G-csf偶联物的制作方法

专利名称：：G-csf偶联物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及能显示粒细胞集落刺激因子(G-CSF)活性的新的多肽，显示G-CSF活性的多肽与非多肽组分的偶联物，制备这种多肽或偶联物的方法以及所述多肽或偶联物在治疗，尤其对中性粒细胞减少症或白细胞减少症的治疗方面的应用。
背景技术：
：白细胞在骨髓中的生长，分裂和分化的过程称为造血(DexterandSpooncer，Ann.Rev.Cell.Biol.,3:423,1987)。每种类型的血细胞都来自多能干细胞。体内通常能产生三种类型的血细胞红血细胞(红细胞)，血小板和白血细胞(白细胞)，后者的大多数参与宿主的免疫防御。造血前体细胞的增殖和分化由一个细胞因子家族调节，这一家族的细胞因子包括集落刺激因子(CSFs)例如G-CSF和白细胞介素(Arai等，Ann.Rev.Biochem.，59:783-836，1990)。G-CSF在体内的主要生物学作用是刺激某些称为嗜中性粒细胞的白细胞的生长和发育(Welte等，PNAS画USA82:1526-1530，1985,Souza等,science,232:61-65,1986)。当嗜中性粒细胞被释放到血流时，这些细胞便行使抗御细菌感染及其它感染的功能。Nagata等，nature319:415-418,1986曾报道过人G-CSF(hG-CSF)的氨基酸序列。hG-CSF是一种单体蛋白，它通过形成2个G-CSF分子和2个受体的2:2复合物使G-CSF受体二聚化(Horan等，(1996),Biochemistry35(15):4886-96)。Aritomi等，nature401:713-717，1999描述了G-CSF受体的BN-BC结构域和hG-CSF之间形成的复合物的X线结构。它们确定以下hG-CSF的残基为受体结合界面的一部分G4，P5，A6,S7,S8,L9,P10,Qll,S12，L15，K16,E19,Q20,L108,D109,D112,T115,T116，Q119，E122,E123，和L124。rhG-CSF在大肠杆菌，酿酒酵母和哺乳动物细胞中的表达已有报道(Souza等，Science232:61-65，1986,Nagata等，Nature319:415-418，1986，RobinsonandWittrup，Biotechnol.Prog.11:171-177,1985)。下降)都是导致对各种类型的感染的易感性增加的疾病。中性粒细胞减少症可以是慢性的(例如，在HIV感染者中)，或者是急性的(例如在接受化疗或放疗的癌症患者中)。对于中性粒细胞减少症的重症患者(例如因化疗所致)而言，即使是非常微弱的感染也可以是严重的，甚至可以危及生命。重组人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治疗各种形式的白细胞减少症。因此，可得到冠以filgrastim(Gran和Neupogen),lenograstim(Neutrogin和Granocyte⑧)和nartograstim(Neu-up⑧)名称的rhG-CSF商业制品。Gran和Neupogen⑧为非糖基化形式，可以在重组大肠杆菌细胞中制备。Neutrogin和Granocyte为糖基化形式，可以在重组CHO细胞中制备，Neu-up为非糖基化形式，它在重组大肠杆菌细胞产生的完整rhG-CSF的N末端区域有5个氨基酸被取代。已有文献报道了hG-CSF的多种蛋白工程变体(US5，581,476,US5，214，132，US5，362,853,US4,904，584和Riedhaar-Olson等，Biochemistry35:9034-9041,1996)。为引入比天然多肽至少多一个的糖链，已有人建议对hG-CSF及其它多肽进行修饰(US5,218,092)。所述多肽的氨基酸序列可以通过氨基酸取代，氨基酸缺失或氨基酸插入进行修饰以添加另外的糖链。除此之外，对天然hG-CSF的聚合物修饰，包括连接PEG基团，已有报道(Satake腸IshikawaCellStructureandFunction17:157-160，1992，US5,824,778，US5,824,784,WO96/11953，WO95/21629，WO94/20069，EP0612846Al,WO01/00011)。Bowen等，ExperimentalHematology27(1999),425-432公开了PEG偶联的G-CSF突变蛋白的分子质量及其活性维持时间之间的关系。提示所述蛋白上PEG偶联部分的分子量与体外活性之间有明显反比关系，然而体内活性随分子量的增加而增加。推测偶联物的较低亲和力有增加半寿期的作用，因为受体介导的内吞作用是一种调节造血生长因子水平的重要机制。市售rhG-CSF有短期的药理学作用，因此在白细胞减少状态的持续期间必须一天给药一次。具有较长循环半寿期的分子会减少为緩解白细胞减少症和预防随后的感染而必需的给药次数。现有rG-CSF产品的另一更明显问题是，即使给病人用了G-CSF，也会在化疗后出现中性粒细胞减少症状。对这些病人而言，重要的是尽可能缩短中性粒细胞减少症的持续时间并减轻其程度，从而使严重感染的危险降到最低。现有rG-CSF产品还有一个问题是，出现剂量依赖性骨痛。因为骨痛是患者接受rG-CSF治疗时体会到的明显副作用，所以能提供一种不引起骨痛的rG-CSF产品是人们所期望的，这种产品可以本身没有这种作用，或者是这种产品在足够小的剂量下有效但该剂量不引起骨痛。因此，很明显有必要改进重组G-CSF样分子。关于半寿期，增加蛋白的循环半寿期的一个途径是保证蛋白的清除，尤其是通过肾脏的清除和受体介导的清除的下降。这可以通过将蛋白与能增加表观分子量的化学组分偶联，从而降低肾脏的清除作用，增加上述分子的体内半寿期来实现。进一步地，将蛋白与化学组分连接可以有效地阻断蛋白裂解性酶与蛋白的物理接触，由此可以使蛋白免遭非特异性蛋白水解作用的降解。聚乙二醇(Polyethyleneglycol)(PEG)便是这样一种化学组分，它已用于制备治疗性蛋白制品。最近，一种在N末端连接了单个20kDaPEG基团的G-CSP分子(NeulastaTM)已获准在美国销售。尽管这种PEG化G-CSF分子与非PEG化G-CSF相比半寿期增加，并因此比现有G-CSF产品给药次数减少，但它与非PEG化G-CSF相比并未显著缩短中性粒细胞减少症的持续时间。因此，目前已知的G-CSF分子仍有相当大的改进空间。所以，仍然有必要提供一种新型分子，它既能显示在白细胞减少症/中性粒细胞减少症的治疗中有用的G-CSF活性，同时又具有诸如半寿期增加、尤其是中性粒细胞减少症持续时间缩短等改进特性。本发明涉及这样的分子。
发明内容本发明涉及特异性偶联物，其包含一种显示G-CSP活性的多肽和一种非多肽组分，本发明还涉及上述偶联物的制备方法和它们在医学治疗和药物制备方面的应用。相应地，本发明第一个方面涉及各种特异性偶联物，这些偶联物包含显示G-CSF活性的多肽，该多肽具有与SEQIDNO:1所示人G-CSF的已知氨基酸序列不同在于至少一个特异性改变的包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基的氨基酸序列，且至少有一个非多肽组分连接到该多肽的连接基团上。这些偶联物与未偶联的hG-CSF相比，除了体内半寿期增加以外，体外生物学活性大大降低，我们很意外地发现这一特点可导致中性粒细胞更快速地恢复。另一方面，本发明涉及显示G-CSF活性且形成本发明的偶联物的一部分的多肽。预计本发明的多肽可以用于治疗，诊断或其它的目的，但也可具体作为制备本发明偶联物的中间产物。本发明另一方面涉及一种多肽偶联物，该偶联物包含显示G-CSF活性的多肽，该多肽的氨基酸序列与hG-CSF的氨基酸序列(其氨基酸序列在SEQIDNO:1中列出)不同在于至少一个氨基酸残基是经引入或除去的包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，并且足够数量或类型的非多肽组分提供了与已知重组G-CSF产品相比半寿期增加和/或中性粒细胞更快速恢复的偶联物。本发明一个具体方面涉及具有G-CSF活性的多肽偶联物，它包含这样一种多肽，该多肽与SEQIDNO:l所示hG-CSF的氨基酸序列相比，具有K16R,K34R，K40R,T105K，和S159K这些取代，还可以在位置H170出现例如R、K或Q这样的取代，或者在与SEQIDNO:1有至少80%序列同一性的氨基酸序列的相应位置具有上述取代，并且有2-6个(通常为3-6个)分子量约1000-10,000Da的聚乙二醇组分与该多肽的一或多个连接基团相连。其中这些取代都相对于与SEQIDNO:l具有至少约80%序列同一性的序列，所述序列同一性通常至少约90%或95%，如至少约％%，97%,98%或99%。本发明的另一方面还涉及制备本发明偶联物的方法，包括编码本发明多肽的核苷酸序列，包含此核苷酸序列的表达载体，和包含上述核苷酸序列或表达载体的宿主细胞。本发明的最后一方面涉及包含本发明偶联物或多肽的组合物，制备药物组合物的方法，本发明的偶联物或组合物作为药物的应用，和用上述组合物治疗哺乳动物的方法。尤其，本发明的多肽，偶联物或组合物可以用于使正在进行某些类型的放射治疗，化疗，和骨髓移植的癌症患者预防感染，用于动员祖细胞在外周血祖细胞移植中聚集，用于治疗无论什么原因所致的严重慢性或相关的白细胞减少症，和用于支持对急性髓样白血病(acutemyeloidleukaemia)患者的治疗。另夕卜，本发明的多肽，偶联物或组合物可以用于AIDS或其它免疫缺陷病以及细菌感染的治疗。具体地，本发明涉及如下方面1.一种显示G-CSF活性的多肽偶联物，它包含一种多肽，该多肽与SEQIDNO:1所示的hG-CSF氨基酸序列相比，包含选自K16R/Q,K34R/Q和K40R/Q的至少一个取代，以及选自Tl05K和S159K的至少一个取代，或者在与SEQIDNO:l有至少80%序列同一性的氨基酸序列的相应位置具有上述取代，并且所述偶联物有2-6个分子量约1000-10,000Da的聚乙二醇组分与该多肽的连接基团相连。2.项l的多肽偶联物，包含3，4,或5个所述取代。3.项1或2的多肽偶联物，还包含取代H170K，H170Q或H170R。4.项1-3之一的多肽偶联物，包含选自下组的取代Q70K+S159K，Q70K+H170K,Q90K+S159K,Q90K+H170K，T105K+S159K,T105K+H170K,Q120K+S159K,Q120K+H170K，T133K+S159K，T133K+H170K，S159K+H170K，Q70K+T105K+S159K,Q70K+Q120K+H170K，Q70K+S159K+H170K,Q90K+Q120K+S159K，Q90K+T133K+H170K,T105K+Q120K+H170K，T105K+S159K+H170K,Q70K+Q90K+S159K,Q70K+T105K+H170K,Q70K+T133K+S159K,Q90K+T105K+S159K，Q90K+Q120K+H170K，Q90+S159K+H170K,T105K+T133K+S159K，Q120K+T133K+S159K，Q70K+Q90K+H170K,Q70K+Q120K+S159K，Q70K+T133K+H170K,Q90K+T105K+H170K，Q90K+T133K+S159K，T105K+Q120K+S159K，T105K+T133K+H170K，Q120K+T133K+H170K,Q120K+S159K+H170K，T133K+S159K+H170K,Q70K+Q90K+T105K+S159K，Q70K+Q90K+T105K+H170K,Q70K+Q90K+Q120K+H170K，Q70K+Q9OK+T133K+H170K,Q70K+T105K+Q120K+S159K，Q70K+T105K+T133K+S159K,Q70K+T105K+S159K+H170K,Q70K+Q120K+T133K+H170K,Q90K+T105K+Q120K+S159K,Q卯K+T105+T133K+S159K,Q90K+T105+S159K+H170K，Q70K+Q90K+Q120K+S159K，Q70K+Q90K+T133K+S159K,Q70K+Q90K+S159K+H170K,Q70K+T105K+Q120K+H170K,Q70K+T105K+T133K+H170K，Q70K+Q120K+T133K+S159K，Q70K+T133K+S159K+H170K,Q90K+T105K+Q120K+H170K,Q90K+T105+T133K+H170K，Q90K+Q120K+T133K+S159K，9Q90K+Q120K+T133K+H170K，Q90K+Q120K+S159K+H170K,Q90K+T133K+S159K+H170K,Tl05K+Q120K+T133K+S159K，T105K+Q120K+T133K+H170K，T105K+Q120K+S159K+H170K,5.项l-4之一的多肽偶联物，包含选自下组的取代K16R+K23R，K16R+K34R，K16R+K40R，K23R+K34R,K23R+K40R,K34R+K40R,K16R+K23R+K34R，K16R+K23R+K概，K23R+K34R+K概,K16R+K34R+K40R和K16R+K23R+K34R+K40R。6.项5的多肽偶联物，包含取代K16R+K34R+K40R，并且在第23位包含赖氨酸残基。7.项1-6之一的多肽偶联物，其中所述取代的位置对应于与SEQIDNO:l有至少约90%序列同一性的氨基酸序列中的相应位置。8.项7的多肽偶联物，其中所述取代的位置对应于与SEQIDNO:l有至少约95%序列同一性的氨基酸序列中的相应位置，所述序列同一性例如是至少约96%,97%,98%或99%。9.项l-8之一的多肽偶联物，其中所述聚乙二醇组分与至少一个赖氨酸残基相连，并且还可以与N-末端氨基相连。10.项l的多肽偶联物，它包含一种多肽，该多肽与SEQIDNO:1所示的hG-CSF氨基酸序列相比，包含选自K16R,K34R,K40R,T105K和S159K的取代，并且所述偶联物有2-6个分子量约1000-10,000Da的聚乙二醇组分与该多肽的连接基团相连。11.项l-10之一的多肽偶联物，它在T133位发生糖基化。12.项1-11之一的多肽偶联物，连接有3-5，4-6,3-4，4-5或5-6个PEG组分。13.项12的多肽偶联物，连接有3-6个，例如4-5个，分子量约5000-6000Da的聚乙二醇组分。14.项13的多肽偶联物，连接有4个分子量约5kDa的聚乙二醇组分。15.项13的多肽偶联物，连接有5个分子量约5kDa的聚乙二醇组分。16.项1-15之一的多肽偶联物，其体外生物学活性经本文所述萤光素酶试验测定，为非偶联hG-CSF生物学活性的大约2-30%。17.显示G-CSF活性的多肽偶联物，它包含一种多肽，该多肽包含与SEQIDNO:1所示的hG-CSF氨基酸序列有至少一个氨基酸残基不同的氨至少一个非多肽组分与该多肽的连接基团相连，所述偶联物的体外生物学活性经本文所述营光素酶试验测定，为非偶联hG-CSF生物学活性的大约2-30%。18.项17的多肽偶联物，它与SEQIDNO:l相比，在选自11-41位(螺旋A),71-95位(螺旋B)，102-125位(螺旋C)，和145-170位(螺旋D)的氨基酸位置包含至少一个氨基酸改变。19.项17或18的多肽偶联物，它包含2-6个分子量约1000-10,000Da的聚乙二醇组分与该多肽的连接基团相连。20.制备G-CSF偶联物的方法，所述偶联物与hG-CSF相比，受体介导的清除减少，和/或中性粒细胞减少症的持续时间缩短，所述方法包括制备一种多肽，该多肽具有与SEQIDNO:1所示的hG-CSF氨基酸序列相比至少有一个氨基酸残基不同的氨基酸序列，并且所述多肽的连接基团物与至少一个非多肽组分相连，所得偶联物的体外生物学活性经本文所述萤光素酶试验测定，为非偶联hG-CSF生物学活性的大约2-30%。21.项20的方法，其中所需体外生物学活性是通过，相对于氨基酸序列SEQIDNO:l而言，在选自11-41位(螺旋A)，71-95位(螺旋B),102-125位(螺旋C),和145-170位(螺旋D)的氨基酸位置改变，通常是取代，至少一个氨基酸残基，并将至少一个非多肽组分与所述至少一个改变的氨基酸残基偶联，来获得。22.—种组合物，包含项1-19之一的多肽偶联物和至少一种可药用载体或赋形剂。23.—种治疗中性粒细胞水平不足的患者的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物给药治疗有效量的项l-19之一所述多肽偶联物或项22所述组合物。24.项l-19之一所述多肽偶联物作为药物的用途。25.项1-19之一所述多肽偶联物在制备用于治疗中性粒细胞水平不足的药物组合物中的用途。26.项25的用途，其中所述药物组合物用于预防和/或治疗由于化疗或放疗，或者由于HIV或另一种病毒感染所引起的中性粒细胞减少症。图1:rhG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RiiK34RK40RQ70KQ90KQ120K的体内半寿期。图2:rhG-CSF(Neupogen)和SPA誦PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KQ159K的体内半寿期。图3:在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000-偶联的hG國CSFK16RK34RK40RQ70KQ120K和SPA画PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K的体内生物学活性。图4:在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120KT133K和SPA-PEG5000-偶联的图5:在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA-PEG12000偶联型hG-CSFK16RK34RK40R和不同剂量的SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K的体内生物学活性。