点以粗体表示。所有的PCR反应均包括50inL的反应体积，其中含有10XPCR緩沖液5uL2mMdNTPs5uL引物5'20pmol引物3，20pmolTaqDNA聚合酶，EasyA2.5UDNA10jiLPCR的循环条件为95°C1分钟，62。C1分钟，以及72°C1分钟，总共25个循环，然后在72°C下作最后延伸10分钟。引物混合物的浓度表示每个单独引物的浓度之和。片段的构建包括下面的步骤步骤1PCR反应以合成的cDNA(10)nL)作为模板，涉及到引物1~9和引物10的混合物。这生成了450bpVH片段的混合物，其两侧为5，端Wcol位点以及3'端^oI位点。步骤2为了用先前得到的VH片段融合PelB前导序列，需要进行亚克隆步骤。亚克隆载体的设计如下将EcoRI-XhoI从通用克隆载体EcoRI-Apal-QrETA(252-608)-PelB-Sfil-Xho1/3302中切离出来并插入到类似消化的pSV-73辅助质粒中。将含有不需要的Ncol限制点位的SalT-XhoI片段切除，由于SalI和Xhol具有相匹配的末端，从而载体随后可进行自连。约100ng的凝胶纯化VH片段和200ng的亚克隆载体用Apal(1.5|uL)在总体积为20|uL以及25°C下进行消化2小时。然后将温度上升到37。C并加入Nco1(1.5pL)进行进一步温育2小时。所有的消化产物均经过凝月交纯化。消化的y重链50ng与100ng消化的质粒在16°C和2000单位的T4DNA连接酶存在条件下进行连接过夜。然后使用ZymoResearchConcentrator试剂盒对连接反应混合物进行纯化并洗脱至终体积为16nL。用2纯化的连接反应对EasyShockM10B电转感受态细胞进行电穿孔并重新悬浮于lmL的SOC培养基中。将转化混合物的1/10和1/100稀释液涂平板到添加氨千青霉素(100pg/mL)的LB琼脂板上，以对连接效率进行分析，。将质粒从lmL的过夜培养液中提取出来。提取出的质粒(900ng)用1.5|uL的EcoRI在总体积为20|liL，37°C下下进行消化2小时，用ZymoResearchConcentrator试剂盒进行纯化并用1.5jiL的Apal在总体积为20jaL,于25。C下进行消化2小时。b.k轻链使用cDNA(10iaL)做为模板，用正反应的引物1~6和逆反应的引物7进行PCR反应来构建和扩增Vl-Cl(k)片段，。加入Sfil和Xhol限制性位点(黑体)来助于VL-Cl(k)克隆入EcoRI-ApaI-CH-ETA(252—608rPelB-SfiI-XhoI/3302质粒。k轻链含有VI区以方便克隆。1.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCAT2.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCATCACGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC(SEQIDNO:14)3.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCAT4.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCATCACGATATTGTGWTGACRCAGTCTCC(SEQIDNO:16)5.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCAT6.5，VL:TCGCGGCCCAACCGGCCATGGCGCACCATCATCACCAT逆向(粗体表示Xhol限制性位点)7.3，VL:<CGGG(SEQIDNO:19)PCR的循环条件为95°C下1分钟，62。C下1分钟和72。C下1分钟，进行25次循环，随后在72。C下进行10分钟的最后延伸。在1%的琼脂糖胶中的电泳被用以分离扩增的Pe旧-VH和k轻链PCR产物。对目的带进行切离，使用ZymoResearchTM试剂盒进行纯化并在洗脱至16nL。2|LiL被克隆进TOPOPCR2.1克隆载体并在10F大肠杆菌细胞中进行转化。对转化的大肠杆菌质粒进行分离并使用CEQ测序仪测序，作为下面描述的测序验证步骤的一部分。验证为了确保文库的质量，需进行三个测试在每次连接反应后进行PCR筛选，在插入表达载体前和在文库组装后对随机选4奪的重链和k链的独立克隆进行测序和在96孔净反中表达。文库的构建K轻链克隆一旦通过测序证实了序列多样性，则使用唯一的限制性酶Sfil和Xhol将k链PCR反应物，约100ng，克隆进通用克隆载体EcoRI-ApaI-CH-ETA(252.6Q8rPelB-SfiI-XhoI/3302。在BSA存在条件下，将k链PCR反应物和EcoRI-Apal-CH-ETA^52-6,-PelB-Sfil-Xho1/3302质粒与Xhol(1.5nL)终体积50pL中在37°C下温育2小时，随后加入1.5的Sfil。在50。C下温育2小时后，将消化的k轻链和质粒加到琼脂糖凝胶上，使用ZymoResearch凝胶纯化试剂盒进行纯化并洗脱至16^L。消化的k轻链50ng与100ng消化的质粒在16°C和2000单位的T4DNA连接酶存在下进行连接过夜。然后使用ZymoResearchConcentrator试剂盒对连4妻反应混合物进行纯化(8)并洗脱至最终体积为16pL。对EasyShock10B电转感受态细胞(9)使用2的纯化连接反应物进行电穿孔并重新悬浮于lmL的SOC培养基中。通过将转化混合物的1/10和1/100稀释液涂平板到添加四环素(15(ig/mL)的LB琼脂板上，分析连接效率。此外，使用在4B部分中描述的引物混合物通过PCR筛选出存在k轻链的10个独立的菌落。剩余的转化细胞在37。C下生长在50mL存在15吗/mL四环素的2xYT中。在过夜温育后，从1mL过夜培养液中提取CH-ETA(252-608rPdB-VL-Cl(k)/3302质粒。a.PelB-VH克隆前面的双消化的(EcoRI和Apal)PelB-VH片段100ng被连接到CH-ETA(252-608)-PelB-VlX:l(k)/3302载体中，该载体已使用上述同样的酶进行了预消化。除了使用y引物外，进行了如上所述的连接的纯化、转化和PCR篩选。b.JM109转化克隆的质粒通过Zippy少量提取试剂盒纯化并电穿孔进电转感受态JM109菌株中，在预实验中已发现该菌抹是最高的表达宿主。将转化混合物的1/10和1/100稀释物涂板到含有15|ug/mL四环素的LB琼脂板上后，通过计算菌落数目估算得到文库的大小。C.对独立克隆的重链和K链的测序对含有PelB-VH和K链插入的独立克隆进行测序，以确定在所构建的文库中存在最小冗余。如表1和2所示，每条链的CDR环氨基酸序列都是唯一的。如所预期的，获得了重链的CDR3区的长度变异性，其最小为ll个残基，最大为19个残基。此外，还显示出了K和重链片段的亚类。d.免疫文库克隆的蛋白印迹分析在文库筛选过程中所使用的条件下诱导后，通过蛋白印迹对15个独立克隆的表达水平进行评定，。(图2)用单个转化的JM109菌落/孔接种含有150|iL添加15吗/mL的四环素2xYT的96孔板的孔,并且在37。