专利名称：对硝基苯－α－D－葡糖苷的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)的底物对硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)的制备，及用该底物测定相应的尿酶α-Glu的方法。
背景技术：
对硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)作为α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)的底物，其用途主要有四个方面①检测中性α-D-葡萄糖苷酶(α-Glu)，作为特异性标记酶(WHO推荐的)进行测定，诊断附睾功能障碍，从而评价优生优育和计划生育效果。②可用来诊断肾疾患α-Glu，主要存在于肾小管上皮细胞刷状缘，此酶在血清中含量很微，且分子量大，不易通过肾小球，因而尿中的α-Glu主要来自肾小管上皮细胞，故有“肾实质酶”之称，在各种肾实质疾患及药物中毒造成肾小管损伤时，此酶活性增高。尿中α-Glu的活性升高，作为肾小管损伤肾疾患的敏感指标，在肾疾病四项关键尿液酶的检验中α-Glu作为一项。本法可以诊断的肾疾患有肾小球肾炎、肾病综合症、肾的药物中毒、高血压肾病和糖尿病肾病的早期诊断，其它肾病的诊断和预后判断等。③检测血清酸性α-Glu，确诊糖原累积症(Pompe)临床上由于缺乏酸性α-Glu导致II型糖原累积症，婴儿表现肌张力低，心脏扩大，死于心力衰竭，成人表现肌无力。④在糖尿病治疗中，用来筛选α-Glu抑制剂的天然药材。此外，α-Glu的检测还对一些代谢类疾病有意义，对肝炎、肝硬化、泌尿系统肿瘤(尤其是膀胱癌)有一定的参考价值，还用于溶酶体疾病和细菌酶分析。
1、关于对硝基苯α-D-葡萄糖苷(PNPG)的合成，报道较少，其合成通法是以葡糖为原料经醋酸酐乙酰化，然后与对硝基苯酚缩合，再用甲醇钠水解得到。第一步一般以公知醋酸酐/醋酸钠进行乙酰化。此步收率也较高。第二步缩合反应是关键，国外报道以溶剂法合成，参考日本专利用二氯甲烷作溶剂，反应在回流下进行，可在低温下缩合。此法反应体系内部均匀、温和，但是收率较低，一般在10％-25％之间。国内文献报道类似物如α-岩藻糖苷的合成是用常压熔融缩合法，这种常压熔融法经试验发现，糖反应温度极难掌握，要么反应不完全，要么焦化，反应产生大量乙酸，使反应难向正向进行。
水解反应也是关键一步，由于色团与糖基的不同使水解反应条件差异很大，故不能套用通法。一般文献只提及到用甲醇钠水解，但其加入量、速度、pH值、温度均未报道，用现有文献试验，其反应或不完全，或过量分解。
2、关于尿液α-葡萄糖苷酶的检测方法，目前国内由于没有与此α-Glu相对的底物，检测方法是经过三步法，即以麦芽糖为底物，经α-Glu生成α-葡糖，再经葡糖氧化酶成葡糖酸内酯，再经过氧化物酶形成红色醌亚胺，本操作过程长，复杂，影响因素较多。
发明内容
本发明的目的就是解决上述现有技术的不足，提供一种对硝基苯-α-D葡糖苷的制备方法及其在尿液α-葡萄糖苷酶的检测方法中的应用。
本发明所述的对硝基苯-α-D葡糖苷的制备，是经过以下步骤制得——β-五乙酰葡糖的制备以葡萄糖为原料进行乙酰化反应，取0.25-0.28mol干燥葡糖，无水醋酸钠0.4-0.6mol，醋酐2.6-3.0mol温热溶解，水浴上加热回流并时时振摇1-3h，搅拌下倒入8-15倍于醋酐量的冰水中，搅拌1-3h，析出大量浅色结晶，过滤，水洗结晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重结晶，得到β-五乙酰葡糖结晶，熔点mp132-134℃；——对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷的制备以上步β-五乙酰葡糖为原料进行缩合反应，以3倍-5倍克分子的对硝基苯酚缩合并作为熔媒，在搅拌下和减压下，120-127℃油浴中使体系熔融，加入新炒过的氯化锌，用量为β-五乙酰