图6:在健康大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K，SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K和SPA-PEG20000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K的体内生物学活性。图7:在患有化疗引起的中性粒细胞减少症的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K，和SPA-PEG20000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ90K的体内生物学活性。图8:在患有化疗引起的中性粒细胞减少症的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),SPA画PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K和SPA画PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K的体内生物学活性(白细胞计数)。图9:在患有化疗引起的中性粒细胞减少症的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen⑧)和SPA画PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K的体内生物学活性(绝对中性粒细胞计数)。图10:在患有化疗引起的中性粒细胞减少症的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),带有20kDaN-末端PEG基团的rhG-CSF(Neulasta),以及产生于酵母和CHO细胞中的与SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K的体内生物学活性(白细胞计数)。图11:在患有化疗引起的中性粒细胞减少症的大鼠中，rhG-CSF(Neupogen),带有20kDaN-末端PEG基团的rhG-CSF(NeulastaTM)，以及产生于酵母和CHO细胞中的与SPA-PEG5000-偶联的hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K的体内生物学活性(绝对中性粒细胞计数)。发明详述定义在本申请和发明的上下文中应用了以下定义术语"偶联物，，是指由一个或多个多肽，通常为单独一个多肽与一个或多个非多肽组分，尤其是聚合物分子共价连接形成的异源分子。此外，偶联物可以与一或多个糖组分相连，尤其是借助N-或O-糖基化作用来连接。术语共价连接是指多肽和非多肽组分直接彼此共价连接，或者是通过一个或多个间插组分，例如桥，间隔臂，或连接组分彼此间接共价连接。优选，偶联物在相应的浓度和条件下是可溶性的，即在生理性的体液(例如血液)中是可溶性的。术语"非偶联的多肽"可用于指偶联物的多肽部分。本发明中术语"多肽，，可以和术语"蛋白"交换使用。术语"聚合物分子"是由二个或多个单体共价连接形成的分子，其中没有一种单体是氨基酸残基，但聚合物是人白蛋白或另一种高丰度血浆蛋白的情况除外。术语"聚合物"可以和术语"聚合物分子，，交换使用。该术语将包括糖分子，但通常情况下，该术语不包括通过体内N-或O-的糖基化(以下进一步描述)连接到所述多肽上的这类糖分子，因为这类分子在下文中被称为"寡糖组分"。除非对聚合物分子的数目有清楚的说明，每次提及本发明多肽中包含的"一个聚合物"，"一个聚合物分子"，"聚合物"或"聚合物分子"或在本发明中应用的上述称谓都涉及一个或多个聚合物分子。术语"连接基团"是指多肽中能够偶联到相关非多肽组分上的氨基酸残基基团。例如，在聚合物偶联，尤其与PEG偶联的情况中，常用的连接基团是赖氨酸的s氨基或N末端氨基。其它的聚合物连接基团包括游离羧酸基团(例如，C末端氨基酸残基的游离羧酸基团或天冬氨酸或谷氨酸残基的游离羧酸基团)，适当活化的羰基基团，氧化的糖组分和巯基基团。有用的连接基团和它们相配对的非肽组分见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>对于体内的N糖基化，术语"连接基团"以非常规的方式应用以表示构成N糖基化位点的氨基酸残基(带有N-X，-S/T/C-X"序列，其中X，是除脯氨酸外的任何氨基酸残基，X"可以是与X，相同或不同的任何氨基酸残基且优选其不是脯氨酸，N是天冬酰胺，S/T/C可以是丝氨酸，苏氨酸或半胱氨酸，优选是丝氨酸或苏氨酸，最优选是苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是糖基化过程中寡糖组分所连接的部位，但这种连接不能实现，除非存在N糖基化位点的其它氨基酸残基。因此，当非肽组分是寡糖组分且经过N-糖基化实现偶联时，与目标多肽氨基酸序列的改变连用的术语"包含非肽组分连接基团的氨基酸残基"应理解为构成N糖基化位点的一个或多个氨基酸残基以下述方式改变，即将功能性N糖基化位点引入到该氨基酸序列或从所述序列中除去。在本申请中，氨基酸的名称和原子名称(例如，CA,CB，NZ，N,O，C,等)依照蛋白数据库(PDB)(www.pdb.org)的定义应用，这些名称是根据IUPAC命名法命名的(IUPACNomenclatureandSymbolismforAminoAcidsandPeptides(residuenames,atomnamesetc.),Eur丄Biochem.138，9-37(1984)和在Eur丄Biochem.中对它们的更正152,1(1985)。术语"氨基酸残基"主要是指任何天然或非天然氨基酸残基，尤其20个天然氨基酸中的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A),半胱氨酸(Cys或C),天冬氨酸(Asp或D),谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G),组氨酸(His或H)，异亮氨酸(Ile或l),赖氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，蛋氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N),脯氨酸(Pro或P),谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R),丝氨酸(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，缬氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。用于定义氨基酸的位置/取代的术语举例说明如下F13是指参考氨基酸序列中编号13的位置由苯丙氨酸残基占据。F13K是指位置13的苯丙氨酸残基已经被赖氨酸残基取代。除非另有说明，本文中氨基酸残基的编号与SEQIDNO:1所示hG-CSF的氨基酸序列相对应。可供选择的取代用7"表示，例如，Q67D/E是指其中第67位的谷氨酰胺被天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。多个取代用"+"表示，例如，S53N+G55S/T是指其中第53位的丝氨酸残基被天冬酰胺取代且第55位的甘氨酸残基被丝氨酸或苏氨酸残基取代的一个氨基酸序列。术语"核苷酸序列"是指二个或多个核苦酸分子的连续延伸。核苷酸序列可以是基因组型，cDNA型，RNA型，半合成或合成来源的，或它们的任何组合。术语"聚合酶链反应"或"PCR"通常是指一种已知的利用热稳定DNA聚合酶在体外扩增所需核苷酸序列的方法。"细胞"，"宿主细胞"，"细胞系，，和"细胞培养物"在本发明中可以交换使用且所有这些术语都应该包括细胞生长或培养后产生的后代。"转化"和"转染"可以交换使用，指将DNA导入细胞的过程。"可操作地连接"是指二个或多个核苷酸序列通过酶连接或其它方式共价连接形成相互之间的构型，以使这些序列行使正常功能。例如，如果前序列或分泌前导序列作为参与多肽分泌的前蛋白表达，那么将编码前序列或分泌前导序列的核苷酸序列可操作地连接到多肽的核苷酸序列上启动子或增强子如果影响该序列的转录则可操作地连接到编码序列上；如果核糖体结合部位位于可促进翻译的位置，那么将核糖体结合部位可操作地连接到编码序列上。通常"可操作地连接"是指被连接的核苷酸序列是邻近的，且在分泌前导序列的情况下，是邻近的同时又是处在阅读状态的。连接可以方便的在限制性酶切位点完成。如果这样的部位不存在，那么需要应用合成的寡核苷酸衔接头或接头，并结合标准的重组DNA方法。术语"引入"是指引入含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，尤其通过对现有氨基酸残基的取代，或通过插入另外的氨基酸残基。术语"除去"是指将包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基除去，尤其通过将该氨基酸残基用另外的氨基酸残基取代的方式除去，或者选择地通过删除(没有取代)预除去的氨基酸残基。当对亲代多肽进行取代时，这些取代优选是"保守性取代"，换句话说取代是在具有相似特点的氨基酸，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，碱性氨基酸，疏水性氨基酸和芳香性氨基酸之间进行取代。本发明中优选的取代尤其选自下表中列出的保守取代组保守取代组:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>与给定的物质联用的术语"免疫原性"是指该物质能诱导免疫系统的反应。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(对免疫原性的进一步解释参见，例如Roitt:EssentialImmunology(8thEdition,Blackwell))。正常情况下，抗体反应性的降低将意味着免疫原性的降低。降低的免疫原性可以通过应用本领域熟知的任何适当的方法，例如体内的方法或体外的方法确定。术语"体内功能半寿期，，以其正常的含意使用，即在体内/靶器官内多肽或偶联物仍然存在50%生物学活性的时间，或多肽或偶联物的活性是最初活性的50%的时间。确定体内功能半寿期的另一种方法可以是确定"血清半寿期"，即50%的多肽或偶联物分子在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的其它术语包括"血浆半寿期"，"循环半寿期，，，"血清清除率""血浆清除率"，"清除半寿期"。多肽或偶联物由网状内皮系统(RES)，肾脏，脾脏或肝脏中的一个或多个，通过受体介导的降解，或通过特异性或非特异性蛋白水解作用，尤其通过受体介导的清除和肾脏的清除而被清除。通常，清除取决于蛋白的大小(相对于肾小球过滤的截留值)，电荷，连接的糖链，和该蛋白的细胞受体的存在。被保留的功能性通常选自增殖或受体结合活性。体内功能半寿期和血清半寿期可以通过本领域熟知的任何适当的方法确定，这在以下的材料和方法中进一步讨论。关于体内功能半寿期或血清半寿期所用的术语"增加的，，是指偶联物或多肽的相应半寿期经可比条件下的测定，相对于参考分子，例如非偶联的hG-CSF(例如Neupogen⑧)的半寿期在统计学意义上是增加的。例如，相应半寿期可能增加至少大约25%,例如至少大约50°/。，例如至少大约100%,200o/q，500%或1000%。所用术语"肾脏清除，，的正常的含意是指肾脏，例如通过肾小球的过滤，肾小管的分泌或肾小管的排泄进行的任何清除。肾脏清除依赖于偶联物的物理特征，包括大小(直径)，对称性，形状/刚性和电荷。通过任何适当的检测，例如，一种现有体内检测法可以确定肾脏清除的降低。通常，肾脏清除可通过给予患者一种标记的(例如，放射性标记或荧光标记的)多肽偶联物并检测所收集的患者尿中标记物的活性进行确定。在可比较的条件下，肾脏清除的降低可对比相关的参考多肽例如，相应的非偶联多肽，非偶联的相应的野生型多肽或另一偶联多肽(例如并非依照本发明的偶联多肽)确定。优选，偶联物的肾脏清除率与相关的参考多肽相比降低至少50%,优选至少降低75%，最优选至少降低90%。通常，受体的活化是和受体介导的清除(RMC)相关联的，这使得多肽与其受体在非活化的情况下的结合不能导致rmc，而受体的活化导致RMC。清除是由于受体结合的多肽的内化并随后被溶酶体降解所致。设计偶联物使其能够结合和活化足够数目的受体，以获得最佳体内生物学反应17并避免活化比获得该反应所需数量更多的受体，从而可使RMC降低。这可以反映在降低的体外生物学活性和/或增加的脱离率方面。在一个优选实施方案中，本发明的偶联物与未偶联的hG-CSF相比，体外生物学活性大大降低。通常，体外生物学活性的降低反映了功效/效率的降低和/或有效性的降J氐，这可以通过用确定这些特性中任何一种的任何适当方法确定。例如，体外生物学活性可以在基于萦光素酶的试验中确定("初步试验2";参见材料和方法)。测定体外生物学活性的另一种方法是，利用材料和方法章节所述的基于细胞的试验("第二步试验")测定本发明偶联物的结合亲和力。目前已经发现，体外生物学活性比hG-CSF(SEQIDNO:l)低，有利于延长血浆半寿期和高度刺激中性粒细胞。还意外发现，给予具有较低体外生物学活性的本发明G-CSF偶联物与给予hG-CSF相比，中性粒细胞恢复得更快，即中性粒细胞计数更快地恢复到正常水平。这是一个重要发现，原因是，对由于放疗或化疗等原因而中性粒细胞水平降低的患者，能否尽可能地缩短中性粒细胞减少症的持续时间是非常关键的。因此，在一个优选实施方案中，通过本文所述的萤光素酶试验测定，或者利用基于细胞的受体结合亲和力试验("第二步实验")测定，本发明偶联物的体外生物学活性为hG-CSF(这里用作参照多肽的hG-CSF具有SEQIDNO:l，还可以具有N-末端蛋氨酸残基；所述参照hG-CSF尤其可以是Neupogen⑧，即一种非糖基化的Met-hG-CSF)生物学活性的大约2-30%,优选约3-25o/。。因此，在可比条件下测定，所述偶联物的体外生物学活性优选比hG-CSF的体外生物学活性降j氐至少70%,如至少75%,例如至少80%或85%。换而言之，所述偶联物具有野生型多肽体外生物学活性的大约2%，通常至少约3%,如至少约4%或5%。例如，在可比条件下测定，所述体外生物学活性为hG-CSF的大约4-20%。当希望降低体外生物学活性以便减少受体介导的清除时，很显然必须维持足够的生物学活性以便获得所需的受体活化，这就是为什么在上文中提到所述生物学活性必须至少是hG-CSF的大约2%，且优选略高的原因。有人发现，在G-CSF的螺旋区，即选自氨基酸位置11-41(螺旋A)，71-95(螺旋B)，102-125(螺旋C)，以及145-170(螺旋D)(相对于SEQIDNO:l)的氨基酸残基中，出现氨基酸改变(尤其是取代)，如果所得多肽与聚乙二醇偶联，就可以导致受体介导的清除减少，并因此增加体内半寿期。除了发现半寿期更长以外，还意外发现，给予这种多肽偶联物与给予市售G-CSF产品Neupogen⑧和NeulastaTM相比，还能以相同或者甚至更好的水平刺激白细胞和中性粒细胞生成。具有降低的体外生物学活性的G-CSF偶联物因此可以通过在G-CSF的螺旋区中改变(通常是取代)一或多个氨基酸残基，并将所得多肽与一或多个非多肽组分如聚乙二醇偶联来制备。优选，多肽偶联物及其受体的脱离率的增加将达到一定程度，使得可以导致在受体配体复合物的任何实质性内吞作用发生之前，将多肽偶联物从其受体上释放出来。受体多肽结合亲和力可以依照本文材料和方法部分的描述确定。所述脱离率可以利用材料和方法章节中描述的Biacore⑧技术来测定。体外RMC可以如下确定标记(例如》欠射性的或荧光的标记)多肽偶联物，刺激包含针对该多肽的受体的细胞，洗涤这些细胞并检测标记物的活性。或者，将偶联物暴露于表达相关受体的细胞。适当时间的温育后将上清液取出转移到包含相似细胞的培养孔中。这些细胞对上清液的生物反应可以与非偶联多肽或另一参考多肽对比确定，这就是RMC降低程度的测量值。通常，偶联物体外生物学活性的降低可以是其被非多肽組分修饰的结果。然而，为进一步降低体外生物学活性或为其它原因，可能还需要对偶联物的多肽部分进行修饰。例如，在一个实施方案中，与相应的野生型的多肽相比，位于多肽的受体结合区或其附近的至少一个氨基酸残基可以用另一氨基酸残基取代，以降低体外生物学活性。通过取代引入的氨基酸残基可以是能够降低偶联物的体外生物学活性的任何氨基酸残基。便利地，被引入的氨基酸残基包含本文定义的非多肽组分连接基团。尤其，当非多肽组分是聚合物分子例如PEG时，被引入的氨基酸残基可以是赖氨酸残基。术语"显示G-CSF活性"是指多肽或偶联物有天然G-CSF，尤其具有SEQIDNO:1显示的氨基酸序列的G-CSF的一个或多个功能，包括与G画CSF受体结合的能力(Pukunaga等，J.Bio.Chem,265:14008，1990)。G-CSF活性用下面材料和方法中描述的初步;f企测方法可以^^利地;险测。"显示"G-CSF活性的多肽当显示可检测的功能，例如可检测的增殖活性或受体结合活性(例如那些通过材料和方法中描述的初步检测方法确定的活性)时，被认为具备了这样的活性。本文中显示G-CSF活性的多肽为简便起见也可以称为"G-CSF分子，，，即使所述多肽事实上是G-CSF变体也可以。术语"亲代G-CSF"或"亲代多肽"是指将根据本发明被修饰的分子。亲代G-CSF通常是hG-CSF或其变体。"变体，，是有一个或多个氨基酸残基与亲代多肽不同的多肽，通常1,2,3,4,5，6,7,8,9,10,11,12,13，14或15个氨基酸残基不同。rhG-CSF的实例包括filgrastim(Gran和eupogen),lenograstim(Neutrogin和Granocyte)和nartograstim(Neu-up)。本发明的偶联物如上所述，本发明第一方面涉及包含显示G-CSF活性的多肽以及连接至该多肽的连接基团上的至少一个非多肽组分的偶联物，该多肽包含的氨基酸序列与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列不同在于特别引入或去除至少一个包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基。被引入和/或去除的氨基酸残基在以下进一步描述。应理解偶联物本身也显示G-CSF活性。