C恒定摇动下过夜温育。将过夜生长的种子培养液20nL加入到含有130nLTB的孔中，并在37。C下温育78小时。然后，用17.5pL的2。/。L-阿拉伯糖进行诱导培养物并在25°C下进行过夜温育。在5000RPM条件下离心30分钟后，将来自于15个不同孔的16pL上清液在非还原条件下加载到SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶中，并使用缀合至HRP上的抗-人k轻链抗体进行蛋白印迹分析来验证重组蛋白的存在与大小。检测到3个克隆具有全长表达的Fab-ETA(252-608)，并且表达水平与阳性对照VBS845-Fab-ETA(252-608)类似。观察到另外2个克隆具有低水平的表达(在右侧印迹的泳道3和6)。此外，还检测到截短产物并且其带型类似于阳性对照。4.基于免疫毒素文库的结肠癌的筛选扩增每个独立的克隆并通过向培养基中96孔板中的一个孔的培养基加入阿拉伯糖表达该克隆。检测每个孔的上清液，获得诱导所选择的靶细胞系的细胞凋亡的能力FMAT分析向SW-480肿瘤细胞(前面在96孔板中接种的)中介入每孔上清液10|uL。为了提供定量数据，用AnnexinV和centriRed染色进行死/或分析。野生型的VB6-845-ETA(252-608)用作阳性对照。FMAT板在37。C下温育24小时。将20fiL的Annexin陽Alexa画Fluor647/Centri隱Redtm溶液加到毎个孔中，并且所述平板在室温下在黑暗中温育1小时。接着在FMAT读取仪上度数。细胞凋亡阳性的细胞会应该结合。所有的细胞被Cetri-Red染料染色。。/。细胞凋亡被计算为Aimexin阳性事件除以Cetri-Red阳性事件数的弁比率。如果细胞凋亡超过含有空表达载体(pING-3302)细胞上清液的阴性对照20%以上，克隆一皮认为是阳性的。然后对在第一次筛选中为阳性的所有克隆在相同的条件下进行再筛选。通过前两轮为阳性的细胞随后在第三轮中进行测试，该轮测试包括阳性(癌症类型匹配的)和阴性(无关癌症类型)细胞系。FMAT筛选的3阶段的结果显示于表3。通过FMAT分析的所有3阶段的克隆被进一步纯化和验证。FMAT筛选呈阳性克隆的纯化培养表达所选择的阳性克隆的细胞。将2xYT+四环素(25mg/L)的100mL初始培养液均匀地分在两个振荡培养瓶中，使用储存在10%甘油中的1mL冷冻细胞储备液接种并且在振荡条件下于37。C进行过夜的生长。第二天，将6L的TB培养基分在12个振荡培养瓶中(每个0.5L),使用60mL的初始培养物(每个5mL)进行接种并且在振荡条件下于37。C进行生长直至OD6c)q-2.0。在该阶段，加入阿拉伯糖至最终浓度为0.2%，接着在振荡条件下于25°C进行温育对蛋白表达进行诱导。次日，于4°C条件下，以8000RPM(SorvallTM)离心50分钟去除细胞，随后通过筒式过滤器(SartoriusTM)进行粗过滤。使用30KDaMWCO薄膜，NaP0420mMpH-7.5緩冲液对上清液进行渗滤，使体积从6L减少到0.5L。下一个阶段包括使用Ni^柱(12mL)进行纯化。第一个步骤包括向柱中加入MC120.1M(5xCV)，随后用H20(10xCV)洗涤并用5xCV的NaP0420mM、NaCl150mMpH-7.5緩冲液进行平衡。以5mL/min的速度载入渗滤材料，然后先用10xCV的NaP0420mM、NaCl150mMpH-7.5緩冲液洗涤，然后再用8xCV的NaPO420mM、NaCl150mM、咪唑100mMpH-7.5洗涤。用NaP0420mM、NaCl150mM、咪唑250mMpH-7.5洗脱柱子并收集到10x2mL的馏分，测量OD28。咖来选择哪一种馏分用于下一个阶段筛选，下一个阶段包括Q-Sepharose(3mL)柱。在载入含有上步馏分的稀释的蛋白之前，使用NaPO420mM、NaCl90mMpH-7.5平衡柱子。在NaP0420mMpH-7.5中进行稀释以得到类似于平衡緩沖液的导电性。载入样品后，使用15xCV的平衡緩沖液洗涤柱子并用NaP0420mM、NaC1500mMpH-7.5緩冲液进行洗脱。收集馏分(10x2mL)并存储在-20。C下过夜。第二天，将上阶段的洗脱物加载到S-200大小排阻柱中，该柱事先用NaP0420mM、NaCl150mMpH-7进行沖洗。在通过100mL的空隙体积后收集馏分(10mL每个)。按照SOP的2丄55和2.1.63，使用检测用的a-KappaHRP-缀合抗体，通过考马斯和蛋白印迹法来估计;〖皮处理材料的纯度和同一性。最后，使用旋转柱将纯化的材料浓缩到约1mL体积并使用BCA分析确定蛋白质的浓度。结合亲和力的测量使用流式细胞仪来测量结合并确定用于阳性筛选细胞系中所选择的阳性克隆的亲和力。(SW-480)。为了评估结合，针对固定数目的SW-480细胞来对纯化克隆上清液进行温育以建立饱和曲线。使用兔抗-ETA(252-608)来检测结合并与阳性对照VB6-845PE(高亲和力)和VB6-011ETA(252-608)(中等亲和力)做比较。为了确定亲和力，温育高浓度的纯化克隆的上清液。结合亲和力通过解离常数来表达，通过Lineweaver-Burk方法来计算KD,该方法中，以中值荧光度的倒数作为抗体浓度倒数的函数来作图。通过下面的等式来确定解离常数l/F=l/FMax+(KD/FMax)(l/[scFv)),其中F对应于减去背景的中值荧光度，FMax由图中计算得到。对8个可接受克隆中的4个的结合估测的结果列于表4。MTS分析MTS分析用于确定所选择的阳性克隆的IC5。值，其使用阳性细胞系SW-480和来自不相关的癌症类型的的阴性细胞系CA-46。MTS分析的结果汇总于表4。实施例3:用于亲和力成熟的文库的构建为了对由"热点区改性"或通过随机突变所产生的亲和力成熟抗体进行有效筛选，将每个候选的Fab形式连接到细胞毒性蛋白假单胞菌外毒素A的变异体。Fab-ETA(252-608)形式(这里也称之为VB6-ETA(252-608)形式)适用于评测结合活性以及肿瘤细胞效价，其允许对表达高亲和力抗体的克隆快速识别。此外，该形式还允许通过TMA压型对正常组织和肿瘤组织进行快速筛选。1.文库的构建"热点区方法论"a.热点区识别在活体靶特异性序列发生的体细胞超变被称为"热点区"(NeubergerM.SandMilsteinC.1995.Somatichypermutation.Curr.Opin.Immunol.7:248-254)。热点区序列可定义为在某些密码子中共有的核苷酸序列。共有序列为四核普酸、RGYW,其中R可以是A或G，Y可以是C或T以及W可以是A或T(NeubergerM.S.etal.,1995)。此夕卜，由AGY编码的丝氨酸残基主要位于可变区的CDR区，位于那些由TCN编码的与潜在的热点区序列对应的区之上(WagnerS.D.,MilsteinC.andNeubergerM.S.1995.Codonbiastargetsmutation.Nature,376,p732)。