葡糖重量的1/4至1/3，反应1-2h，待体系变黑，冷至60℃时，按重量体积比加入β-五乙酰葡糖的10-15倍的苯溶解缩合物，用等体积水洗，再用等体积1mol的NaOH或饱和的碳酸钠液洗至无色，再用水洗，分出苯层，加入无水硫酸钠和活性碳搅拌0.5-1.5h，干燥，脱色，滤液在40-55℃水浴下减压蒸去苯，制得糖浆，糖浆以少量无水乙醇热溶后待析品，3天后收集结晶，并以乙醇重结晶，制得对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷，熔点mp111-113℃。
——对硝基苯-α-D葡糖苷的制备取上步的对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷进行水解反应，按重量体积比加入对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷3-5倍的干燥过的无水甲醇，搅拌下滴加1N或0.5N甲醇钠0.2-0.8ml，有析出物后，冰箱过夜，次日收集结晶，用无水乙醇重结晶，制得对硝基苯-α-D葡糖苷，熔点mp216-217℃。
一种用上述方法制得的对硝基苯-α-D葡糖苷在尿液α-葡糖苷酶的检测中的应用，是用特异性底物对硝基苯-α-D葡糖苷去检测尿中的α-葡糖苷酶，以诊断肾损伤，其步骤如下——试剂的配制缓冲液0.1mol/l pH5.6磷酸盐缓冲液；终止液0.1mol/l NaoH；对硝基酚贮存液6mmol/l用0.01mol/l HCl溶液配制；对硝基酚应用液600μmol/l用0.02mol/l NaoH液稀释贮存液；——底物缓冲液采用底物对硝基苯-α-D葡糖苷在上述缓冲液中的浓度为20mmol/l；——酶促反应时间在4h处；孵育温度37℃，酶作用最佳pH值为5.6；——尿液α-葡萄糖苷酶的测定方法如下
405nm处测定吸光度。
发明的优点及效果1、本发明是国内率先研究合成的α-葡糖苷酶底物之一对硝基苯-α-D吡喃葡糖苷(PNPG)。经紫外、红外、核磁共振、元素分析等确认，所合成底物均能达到国外产品水平。2、合成方法上进行了改进和提高将熔融法缩合常压改为减压，防止了糖的焦化，及时抽走产生的酸，使反应容易进行，α型缩合物(对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷)的收率能达25％-30％，并且省掉柱层析分型精制。水解反应，改为滴加碱液，防止了水解不全和水解过度问题，当原料溶解之时，随后便是产物出生之时，这样将文献报道的5小时水解，缩短为10-20分钟，且收率达到60％-70％。3、用自行合成的底物，率先按WHO的规范方法研究建立精浆中性α-葡糖苷酶的检测方法，属国内领先，与进口试剂相比，无显著性差异。可以代替进口试剂。4、用自行合成的专属性底物，测定尿液α-Glu，可一步完成，方法简单价格低廉，可在肌酐升高之前检测，可作为肾损伤的早期指标；本方法国内领先.一步法测定国内外未见报道，为临床检测提供一个专用的新方法。
具体实施例方式实施例1、对硝基苯α-D吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)的合成1、β-五乙酰葡萄糖的制备1000ml三颈瓶中，加入50g干燥的葡萄糖，40g无水醋酸钠，250ml醋酐，温热使之溶解，水浴上加热回流并时时振摇2h，搅拌下倒入2500ml冰水中，电磁搅拌3h，析出大量浅色结晶，倾去上层液体，过滤，水洗两次，干燥，得粗品84g。用7倍量95％乙醇重结晶，得雪白结晶69g，mp132-134℃(文献值132℃)2、对硝基苯-α-D-四乙酰葡糖苷的制备
24g对硝基酚，15g β-五乙酰葡萄糖混合搅拌下于125℃油浴中熔融后加入新炒过的氯化锌3.5g，减压下反应，125℃油浴加热1h，随后冷却至60℃，加入200ml苯，用等体积水洗两次，等体积1mol/L NaOH水溶液洗7次，使溶液近无色，再用水洗两次，分出苯层，加入氯化钙及活性炭干燥脱色，搅拌1h后过滤，滤夜在45℃以下水浴减压蒸去苯，得一糖浆，糖浆30ml无水乙醇热溶后待析品。3天后收集结晶，并以乙醇重结晶至熔点不变，得4.5g，mp111-113℃(文献值113℃)。