通过引入和/或去除包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，可以定向改造多肽，以使多肽分子更易于与所选定的非多肽组分偶联，使偶联模式最优化(例如保证非多肽组分在G-CSF分子表面最优化分布并保证分子中只存在将进行偶联的连接基团)，从而获得既具备G-CSF活性还具有与现有G-CSF分子相比改善了一个或多个特性的新的偶联分子。多肽可以是任何来源的，尤其可以来源于哺乳动物，优选来源于人，尤其具有氨基酸序列SEQIDNO:l的多肽的变体。在本发明的优选实施方案中，具备G-CSF活性的多肽的一个以上的氨基酸残基被变更，例如这种变更包括去除和引入含所选非多肽组分连接基团的氨基酸残基。除本发明公开的旨在去除和/或引入非多肽组分的连接位点的氨基酸残基变更之外，可以理解本发明多肽的氨基酸序列在需要时可以包含其它的与引入或去除连接位点无关的变更，即其它的取代，插入或缺失。这些变更可以，例如，包括截去N末端和/或C末端一个或多个氨基酸残基，或在N末端和/或C末端添加一个或多个额外的残基，例如在N末端添加蛋氨酸残基。本发明的偶联物与hG-CSF相比，尤其与rhG-CSF(例如filgrastim,lenograstim或artograstim)或已知的hG-CSF变体相比有一个或多个以下改善的特性缩短中性粒细胞减少症持续时间的能力增加，功能性体内半寿期增加，血清半寿期增加，肾清除减少，受体介导的清除减少，副作用例如骨痛减弱，和免疫原性降低。可以理解，包含非多肽组分的连接基团的氨基酸残基，不管它是被引入还是被去除，都将根据所选择的非多肽组分的性质，且在多数情况下，根据多肽和非多肽组分之间实现偶联的方法选择。例如，当将聚乙二醇与赖氨酸残基偶联时，合适的活化分子是例如来自ShearwaterCorp.的mPEG-SPA，氧基羰基-氧-N-二羧酰亚胺-PEG(US5,122,614)，或可从PolyMASCPharmaceuticalsplc.得到的PEG。对这些分子中的第一个分子将在以下作进一步描述。为避免对亲代hG-CSF分子的结构和功能的破坏，依照本发明需要变更的氨基酸残基总数，例如如本发明下面描述的，(与SEQIDNO:1所示氨基酸序列相比)通常不超过15个。实际引入或去除的氨基酸残基数目和类型尤其依赖于所期望的偶联的性质和程度(例如，非肽组分的特征，多少非多肽组分期望或可能与多肽偶联，期望偶联发生的部位或应该避免偶联发生的部位，等)。优选，本发明偶联物的多肽部分或本发明的多肽有l-15个氨基酸残基，通常2-10个氨基酸残基，例如3-8个氨基酸残基，例如4-6个氨基酸残基，与SEQIDNO:1显示的氨基酸序列相比不同。所以，通常本发明的偶联物的多肽部分或本发明的多肽有1,2,3，4,5，6，7，8,9，10，11,12，13,14或15个氨基酸残基不同于SEQIDNO:1显示的氨基酸序列。通常偶联物的多肽部分通常具有与SEQIDNO:1至少约80%同一性的氨基酸序列，优选至少约90%，如至少约95%,例如至少约96%，97%，98%或99%的序列同一性。氨基酸序列的同源性/同一性可以便利地，用例如ClustalW程序，版本1.8，1999年6月，用缺省参数从被比对的序歹寸确定(Thompson等,1994，ClustalW:Improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsRes.22:4673-4680)或从PFAM家族数据库版本4.0(http:〃pfam.wustl.edu/)(NucleicAcidsRes.1999Jan1;27(1):260-2)通过应用GENEDOC版本2.5(Nicholas,K.B.,NicholasH.B.Jr.,和Deerfield,D.W.II.1997GeneDoc:AnalysisandVisualizationofGeneticVariation,EMBNEW.NEWS4:14;Nicholas,K.B.andNicholasH.B.Jr.1997GeneDoc:AnalysisandVisualizationofGeneticVariation)进行确定。在优选实施方案中，多肽的氨基酸序列和SEQIDNO:1显示的氨基酸序列之间的差异在于引入至少一个且经常是多个，例如1-15个包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，优选通过替换的方式引入到氨基酸序列中。所以，多肽部分变更了与所选非多肽组分结合的特定氨基酸残基的含量，从而获得更有效的，特异的和/或更大范围的偶联。例如，当包含所选非多肽的连接基团的氨基酸残基总数变更到较佳水平时，由于偶联获得的分子的形状，大小和/或电荷的改变，偶联物的清除通常明显降低。进一步地，当包含所选非多肽的连接基团的氨基酸残基总数增加时，更大比例的多肽分子被所选非多肽组分掩蔽，导致较低免疫反应。本申请中所用术语"一种不同"是指允许另外的不同存在。所以，除了特定的氨基酸的不同之外，其它的氨基酸残基可以发生突变。在另一优选实施例中，多肽的氨基酸序列和SEQIDNO:l所示氨基酸序列之间的不同是至少一个，优选多个，例如1-15个含非多肽组分连接基团的氨基酸残基从氨基酸序列中被去除，优选被取代。通过去除一个或多个包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，可以避免非多肽组分偶联在多肽上导致不利偶联的部位，例如在多肽的功能部位处或其附近的氨基酸残基上(因为在此类部位的偶联可能由于受体的识别受到影响导致所产生的偶联物失活或G-CSF活性下降)。本文术语"功能部位"是指一个或多个为hG-CSF功能或效应所必不可少或者相关的氨基酸残基。这样的氨基酸残基构成功能部位的一部分。功能部位可以通过本领域已知的方法确定，优选通过分析多肽和相关受体，例如hG-CSF受体(参见Aritomi等，nature401:713-717,1999)的复合物的结构确定。本发明的偶联物通常包含足够数量和类型的非多肽组分，以使该偶联物与hG-CSF，例如filgrastim,lenograstim或nartograstim比4交，优选与包含N末端连接的单个20kDaPEG组分的rhG-CSF比较，缩短中性粒细胞减少症持续时间的能力增加。缩短中性粒细胞减少症持续时间的能力的增加可以通过本文材料和方法章节("4#,化《谬寻的哞'/4在细應減,症的义葳确定。本发明的偶联物可以包含非多肽组分的至少一个尚未偶联、可进行偶联的连接基团。在本发明的上下文中所用的术语"可偶联的连接基团"是指位于多肽中可进行偶联的部位的连接基团，且当进行偶联时，若不存在特殊的预防措施，上述连接基团便可与相关的非多肽组分偶联。例如，这类连接基团可以是多肽表现其活性必需或相关的氨基酸残基的一部分。避免其它可偶联连接基团发生偶联的一个便利方法是利用辅助分子对连接基团进行掩蔽，例如采用题为"对功能部位的阻断"部分所述的方式。应理解尚未被偶联但可偶联连接基团的数目由特定的G-SCF多肽和可偶联的连接基团的位置决定。例如，多肽偶联物包含一个或二个未被偶联但可偶联的连接基团，和至少一个，优选二个或多个已被偶联的连接基团。G-CSF的4个螺旋包括氨基酸残基11-41(螺旋A),71-95(螺旋B)，102-125(螺旋C),以及145-170(螺旋D)(Zink等，(1994)^oc/zew/W^33:8453-8463)。意外发现，虽然一般认为对蛋白质螺旋(例如G-CSF等4螺旋束蛋白的螺旋结构)进行修饰的同时有干扰蛋白功能的危险，但当非多肽组分与位于G-CSF的一或多个螺旋区的氨基酸残基相连时可以得到有利的结果。在一个实施方案中，本发明的多肽偶联物因此包含至少一个非多肽组分，且该组分与位于其中一个螺旋(尤其B、C或D螺旋中的一或多个)中的氨基酸残基相连。本发明的偶联物，其中非多肽组分与赖氨酸连接总体上，多肽偶联物可以包含i)显示G-CSF活性的多肽，该多肽包含的氨基酸序列与SEQIDNO:1显示的氨基酸序列不同在于它至少存在选自以下取代中的一个取代T1K，P2K，L3K,G4K，P5K，A6K,S7K，S8K,L9K，PICK，Q11K，S12K,F13K,L14K，L15K,E19K，Q20K，V21K，Q25K,G26K,D27K，A29K，A30K,E33K，A37K,T38K,Y39K,L41K,H43K,P44K,E45K，E46K,V48K,L49K，L50K，H52K,S53K,L54K，I56K,P57K,P60K，L61K，S62K,S63K,P65K，S66K,Q67K,A68K，L69K，Q70K，L71K，A72K，G73K，S76K,Q77K，L78K,S80K,F83K,Q86K，G87K，Q90K,E93K,G94K，S96K,P97K,E98K,L99K,G100K，P101K,T102K，D104K，T105K,Q107K,L108K，D109K，A111K,D112K,F113K,T115K，T116K，W118K,Q119K，Q120K，M121K，E122K,E123K,L124K,M126K,A127K，P128K,A129K,L130K,Q131K,P132K,T133K，Q134K,G135K,A136K，M137K，P138K，A139K,A141K,S142K，A143K,F144K,23Q145K,S155K,H156K，Q158K,S159K，L161K,E162K，V163K，S164K,Y165K,V167K，L168K，H170K，L171K，A172K,Q173K和P174K，和ii)至少一个与该多肽的赖氨酸残基相连的非多肽组分，还可以有N-末端氨基酸残基。hG-CSF包含四个赖氨酸残基，其中K16位于受体结合结构域，其它的分别位于距离受体结合结构域相对较近的23，34和40位。为了避免这些赖氨酸残基的一个或多个氨基酸残基的偶联反应(因为这种偶联可以使所产生的偶联物的活性丧失或严重下降)需要去除至少一个赖氨酸残基，例如二个，三个或所有这些残基。所以，在另一更优选的方面本发明涉及以上定义的多肽偶联物，其中选自K16，K23,K34和K40的至少一个氨基酸残基^皮删除或被另一氨基酸残基取代。优选至少K16被另一氨基酸残基取代。优选的氨基酸取代实例包括Q70K，Q90K,T105K,Q120K,T133K,S159K和H170K/Q/R中的一个或多个，例如这些取代中的二个，三个或四个或五个，例如Q70K+Q90K,Q70K+T105K，Q70K+Q120K,Q70K+T133K，Q70K+S159K,Q70K+H170K,Q90K+T105K,Q90K+Q120K，Q90K+T133K,Q90K+S159K，Q90K+H170K，T105K+Q120K,T105K+T133K,T105K+S159K,T105K+H170K,Q120K+T133K，Q120K+S159K，Q120K+H170K，T133K+S159K,T133K+H170K,S159K+H170K,Q70K+Q90K+T105K，Q70K+Q90K+Q120K,Q70K+Q90K+T133K,Q70K+Q卯K+S159K，Q70K+Q90KH170K,Q70K+T105K+T120K,Q70K+T105K+T133K,Q70K+T105K+H170K,Q70K+Q120K+H170K,Q70K+S159K+H170K,Q90K+T105K+S159K,Q90K+Q120K+S159K,Q90K+T133K+H170K，T105K+Q120K+S159K,T105K+T133K+H170K,Q120K+T133K+H170K,Q70K+T105K+S159K，Q70K+Q120K+S159K,Q70K+T133K+H170K，Q90K+T105K+T133K，Q90K+Q120K+T133K,Q90K+T133K+S159K,T105K+Q120K+T133K,T105K+T133K+S159K,Q120K+T133K+S159K,T133K+S159K+H170K,Q70K+Q90K+T105K+T133K,Q70K+Q120K+T133K,Q70K+T133K+S159K,Q90K+T105K+Q120K，Q90K+T105K+H170K,Q90K+Q120K+H170K,Q90K+S159K+H170K,T105K+Q120K+H170K，T105K+S159K+H170K，Q120K+S159K+H170K,Q70K+Q90K+T105K+Q120K，Q70K+Q90K+T105K+S159K,Q70K+Q90K+T105K+H170K,Q70K+Q90K+Q120K+S159K,Q70K+Q卯K+T133K+S159K，Q70K+Q卯K+S159K+H170K，Q70K+T105K+Q120K+S159K，Q70K+T105K+T133K+S159K,Q70K+T105K+S159K+H170K,Q70K+Q120K+T133K+H170K,Q卯K+T105K+Q120K+T133K,Q90K+T105K+Q120K+H170K，Q卯K+T105K+T133K+H170K,Q卯K+Q120K+T133K+S159K，Q90K+Q120K+S159K+H170K，T105K+Q120K+T133K+S159K，T105K+Q120K+S159K+H170K,Q70K+Q90K+Q120K+T133K，Q70K+Q90K+Q120K+H170K,Q70K+Q90K+T133K+H170K,Q70K+T105K+Q120K+T133K,Q70K+T105K+Q120K+H170K,Q70K+T105K+T133K+H170K，Q70K+Q120K+T133K+S159K，Q70K+T133K+S159K+H170K，Q90K+T105K+Q120K+S159K,Q90K+T105K+T133K+S159K，Q卯K+T105K+S159K+H170K，Q90K+Q120K+T133K+H170K，Q90K+T133K+S159K+H170K，T105K+Q120K+T133K+H170K，T105K+T133K+S159K+H170K,或Q120K+T133K+S159K+H170K，其中的取代H170K可以用H170Q或H170R代替。具有至少一个被引入和一个被去除的赖氨酸的多肽优选包含至少一个，例如一个，二个，三个或四个选自K16R，K16Q，K23R,K23Q，K34R，K34Q，K40R和K40Q的取代，更优选至少一个K16R取代，以便避免该残基的偶联。优选，上述多肽包含至少一个选自K16R+K23R,K16R+K34R，K16R+K40R,K23R+K34R,K23R+K40R，K34R+K40R,K16R+K23R+K34R，K16R+K23R+K40R,K23R+K34R+K40R,K16R+K34R+K40R和K16R+K23R+K34R+K40R的取代。在一个优选实施方案中，该多肽包括取代K16R+K34R+K40R,但第23位的赖氨酸未发生改变。如上所述，本段所列的用于去除赖氨酸残基的每一种取代或取代组合，可以适当地与本文公开的用于引入赖氨酸残基的任何其它取代一起使用，尤其可以与上一段列举的取代一起使用。在一个具体实施方案中，所述多肽包括取代K16R，K34R，K40R，T105K和S159K，并且与2-6(通常3-6)个分子量约1000-10,000Da的聚乙二醇组》偶联。在一个实施方案中，本发明偶联物在T133位糖基化，即该位置相对于野生型hG-CSF未发生改变。这是一个天然糖基化位点。或者，偶联物也可以不发生糖基化，但优选糖基化的偶联物。尤其，偶联物可以与2-6(通常3-6)个分子量约5000-6000Da的聚乙二醇组分相连，例如与分子量约5kDa的mPEG相连。优选偶联物连接有4-5个分子量约5000-6000Da的聚乙二醇组分，例如5kDamPEG。在另一实施方案中，所制备的偶联物可以仅与单一数量的PEG组分相连，例如每一多肽与2，3,4，5或6个PEG组分相连，或者是与不同数量的PEG组分相连的多肽偶联物混合物，例如具有2-5，2-4,3-5，3-4，4-6,4-5，或5-6个连接的PEG组分的混合物。如上所述，优选的偶联混合物的一个实例也具有4-5个约5kDa的PEG组分。可以理解，具有特定数量的相连的PEG组分的偶联物，或者具有一定数量范围的相连的PEG组分的偶联物的混合物，可以通过选择合适的PEG化条件来获得，并且还可以通过利用随后的纯化来分离具有所需数量的PEG组分的偶联物。分离具有不同数量的PEG组分的G-CSF分子的方法实例如下。所连接的PEG组分的数量可通过例如SDS-PAGE来确定。为了本发明的目的，如果一种多肽偶联物经SDS-PAGE凝胶分离后，除了与给定数量的PEG組分相对应的数条带以外，未显示出其它带或者仅显示微弱的其它带，则可以认为该多肽偶联物连接了所述给定数量的PEG组分。例如，一份多肽偶联物样品经SDS-PAGE凝胶分离后，显示出分别对应于4和5个PEG基团的带，而对应于3或6个PEG基团的带很微弱或者根本未出现，则可以认为该多肽偶联物连接了4-5个PEG基团。如上所述，优选非多肽组分是聚合物分子，优选选自线性或分支的聚乙二醇或另一种聚环氧烷。优选的聚合物分子有来自ShearwaterCorp.的mPEG-SPA(尤其SPA-mPEG5000),或氧基羰基-氧-N-二羧酰亚胺PEG(US5,122,614)。可以理解，在这一章节中具体提到的任何氨基酸变更(尤其取代)，可以与公开了具体氨基酸修饰(尤其糖基化位点的引入和/或去除)的本发明其它章节中具体提到的任何氨基酸变更(优选取代)组合。本发明的糖基化偶联物除了如上所述具有引入的和去除的赖氨酸残基以外，本发明偶联物还可以通过在糖基化宿主细胞中表达所述多肽，而在hG-CSF的天然糖基化位点(T133)和/或引入的(一或多个)糖基化位点发生糖基化，使最终得到的偶联物包含一或多个糖组分。所述偶联物因此可以是具有G-CSF活性的糖基化多肽，其包含不同于SEQIDNO:l的氨基酸序列，所述不同在于通过选自下组的至少一种取代将至少一个非天然糖基化位点？