结构分析已显示CDR环，尤其是CDR3环，对于抗原结合起了最大的作用(GiudicelliV.,ChaumeD.andLefrancM.P.2004.IMGT/V-QUEST,anintegratedsoftwareprogramforimmunoglobulinandTcellreceptorV-JandV隱D-Jrearrangementanalysis.NucleicAcidsRes.32:435-440)。因此，对每个候选的重链和轻链的CDR的核苷序列进行扫描以检测热点区序列和AGY密码子的存在。利用InternationalImMunoGenTics数据库，轻链和重链的CDR区鉴定的热点区可与重链和轻链的生殖序列做对比(IMGT,http:〃imgt.cines.fr/textes/vquest/)(DaviesD.R.,PadlanE.A.andSheriffS.1990.Antibody-antigencomplexes.Annu.Rev.Biochem.59:439-473)。与种系相同的序列表明未发生体细胞突变；因此模仿在体内发生的体细胞事件引进随机突变。相反，不同的序列则表明一些体细胞突变已经发生。仍需确定是否在活体内的体细胞突变是最佳的。用于对CDR内的隐蔽的或保守的氨基酸进行编码的热点区不会被诱变。这些残基对于整个结构通常是至关重要的并且由于其是隐蔽的，所以不可能与抗原相互作用。此外，该分析被比作在主要发生体细胞突变的种系序列中的预测位置(TomlinsonI.M.,CoxJ.P丄.，GherardiE.,LeskA.M.andChotiaC.1995.ThestructuralrepertoireofthehumanV入domain.EMBOJ.14:4628-4638;TomlinsonI.M.，WalterG.,JonesP.T.,DearP.H.,SonnhammerE丄丄.andWinterG1996.TheimprintofsomatichypermutationontherepertoireofhumangermlineVgenes.J.Mol.Biol.256:813-817)。类似的策略适用于BL22scFv的亲和力成熟。在重链的CDR3中引入点突变导致各种CD22-阳性细胞系上的结合活性5~10倍的增加(SalvatoreG.,BeersR.,MarguliesI.，KreitmanR.J.andPastanI.2002.Improvedcytotoxicactivitytowardcelllinesandfreshleukemiacellsofamutantanti-CD22immunotoxinobtainedbyantibodyphagedisplayClinicalCancerResearch,8:995-1002.)。此外，在CDR1和CDR2环中的各种氨基酸的突变也产生了亲和力提高3~7倍的变异体(HoM.,KreitmanJ.,OndaM.andPastanI.2005.Invitroantibodyevolutiontargetinggermlinehotspotstoincreaseactivityofananti-CD22immunotoxin.J.Biol.Chem.,280:607-617)。b.通过PCR在所选择的VL区热点区中引入随机突变一旦热点区被鉴定，就使用含有简并密码子(NNS,其中N为A、G、C或T且S为G或C)的寡核苷酸在靶位置引入所有可能的氨基酸，但不包括TAA和TGA终止密码子。先前的研究建议，与在轻链和重链两种链中独立分离的突变相比，轻链CDR诱变后接着重链CDR诱变会导致亲和力增加。因此，每个候选对象的亲和力成熟将起始于轻链的最优化。通过PCR对VL区的CDR中识别的热点区进行随机谦变。产生的PCR片段含有适合于在表达载体VB6-ETA(252-608)/3302中定向克隆的唯一的限制性位点。在通过电穿孔转化大肠杆菌细胞后和用合适的抗生素涂平板选择后，生长了20个克隆并对分离的质粒测序。对序列进行分析以评估在乾位置引入的多样性。2.筛选过程表达用单个转化的JM109菌落/孔接种含有150添加15pg/mL四环素的2xYT的96孔板的孔,并且在37。恒定摇动下过夜温育。将20pl过夜生长的种子培养液加入到含有130plTB的96孔板中，并在37。C下温育7~8小时。然后，使用17.5pi的2。/。L-阿拉伯糖对培养液进行诱导并在25°C下温育过夜，以允许上清液中分泌Fab-ETA(252-608)。用PCR测序确定的变异体在可溶性重组VB6-ETA(252-608)形式中表达，并篩选在肺瘤细胞上具有增强的结合/杀死的突变体。简而言之，筛选始于用菌落挑取仪将单菌落接种到含有培养基的96孔板中。然后在振动的培养箱中于37°C下培养平板。当OD,达到2时，取出每孔的等量培养液并在甘油存在时冷冻。然后，加入诱导剂对细菌进行诱导，并在25。C下温育过夜以允许在上清液中分泌Fab-ETA(252-608)。基于肿瘤结合的功能性筛选在5000RPM下离心30分钟后，将每个孔中的上清液加入到活的肿瘤细胞(先前接种在96孔板中)中，并使用针对对VB6-ETA(252-608)形式的兔抗体抗-Fab或抗-ETA(252-608)来检测VB6-ETA(252-608)的结合活性，随后进行抗-兔-FITC。在FMATTM酶表仪中对96孔板进行读数。可期望通过二个多克隆抗体放大的荧光检测能够提高分析的灵敏度并能足以检测到野生型和随后的增强结合剂。挑选出对表达了比野生型具有更高结合反应性的VB6-ETA(252-608)变异体的任何克隆并验证认其反应性。预计对来自于酶表仪的数据将是定量的，这样克隆可根据反应性而被分级。基于表型篩选的主要优点在于能够进行快速的分析。基于存活/死亡分析的功能性筛选此外，可使用AnnexinV或钙黄绿素染色来实施存活/死亡分析。用接种在96孔FMAT板中的肿瘤细胞温育VB6-ETA(252-608)上清液，并在24时后评定细胞毒性的水平。建立细胞毒性的水平后，诱变克隆的效力得以分析并与野生型VB6-ETA(252-608)做对比。由于每种克隆的靶是相同的，所有通常认为在杀死活性上的增加与亲和力上的增加是相互关联的。出于分析细胞毒性效果需要温育时间的原因，因此存活/死亡分析要慢于肺瘤细胞的表型。ELISA分析以及流式细胞术如果由突变的融合蛋白如在一些亲和力成熟免疫毒素的情况下所识别的表位或配体(如靶分子)是已知的，则将相应的蛋白或肽或化合物加在96孔板上并与诱导的上清液在室温下温育2小时。来自诱导克隆的野生型(原始抗体)以及空栽体3302的上清液被用作阳性和阴性对照以进行表位的识别。然后通过ELISA来评估亲和力成熟抗体对表位的结合。为了验证阳性克隆的反应性，接着将上清液与选择的靶胂瘤细胞进行温育并使用流式细胞仪来检测结合的膜膜相关的免疫毒素。测序一旦验证了前十个克隆的反应性，质粒DNA将被提取出进行测序。如果测序在热点区位置识别出一个唯一的氨基酸，则设计出最终的构建物以含有该残基。然而如果得到了多个残基，那么将使用在不同位置的最优化的残基来构建一个组合文库并如上所述那样进行篩选。一旦选出最优克隆，则通过对野生型VB6-ETA(252-608)和亲代抗体的竟争性分析评估其特异性。预期轻链Fab-ETA(252-608)蛋白的最优化的CDR将与这两种蛋白竟争。