3、对硝基苯-α-D-葡糖苷的制备取8g对硝基苯-α-D-四乙酰葡糖苷，加干燥过的无水甲醇40ml，搅拌下滴加1N甲醇钠约0.4ml，10分钟后由澄清开始变混，有析出后，冰箱过夜，次日收集析出物，干燥，多次用无水乙醇重结晶，得3.5g，mp216-217℃，[α]D20+218.8(水0.500)。(文献值212-214℃，[α]D22+203.3甲醇；mp210℃[α]D20为+215℃水)PNPG的结构确认元素分析(C12H15NO8)理化值C 47.84％H 5.02％N 4.65％测试值C 47.95％H 5.07％N 4.69％红外光谱(kBr)3452，3294(-OH)；2925(-C＝C)；1608，1487(ph)；1346(-NO2)；1236(-O-C)核磁共振谱(溶剂D2O+DMSO-D6，内标TMS，频率200)8.147.25(m，4H，ph)5.57(d，1H)3.18-3.67(糖上H，9H)3.48-3.93(m 6H，H2-6)紫外最大吸收302nm，比旋光度[α]D20+218°(C 0.500，H2O)实施例2、尿液α-葡萄糖苷酶的测定方法1.本发明试剂的配制1.1底物缓冲液PNP-α-D-比喃葡萄糖苷(天津医药研究所合成)用0.1mol/lpH5.6磷酸盐缓冲液配制，4℃冰箱保存；1.2终止液0.1mol/l NaoH；1.3对硝基酚贮存液(6mmol/l)用0.01mol/l HCl溶液配制，避光，4℃冰箱保存；1.4对硝基酚应用液(600μmol/l)用0.02mol/l NaoH液稀释贮存液，现配现用；1.5肌酐测定试剂购于Randox公司(857CR)；
2、测定方法见表1表1 α-Glu测定方法
405nm处测定吸光度其测定原理
对硝基酚在碱性溶液中呈现黄色，在405nm测定单位定义及标准曲线1升尿液中的α-Glu在37℃水解底物PNP-α-D-吡喃葡萄糖苷每分钟生成1μmol的PNP相当于1单位酶活力(U/L)绘制标准曲线见表2表2 标准曲线的绘制
结果统计采用两样本均数及样本均数与总体均数比较的t检验和相关回归分析。
实施例3、尿液α-Glu测定的方法学1.α-Glu Km值的测定测定同一份标本在不同底物浓度时的吸光度，每管重复三次，取均值，作1/A-1/[S]曲线，由此双倒数图作图得Km为4.0mmol/l，直线回归求得Km为4.25mmol/l，本法考虑到最大反应速度兼顾溶解度的问题，选用的底物浓度为20mmol/l，约为Km值的5倍。反应速度为最大反应速度的82.5％。
2.α-Glu最适pH值的选择测定同一份标本在不同pH值时的吸光度，每管重复三次，取均值，酶在pH5.6显示最大活力(pH＜5底物缓冲液应用终止液NaoH0.02mol/l)。
(1)磷酸盐缓冲液(2)柠檬酸盐缓冲液3.酶促反应时间曲线取一份高值标本和一份正常标本，分别测定在0.5h，1h，2h，3h，4h，6h时的吸光度，4h处无论正常及高值标本均保持线性。
实施例4方法学评价1.精密度取两份标本，一份正常，一份高值，作10个平行管，正常标本CV为11.1％，病理标本CV为4.5％。
2.准确度2.1干扰试验见表3表3 干扰试验结果
以±10％内作为干扰，当尿中葡萄糖＜5mg/ml(即尿糖为+时)，可无明显干扰。
2.2稀释实验取一份高值标本，稀释成4个稀释度，分别测定吸光度，γ＝0.99。
实施例5 临床检测1.标本来源1.1病理标本2002年3月到5月，天津市公安医院住院的肾损伤病人共40例(尿蛋白+～+++)，其中原发性肾损伤16例(慢性肾衰4例，肾移植术后4例，肾病综合症8例)，继发性肾损伤24例(糖尿病肾病14例，高血压肾病6例，化疗药物、外伤的肾损伤4例)。
1.2正常人标本2002年4月，天津市某公司查体正常的人的尿标本40例(18-60岁)，其中男性20例，女性20例。
2.绘制标准曲线.