1入氨基酸序列中L3N+P5S/T，P5N，A6N，S8N+P10S/T,P10N,Q11N+F13S/T,S12N+L14S/T,F13N+L15S/T,L14N+K16S/T,K16N+L18S/T,E19N+V21S/T，Q20N+R22S/T，V21N+K23S/T，R22N+I24S/T,K23N+Q25S/T,Q25N+D27S/T，G26N+G28S/T，D27N+A29S/T，A29N+L31S/T，A30N+Q32S/T，E33N+L35S/T，A37N+Y39S/T，T38N+K40S/T,Y39N+L41S/T,P44N+E46S/T,E45N+L47S/T,E46N+V48S/T,V48N+L50S/T,L49N+G51S/T，L50N+H52S/T，H52N+L54S/T，S53N+G55S/T，P60N，L61N，S63N+P65S/T,P65N+Q67S/T,S66N+A68S/T，Q67N+L69S/T,A68N+Q70S/T,L69N+L71S/T,Q70N+A72S/T，L71N+G73S/T,G73N+L75S/T,S76N+L78S/T，Q77N+H79S/T，L78N,S醒+L82S/T,F83N+Y85S/T,Q86N+L88S/T,G87N+L89S/T，Q90N+L92S/T,E93N+I95S/T，P97N+L99S/T,L99N+P101S/T,P101N+L103S/T,T102N+D104S/T,D104N+L106S/T，T105N+Q107S/T,Q107N+D109S/T,L108N+V110S/T，D109N+A111S/T，A111N+F113S/T,D112N+A114S/T,F113N,T115N+1117S/T,Tl16N+W118S/T,W118N+Q120S/T,Q119N+M121S/T,Q120N+E122S/T,M121N+E123S/T,E122N+L124S/T,E123N+G125S/T,L124N+M126S/T,M126N+P128S/T,P128N+L130S/T,L130N+P132S/T，P132N+Q134S/T,T133N+G135S/T,Q134N+A136S/T，A136N+P138S/T，P138N+F140S/T,A139N+A141S/T,A141N+A143S/T，S142N+F144S/T，A143N+Q145S/T，F144N+R146S/T,Q145N+R147S/T，R146N+A148S/T,R147N+G149S/T,S155N+L157S/T,H156N+Q158S/T，S159N+L161S/T，L161N+V163S/T,E162N,V163N+Y165S/T,S164N+R166S/T,Y165N+V167S/T,R166N+L168S/T，V167N+R169S/T,L168N+H170S/T，R169N+L171S/T和H170N+A172S/T，其中S/T代表一个S或T残基，优选T残基。可以理解，为了制备依照这一方面的偶联物，所述多肽必须在能够将寡糖组分连接到糖基化位点的糖基化宿主细胞中表达，或者使多肽在体外得到糖基化。糖基化宿主细胞的实例在下文的题为"与寡糖组分的偶联"的章节中给出。或者，依照这一方面的偶联物包含具有G-CSF活性的多肽，该多肽包含不同于SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述不同在于至少一个选自P5N,A6N，P10N，P60N,L61N，L78N,F113N和E162N，更4尤选选自PSN，A6N，PION,P60N，L61N,F113N和E162N,例如选自P60N，L61N,F113N,E162N中的取代。或者，本发明该方面的偶联物包含显示G-CSF活性的多肽，该多肽含有不同于SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述不同在于至少一个选自下组的取代D27N+A29S，D27N+A29T,D104N+L106S,D104N+L106T,D109N+A111S,D109N+A111T,D112N+A114S和D112N+A114T，更优选选自D27N+A29S,D27N+A29T，D104N+L106S，D104N+L106T,D112N+A114S，和D112N+A114T,如选自D27N+A29S，D27N+A29T,D104N+L106S,和D104N+L106T。制备本发明偶联物的方法在以下"与聚合物分子的偶联"和"与寡糖组分的偶联"的章节中，描述了与特定类型非多肽组分的偶联。一般来说，本发明多肽偶联物可以如下制备在有益于所述多肽表达的条件下培养适当的宿主细胞，并收获所述多肽，之后使所述多肽与非多肽组分体外偶联。在含有至少一个N-或O-糖基化位点的糖基化多肽的情况中，优选利用能进行体内糖基化的真核宿主细胞来实现糖基化。与聚合物分子的偶联将与多肽偶联的聚合物分子可以是任何一种适当的聚合物分子，例如天然的或合成的均聚物或杂聚物，通常多肽与分子量在大约300-100,000Da的范围的分子偶联，例如在大约500-20,000Da，更优选在大约1000-15,000Da,甚至更优选在大约2000-12,000Da，例如在大约3000-10,000的范围之间的分子。本发明关于聚合物分子所使用的一词"大约"是指一个大概范围的分子量且反映这样一个事实，即通常在给定的聚合物制品中会有一个确定的分子量分布。均聚物的实例包括多羟基化合物(即聚-OH),聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-COOH)。杂聚物是包含不同偶联基团，例如羟基和胺基的聚合物。适当的聚合物分子的实例包括选自聚环氧烷(PAO),包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如线性的或分支的聚乙二醇(PEG)和聚丙烯乙二醇(PPG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯(poly-carboxylate)，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯-共-马来酸酐(polyethylene國co-maleicacidanhydride),聚苯乙烯-共國马来酸酸酐(polystyrene-co-maleicacidanhydride),右S走斗唐酐，包4舌羧曱基右^走辟唐酐iU壬何其它的适合降低免疫原性和/或增加体内功能半寿期和/或血清半寿期的生物聚合物的聚合物分子。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一高丰度血浆蛋白。通常，聚环氧烷来源的聚合物是适合生物的，无毒性的，无抗原性的，无免疫原性的，有各种水溶解特性，且易从活的生物体排泄。PEG是优选的聚合物分子，因为与多肽例如右旋糖酐相比它仅有几个能够进行交叉连接的反应基团。尤其，单一功能的PEG,例如曱氧基聚乙二醇(mPEG)，因为它的偶联化学反应相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团的偶联)所以受到关注。因而，交叉连接的危险被排除，所产生的多肽偶联物是较均一的且聚合物分子与多肽的反应比较容易受到控制。为了实现聚合物分子和多肽的共价连接，提供的聚合物分子的羟基结尾的基团是活化的形式，即是功能性的反应基团。适当的活化的聚合物分子可以购买到，例如从ShearwaterPolymers,Inc.,Huntsville，AL,USA,或从PolyMASCPharmaceuticalspic,UK.购买到。或者，聚合物分子可以通过本领域已知的便利的方法，例如WO90/13540中公开的方法活化。本发明中应用的活化的线性或分支状的聚合物分子的具体的实例在ShearwaterPolymers,Inc.1997and2000Catalogs(FunctionalizedBiocompatiblePolymersforResearchandpharmaceuticals,PolyethyleneGlycolandDerivatives,纳入本发明作参考)中描述。活化的PEG聚合物的具体实例包括以下线性PEG:NHS-PEG(例如SPA画PEQSSPA画PEQSBA-PEQSS画PEQSSA-PEQSC-PEQSG-PEG和SCM-PEG),和NOR-PEG)，BTC-PEQEPOX-PEQNCO國PEQNPC-PEQCDI國PEQALD-PEQTRES-PEQVS-PEQIODO-PEQ和MAL-PEQ和分支PEG例如PEG2-NHS以及那些在US5,932,462和US5,643,575中公开的聚合物，它们都被纳入本发明作参考。进一步地，在以下被纳入本发明作参考的出版物中，公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化合物US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP229,108，EP402,378，US4,902,502,US5,281,698，US5，122，614，US5,219,564,WO92/16555,WO94/04193,WO94/14758,WO94/17039,WO94/18247,WO94/28024,WO95/00162,WO95/11924，W095/13090,WO95/33490，WO96/00080,WO97/18832,WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134,WO99/32139,WO99/32140,WO96/40791,WO98/32466,WO95/06058，EP439508，WO97/03106，WO96/21469,WO95/13312，EP921131,US5,736,625，WO98/05363,EP809996,US5,629,384,WO96/41813,WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605963，US5,382,657，EP510356，EP400472，EP183503和EP154316。多肽和活化的聚合物分子的偶联可通过应用任何便利的方法，例如按照以下参考文献中描述的方法(这些文献也描述了聚合物分子的适当的活化方法)进行R.F.Taylor,(1991),"Proteinimmobilisation.Fundamentalandapplications",MarcelDekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking",CRCPress,BocaRaton;G.T.Hermanson等，(1993)，"ImmobilizedAffinityLigandTechniques",AcademicPress,N.Y.)。才艮4居多肽的连接基团(实例在上面已给出)和聚合物的功能基团(例如胺，羟基，羧基，醛，sulfydryl，琥珀酰亚胺(succinimidyl),马来酰亚胺，乙烯基砜(vinysulfone)或卣代醋酸盐(haloacetate)技术人员知道所要应用的活化方法和/或偶联化学。PEG化可以是直接指向多肽上所有可利用的连接基团(即被暴露在多肽表面的那些连接基团)的偶联或者可以是直接指向一个或多个特定的连接基团，例如N末端氨基(US5,985,265)的偶联。进一步地，偶联可以以一步或逐步的方式完成(例如象WO99/55377描述的那样)。可以理解，通过设计PEG化作用可以制备出最佳的分子，使得所连接的PEG分子的数量、大小和形式(例如，线性还是分支)、以及它们在多肽中的连接位置都最佳。所用聚合物的分子量可根据预期效果进行选择。例如，当偶联的主要目的是获得高分子量和较大体积的偶联物(例如为了降低肾清除)时，可与一或几个高分子量聚合物分子偶联，或与很多个分子量较小的聚合物分子偶联，以获得所需效果。但优选，使用数个分子量相对较低的聚合物分子。当需要较大程度地掩蔽表位时也是如此。这时，可以应用例如分子量约5，000Da的2-8个聚合物，例如3-6个这样的聚合物。如以下列举的实例，与应用较少的具有较高分子量的聚合物分子(例如1-3个分子量为12,000-20,000的分子)相比，应用较多的具有较低分子量的聚合物分子(例如4-6个分子量为5000的分子)，在改善多肽偶联物的体内功能半寿期方面更有优点，即使当这两种情况中所连接的聚合物分子的总分子量相同时，也是如此或类似。可以相信，较小分子量的较多的聚合物分子的存在比例如单独一个较大的聚合物分子可以为多肽提供较大的半径或外观形状，至少当聚合物分子是相对均一地分布在多肽表面时情况是这样的。另外还发现，当本发明偶联物的至少一个主要部分的表观大小(也称"表观分子量"或"表观质量")为至少约50kDa,优选至少约55kDa，更优选至少约60kDa，例如至少约66kDa时，能获得较有利的结果。我们相信这可归因于以下事实对于具有相当大的表观大小的偶联物而言，肾清除基本上消失了。在本文上下文中，G-CSF偶联物或多肽的"表观大小"通过以下实施例章节中描述的SDS-PAGE方法来确定。术语"主要部分"的使用与本发明多肽偶联物通常含有多个单独的偶联物且它们与不同数量的非多肽组分相连的事实有关。例如，给定的多肽在给定的一套PEG化条件中进行PEG化，可以得到一种组合物，其中大多数的多肽偶联物个体与例如3-5个PEG基团连接，绝大多数的偶联物连接4个PEG基团。很显然，这些偶联物分子彼此的表观分子量是不同的。在这个实例中，如果我们假定G-CSF多肽与分子量为5kDa的PEG基团偶联，则仅与3个PEG基团偶联的那些偶联物在SDS-PAGE凝胶上表现为表观分子量小于约50kDa的带，而与4或5个PEG基团偶联的那些偶联物则产生明显较大的表观分子量的带，很可能它们全部都大于约50kDa。因此，在这个实例中，在SDS-PAGE凝胶上将出现3种主要的带，它们分别对应于与3，4，或5个PEG基团偶联的偶联物。因此，术语"主要部分"在本说明书和权利要求书的上下文中是指，SDS-PAGE凝胶上的上述主要带至少有一种对应于所指明的最低表观分子量。优选，单独的偶联物分子有至少50%具有上述的最低表观大小。更优选，偶联物分子有至少60%具有所述最低表观大小，还更优选至少70%,75%，80%或85%。最优选，偶联物分子有至少90%具有上述的最低表》见大小，即至少50kDaJM尤选更大，例如至少55kDa或60kDa。可以理解，偶联物或多肽的表示为kDa的表观大小不必与该偶联物或多肽的实际分子量一致。这种表观大小更有可能反映的是真实的分子量以及总体质量这二者。由于在大多数情况中，一或多个PEG基团或其它非多肽组分的连接可以使与之连接的多肽的质量大大增加，故本发明多肽偶联物的表观大小通常超过该偶联物的真实分子量。因此，考虑到肾清除，本发明偶联物可以很容易地表现出分子量大于例如66kDa(对应于表观大小)的多肽的特征、但其实际分子量却小于66kDa。我们相信，表观大小上的这种效应是导致以下现象的原因连接例如4个5kDa的PEG基团的结果要超出仅连接一个20kDa的PEG基团的多肽。尽管仅将单个聚合物分子连接在蛋白上的单个连接基团上不是优选的情况，但在仅连接一个聚合物分子的事件中，如果该聚合物分子(线性或分支的都可以)具有相对较高的分子量，例如约20kDa，通常较有利。在另一个优选实施方案中，本发明的偶联物具有l)至少一个表观分子性(降低的受体结合亲和力)。我们发现，这样的偶联物由于表观大小较大而导致肾清除水平较低，并且由于体外生物学活性较低(受体结合亲和力较低)而导致受体介导的清除水平较低。总体结果在以下方面是非常优秀的有效刺激中性粒细胞、显著增加体内半寿期、因此而长时间发挥作用从而带来重要的临床效益。通常，聚合物的偶联是在使尽可能多的可利用的聚合物连接基团与聚合物分子反应的条件下进行的。这可以通过使聚合物相对于多肽(连接位点的数量)适当摩尔过量的方式达到。活化的聚合物分子与多肽连接位点的典型摩尔比最多约1000-1,例如最多约200-1或最多约100-1。但在一些情况中，例如，在需要较低程度的聚合物连接时，上述比例可以有所降低，例如最多约50-1，10-1或5-1。本发明对聚合物分子通过一个接头与多肽偶联也进行了研究。适当的接头对技术人员来说是熟知的。优选的实例是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977),J.Biol.Chem.252,3578-3581;US4,179,337;Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,24，375-378)。偶联后，按本领域已知的方法如通过将伯胺加入到反应混合物中而封闭残留的活化聚合物分子，并通过合适的方法除去所产生的失活的聚合物分子(参见材料与方法)。在一个优选实施例中，本发明的多肽偶联物包含PEG分子，其与所述多肽中可用于PEG化的一些、大多数或优选基本上全部赖氨酸残基连接，所述PEG分子尤其是线性或分支的PEG分子，例如分子量约l-15kDa，通常约2-12kDa，例如约3-10kDa，例如约5或6kDa的PEG分子。可以理解，根据多种情况，例如多肽的氨基酸序列，所用活化PEG化合物的性质和特定的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比，可获得不同程度的PEG化，较高程度的PEG化通常可以通过PEG与多肽的较高比率获得。然而，由任何给定的PEG化过程所产生的PEG化多肽，通常将包含PEG化程度略有差异的多肽偶联物的随机分布。必要时，这种与不同数量的PEG组分相连的多肽的混合物，可以利用以下实施例中描述的方法进行纯化，从而获得具有更单一的PEG化程度的产物。在另一实施例中，本发明的多肽偶联物包括连接至可用于PEG化多肽赖氨酸残基上的PEG分子，和另外连接至多肽的N末端氨基酸残基上的PEG分子。与寡糖组分的偶联与寡糖组分的偶联可以在体内或体外进行，优选体内。为了完成包含一个或多个糖基化位点的G-CSF分子的体内糖基化，必须将编码多肽的核苷酸序列插入到可糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、动物细胞，或选自转基因植物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞，如HEK293,或昆虫细胞，如SF9细胞，或者酵母细胞如酿酒酵母((Sacc/zaram少cesCerev/s/"e)、毕赤巴斯德酵母(尸/c/n'apostor/力或下文描述的任何宿主细胞。也可利用糖(右旋糖酐)与多肽氨基酸残基的体外共价偶联，例如，按照WO87/05330和Aplin等，CRCCritRev.Biochem.,pp.259-306，1981中所描述的方法进行。寡糖组分或PEG与蛋白-和肽-结合的Gin残基的在体外的偶联可通过谷氨酰胺转移酶(TG酶)来实现。