由单点突变所获得的增加的亲和力可能无法通过表型或存活/死亡分析进行测量。因此，将设计出具有两个或三个诱变位置的文库。例如，可对CDR1和CDR2的热点区区进行组合。3.通过PCR在VH区的选择热点区中引入随机突变使用先前描迷的相同的策略在识别的VH区CDR的热点区构建随机突变。然后使用唯一的限制性位点插入PCR片段构建Fd-ETA(252-608)文库。设计出最优的轻链后，将在不同的Fd-ETA(252-608)文库中对其进行克隆。使用连接反应物对大肠杆菌细胞进行电穿孔以及适当的选择后，如上所述对单克隆使用进行筛选。选择出与最优化的轻链克隆相比具有较高VB6-ETA(252-608)反应性的克隆并分级。证实了前五个候选对象的反应性后，提取质粒DNA并进行测序。然后设计出在重链和轻链的CDR中具有组合突变的最终构建物并测试其生物活性。在亲和力成熟的Fab和亲代抗体之间进行竟争性分析以确保最初的结合特异性4皮保留。4.进一步生物测试将含有可溶亲和力成熟的Fab-ETA(252-608)、野生型Fab-ETA(252-608)以及VB6-845-ETA(252-608)加入到抗原-P日性肺瘤细胞(用于淘选)以及抗原-阴性肺瘤细胞中。在37。C下温育3天后，将可溶亲和力成熟Fab-ETA(252-608)的IC5Q与野生型Fab-ETA(252-608)以及VB6-845-ETA(252-608)的进行比较。可能出现不同的情况A)如杲IC50在可接受的范围，即〈10pM，并且在阴性肿瘤细胞中至少高出2个log值，则克隆还会生长。纯化产物将使用ProxiniumTM建立的程序通过TMA进行才全测以确保与正常的关4走组织相比，在肺瘤组织中观察到选择结合。如果克隆通过TMA,则将使用流式细胞术对反应性Fab-ETA(252-608)作进一步表征，以确定其对含有15种不同指征的全体肿瘤细胞文库的特异性和交叉反应性。B)如果ICso高于10pM，因而不适合于临床前开发，除了具有结构功能的氨基酸以及N-附加段中的氨基酸以外，轻链和重链的CDR3中的34个氨基酸嵌段将被随机诱变。在另一种方法中，VH和VL区将通过易错PCR进行随机诱变。已有几篇文章报告在构架中引入突变会通过CDR环的调整而导致亲和力增加，因此增强了与抗原的相互作用(DaughertyRS.,ChenG.,IversonB.L.andGeorgiouG2000.QuantitativeanalysisoftheeffectofthemutationfrequencyontheaffinitymaturationofsinglechainFvantibodies.ProcNatl.Acad,Sci.U.S.A.97:2029-2034)。例如可使用APEx显示器。如上所述进行热点区谦变所述述的进行生物检测，并将以具有合适IC5o值的克隆作为临床候选对象而作进一步研究。图3描绘了亲和力成熟过程。实施例4:VB6-011免疫毒素的亲和力成熟1.目标设计成Fab-de-bouganin融合蛋白的纯化VB6-011与亲代抗体VB1-011相竟争，表明在重组形式和亲代抗体之间保留了特异性。然而，VB6-011的亲和力，在10-6~l(T7M之间，其要比VB1-011少5~10倍，获得350nM的IC,因此，VB6-011需要亲和力成熟步骤使其能够适合用于进一步的临床研究的有效治疗剂。该项研究方案将描述VB6-011-PE的设计、在CDR区中引入点突变以及文库的构建和筛选程序。2.实验没计用于VB6-011的亲和力成熟的重组形式是连接到具有添加的KDEL序列的假单胞菌外毒素A变异体上的Oll-Fab片段。先前的研究已表明，当转化的大肠杆菌被诱导时，该形式导致上清液中可溶材料的表达。然后该可溶表达Fab-ETA(252-608)蛋白被用于一混合和读数检测中，以评价肿瘤细胞经Fab部分的相互作用与缀合抗原的结合，以及被用于通过测量细胞毒性的活性的MTS分析中，并适合TMA染色。产生了含有2个单元的双顺反子表达体系。一个单元含有PE-252-608,其通过接头连接到Vh-Ch区。第二个单元含有VL-CL区，其含有放于N-端的组氨酸亲合力标签。双顺反子单元被克隆进pING3302Xoma载体中，在阿拉伯糖-可诱导的araBAD启动子控制下。在两个单元中均存在的PelB前导序列使得蛋白分泌到周质空间，在这里，非还原环境将使得在Fab的两个恒定区之间形成二硫4建。最后，VB6-011-ETA(252-608)融合蛋白分泌到培养液上清液中。A)VB6-011—ETA的设计VB6-011-ETA(252-608)的设计是通过在含有Apal-CH-ETA(252-608)-PelB-Sfil-Xho1插入片段的3302质粒DNA中将PelB-Vmi和VLu-CLK进行连接而实现。VB6-011/3302质粒DNA通过PvuII和Miel限制酶进行消化并且一齐VH11片段连接到用相同的酶预消化的Peffi-NcoI-VH08-CH/pSV73质粒中。PelB序列和PelB-NcoI-VHo8-CH/pSV73的CH区分别含有创建Vh盒的NcoI和Apal限制性位点。使用连接反应物对10F感受态细胞进行转化并涂平板补充有氨千青霉素的LB-琼脂板上。具有Peffi-Vmi-CH片段的克隆用EcoRI和Apal消化并连接到用相应的酶进行消化的CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302质粒DNA中。类似的，VB6-011/3302质粒DNA用EcoRV和Xhol限制酶进行消4匕且VLu-clk片段被连接到使用相同的酶进行预消化的Pem-SfiI-VL845_CLK/pSV73质粒上。对PelB序列进行修饰使其含有创建轻链盒的唯一的Sfil限制性位点。在用连接反应物对10F感受态细胞进行转化后，在补充有氨苄青霉素的LB-琼脂板上对细胞进行选择。具有PelB-SfiI-VL11—CLk片段的克隆用Sfil和Xhol消化并连接到使用相应的酶进行消化的质粒PelB-VH11-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302中。然后使用含有VB6-011-ETA(252-608)插入物的质粒对E104和JM109细胞进行转化。小规模的表达研究含有VB6-011-ETA(252-608)的转化E104和JM109细胞在250mL摇瓶的30mLTB培养基(1%接种物)中，在37°C下，以225rpm摇动增殖约5小时直到光密度(O.D.600nm)达到2。此时，对培养液使用最终浓度为0.1%的L-(+)阿拉伯糖诱导16小时并在25°C下进行温育。随后，上清液通过在14000rpm下进行5分钟离心后收集并在还原和非还原条件下4吏用抗-人k轻链(SigmaA-7164)进行蛋白印迹分析，以确定免疫毒素的存在及大小。如果VB6-011-ETA(252_608)的蛋白印迹分析表明完整Fab-ETA(252-608)在适当的水平被表达，则在用单个转化E104和JM109菌落接种的96孔板中的200uLTB中进行类似实验。与摇瓶相比，96孔板中存在类似表达水平的VB6-011-ETA(252-608)表明可使用96孔上清液对文库进行筛选。