按前述方法绘制标准曲线，求得相关系数γ＝0.99，斜率0.06524，以下测定酶的浓度(U/L)＝吸光度*1/斜率＝吸光度*15.333.参考范围的测定见表4表4 40例健康成人的尿α-Glu测定结果
*男性与女性相比，无明显差异(P＞0.01)4.肾损伤标本测定见表5表5 不同原因肾损伤尿α-Glu测定结果
各种原因所致的肾损伤与健康人相比均存在显著性差异。
5.α-Glu的测定与尿微量白蛋白测定的相关性及阳性率(见表6)的比较α-Glu与微量白蛋白相关系数γ＝0.44(n＝22)，t＝2.19，P＜0.05，二者呈正相关。
表6 α-Glu与微量白蛋白的阳性率比较
(α-Glu的正常范围为0.243-0.588U/mmolCr，尿微量白蛋白正常范围为0-22.5mg/dl)实施例6 男性不孕症附睾中性α-葡糖苷酶的临床测定材料和方法一、试剂及仪器1、试剂对照品对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(P-Nitriophenyl-α-D-glucopyranosidePNPG，购置Sigma公司)。罂粟精素(Castanospermine，购置Sigma公司)。对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(天津医药科学研究所合成并提供)。硝基苯酚、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、碳酸钠、等均为分析纯。
2、试液配制(1)磷酸盐缓冲液，PH为6.8(0.1mol/l)参照中华人民共和国药典(2000版)[25]。(2)对照品及自己合成的对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG底物含5g/l及1％十二烷基硫酸钠)缓冲液，每次测定都需新配制。(3)罂粟精素(10mmol/l)储存液精称1mg罂粟精素溶于0.53蒸馏水中，-20℃储存。1mmol/l溶液精取0.1ml 10mmol/l储备液加入0.9ml蒸馏水中，分装为每份0.2ml贮存于4℃，其余部分-20℃贮存。(4)碳酸钠(0.1mol/l用蒸馏水溶解)。(5)对硝基苯酚(PNP)标准液配制(PNP5mmol/l)将适量PNP精称于棕色容量瓶中，用蒸馏水稀至刻度，使其充分溶解、摇匀，在4℃贮存(在读吸光值之前1小时完成)。
3、仪器、紫外分光光度计(ShimadzmUV-260)等。
二、测定主要步骤如下(1)备好水浴箱，37℃孵育。
(2)空白对照管将试管中加入上述配制好的PNPG溶液200μl，再加入20μl的蒸馏水。
(3)精液对照管将待测精浆20μl加到含200μlPNPG和20μl罂粟精素(1mmol/l)的实验管中。
(4)实验管将待测精浆20μl加到含200μlPNPG的实验管中。
以上各管，在振荡器中振摇后，将其放入37℃水浴中孵育4小时，(孵育温度和孵育时间至关重要)孵育结束后，向每管均加1ml碳酸钠(0.1mol/l)以终止孵育并旋转混匀后，放入比色杯内，在紫外分光光度计，波长为405nm处测各管的吸光值。
试验表明，用合成的对硝基苯酚α-D-吡喃葡糖苷试剂可以代替进口的对硝基苯酚α-D-吡喃葡糖苷试剂作底物，测定附睾功能特异性酶(即精浆中中性α-葡糖苷酶)的含量。
权利要求
1.一种对硝基苯-α-D-葡糖苷的制备，其特征在于该对硝基苯-α-D-葡糖苷是以葡糖为原料，用硝酸钾或硝酸钠经乙酰化，减压下缩合，水解步骤制成。