在所谓交联反应中谷氨酰胺转移酶催化供体的胺基转移到蛋白结合型和肽结合型的Gin残基上。供体的胺基可以是蛋白结合型或肽结合型的，例如象赖氨酸残基中的s胺基，或者可以是小的或大的有机分子的一部分。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中一个可起胺基供体作用的小的有机分子的实例是腐胺(l,4丁二胺)。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中起胺基供体作用的较大的有机分子的一个实例是包含胺基的PEG(Sato等，Biochemistry35，13072-13080)。通常，谷氨酰胺转移酶是高度特异性的酶，不是每个暴露在蛋白质表面的Gin残基都可以在谷氨酰胺转移酶的催化下交联到包含胺基的底物上。相反，仅仅几个Gin残基可自然起到谷氨酰胺转移酶底物的功能，但决定哪一个Gln-残基是好的谷氨酰胺转移酶底物的准确标准尚未可知。所以，为了使蛋白易于进行谷氨酰胺转移酶催化的交联反应，通常在方便的位置添加已知可以很好地行使谷氨酰胺转移酶底物功能的氨基酸序列是首要条件。已知几种氨基酸序列本身是或者包含极好的天然谷氨酰胺转移酶底物例如P物质，快反应型弹性蛋白酶抑制肽，血纤蛋白原，纤连蛋白，(12纤溶酶抑制物，a酪蛋白和|3酪蛋白。功能性位点的封闭已经报道聚合物的过度偶联可导致与聚合物偶联的多肽活性丧失。消除该问题的方法可以是，例如去除位于功能性位点的连接基团，或在偶联前封闭功能性位点、从而在偶联时功能性位点处在被封闭状态。后一种策略构成本发明进一步的技术方案(第一种策略在上文中进行了举例说明，如通过去除邻近功能性位点的赖氨酸残基)。更具体来说，按照第二种策略，多肽和非多肽组分之间的偶联是在多肽功能性位点在能够结合多肽功能性位点的辅助分子封闭的条件下进行的。优选地，辅助分子能特异性识别多肽的功能性位点，如受体，特别是G-CSF受体或G-CSF受体的一部分。另外，辅助分子可以是抗体，特别是识别显示G-CSF活性的多肽的单克隆抗体。特别是，辅助分子可以是中和性单克隆抗体。所述多肽可以在偶联之前与辅助分子相互作用。这确保多肽的功能性位点被掩盖或保护并因此不能被非多肽组分如聚合物衍生。从辅助分子洗脱后，非多肽组分和多肽之间的偶联可用至少部分保留的功能性位点来恢复。具有被封闭的功能性位点的多肽与聚合物、寡糖组分或任何其它化合物的随后偶联，以常规方式进行，如上文所述。不考虑用于掩盖偶联物中多肽功能性位点的辅助分子的性质，理想的是辅助分子不含或仅仅含有少量的与分子中指定非多肽组分结合的基团，其中与这些基团的偶联将阻止偶联的多肽从辅助分子上解除吸附。因此，可与多肽非掩盖部分中存在的连接基团选择性偶联并且辅助分子可反复用于重复偶联。例如，如果非多肽组分是聚合物分子如PEG这种具有赖氨酸s氨基或N-末端氨基酸残基作为连接基团的分子时，理想的是辅助分子基本上不含可偶联的s氨基，优选不含任何s氨基。因此，在优选的实施方案中，辅助分子是能够与多肽功能性位点结合的蛋白质或肽，该蛋白质或肽不含任何与指定非多肽组分可偶联的连接基团。本发明的实施例中多肽偶联物是从多种多样的编码目的多肽的核苷酸序列中制备的，功能基团的阻断是在偶联之前在微滴定板中实现的，例如，将表达出来的多肽变体加入到包含被固定的阻断基团，例如受体，抗体或类似物的微滴定板中。在另一实施例中，辅助分子首先与固相，例如柱充填材料，例如交联葡聚糖或琼脂糖珠，或一种表面，例如反应器皿共价连接。随后，将多肽装载到携带辅助分子的柱体材料上，然后依照本领域熟知的方法，例如按照上文所述进行偶联。该方法允许多肽偶联物通过洗脱与辅助分子分离。多肽偶联物通过常规技术在不导致多肽偶联物实质性降解的物理化学条件下洗脱。包含多肽偶联物的液相从固相中被分离，但辅助分子仍然与多肽偶联物共价连接。所述分离可以用其它的方法实现例如，辅助分子可以用一个第二分子(例如生物素)衍生，所述第二分子可以被一个特异性结合物(例如链霉抗生物素)识别。可以将特定的结合物与固相连接，这样使多肽偶联物与辅助分子-第二分子复合物在经过第二个辅助物-固相柱时得到分离，在随后洗脱时，辅助分子-第二分子复合物保留在固相柱上，而多肽偶联物从柱上被洗脱下来。多肽偶联物可以任何适当的方式从辅助分子中释放出来。通过提供辅助分子从与其结合的G-CSF的功能位点分离的条件可解除保护作用。例如，聚合物偶联的抗体和抗独特型抗体之间形成的复合物可以通过将pH值调整到酸性或碱性pH水平得到解离。带标记的多肽的偶联在另一实施方案中，多肽与标记物(即通常由1-30,例如l-20个氨基酸残基组成的一段氨基酸序列或肽片段)以融合蛋白的形式表达。除了能使纯化快速和容易外，该标记物还是被标记的多肽和非多肽组分之间实现偶联的便利工具。尤其，标记物可以用来完成微滴定板中的偶联或通过标记物将标记后的多肽固定到其它载体，例如顺磁性珠上。在微滴定板上与标记的多肽偶联具有以下优点，标记的多肽可从培养肉汤直接固定在《敬滴定板35上(原则上不经任何纯化)并进行偶联。因此，可减少操作步骤的总数(从表达到偶联)。而且，标记物可起间隔臂分子的作用以确保更易于使固定的多肽偶联。使用标记多肽进行的偶联可以是与本文中公开的任何非多肽组分的偶联，如与聚合物分子如PEG的偶联。所要应用的特定标记物的特征并不重要，只要该标记物能够和多肽一起被表达且能够被固定到适当的表面或载体物质上。可以市场上购买到许多适当的标记物,例如购自Unizymeboratories,Denmark。例如，所述标记物可以是任一下列序列Met-Lys隱His-Gln-His-Gln隱His-Gln-His-Gln-His國Gln-His-Gln-Gln(SEQIDNO:5)His-His-His國His-His-His(SEQIDNO:9)Met-Lys-His-His-His-His-His陽His(SEQIDNO:10)Met-Lys-His國His隱Ala-His-His-Gln-His-His(SEQIDNO:l1)Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His陽Gln陽His國Gln-His-Gln(SEQIDNO:12)或以下的任何序列EQKLISEEDL(SEQIDNO:13)(在Mol.Cell.Biol.C5:3610-16，1985中描述的C末端标记物)DYKDDDDK(SEQIDNO:14)(C末端或N末端标记物)YPYDVPDYA(SEQIDNO:15)也可以从市场上获得抗上述标记物的抗体，例如可购自ADI,AvesLabandResearchDiagnostics。应用标记后的多肽进行PEG化4更利方法在以下材料与方法部分描述。随后可以用从市场上可购到的酶将标记物从多肽中切割下来。制备本发明的多肽或本发明偶联物的多肽组分的方法本发明的多肽或偶联物的多肽部分，可选择地，以糖基化形式，通过本领域熟知的任何适当的方法制备。所述方法包括构建编码多肽的核苷酸序列并且在适当的转化或转染宿主中表达。然而，本发明的多肽也可以通过化学合成的方法制备(尽管这种方法的效率较低)，或者联合应用化学合成和重组DNA纟支术。编码本发明的多肽或偶联物的多肽部分的核苷酸序列可以通过分离或合成编码亲代G-CSF,例如具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的hG-CSF的核苷酸序列构建，然后改变核苷酸序列以引入(即插入或取代)或删除(即去除或取代)相关的氨基酸残基。依照常规方法通过定点突变可便利地修饰核苷酸序列。或者，可通过化学合成核芬酸序列，例如通过应用一种寡聚核苷酸合成仪制备，其中寡聚核苷酸是在目的多肽的氨基酸序列的基础上设计的，且优选那些有利于在制备重组多肽的宿主细胞中表达的那些密码子。例如可以合成编码目的多肽部分的几个小寡核香酸，然后通过PCR,连接反应或连接酶链反应(LCR)将所述寡核苷酸装配起来(Barany，PNAS88:189-193，1991)。通常，每个寡核苷酸包含用于补足性装配的5'或3'的悬垂部分。可以应用另外的核苷酸序列修饰方法制备高产量筛选的多肽变体，例如，US5,093,257中公开的涉及同源交叉的方法，和涉及基因改组(shuffling)的方法，即二个或多个同源核苷酸序列的重组导致新的核苷酸序列与起初的核苷酸序列比较具有多个核苷酸改变。基因改组(也称为DNA改组)涉及一个或多个随机片段的循环和核苷酸序列的组装，然后进行筛选以选择编码具有所需特性的多肽的核苷酸序列。为了进行同源基础的核酸改组，核苷酸序列相关的部分优选至少50%相同，例如至少60%相同，更优选至少70%相同，例如至少80%相同。重组可以在体外或者体内进行。适当的体外基因改组方法的实例由Stemmer等，(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA;vol.91，pp.10747-10751;Ste醒er(1994)，naturevol.370,pp.389-391;Smith(1994),Naturevol.370,pp.324-325;Zhao等，natureBiotechnology,1998,Mar;16(3):258-61;ZhaoH.andArnold,FB，1997,Vol.25.No.6pp.1307-1308;Shao等，NucleicAcidsResearch1998,Jan15;26(2):pp.681-83;WO95/17413公开。适当的体内改组方法的实例在WO97/07205中公开。其它的通过体外或体内重组的核酸序列的突变技术已由例如WO97/20078和US5,837,458公开。特定的改组技术的实例包括"家族改组"，"合成改组"和"计算机摹拟(insilico)改组"。家族改组涉及将来自不同种属的同源基因的家族进行一个或多个改组循环，然后进行筛选或选择。家族改组技术已由例如Crameri等，(1998)，naturevol.391,pp.288-291;Christians等,(1999)，natureBiotechnologyvol.17,pp.259-264;Chang等，(1999),natureBiotechnologyvol.17，pp.793-797;andNess等，(1999),natureBiotechnologyVol.17,893-896公开。合成改组涉及提供重叠的合成寡核香酸文库，所述寡核苷酸是以例如目标同源基因序列比对为基础的。将合成的寡核苷酸重组，然后将所形成的重组核酸序列进行筛选，如果需要，可将所形成的重组序列用于进一步的改组循环。合成改组技术在WO00/42561中公开。计算机摹拟改组中涉及DNA的改组程序，该改组程序是应用计算机系统进行或模拟的，所以部分或完全避免了核酸的人工操作。WO00/42560公开了计算机摹拟改组的技术。一旦完成组装(通过合成，定点突变或其它的方法)，即将编码多肽的核苷酸序列插入到一种重组载体中，且可操作地连接到期望转化的宿主细胞中G-CSF表达所需的调控序列上。可以理解，不是所有的载体和表达调控序列都能同样完好的表达编码本文所述多肽的核苷酸序列。即使应用同样的表达系统所有的宿主也不是都能同样完好地行使其功能。然而，本领域中有一种技术可以在无不适当试验的情况下对这些载体，表达调控序列和宿主进行选择。例如，在选择载体时，必须考虑到宿主，因为载体必须在宿主中复制或能够整合到染色体中。也应该考虑载体的拷贝数量，其调控拷贝数量的能力，和任何其它的由载体编码的蛋白的表达，例如抗生素标志物。在选择表达调控序列时，也应该考虑许多因素。这些因素包括，例如，序列的相对长度，序列的可控制性，和该调控序列与编码多肽的核苷酸序列的相容性，尤其要注意序列的可能的二级结构。选择宿主时应该考虑宿主与所选载体的相容性，由核普酸序列编码的产物的毒性，宿主的分泌特性，宿主正确折叠多肽的能力，宿主的发酵或培养条件，和由核苦酸序列编码的产物的纯化的难易。重组载体可以是自主复制的载体，即这种载体可以作为染色体外的实体存在，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。或者，载体也可以是这样一种载体，当导入到宿主细胞时，其被整合到宿主细胞基因组中且同被整合的染色体一起复制。载体优选是一种表达载体，在该表达载体中编码本发明的多肽的核苷酸序列被可操作性地连接到核苷酸序列转录所需的另外的区段上。通常，载体来源于质粒或病毒DNA。本发明中提到的在宿主细胞中表达的许多适宜的表达载体可从商业渠道购买或者在文献中有描述。用于真核宿主的表达载体包括，例如来自SV40，牛乳突淋瘤病毒，腺病毒和细胞巨化病毒的包含表达调控序列的载体。特定的载体是，例如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和pCI-neo(Stratagene,LaJolla,CA，USA)。38用于酵母细胞的表达载体包括2iu质粒和它们的衍生物，P0T1(US4,931,373),在Okkels，Ann.NewYorkAcad.Sci.782，202-207，1996，和pPICZA，B或C(Invitrogen)中描述了pJS037载体。用于昆虫细胞的载体包括pVL941,pBG311(Cate等，"IsolationoftheBovineandHumanGenesforMullerianInhibitingSubstanceAndExpressionoftheHumanGeneInAnimalCells",纟田胞45,pp.685-98(1986),pBluebac4.5和pMelbac(两者都可以从Invitrogen获得)。用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(两个都来自NovagenInc.,WI,USA),较宽宿主范围的质粒，例如RP4，噬菌体DNA,例如入噬菌体的许多衍生物，例如NM989,及其它的DNA噬菌体，例如M13和丝状单链DNA噬菌体。本发明中应用的其它载体包括允许编码多肽的核苷酸序列以一定的拷贝数扩增的那些载体。上述可扩增的载体在本领域中已熟知。它们包括，例如能够通过DHFR扩增(参见，例如，Kaufman,U.S.PatNo.4，470，461,Kaufman和Sharp,"ConstructionOfAModularDihydrafolateReductasecDNAGene:AnalysisOfSignalsUtilizedForEfficientExpression",Mol.Cell.Biol"2,pp.1304-19(1982))和谷氨酰胺合成酶扩增("GS")的载体(参见，例如，US5，122,464和EP338,841)。重组载体可进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。此序列的一个例子(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起始点。当宿主细胞是酵母细胞时，能够使载体复制的合适序列是酵母质粒2p复制基因REP1-3和复制起始点。载体也可含有能选择的标记，如基因，其产物补充宿主细胞的缺陷，如编码二氬叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell,Gene40，1985,pp.125-130),或者赋予对药物如氨千青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。对于丝状真菌来说，能选择的标记包括amdS、pyrG、arcB、niaD、sC。术语"控制序列，，在本文中包括对本发明多肽表达必需的或有利的所有成分。每个控制序列对编码多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包4舌启动子。本发明可以使用各种各样的表达控制序列。这些可使用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达控制序列以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。哺乳动物细胞中指导转录的合适控制序列的实例包括SV40和腺病毒的早期或晚期启动子，如腺病毒2的主要晚期启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子、人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、人延伸因子lot(EF-la)启动子、果蝇最小热休克蛋白70启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、人遍在蛋白C(UbC)启动子、人生长激素终止子、SV40或腺病毒Elb区聚腺苷酸化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.JMolBiol1987Aug20;196(4):947-50)。为了改善在哺乳动物细胞中的表达，可以将合成的内含子插入编码所述多肽的核苷酸序列的5'未翻译区。合成内含子的实例是来自质粒pCI-Neo的合成内含子(购自PromegaCorporation,WI,USA)。昆虫细胞中指导转录的合适控制序列的实例包括多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿4艮紋夜蛾04wtogra//wca/z/orw'ca)多角体病毒石咸性蛋白启动子、杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟早期基因启动子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括酵母a交配系统的启动子、酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子、来自酵母糖酵解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子、ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。