VB6-011-ETA(252-608)的生物学活性使用抗原-阳性细胞系，A-375和Saos-2以及抗原-阴性细胞系，Panc-l，通过流式细胞术对上清液中含有的VB6-011-ETA(252-608)的结合特异性进行评测。使用兔抗-ETA(252-608)(l/100)检测结合。此外，使用MTS分析来确定是否可使用抗原-阳性细胞系、A-375和Saos-2以及抗原-阴性细胞系、Panc-l来对上清液中含有的VB6-011-ETA(252-608)的细胞毒性进行检测。VB6-011-ETA(252-608)的亲和力成熟种系和VB1-011的VH和Vt序列的分析显示在轻《连的CDR环中的13个密码子以及在重链的CDR环中有7个密码子含有热点区或AGY序列。因此，分别构建5和3个文库来覆盖轻链和重链。a.通过在轻链中饱和诱变来引入靶点突变通过PCR在靶位置产生含有随机核苷酸的PCR片段。引物1和4对所有的文库共有的而引物2和3对每个文库是特异的。存在于PCR片賴:中的限制性位点SfiI和Xhol被用于创建VB6-011-ETA(252-608)文库。通过拼接重叠延伸聚合酶链式反应的方法(Weissensteineretal.(2004):PCRtechnology,CurrentInnovations.CRCPress,BocaRaton,Florida33431,USA;Horton,R.M.andTait,R.C.(1998):GeneticEngineeringw池PCR,HorizonScientificPress,Wymondham,Norfolk,England)在CDR环中引入点突变，使用PelB-SfiI-VLn-CLK作为模板以及如下的引物5'引物l:5，PelB:GAATTCCTGCAGGTCTATGGAACGATAAAT(SEQIDNO:20)2)3'引物2:5，CDR1曙L1:GTAGCTGCTACTAACS丽CTBS丽GGCCCTGCAGGA(SEQIDNO:21)5，CDR1-L2:GTACCAGGCTAAGTAS丽SNNS丽AACACTCTGACT(SEQIDNO:22)5'CDR2-L1:CATGCCAGTGGCCCTS丽GGATGCACCATA(SEQIDNO:23)5，CDR3-L1:CTGAGGTGAGCTACCS丽S丽SNNACAGTAATACAC(SEQIDNO:24)5，CDR3-L2:AGGTGTCTGAGGTGNS丽S丽ATACTGCTGACA(SEQIDNO:25)3)5，引物35,CDR1-L1:CTCTCCTGCAGGGCC丽SVAG丽SGTTAGTAGCAGC(SEQIDNO:26)5'CDR1-L2:GCCAGTCAGAGTGTT丽S丽S丽STACTTAGCCTGG(SEQIDNO:27)5，CDR2-L1:ATCTATGGTGCATCCNNSAGGGCCACTGGC(SEQIDNO:28)5，CDR3-L1:GCAGTGTATTACTGT丽S丽S丽SGGTAGCTCACCT(SEQIDNO:29)5,CDR3-L2:TACTGTCAGCAGTAT丽SNNSNCACCTCAGACA(SEQIDNO:30)4)3，K國XhoI5，CTCGAGTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT(SEQIDNO:31)使用所有上述引物进行二步拼接重叠延伸PCR法对相应的文库进行扩增，即CDRl环的文库1和2、CDR2环的文库1和2以及CDR3环的文库1和2(Weissensteineretal,2004;HortonandTait,1998)。限制性位点以下划线表示。N对应于随机的核苷酸A、G、C、T;B对应T、C、G;V对应A、C、G以及S对应G、C。PCR反应包括50pL的反应体积，其含有IOXPCR緩冲液5|iiL2mMdNTPs5pL50mMMgCl22引物5，20pmol引物3，20pmolTaqDNA聚合酶2.5UDNA模板50ngPCR的循环条件为94°C1min.,62°C1min.,以及72°C0.5min.,总的进行20个循环，最后在7fC下延伸10分钟。步骤1:使用引物1和2扩增5'文库PCR片段，其在5'末端含有PelB区、在3，末端含具有靶随机的核苷酸的CDR环。在第二个PCR反应中，使用引物3和4扩增3'文库PCR片段，其在5'末含具有靶随机的核普酸的CDR环，在3，末端含2个终止密码子以及Xhol限制性位点。歩骤2:在第二个PCR反应中，将ljLil各PCR产物与引物1和4一起使用以生成PCR片段，其在相应的CDR环(818bp)中的特定位置上含有随机的核苷酸。使用DNA清洁和浓缩试剂盒对带进行纯化并用Sfil和Xhol限制性酶进行消化。对该消化的带经纯化并插入到使用相同的酶进行预消化的PelB-VHi广CH-ETA(252—608>PelB-SfiI-Xhoiy3302载体中。试验不同比率如1:3和1:2的载体/插入物，并在高浓度的T4DNA连接酶的存在下在最终体积20|uL中进行连4妻反应，且在16。C下温育12小时。然后用连接反应物刈-JM109电-受态细胞进行转化并涂平板于补充有四环素的LB-琼脂板上。在转化完成后得到的菌落数将决定用于连接反应的最佳条件。文库的筛选a.生长和诱导用单转化的JM109菌落/孔接种含有150pL补充有15ng/mL四环素的2xYT的96孔板孔,并且在37°C恒定摇动下过夜温育。将20(il的种子培养液加入到含有130nlTB的96孔板中并在37。C下温育78小时。然后使用17.5^1的L-阿拉伯糖对培养液进行过夜诱导，从而使得VB6-011-ETA(252-6,分泌进上清液。图4显示了VB6-011-ETA(252-6,轻链克隆的蛋白免疫印迹结果。b.基于肿瘤细胞表型的功能性筛选野生型VB6-011-ETA^2-608)的滴定结合曲线用于确定室温下的温育时间，由此获得使用FMATTM时的最佳信号。将每孔中的上清液10fiL加入到Saos-2肿瘤细胞(先前接种在96孔板中)中并且使用与AlexaFluor647(1/250)缀合的羊抗-人IgG(H+L)抗体来检测VB6-011-ETA(252-6Q8)突变克隆的结合活性。此外，在每个实验中，野生型VB6-011-ETA^2-6Q8)被用作阳性对照。仅挑选出对表达了比野生型具有较高结合反应性的VB6-011-ETA(252-608)变异体的任何克隆并确认其反应性。图5显示了FMAT筛选的结果。c.基于存活/死亡分析的功能性筛选然而，如果数据不是定量的，使用AnnexinV以及centriRed染色进行存活/死亡分析。将野生型VB6-011-ETA(252-6。s)上清液与胂瘤细胞一起进行温育，在24小时后分析细胞毒性的水平并与野生型(原始序列)VB6-011-ETA(252-608)作对比。一旦建立，即对诱变克隆的效力进行分析并与野生型VB6-011-ETA(252-608)做对比。如果对于每个克隆来讲靶是相同的，通常认为杀死活性的增加与亲和力的增加是相互关联的。图6显示了MTS分析的结果。d.测序以及反应性一旦证实了前十克隆的反应性，提取它们的质粒DNA并进行排序。如果测序在热点区位置识别到一个唯一的氨基酸，那么设计终构建物以含有该残基。