2.根据权利要求1所述的对硝基苯-α-D-葡糖苷的制备，其特征是所述的对硝基苯-α-D葡糖苷经过以下步骤制得——β-五乙酰葡糖的制备以葡萄糖为原料进行乙酰化反应，取0.25-0.28mol干燥葡糖，无水醋酸钠0.4-0.6mol，醋酐2.6-3.0mol温热溶解，水浴上加热回流并时时振摇1-3h，搅拌下倒入8-15倍于醋酐量的冰水中，搅拌1-3h，析出大量浅色结晶，过滤，水洗结晶，干燥，制得β-五乙酰葡糖粗品，用5-8倍量95％乙醇重结晶，得到β-五乙酰葡糖结晶，熔点mp132-134℃；——对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷的制备以上步β-五乙酰葡糖为原料进行缩合反应，以3倍-5倍克分子的对硝基苯酚缩合并作为熔媒，在搅拌下和减压下，120-127℃油浴中使体系熔融，加入新炒过的氯化锌，用量为β-五乙酰葡糖重量的1/4至1/3，反应1-2h，待体系变黑，冷至60℃时，按重量体积比加入β-五乙酰葡糖的10-15倍的苯溶解缩合物，用等体积水洗，再用等体积1mol的NaOH或饱和的碳酸钠液洗至无色，再用水洗，分出苯层，加入无水硫酸钠和活性碳搅拌0.5-1.5h，干燥，脱色，滤液在40-55℃水浴下减压蒸去苯，制得糖浆，糖浆以少量无水乙醇热溶后待析品，3天后收集结晶，并以乙醇重结晶，制得对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷，熔点mp111-113℃。——对硝基苯-α-D葡糖苷的制备取上步的对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷进行水解反应，按重量体积比加入对硝基苯-α-D四乙酰基葡糖苷3-5倍的干燥过的无水甲醇，搅拌下滴加1N或0.5N甲醇钠0.2-0.8ml，有析出物后，冰箱过夜，次日收集结晶，用无水乙醇重结晶，制得对硝基苯-α-D葡糖苷，熔点mp216-217℃。
3.一种权利要求1和2中制得的对硝基苯-α-D-葡糖苷在尿液α-葡糖苷酶的检测中的应用，其特征在于用特异性底物对硝基苯-α-D-葡糖苷去检测尿中的α-葡糖苷酶，以诊断肾损伤，其步骤如下——试剂的配制缓冲液0.1mol/l pH5.6磷酸盐缓冲液；终止液0.1mol/l NaoH；对硝基酚贮存液6mmol/l用0.01mol/l HCl溶液配制；对硝基酚应用液600μmol/l用0.02mol/l NaoH液稀释贮存液；——底物缓冲液采用底物对硝基苯-α-D葡糖苷在上述缓冲液中的浓度为20mmol/l；——酶促反应时间在4h处；孵育温度37℃，酶作用最佳pH值为5.6；——尿液α-葡萄糖苷酶的测定方法如下
405nm处测定吸光度。
全文摘要
对硝基苯－α－D葡糖苷的制备及其应用。以D－葡萄糖为原料，经醋酐进行乙酰化，与对硝基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得底物。本发明成功合成了α－PNPG，建立了α－Glu尿酶的一步检测法。本底物检测尿α－Glu的最佳底物浓度为20mmol/L，反应速度为最大反应速度的82.5％，最适宜的pH为5.6，促酶反应时间为4小时，尿液正常标本CV为11.1％，病理标本CV为4.5％，当尿中葡萄糖＜5mg/ml可无明显干扰。正常标本男性女性无明显差异P＞0.01，不同原因的肾损伤与健康人相比有显著性差异P＜0.01和P＜0.05。结论本底物可特异性检测尿酶α－Glu，并可一步法完成，方法简单，价格低廉，对各种肾脏损伤α－Glu升高，均有统计学意义，可作为肾损伤的尿α－Glu有用指标。
文档编号C07H15/00GK1712407SQ20041007794
公开日2005年12月28日 申请日期2004年9月21日 优先权日2004年6月23日
发明者孙家莉, 王金良, 邵长风, 褚捷 申请人:天津市医药科学研究所