在丝状真菌宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括ADH3启动子和终止子，由编码如下酶的基因衍生的启动子米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶、黑曲霉a淀粉酶、黑曲霉或构巢曲霉(AiW血/a"力葡糖淀粉酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(及/z/zomwcwm/e/^')天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶，TPI1终止子和ADH3终止子。在细菌宿主细胞中使用的合适控制序列的实例包括lac系统、trp系统、TAC或TRC系统的启动子和噬菌体入的主要启动子区域。信号肽的存在与否取决于，例如用于生产需要表达的多肽(细胞内或细胞外多肽)的表达宿主细胞、以及是否需要分泌。为了在丝状真菌中使用，信号肽可以由编码曲霉属菌林的淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或i/wm'co/a/am^/wo^脂肪酶的基因方便衍生。信号肽优选由编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因衍生。为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以由昆虫基因方便地衍生(参见WO90/05783),如鳞翅目Mam/wca脂动激素前体(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蜕皮甾类UDP葡糖基转移酶(egt)(Murphy等，ProteinExpressionandPurification4,349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(MethodsinEnzymology284,pp.262-272，1997)。哺乳动物细胞中使用的优选信号肽是hG-CSF的信号肽或鼠IgK轻链信号肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods152:89-104)。为了在酵母细胞中使用，发现合适的信号肽是酿酒酵母a-因子信号肽(参见US4870008)、改良的羧肽酶信号肽(参见L.A.Vails等，Cell48,1987,pp.887-897)、酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等人，Yeast6,1990,pp.127-137)和合成的前导序列TA57(W098/32867)。已发现适宜于大肠杆菌的信号肽是ompA。编码显示G-CSF活性的多肽的本发明核苷酸序列，无论是通过定点诱变、合成还是其它方法制备的，都可以包括也可以不包括编码信号肽的核苷酸序列。多肽从表达该多肽的细胞中分泌时，存在信号肽。如果存在，此信号肽应当由选来用于表达多肽的细胞识别。信号肽可以与多肽同源(如,通常与G-CSF相连)或异源(即，来自于除hG-CSF之外的另一来源)或者可以与宿主细胞同源或异源，即是由宿主细胞正常表达的信号肽或是由宿主细胞非正常表达的。因此，信号肽可以是原核的如由细菌如大肠杆菌衍生的，或真核的，如由哺乳动物或昆虫或酵母细胞衍生的。可以使用任何合适的宿主产生本发明偶联物的多肽或多肽部分，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系、以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、或链霉菌，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌或假单孢菌菌抹。可将载体引入细菌宿主细胞，例如可通过原生质体转化(参见如ChangandCohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受态细胞(参见如YoungandSpizizin,1961，JournalofBacteriology81:823-829,或Dub醒andDavidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)、电穿孔(参见如ShigekawaandDower,1988，Biotechniques6:742-75l)或偶联(参见如KoehlerandThorne，1987，JournalofBacteriology169:5771-5278)来进行。合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌林，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属或木霉菌属。真菌细胞可以转化，转化过程涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。在Malardier等1989，Gene78:147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀菌属的合适方法。合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌林，如酿酒酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属，如巴斯德毕赤酵母或PM^/^"o"ca、汉逊酵母属，如多形汉逊酵母或KwrovWa。酵母可/f吏用Becker和Guarente,InAbelson，J.N.AndSimon,M.I.，editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymologyVolume194，pp182-187,AcademicPress,Inc"NewYork;Ito等人，1983，JournalofBacteriology153:163;和Hinnen等人1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法和ClontechLaboratories,Inc，PaloAlto,CA,USA(在YeastmakerYeastTranformationSystemKit的产品使用说明书)公开的来转化。合适昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾细胞(HighFive)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法转化昆虫细胞并在其中产生异源多肽。合适哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，CHO-K1;ATCCCCL-61)、绿猴细胞系(COS)(如，COSl(ATCCCRL-1650)、COS7(ATCCCRL-1651));小鼠细胞(如，NS/0)、仓鼠幼鼠肾脏(BHK)细胞系(如，ATCCCRL-1632或ATCCCCL-10)和人细胞(如，HEK293(ATCCCRL-l573))，以及组织培养中的植物细胞。另外合适的细胞系在本领域中是已知的并可购自公开的保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。将外源性DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钓介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体和由LifeTechnologiesLtd,Paisley,UK戶斤述的^吏用Lipofectamin2000的转染方法。这些方法在本领域中是已知的，例如Ausbel等(eds.),1996,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,USA所述。按建立的方法进行哺乳动物细胞的培养，例如在AnimalCellBiotechnology,MethodsandProtocols,NigelJenkins编，1999，HumanPressInc,Totowa，NewJersey,USAandHarrisonMAandRaeIF,GeneralTechniquesofCellCulture,CambridgeUniversityPress1997中的^>开的。在本发明生产方法中，细胞用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养培养基中培养。例如，细胞可以在实验室中通过振摇烧瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、成批、补料分批或固体状态发酵)或在合适培养基和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行工业发酵来发酵。培养在含有碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基可商购或可以按公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中所述的)。如果多肽分泌在营养培养基中，多肽可从培养基中直接回收。如果多肽不被分泌，可从细胞裂解物中回收。可通过本领域已知的方法来回收所得多肽。例如，可通过常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基中回收多肽。可通过本领域已知的各种方法来纯化多肽，所述方法包括但不限于层析(如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如，制备性等电聚焦)、溶解度差异(如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，^口ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,纟扁，VCHPublishers,NewYork,1989)。纯化具有G-CSF活性的多肽的具体方法参见D.Metcalf和N.A.Nicola的Thehemopoieticcolony-stimulatingfactors,p.50-51,CambridgeUniversityPress(1995)，以及参见C.S.Bae等的Appl.Microbiol.Biotechnol,52:338-344(1999)和US4,810,643。本发明的药物组合物及其应用本发明进一步包含本文所述多肽或偶联物的组合物和至少一种可药用载体或赋形剂。用本发明的多肽，偶联物或药物组合物可以制备治疗某些疾病的药物，尤其用于预防正接受某些类型的化疗，放疗和骨髓移植治疗的癌症患者的感染，在外周血前体细胞移植时用于动员前体细胞汇聚，用于严重的慢性或相关的白细胞减少症患者的治疗，用于急性髓样白血病患者的治疗，用于AIDS病或其它免疫缺陷病的治疗，和抗真菌治疗，尤其用于对全身性或侵袭性念珠菌病的治疗。另一方面，本发明的多肽、偶联物或药物组合物可用于对一般(general)造血疾病(包括放疗或化疗引发的那些，尤其是中性粒细胞减少症或白细胞减少症)，AIDS或其它免疫缺陷病的患者进行治疗的方法中，该方法包括对需要治疗的哺乳动物施用上述多肽、偶联物或药物组合物。尤其是，所述方法旨在增加中性粒细胞水平不足(例如，由于化疗，放疗，或者HIV或另一种病毒感染所致)的患者体内中性粒细胞的水平。将本发明的多肽和偶联物以"治疗有效的"剂量，即足以对给药治疗的疾病产生所期望的效果的剂量，给予患者。准确的剂量将根据所要治疗的疾病决定，且可以由本领域技术人员用已知的技术确定。本发明的多肽或偶联物可以例如用类似于rhG-CSF，例如Neupogen⑧的治疗剂量给药。本发明偶联物的适当剂量预计是在大约5-300ing/kg体重的范围内(根据偶联物的蛋白部分的重量)，10-200pg/kg,例如25-100pg/kg。本发明的多肽，偶联物或组合物的有效量尤其依赖于，疾病，剂量和给药的时间表，多肽或偶联物或组合物是否单独给药或与其它的治疗制剂结合给药，组合物的血清半寿期，患者的一般健康状况，和给药的频率，这些对本领域的技术人员来说是显而易见的。优选，本发明的多肽，偶联物，制品或组合物以有效量给予，尤其所给剂量足以使所涉及的患者体内白细胞，尤其是嗜中性粒细胞的数量达到正常。依照惯例以一定时间间隔简单地计数白细胞可以确定白细胞数量是否已达到正常。本发明的多肽或偶联物优选以包含一个或多个可药用载体或赋形剂的组合物形式给药。可把多肽或偶联物以本领域人人尽知的方式配制成药物组合物以产生储存十分稳定且适合对人或动物给药的多肽药物。可以将药物组合物以多种形式配制，包括液态或凝胶体，或冻干的或任何其它的形式。优选形式取决于所要治疗的具体指征，这一点对本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，本发明提供治疗各种形式的白细胞减少症或中性粒细胞减少症的组合物和方法。尤其本发明的多肽，偶联物或组合物可用来预防正接受某些类型的放疗，化疗和骨髓移植的癌症患者的感染，在外周血前体细胞移植时用于动员前体细胞汇聚，用于治疗严重的慢性或相关的白细胞减少症和用于患急性髓细胞性白血病患者的支持治疗。另外，本发明的多肽，偶联物或组合物可用于治疗AIDS或其它的免疫缺陷病，用于抗真菌治疗，尤其用于治疗全身性或侵袭性念珠菌病，和用于治疗细菌感染。鉴于本发明的多肽偶联物具有较长的体内半寿期，并已发现它们通过给药单一剂量就能缩短中性粒细胞减少症和白细胞减少症的持续时间，而不象hG-CSF那样必需每天给药，故本发明的偶联物非常适合于例如每周一次给药以达到预防和/或治疗中性粒细胞减少症的目的。在一个实施方案中，本发明的多肽偶联物或药物组合物用于预防和/或治疗由于化疗引起的中性粒细胞减少症。在通过静脉注射或另一种形式的注射(如皮下注射或肌肉注射)而每周一次给药进行化疗的情况中，通常每次化疗之前、之后或同时给药单一剂量的本发明偶联物就足够达到效果了。在通过其它途径给药(例如每天一次口服或一段较长时间内通过输液泵输液)进行化疗的情况中，本发明的偶联物可以以类似的方式^^药，例如一周一次，或当化疗次^t少于一周一次时为每次化疗给药一次。本发明的多肽或偶联物可以"原型"和/或以它们的盐形式应用。适当的盐包括，但不限于，；咸金属盐或》咸土金属盐，例如钠，钾和镁盐，和例如锌盐。这些盐和复合物可以作为一种晶型和/或无定形的结构存在。腐形刺"可药用的"是指一种所使用的剂量和浓度在接受药物的患者体内不产生任何不良作用的载体或赋形剂。上述可药用的载体和赋形剂在本领域是人所共知的(参见Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.，MackPublishingCompany[1990];PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S,Frokjaer和L.Hovgaard，Eds"Taylor&Francis[2000];和HandbookofPharmaceuticalExcipients，3rdedition,A.Kibbe,Ed"PharmaceuticalPress[2000])。秀錄的;遂合本发明的药物组合物可以单独给药或与其它的治疗剂结合给药。可以将这些制剂作为同一药物组合物的一部分给药，或与本发明的多肽或偶联物分开，同时给药或按照另一治疗时间表给药。另外，本发明的多肽或偶联物或药物组合物可以用作对其它治疗的一种辅助治疗。本发明中的"患者"既包括人和其它哺乳动物。因此所述方法可用于人类治疗和兽用。-绘秀逸径本发明配制剂可以通过多种方式给药，包括但不限于，经口服、皮下、静脉内、脑内、鼻内、真皮内、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道内、直肠内、眼球内或以任何其它可接受的方式给药。配制剂可以连续地灌输给药，也可以利用本领域熟知技术进行大药丸注射(bolusinjection)。一般情况下，将所述配制剂设计成适合于非胃肠道给药，例如通过皮下途径给药。药物组合物的实例是设计成非肠道给药的溶液剂。尽管在很多情况下，药物溶液剂可以以适用于立即使用的液体制剂形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为"赋形剂")适当混合来制备，赋形剂如緩冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。緩沖剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适緩沖剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐緩冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐緩冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐緩冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氬氧化钠混合物等)、富马酸盐緩冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)盐緩沖剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐緩沖剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氬氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐緩沖剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐緩冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氬氧化钠混合物等)。其它可能的緩沖剂是磷酸盐緩沖剂、组氨酸緩冲剂和三曱胺盐如Tris。加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2%-l%(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯曱醇、间曱酚、羟苯曱酸(paraben)曱酯、羟苯曱酸丙酯、十八烷基二曱基苯曱基铵氯化物、苯亚曱基4翁卣化物(如苯亚曱基4翁氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯曱酸烷基酯如羟苯曱酸曱酯或羟苯曱酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1%-25%重量比，通常为10/。