然而如果得到多个残基，那么将使用在不同位置的最优化的残基来构建一个组合文库并如上所述进行筛选。从VB6-011ETA(252—608)的轻链的亲和力纯化中得到的修饰轻链被列于表5中。如上所述使用流式细胞术分析VB6-011的结合。如图7所示，通过比野生型克隆或竟争型克隆更高的平均荧光度确定最优克隆，并通过对抗原的ELISA结合证实。在VB6-011的情况下，这是固定的硫酸软骨素的ELISA，如图8所示。一旦选定了最优克隆，通过与VB1-011抗体的竟争性分析来评价其特异性。简言之，即对升高浓度的VB1-011与固定数目的Saos-2细胞进行温育，所述Saos-2细胞是用野生型或诱变的VB6-011-ETA(252-6Q8)上清液进行预温育的。然后将优化的轻链与重链中的靶突变文库进行组合。在重链中通过饱和诱变来引入靶点突变通过PCR产生在靶位置含有随机核苷酸的PCR片段。引物1和4为所有的文库共有，而引物2和3对每个文库是特定的。在PCR中存在的限制性位点EcoRI和Apal被用于创建VB6-011-ETA(252-608)文库。用PelB-VH11为模板以及下述引物，通过拼接重叠延伸聚合酶链式反应的方法(Weissensteiner,2004;HortonandTait,1998)在CDR环中引入点突变1)5'引物l5，PelB:GAATTCCTGCAGGTCTATGGAACGATAAAT(SEQIDNO:32)2)3，引物25，CDR1-H1:GACCCAGTGCATAGCAAASNNTCTGAAGGGGAATCC(SEQIDNO:33)5，CDR2-H1:CACGGAGTCTGCGTASNNTTTS丽S丽TCCATCATATGATATAAC(SEQIDNO:34)5，CDR3-H1:TTTGCCCCAGACGTCCANSNNGTAGTAGTG3)5，引物35,CDR1-H1:TCTGGATTCCCCTTCAGA丽STTTGCTATGCACTGG(SEQIDNO:36)5，CDR2-H1:ATATCATATGATGGA丽SNNSAAA丽STACGCAGACTCCGTGAAG(SEQIDNO:37)5，CDR3-H1:GCGAGAGATCAGNNSCTGTTGGGTGACTATGACCACTACTACNNSNTGGACGTCTGG(SEQIDNO:38)4)3，VH-CH-Apal5，CGATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAAGAGACCGTGAC(SEQIDNO:39)使用所有上述引物进行二步拼接重叠延伸PCR法扩增相应的文库，即各CDR环的一个文库(GriffinandGriffin，1994;HortonandTait,1998)。限制性位点以下划线表示。N对应于随机核苷酸A、G、C、T，以及S对应G、C。步骤1使用引物1和2扩增5'文库PCR片段，其在5'末端含有PelB区、在3'末端含具有靶随机核苷酸的CDR环。在第二个PCR反应中，使用引物3和4扩增3'文库PCR片段，其在5，末含具有靶随机核香酸的CDR环，在3，末端含2个终止密码子以及Apal限制性位点。步骤2在第二个PCR反应中，使用引物1和4与liul各PCR产物以生成PCR片段，其在相应的CDR环(527bp)中的特定位置上含有随机的核苷酸。如上所述对目的带进行纯化并使用EcoRI和Apal限制性酶进行消化。纯化该消化的带并插入到使用相同的酶进行预消化且含有最优轻链的PelB-CH-ETA(252-608rPelB-SfiI-VL11-CLK/3302载体中。使用连接反应物对JM109电-感受态细胞进行转化并涂平板于补充有四环素的LB-琼脂板上。然后通过FMAT对阳性细胞系MDA-MB-345S进行文库篩选。如果获得的％细胞凋亡大于含有优化VL-2轻链的野生型(原始序列)VB6-011-ETA(252-6,的。/。细胞凋亡，则克隆被选作阳性并进行测序。如果发现不止一个基序，则构建一个组合文库并重复FMAT筛选。表6中列出了一些用于VB6-011ETA(252—608)重链的CDR基序。通过FMAT篩选，从VB6-011ETA(252-608)VL-2重链组合文库中选出了43个为阳性的克隆。通过CSAELISA验证了其中的25个维持抗原的特异性。通过流式细胞术一睑证了12个为阳性。由流式细胞术选出具有最高MF结合的一个为最优克隆(图9)。表7总结出了用于VB6-011ETA(252-6,的前4个的亲和力成熟的构建物的结果。设计具有最优重链和轻链的最终构建物，在这里选择了克隆2D3。最终的构建物可保持ETA(252.6Q8)形式或其它的毒素，或可在如改性的bouganin中设计效应物。选择的克隆的最终序列示于图10。亲和力成熟的VB6-011-bouganin的纯4匕使用ApaI和SfiI限制性酶用去-bouganin毒素设计最终克隆2D3。简言之，使用ApaI和Sfil对VB6-011ETA(252-6()8)进行消化并得到二个片段。第一个片段对应具有VH和VL-CL的pING3302质粒，而第二个片段对应于CH-ETA(252-6()8)。将第一个片段进行纯化并与使用相同的酶预消化的CH-去-bouganin片段进行连接，以产生VB6-011-Boug-2D3/3302载体。在20L的CHEMAP发酵罐中使用GMM培养基(14)对VB6-011-2D3克隆进行补料分批发酵。将装500mLGMM的2L摇瓶通过一小瓶的MCB进行接种，其中GMM中含有25fig/mL的四环素并补充有微量元素D、氯化钙、尼克酸以及硫胺。将细胞置于一振动培养箱中，设置温度为28。C及200rpm的匀速搅动。让培养液生长直到OD6oo达到2.0-2.5。然后，用150mL的种子培养液接种含有l5L的GMM培养基以及上述补充元素的20L的chemap发酵罐。设置温度为28。C，且在整个发酵过程中，通过pH控制回路添加500/0氢氧化铵溶液维持pH在7.0。设置搅动速率为300rpm及空气流速为3slpm，并持续升高至600ipm以及6slpm，然后再升至IOOOrpm和IOslpm，从而在整个分批阶段维持溶解氧在41%以上。当分批培养基中的石友源被耗竭时，溶解氧升高到90%以上，此时要求加入料l溶液(50%甘油溶液)。然后，设置D0恒定调定点在41。/。并根据DO读数的级联控制进行供料。在光密度为IOO时，切换到料2溶液(50%甘油+30g/L阿拉伯糖溶液)对培养液进行诱导，且该诱导在与料l相同的控制下持续48小时。在经过48小时的诱导后，收集培养液并在8000rpm下进行离心30分钟，然后使用CM-琼脂糖、螯合-琼脂糖SP-琼脂糖柱进行纯化，最后通过大小排阻柱进行纯化。简言之，对上清液进行浓缩并用20mM磷酸钠pH7士0.1进行渗滤。然后将渗滤浓缩后的上清液加到已经用20mM磷酸钠，25mMNaClpH7±O.l进行平衡的CM-琼脂糖柱上。使用20mM磷酸钠，25mMNaClpH7±0.1洗脱柱子。随后使用20mM磷酸钠，150mMNaClpH7.5±0.1对结合的VB6-008进行洗脱。将CM-琼脂糖洗脱液调节至0.25%triton-Xl00的最终浓度并加到在带电的螯合琼脂糖凝胶柱上。