-5%,以其它组分的相对量计算。稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作"湿润剂")以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽来避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面压力而没有引起多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic⑧多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(Tween⑧20、Tween80等)。其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。活性组分也可以被包裹在制备的微嚢中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合制备的，例如羟曱基纤维素、明胶或聚(曱基曱丙烯酸酯)微嚢，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶嚢)中或包裹在大乳剂中。在Remington，sPharmaceuticalSciences(同上)中公开了这些技术。体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是灭菌的。该过程容易完成，例如，通过无菌滤膜来过滤。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微嚢的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基曱丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease③技术或LupronDepot⑧(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包嚢中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37。C潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致丧失生物学活性并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合物基质组合物来达到稳定。本文引用的所有参考文献都以其全文引入作为参考。本发明将通过以下的非限制性实施例做进一步描述。序列表所附序列表包含以下序列SEQIDNO:1:人G-CSF的氨基酸序列。SEQIDNO:2:编码人G-CSF的合成的DNA序列，具有利于在大肠杆菌中最佳表达的密码子使用特性。SEQIDNO:3:OmpA信号序列的氨基酸序列。SEQIDNO:4:编码OmpA信号序列的合成的DNA序列。SEQIDNO:5:合成的组氨酸标i己物。SEQIDNO:6:编码SEQIDNO:5所示组氨酸标记物的合成的DNA序列。SEQIDNO:7:人G-CSF信号肽的氨基酸序列。SEQIDNO:8:编码人G-CSF，包括SEQIDNO:7所示信号肽的，合成的DNA序列，其具有适于在CHO细胞中最佳表达的密码子使用特性。SEQIDNO:9-15:各种人工合成的标记物材料与方法用于确定需要修饰的氨基酸的方法y凝近的4面且誠"&4)通过NMR波i普仪确定的10种结构的3D全貌(Zink等，(1994)Biochemistry33:8453画8463)可从蛋白数据库(ProteinDataBank)(PDB)(www.rcsb.org/pdb/)中获得。可将该信息输入计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards,J.Mol.Biol.55:379-400(1971))版本2(Copyright1983YaleUniversity)并用于计算结构中各个原子的可接近的表面区域(ASA)。该方法通常使用1.4A大小的探针并将可接近的表面区域(ASA)定义为探针中心形成的面积。于该计算前，从坐标中去除所有水分子和所有氢原子，以及其它不与该蛋白质直接相连的原子。,條的为、浙尸露"麵緒^侧链原子的分部ASA通过侧链中原子的ASA总和除以延长的ALA-x-ALA三肽中该残基类型侧链原子的ASA代表值来计算。参见Hubbard,Campbell&Thomton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在该例中，CA原子被看作甘氨酸残基侧链的一部分但不被看作其它残基的一部分。下表表示侧链的100%ASA标准Ala69.23A2Eeu140.76A2Arg200.35A2Lys162.50A2Asn106.25A2Met156.08A2Asp102.06A2Phe163.90A2Cys96,69A2Pro119.65A2Gin140.58A2Ser78.16A2Glu134.61A2Thr101.67A2Gly32.28A2Trp210.89A2His147.00A2Tyr176.61A2lie137.91A2Val114.14A249该结构中未探测到的残基被定义为100%暴露，因为可以认为这些残基位于弹性区域。确;t^子之河的/)g^用分子制图软件，例如Insightllv.98.0，MSIINC可以非常容易地确定原子之间的距离。^于要發彿的戎差沐惑傳者^夢资如上所述，依照本发明需要修饰的氨基酸残基优选是下述氨基酸残基其侧链表面是暴露的，尤其其侧链的25%以上暴露在分子表面，更优选50%以上的侧链暴露在分子表面。另一种考虑是优选将位于受体接触面上的残基排除以免其对受体的结合或活化可能产生干扰或至少使干扰降低到最小。进一步考虑的是应该将距离最近的lys(Glu,Asp)CB-CB(对Gly而言为CA)不足IOA的残基排除。最后，优选的修饰部位具体是具有亲水和/或带电残基，即Asp,Asn,Glu，Gln，Arg，His，Tyr，Ser和Thr的那些，具有精氨酸残基的部位尤其优选。謇定需姿修錄的G-CSF我差^/4'差以下例举了确定本发明所要修饰的氨基酸残基时一般应该考虑的因素。对应用X线晶体学(Hill等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5167-5171)和画R波谱学方法(Zink等，(1994)Biochemistry33:8453-8463)得到的人G-CSF三维结构已有报道。如上所述，Aritomi等(nature401:713-717，1999)已确定以下hG-CSF残基为受体结合界面的一部分G4，P5,A6,S7,S8，L9，P10,Qll,S12,L15,K16，E19,Q20，L108,D109,D112,T115,T116,Q119,E122,E123，和L124。因此，尽管可以对这些残基进行修饰，但优选不修饰这些残基。通过将Zink等(1994)确定的G-CSF的10种NMR结构用作输入结构，然后计算侧链的平均ASA，而将以下残基确定为具有25%以上的ASA:MO,Tl，P2,L3,G4，P5，A6，S7,S8,L9，PIO，Qll，S12，F13，L14,L15,K16，C17,E19，Q20，V21，R22，K23,Q25，G26,D27，A29，A30，E33,K34，C36,A37,T38,Y39，K40，L41，H43，P44,E45，E46,V48,L49，L50，H52,S53,L54,156，P57，P60，L61，S62,S63，P65，S66，Q67,A68,L69，Q70，L71,A72，G73,C74,S76，Q77，L78,S80,F83,Q86，G87，Q90,E93,G94，S96,P97,E98，L99,G腦，PlOl,T102,D104,T105，Q107,L108，D109,Alll，D112，F113,T115，T116,W118,Q119,Q120，M121，E122,E123,L124，M126,A127，P128,A129,L130，Q131,P132,T133,Q134,G135,A136,M137，P138,A139，A141,S142，A143,F144,Q145，R146,R147,S155,H156,Q158,S159，L161,E162,V163,S164,Y165,R166，V167,L168,R169,H170,L171,A172,Q173，P174。同样，以下残基具有50。/。以上ASA:M0，T1,P2,L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，PIO，Qll,S12，F13,L14，L15,K16，C17，E19，Q20,R22，K23，G26，D27，A30,E33，K34，T38，K40,L41,H43,P44，E45,E46,L49,L50，S53，P57，P60,L61,S62,S63,P65,S66,Q67,A68，L69,Q70,L71,A72，G73，S80，F83，Q90，G94,P97，E98，PlOl，D104,T105,L108,D112,F113,T115，T116,Q119，Q120,E122，E123，L124,M126，P128,A129，L130,Q131,P132,T133，Q134,G135,A136,A139,A141,S142,A143，F144,R147,S155，S159，E162,R166,V167,R169,H170,L171,A172,Q173,P174。用分子制图程序InsightIIv.98.0确定以下残基，它们具有距离最近的氨基15A以上的CB原子(在甘氨酸的情况下是CA),这样的原子被确定为赖氨酸的NZ原子和N末端残基T1的N原子。以下所列包括在IO种NMR结构的至少一种中满足这一标准的残基G4,P5，A6,S7,S8,L9,PIO,Qll,L14,L15，L18，V21，R22，Q25，G26，D27，G28,A29，Q32，L35，C36，T38,Y39,C42,H43,P44,E45,E46，L47,V48，L49,L50，G51,H52,S53，L54，G55,156，P57,W58,A59，P60，L61,S62，S63，C64,P65,S66，Q67,A68,L69，Q70，L71,A72，G73,C74,L75,S76,Q77,L78，H79,S80,G81,L82,F83，L84，Y85,Q86，G87，L88,L89，Q90,A91,L92，E93，G94,195，S96，P97，E98,L99,G100,PlOl，T102,L103,D104，T105，L106，Q107,L108，D109,VllO，Alll，D112，F113，A114,T115,T116,1117,W118,Q119，Q120,M121,E122,E123,L124,G125,M126,A127,P128,A129,L130,Q131，P132，T133，Q134,G135,A136,M137,P138,A139，F140,A141,S142,A143,P144，Q145，R146,R147,A148,G149，G150，V151,L152，V153,A154，S155,H156,L157，Q158,S159,F160，L161，E162,V163，S164,Y165，R166,V167,L168,R169,H170,L171,A172,Q173,P174。分子制图程序InsightIIv.98.0也用于确定以下残基，它们具有离最近的酸性基团IOA以上的CB原子(在甘氨酸的情况下是CA)，这样的原子被确定为天冬氨酸的CG原子，谷氨酸的CD原子和C末端残基P174的C原子。以下所列包括在10种NMR结构的至少一种中满足这一标准的残基M0,Tl,P2，L3,G4,P5,A6,S7,S8,L9，P10,Qll,S12,P13,L14,T38,Y39,K40,L41，C42，L50，G51，H52，S53,L54,G55,156，P57,W58，A59，P60，L61，S62，S63，C64，P65，S66，Q67,A68，L69，Q70,L71，A72，G73，C74，L75，S76,Q77，L78，H79,S80,G81，L82，F83,L84，Y85，Q86,G87,L88,1117，M126,A127,P128,A129，L130,Q131,P132,T133,Q134,G135,A136，M137,P138,A139,F140,A141,S142，A143,F144,Q145，R146,R147,A148，G149,G150,V151,U52，V153,A154,S155,H156，L157,V167,L168,R169,H170,L171。综合以上所列并经比较发现，有可能选择单个氨基酸残基进行修饰，从而产生一组有限数目的氨基酸残基，它们在特定G-CSF多肽中的修饰很可能产生所期望的特性。hG-CSF及其变体的PEG化方法/^-csf及^ir傳4溶遂#的尸五g人hG-CSF及其变体在50mM磷酸钠，100mMNaCl,pH8.5的溶液中以250ilig/ml的浓度进行PEG化。PEG的摩尔数超过所述蛋白上PEG化位点的50-100倍。将反应混合物放入37°C热混合器中，1200rpm，30分钟。30分钟后，加入摩尔数过量的甘氨酸终止反应。用阳离子交换层析去除反应混合物中过量的PEG,甘氨酸及其它副产品。用20mM柠檬酸钠pH2.5稀释PEG化反应混合物至离子强度7mS/cm以下。用5NHC1调整pH值至2.5。将上述混合物加到用20mM柠檬酸钠pH2.5平衡过的SP-sepharoseFF柱上。用4个柱体积的平衡緩沖液将未结合的物质从柱上洗下来。用20mM的柠檬酸钠，750mM氯化钠以三个柱体积洗脱PEG化蛋白。浓缩纯PEG化G-CSF并用分子量截留值(mwco)为10kDa的VivaSpin浓缩仪对其进行緩沖液的交换。^G-CS尸；'^/i^标记多應4凝量谅;t炎^的尸五G化表达携带适当的标记物，例如上述一般描述中列举的任何一种标记物，并显示G-CSF活性的多肽，然后，将培养液转移至能固定标记多肽的微量滴定板的一个或多个孔中。当标记物是Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln时，使用可购自QIAGEN的镍-氨三乙酸(Ni-NTA)HisSorb樣i量滴定板。将标记多肽固定到微量滴定板，然后用适于结合和随后PEG化的緩沖液洗涤各孔，然后与选择的活化PEG—起温育。例如，可使用ShearwaterCorp.的M-SPA-5000。应使活化的PEG与多肽的摩尔比优化，但通常大于10:1，例如大约100:1或更高。室温反应合适的时间，通常约1小时后，除去活化的PEG溶液以便中止反应。偶联蛋白通过与适当的緩沖液温育而从微量滴定板中被洗脱下来。适当的洗脱緩冲液可能包含咪唑，过量NTA或另一种螯合化合物。分析所述偶联蛋白的相应生物学活性和免疫原性。可任选使用本领域公知的方法，如使用二氨基肽酶将该标记物切割下来并用GCT(谷氨酰环转移酶)将1-位的Gln转化为焦谷氨酰基，最后用PGAP(焦-谷氨酰基-氨肽酶)将其切割下来，产生无标记的蛋白质。该方法包括几步骤金属螯合亲和层析。或者，可以将经过标记的多肽进行偶联。^才封历的^谬潜合/ji^的/2G-CSF话遂多农的化为了使hG-CSF以一定方式最佳PEG化，并保证参与受体识别的赖氨酸不被PEG化，已经开发了下列方法纯化的hG-CSF按照实施例4所述方法获得。hG-CSF多肽和G-CSF受体可溶性结构域以2:2化学计量组成的同型二聚体复合物在磷酸盐緩冲液(PBS)pH7中形成。hG-CSF多肽的浓度是大约20ug/ml或luM且受体以相同的摩尔浓度存在。将来自ShearwaterCorp.的M-SPA-5000以三种不同浓度加入，所述浓度分别比hG-CSF多肽中连接位点的数量过量10，25和50摩尔。反应时间为室温30分钟。反应了30分钟后，将反应混合物调为pH2.0，且将反应混合物上样至VydacC18柱上，然后基本上按已描述的方法(Utsumi等，J.Biochem.,Vol.101,1199-1208,(1987)用乙腈梯度液洗脱。或者，可使用异丙醇梯度洗脱。用本文描述的初步筛选试验对各组分进行分析，然后将上述方法获得的活性PEG化hG-CSF多肽于-80°C储存在包含1mg/ml人血清白蛋白(HSA)的PBSpH7中。用于鉴定偶联和非偶联型hG-CSF及其变体的方法确;t/zG-GSF及^f沐的分子义小偶联型或非偶联型hG-CSF或其变体的分子量可以通过SDS-PAGE，凝月交过滤，基质辅助的〗敫光解吸附质"i普测定法(matrixassistedlaserdesorption53massspectrometry)或者平衡离心法确定。正如所解释的那样，SDS-PAGE提供关于"表观分子量"的信息。真实的分子量可利用质"i普术便利地测定。SDS-PAGE用来自Invitrogen的NuPAGE⑧试剂盒(Novex高显现度预铺(high-performancepre-cast)凝胶)来进行。将15|il样品加载到NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶(Cat.Nr.NP0321)上，在NuPAGEMESSDS电泳緩沖液(Cat.Nr.NPO002-02)中以200v和120mA洗脱35分钟。确定多农求產用280nm光密度4企测法，酶联免疫吸附实验(ELISA)，放射免疫分析(RIA),或本领域熟知的其它此类免疫4企测:汰术4企测多肽的浓度。而且，样品中的多肽浓度也可用Biacore仪器用包被了该多肽特异性抗体的Biacore⑧芯片进行才企测。将上述抗体通过多种化学方法共价偶联到8;300^@芯片上。或者，使抗体非共价结合，例如通过特异性针对抗多肽抗体Fc部分的抗体来结合。将Fc特异性抗体首先共价偶联到芯片上。然后使抗多肽抗体流过该芯片并被第一抗体直接结合。