然后使用20mM磷酸钠、150mMNaCl、10mm咪唑pH7.5±O.l洗脱螯合-琼脂糖凝胶柱。使用20mM磷酸钠、150mMNaCl、250mM咪唑，pH7.5±O.l对结合的VB6-008进行洗脱，并收集在5mL的馏分中。确定每种馏分在A280nm下的吸光率，并混合含有材料的馏分，且分别调节pH和电导率至6和5.8mS。然后，将材料加到SP-琼脂糖凝胶柱上，使用20mM磷酸钠、25mMNaClpH6.0±O.l进行洗脱，并用20mM磷酸钠，300mMNaClpH7.5±O.l进行洗脱。将SP-琼脂糖凝胶柱的混合的馏分加到SEC-200柱上，其中SEC-200柱已经用20mM磷酸钠、150mMNaClpH7.5±O.l平衡。使用centricon柱对含有全长VB6-011-Boug-2D3的馏分进行浓缩。亲和力成熟的VB6-011的生物活性a.Boug改性的流式细月包术验证为了验证VB6-0112D3boug相对于野生型VB6-011boug来讲具有增加的亲和力，用高011结合细胞系(Cal-27)和中到低结合的细胞系PANC-1进行流式细胞术分析。结果见图11和表8中。b.亲和力测量使用流式细胞术测量VB6-011-Boug的亲和力。用固定数目的Cal-27细胞对高浓度的纯化VB6-011-Boug进行温育以建立饱和曲线。使用兔抗-boug来检测结合并与野生型VB6-011做对比。结合亲和力表达为解离常数，通过Lineweaver-Burk方法来计算KD,该方法将中值荧光的倒数作为抗体浓度倒数的函数来进行绘图。通过下面的等式来确定解离常数l/F=l/FMax+(KD/FMax)(l/[scFv|),其中F对应于减去背景的中值荧光，并且FMax由图中计算得到。TMA:用固定的saos-2细胞系沉淀首先检测VB6-011-Boug以确定用于染色的最佳条件。然后进行IHC。MTS分析使用MTS分析用抗原阳性细胞系、A-375和Saos-2以及抗原阴性细胞系Panc-l来确定变异体的IC5o值。变异体的ICso值^L确定并与VB6-011-Boug野生型的做对比。尽管本发明已通过当前认为的优选的实施例进行了描述，但应知晓本发明并不局限于这些公开的实施例。相反，本发明意在包括各种在本发明精神和后附的权利要求范围之内的各种变形和替代的组合。这里提及的所有的公开的内容、专利和专利申请均经引用而全部并入本文，正如每个独立公开的内容、专利和专利申请经引用而全部并入本文。表1:K轻链的CDR区的氨基酸序列亚类CDR1CDR2CDR3SEQIDNOS:2QGLVYSDG丽YKVSYRDSQGTHWP40-421QDISKFDASNVQTVFIFPPSDEQL43-451QGISTYAASTLQSQKDNSDPRT46-482QSLLNSNG丽LGFNRASMQTLQIPYT49-511VRTLSNYAAATLQRLQYNSYPLT52-541VRV*LVIATSTLQSQQSYTTPYT55-572QSLVHSNEYNYLGSNRASTQALQIPIT58-601QGISTYAVSTLQSQQLNSYPIT61-63*-序列不清楚表2:VH片段的CDR区的氨基酸序列亚类CDR1CDR2CDR3SEQIDNOS:3GFTFSSYAAISGNGGRTAKD證GGSIVAAGGTGFDP64-661GYTFTGYY腿PNSGGTARDHSYGDSNWFDP67-694GGSISSGGYYYIYYSGTTSLKLSSVTAAD70-723GFTFSGSARIRTKA丽YATTRHEWRGKEGDY73-753GFTFDDYAGTSWNSATIARDMGSGWFTAFHI76-781VTPLPALIISAYKGNTAREPMTTVTVDY79-813GFTFSNYAGISGSGHSTAKSERAVTVILWITGVYFDY82-843GFSFSNSGLLSYDGVSKATDRARGYYDSGGAYFDY85-87表3:来自结肠免疫毒素文库的FMAT筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>*该文库最初含520,000个克隆，此时有约45000被筛选表4:基于结肠的免疫毒素文库中通过FMAT筛选的克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表5:VB6-011ETA(252-608)亲和力成熟轻链基序<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表6:VB6-011ETA(252-608)亲和力成熟重链基序<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>表8:<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>参考文献1.MolecularImmunology.Leeds,UK:OxfordUniversityPress;1996.2.FundamentalImmunology.:Lippincott,Williams&Wilkins;2003.3.ArnoldFH,GeorgiouG.DirectedEvolutionLibraryCreationMethodsandProtocols.:HumanaPress;2003.4.BaldariC，JVLurrayJA，GhiaraP,CesareniG,GaleottiCL.Anovelleaderpeptidewhichallowsefficientsecretionofafragmentofhumaninterleukin1betainSaccharomycescerevisiae.EMBOJ1987;6:229-234.5.ClacksonT,HoogenboomHR,GriffithsAD,WinterG.Makingantibodyfragmentsusingphagedisplaylibraries.Nature1991;352:624-628.6.CullenD,GrayGL,WilsonLJetal.ControlledExpressionandSecretionofBovineChymosininAspergillusNidulans.NatBiotech1987;5:369-376.7.DaughertyPS,ChenG,IversonBL,GeorgiouG.QuantitativeanalysisoftheeffectofthemutationfrequencyontheaffinitymaturationofsinglechainFvantibodies.ProcNatLAcad.Sci.U.S.A2000;97:2029-2034.8.DaviesDR,PadlanEA,SheriffS.Antibody-antigencomplexes.Annu.Rev.Biochem.1990;59:439-473.9.FlennikenML,LiepoldLO,CrowleyBEetal.Selectiveattachmentandreleaseofachemotherapeuticagentfromtheinteriorofaproteincagearchitecture.ChemCommun.(Camb.)2005447-449.10.GiudicelliV,ChaumeD,LefrancMRIMGT/V-QUEST,anintegratedsoftwareprogramforimmunoglobulinandTcellreceptorV-JandV-D-Jrearrangementanalysis.NucleicAcidsRes2004;32:W435-W440.11.GoeddelDV.Systemsforheterologousgeneexpression.MethodsEnzymol.1990;185:3-7.12.GrossbardML,FidiasRProspectsforimmunotoxintherapyofnon-Hodgkin'slymphoma,ClinImmunol.Imm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08或其变异体和内质网保留序列组成。11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。12.重组细胞文库，其中每个重组细胞表达融合蛋白，根据权利要求1到11中任何一项所述的方法制备。13.制备融合蛋白文库的方法，包括(a)制备根据权利要求1~10中任何一项所述的重組细胞文库；(b)克隆所述的重组细胞；以及(c)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白是所述重组细胞表达的可溶蛋白。14.根据权利要求13所述的方法制备的融合蛋白文库。15.免疫毒素文库，其包括多个重链可变区和多个轻链可变区，并且其中文库中的每个免疫毒素具有一个重链可变区和一个轻链可变区，且所迷轻链可变区或所迷重链可变区与细胞毒素相连。16.根据权利要求15所述的文库，其中所述细胞毒素是核糖体失活多肽。17.根据权利要求16所述的文库，其中所述细胞毒素选自多花白树毒蛋白、bouganin、皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻蛋白A链、异抹泻根毒蛋白、白喉、局限毒素、假单胞菌外毒素A及它们的变异体。18.根据权利要求17所述的文库，其中所述细胞毒素是改性的bouganin或其变异体。19.根据权利要求17所述的文库，其中所述细胞毒素是假单胞杆菌外毒素A，其没有功能性细胞结合域。20.根据权利要求19所述的文库，其中所述细胞毒素是假单胞菌外毒素A的截短形式，其由氨基酸252-608或其变异体和内质网保留序列组成。21.根据权利要求15到20中任一项所述的文库，其中所述轻链可变区和重链可变区从B细胞中分离。22.根据权利要求21所述的文库，其中所迷B细胞是成熟的B细胞。23.根据权利要求21或22所述的文库，其中所述B细胞来自患有癌症的受试者。24.筛选结合耙细胞的融合蛋白的文库的方法，包括步骤(a)提供根据权利要求14所述的融合蛋白的文库；(b)将融合蛋白与靶分子接触；和(c)确定融合蛋白结合到靶分子上。25.篩选对靶细胞具有细胞毒性的融合蛋白的文库的方法，包4舌步骤(a)提供根据权利要求14所述的融合蛋白文库；(b)将融合蛋白与靶细胞接触；和(c)确定融合蛋白对靶细胞的细胞毒性。26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述融合蛋白是免疫毒素。27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述粑细胞是癌细万包。28.制备改进的融合蛋白的方法，包括步骤(a)提供编码可结合到靶分子上的配体蛋白的核酸序列；(b)在编码配体蛋白的所述核酸序列中引入至少一个点突变，以制备编码变异配体蛋白的核酸序列文库；(c)构建载体文库，其中每个载体编码融合蛋白，并且包括l)一种变异配体蛋白的核酸序列，其在步骤(b)中制备并连接到2)编码效应分子的核酸序列；(d)用所述栽体文库转化宿主细胞，以产生重组细胞文库；(e)克隆转化的宿主细胞；(f)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白是所述宿主细胞表达的可溶蛋白；和(g)筛选同未改性的融合蛋白相比，具有改进活性的融合蛋白的文库，其中改进的活性表示改进的融合蛋白。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述融合蛋白改进的免疫毒素，包括步骤(a)制备根据权利要求2到12中任一项所述的重组细胞文库，其中在构建所述载体文库之前，在编码所述轻链可变区和/或所述重链可变区的才亥酸序列中引入至少一个点突变；(b)克隆表达所述免疫毒素的转化的宿主细胞；(c)表达免疫毒素文库，其中所述免疫毒素是宿主细胞所述表达的可溶蛋白；和(d)篩选同未改进的抗体或免疫毒素相比，对耙细胞具有改进的结合和/或改进的细胞毒性的免疫毒素文库，其中同未改进的抗体或免疫毒素相比，对靶细胞具有改进的结合和/或改进的细胞毒性表示改进的免疫毒素。30.根据权利要求29所迷的方法，其中所述突变是在所述轻链可变区中引入。31.根据权利要求29的方法，其中所述突变是在所述重链可变区中引入。32.根据权利要求29所述的方法，其中在轻链可变区和重链可变区中均引入突变。33.根据权利要求29到32中任一项所述的方法，其中所述突变包括在编码轻链所述可变区和/或所述重链可变区的核酸序列的热点区的至少一个点突变。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述点突变是在轻链可变区的热点区引入。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述点突变是在重链可变区的热点区引入。36.根据权利要求33所述的方法，其中所述点突变是在轻链可变区和重链可变区两者的热点区引入。37.根据权利要求29到36中任一项所述的方法，其中所述耙细月包是癌细胞。38.根据权利要求28到37中任一项所述的方法制备的融合蛋白。39.免疫毒素，其包括示于SEQIDNO:2中的轻链可变区。40.免疫毒素，其包括示于SEQIDNO:l中的重链可变区。41.根据权利要求40所述的免疫毒素，其包括示于SEQIDNO:2中的轻链可变区。42.根据权利要求38至41中任一项所述的免疫毒素在预防或治疗疾病中的应用。43.根据权利要求42所述的免疫毒素在预防或治疗癌症中的应用。全文摘要本发明提供了制备融合蛋白文库如免疫毒素文库的方法。本发明还涉及编码包括融合蛋白的核酸序列的重组细胞文库。此外，本发明还涉及所述文库本身以及使用所述文库筛选对靶细胞，如癌细胞特异的融合蛋白。并且，本发明涉及改进融合蛋白的方法及改进的融合蛋白。文档编号C40B30/04GK101389791SQ200680053419公开日2009年3月18日申请日期2006年12月22日优先权日2005年12月23日发明者吉恩尼克·西兹尔尤,尼古拉斯·R·格罗沃,格伦·麦克唐纳,艾德里安·施瓦兹·米特尔曼申请人:维文蒂阿生物技术股份有限公司