进一步地，可用链霉亲和素包被的表面(例如BiacoreSensorChipSA⑧)固定生物素化抗体(Real-TimeAnalysisofBiomolecularInteractions,NagataandHanda(Eds.)，2000，SpringerVerlag,Tokyo;Biacore2000InstrumentHandbook,1999，BiacoreAB)。当样品流过该芯片时，可以使多肽结合到包被抗体上并可以检测质量的增加。可用已知浓度的多肽制品绘出标准曲线，随后确定样品中多肽的浓度。每次注射样品后，通过能去除结合型分析物的适当洗脱液(例如低pH值的緩冲液)使传感器芯片再生。通常，所应用的抗体是抗野生型多肽的单克隆抗体。在野生型多肽中引入突变或其它操作(额外糖基化或聚合物偶联)可以改变上述抗体的识别。进一步地，能使多肽的分子量增加的操作将使胞质基因共振信号(plasmonresonancesignal)增强。因此，有必要对每一种待测分子建立一个标准曲线。检测偶联和非偶联型hG-CSF及其变体的体外和体内活性的方法初步试验/-沐,AG-CSF话'/4试验鼠细月包系NFS-60(从Dr.J.Ihle，St,JudeChildren's,ResearchHospital,Tennessee,USA获得)的增殖依赖于生长培养基中活性G-SCF的存在。因此，hG-CSF及其变体的体外生物学活性可以如下检测，把G-CSF样品加到生长培养基中，温育一段时间后检测正在分裂的NFS-60细胞的数量。将NFS-60细胞培养在包含10%w/wFBS(胎牛血清)，1%w/wPen/Strep,每升10吗的hG-CSF和2mMGlutamax的IscovesDME培养基中。在加入样品前，用无hG-CSF的生长培养基洗涤细胞两次，然后稀释细胞至2.2x105细胞/ml的浓度。加100|a1细胞悬液至96孔微滴定板(Corning)的每孔中。包含偶联型或非偶联型G-CSF或其变体的样品用生长培养基稀释至浓度达到1.1x1(T6M至1.1x10"3M。每种样品取10|ul加至包含NFS-60细胞的3个孔中。由lOfil哺乳动物生长培养基组成的对照加在每个微滴定板的8个孔中。细胞培养48小时(37。C，5%(302)后用WST-1细胞增殖剂(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)对每个孔中正在分裂的细胞进行定量。各孔加0.01mlWST-l，然后在5。/。C02的空气环境下37。C温育150min。活细胞中线粒体脱氢酶分解四唑盐WST-1形成曱臢(formazan)，该产物可通过450nm下的吸光率定量。从而对每个孔中的活细胞进行定量。在上述检测基础上，计算每种偶联和非偶联G-CSF分子或其变体的剂量反应曲线，然后确定每种分子的EC50值。该值等于获得非偶联人G-CSF最大增殖活性的50%所必需的活性G-CSF蛋白的量。所以，EC50值直接计量给定蛋白的体外活性，EC50值较低表示活性较高。^y步试—發2-傳,AG-GS^活'/i试發用质粒转染鼠造血细胞系BaF3，该质粒携带人G-CSF受体基因，转录调节子，fos的启动子及其后的萤光素酶报告基因。用G-CSF样品刺激上述细胞系，多种细胞内反应引发对fos表达的刺激，随后导致萤光素酶的表达。这种刺激可以通过Steady-GloTM营光素酶检测系统(Promega，Cat.No.E2510)监测，籍此可以对G-CSF样品的体外活性进行;险测。在37。C潮湿的5%C02空气环境下，在完全培养基(RPMI-1640/HEPES(Gibco/BRL,CatNo.22400),10%FBS(HyClone，特定的)，1x青霉素/链霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122),1xL-谷氨酰胺，(Gibco/BRL,Cat.No.25030-081)，10%WEHI-3培养液(可产生muIL-3)中培养BaF3/hGCSF-R/pfos-lux细胞，使其生长到5x105细胞/mL的密度(汇合的)。每2-3天以大约2x104细胞/mL进行再接种。在检测的前一天，将对数期细胞以2x10"田胞/mL悬浮在饥饿培养基55中(DMEM/F-12(Gibco/BRL,CatNo.11039)，1%BSA(Sigma,Cat.No.A3675),Ix青霉素/链霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，lxL-谷氨酰胺(Gibco/BRL,Cat.No.25030-081)，0.1%WEHI-3培养液)，维持饥饿状态20小时。然后用PBS洗涤细胞两次并用台盼兰活性染色法;险测所述细胞的活性。将细胞以4x1(^细胞/mL的浓度重新悬浮在试验培养基中(RPMI-1640(无酚红，Gibco/BRL,Cat.No.11835),25mMHEPES，1%BSA(Sigma,Cat,No.A3675),lx青霉素/链霉素(Gibco/BRL,Cat.No.15140-122),lxL-谷氨酰胺(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，然后96孔微滴定板(Coming)中每孔加50^1所述细胞。用试验培养基将包含偶联型或非偶联型G-CSF或其变体的样品稀释到浓度为1.1x1(TM至l.lxl(T12M。每种样品50|iil加入包含BaF3/hGCSF-R/pfos-lux细胞的三个孔中。将阴性对照50pl培养基加入到每块微滴定板的8个孔中。将平板轻轻混合并于37。C保温2小时。依照PromegaSteady-GloTM的操作步骤(PromegaSteady-GIo萤光素酶检测系统，Cat.No.E2510)检测萤光素酶的活性。每孔加100^1底物，然后轻轻混匀。在TopCount发光仪(Packard)上以SPC(单光子计数)的模式检测发光。根据上述检测，可以绘出每种偶联和非偶联G-CSF分子或其变体的剂量反应曲线，之后，可确定每种分子的EC50值。#二步试發-G-CSF^戈真^沐与/2G-CSFf沐的潜合者和力应用标准的结合实验对rhG-CSF或其变体与hG-CSF受体的结合进行研究。所述受体可以是纯化的细胞外受体功能区，结合到纯化的细胞浆膜上的受体，或整个细胞，这些细胞可以是天然表达G-CSF受体的细胞系(例如NFS-60)或用编码所述受体的cDNAs转染的细胞。rhG-CSF或其变体与天然hG-CSF竟争结合位点的能力可通过其与标记后的G-CSF-类似物，例如生物素化的hG-CSF或放射性碘标记的hG-CSF共同温育进行分析。这种检测的实例由Yamasaki等(Drugs.Exptl.Clin.Res.24:191-196(1998))描述。可选择地将hG-CSF受体的细胞外结构域偶联到Fc上且将其固定到96孔板上。随后加入RhG-CSF或其变体，它们的结合可以用特异性的抗hG-CSF抗体或生物素化的或放射性碘标记的hG-CSF进行检测。豸定偶联型^#偶联型AG-GSF及真^沐的谬力羊老^本发明一个重要方面是延长生物学半寿期，这可以通过构建以下hG-CSF实现，其中的多肽与聚合物组分偶联或不偶联。hG-CSF血清浓度的快速消减使评估对使用偶联型和非偶联型hG-CSF及其变体进行的治疗的生物学反应变得重要。优选，在静脉内(i.v.)给药后，本发明的偶联型和非偶联型hG-CSF及其变体也具有延长的血清半寿期，使例如ELISA方法或初步筛选检测成为可能。体内生物半寿期的检测按照以下描述进行。应用雄性SpragueDawley大鼠(7周龄)。在给药的当天，称量动物体重(每个动物280-310g)。将非偶联型和偶联型hG-CSF样品按每kg体重100吗经尾静脉注射给三只大鼠。注射后l分钟，30分钟，1,2，4，6,和24小时，在C02麻醉下每只大鼠眼球取血500W。室温储存血样品1'/2小时后，离心分离血清(4。C，18000xg离心5分钟)。-80。C储存血样品至分析日。将样品性G-CSF进行定量。US5,824,778中描述了测定G-CSF或其变体的体内半寿期的另一试验，该文献引入本发明作参考。^W定偶联型f"A偶联型AG-GSF及,f谬的谬力i參孝;猪SPFSpragueDawley大鼠购自丹麦的M&BA/S,检测hG-CSF的体内生物学活性，用于评估偶联型和非偶联型G-CSF及其变体的生物学效力。于大鼠抵达当天按照6只一组随机分配。使所有动物适应7天，淘汰那些身体状况不良的个体或者超重的个体。适应阶段开始时的体重范围是250-270g。给药当天大鼠禁食16小时，随后按每kg体重100吗皮下注射hG-CSF或其变体。每种hG-CSF样品给按照6只一组随机分配的大鼠注射。在给药前和给药的6,12，24,36,48，72,96，120和144小时后，从大鼠尾静脉取血300|^1，加EDTA使其稳定。分析血样的以下血液学参数血红蛋白，红细胞计数，血细胞比容，平均细胞体积，平均细胞血红蛋白浓度，平均细胞血红蛋白，白细胞计数，分化型白细胞计数(中性粒细胞，淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞)。根据这些检测可以评估偶联型和非偶联型hG-CSF及其变体的生物学效力。测定hG-CSF或其变体的体内生物学活性的其它试验可参见US5,681,720,US5,795,968，US5,824,778，US5,985,265和Bowen等，ExperimentalHematology27:425-432(1999)。4'^W+if古>欲/#/恶辟型;^#偶联至//zG-GSF及^f沐的沐力^:游孝法'/iSPFSpragueDawley大鼠购自丹麦的M&BA/S。于大鼠抵达当天将它们按照6只一组随机分配。使所有动物适应7天，淘汰那些身体状况不良的个体或者超重的个体。适应阶段开始时的大鼠体重范围为250-270g。给药hG-CSF样品的24小时之前，对大鼠腹腔注射50或90mg/kg体重的环磷酰胺(CPA)。PEG化hG-CSF变体以单一剂量的形式在第0天进行皮下注射，而非偶联型hG-CSF以单一剂量的形式在第0天或者按每天一次的方案进行皮下注射。在第0天给药hG-CSF或变体时的剂量是10(Vg/kg体重。每天一次给药非偶联型hG-CSF(Neupogen⑧)时，剂量有变，参见以下实施例。每一hG-CSF样品注射6只随机分配的大鼠。在给药前，以及给药的6,12,24,36,48，72，96，120，144和168小时以后，乂人大鼠尾静脉采血300ial，力口EDTA使其稳定。分析这些血样的以下血液学参数血红蛋白，红细胞计数，血细胞比容，平均细胞体积，平均细胞血红蛋白浓度，平均细胞血红蛋白，白细胞计数，分化型白细胞计数(中性粒细胞，淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞)。根据这些测量值评价偶联型和非偶联型hG-CSF及其变体的生物学效力。确定多农的爱体-潜合亲和力(0#合速卓和麻,i^,用酶联免疫吸附实验(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，或本领域熟知的其它此类免疫检测技术可以检测受体和配体之间的结合强度。使用胞质基因共振检测的Biacore⑧仪(Zhou等，Biochemistry,1993，32,8193-98;Faegerstram和O'Shannessy，1993，InHandbookofAffinityChromatography,229-52，MarcelDekker,Inc.,NY)也可以检测配体-受体结合相互作用。Biacore⑧技术允许受体结合到金表面并使配体流过所述受体。胞质基因共振检测实时对结合到该表面的物质进行直接计量。使用该技术可获得结合速度常数和解离速度常数并因此直接确定配体-受体解离常数和亲和力常数。/zG-CSF偶农參的举//^瘦#^检验用检测偶联物相对于参考分子或制品的免疫原性的ELISA方法确定本发明偶联物的免疫原性下降。通常，参考分子或制品是重组人G-CSF制品例如Neupogen⑧或另一种重组人G-CSF制品，例如US5，824，784中描述的N末端PEG化rhG-CSF分子。ELISA方法是以抗体为基础建立的，所述抗58体来自用上述重组G-CSF制品中的一种进行治疗的患者。当试验中本发明偶联物的反应与参考分子或制品相比在统计学意义上明显下降时应认为免疫原性是下降的。和作用。使用来自G-CSF参考分子治疗的患者或来自已被免疫的动物的血清。加入固定浓度(l:20-1:500稀释(患者血清)或20-1000ng/ml(动物血清))或从1:20(患者血清)或1000ng/ml(动物血清)开始进行5倍连续稀释的上述血清。在总量为80julDMEM培养基+10%FCS中以从10nM开始进行7倍稀释的浓度或以固定浓度(1-100pM)加入HG-CSF偶联物。将血清与hG-CSF偶联物在37。C温育l小时。然后将样品(0.01ml)转移到96孔组织培养板中包含NFS-60细胞的0.1mlDMEM培养液中。培养物在5%0)2的空气环境下37。C温育48小时。然后力口0.01mlWST-1(WST-1细胞增殖剂RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germany)至培养物中，在5%C02的空气环境下37。C温育150分钟。活细胞中线粒体脱氢酶对四唑盐WST-1的分解导致形成曱臜，该产物通过4企测450nm的吸光度进行定量。在有固定量血清的条件下对hG-CSF偶联物样品进行滴定时，中和效应被定义为倍数抑制(FI)，计量为EC50(有血清)/EC50(无血清)。G-CSF变体蛋白的抗体中和作用的下降被定义为FI变体-l(1--)x100%FIwt-1实施例1薦,4/2G-GSF的^s^差^的—々建;fa^;發以下DNA片段是按照Ste腿er等，(1995),Gene164，pp.49-53描述的通用步骤合成的片段l,由以下序列组成BamHI消化位点，编码YAP3信号肽的序列(WO98/32867),编码TAW前导序列的序歹寸(WO98/32867),编码KEX2蛋白酶识别位点的序歹'J(AAAAGA)，编码hG-CSF的序列(SEQIDNO:2，其密码子使用特点有利于在大肠杆菌中表达)和XbaI消化位点。片段2，由以下序列组成BamHI消化位点，编码YAP3信号肽的序列(WO98/32867)，一个编码TA57前导序列的序列(WO98/32867)，编码组氨酸标记物的序列(SEQIDNO:5)，编码KEX2蛋白酶识别位点的序列(AAAAGA)，编码hG-CSF的序列(SEQIDNO:2，其密码子使用特点有利于在大肠杆菌中表达)和Xbal消化位点。片段3，由以下序列组成Ndel消化位点，编码OmpA信号肽的序列(SEQIDNO:3),编码hG-CSF的序列(SEQIDNO:2,其密码子使用特点有利于在大肠杆菌中表达)和BamHI消化位点。片段4，由以下序列组成BamHI消化位点，Kozak共有序列(Kozak，M.JMolBiol1987Aug20;196(4):947-50)，编码hG-CSF信号肽的序列(SEQIDNO:7)和编码hG-CSF的序列(SEQIDNO:8,其密码子使用特点有利于在CHO中表达)和XbaI消化位点。用标准DNA技术将DNA片段1和2插入到质粒pJS037(Okkels,Ann.NewYorkAcad.Sci.782:202-207，1996)中的BamHI和Xbal消化位点。这样产生质粒pG國CSFcerevisiae和pHISG-CSFcerevisiae。用标准DNA技术将DNA片段3插入到质粒pET12a(Invitrogen)中的NdeI和BamHI消化位点。这样产生质粒pG-CSFcoli。用标准DNA技术将DNA片段4插入到质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中的BamHI和XbaI消化位点。这样产生质粒pG-CSFCHO。实施例2/zG-CSF4顏潘發母和义廯许,伍.co//)^的或这用质粒pG-CSFcerevisiae或pHISG-CSFcerevisiae转化酿酒酵母OS^cc/wramycescweWw'ae)YNG318(可从美国典型培养物保藏中心，VA，USA以保藏号ATCC208973获得)，分离出包含这两种质粒中任一种的转化子，然后在细胞外分别表达携带和不携带HIS标记物的hG-CSF,以上各个步骤按照文献中描述的标准技术进行。用pG-CSFcoli转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,CatNo.69387-3),分离出包含该质粒的转化子，随后在上清液和细胞的外周胞质中表达hG-CSF,以上步骤4妄照Novagen的pETSystemManual(第8版)中描述的进行。酉良酒酵母和大肠杆菌对hG-CSF的表达可以用ImmunoPureUltra-SensitiveABC兔IgG染色试剂盒(Pierce)和多克隆抗hG-CSF抗体(PeproTechECLtd.)通过Western印迹分析来检验。结果发现所述蛋白具有正确的大小。在酿酒酵母和大肠杆菌中的携带和不携带N末端组氨酸标记物的hG-CSF的表达水平可用市售G-CSF特异性ELISA试剂盒(QuantikineHumanG-CSFImmunoassay,R&DSystemsCat.No.DCS50)进行定量。检测到的数值在以下列出。表达系统表达水平(mgG-CSF/L)酿酒酵母中的hG-CSF30酿酒酵母中具有组氨酸标记物的hG-CSF25大肠杆菌中的hG-CSF0.05实施例3璁定的CT/O-X/G-CSF,者于转染的前一天，将CHOKl细胞系(ATCC弁CC1-61)接种在T-25烧瓶中的5mlDMEM/F-12培养基(Gibco弁31330-038)中，该培养基添加了10%FBS以及青霉素/链霉素。一天后(当几乎100%铺满时)，开始准备转染将9(^1不含添加物的DMEM培养基等分至14ml聚苯乙烯试管(Coming)中。直接将10^1Fugene6(Roche)加入该培养基，室温温育5将5吗质粒pG-CSFCHO等分至另一个14ml的聚苯乙烯试管中。保温后，将该Fugene6混合物直接加入DNA溶液中，室温保温15min。然后将所有液体滴加到细胞培养基中。一天后，将该培养基更换为含有360pg/ml潮霉素(Gibco)的新鲜培养基。此后每天更新选择培养基，直至主要转染池达到100%铺满。将该主要转染池通过有限稀释的方法进行再克隆(将300个细胞接种到5个96-孔平板中)。实施例4从顏^餘母培券J:清*^化/zG-CSF及^f沐hG-CSF的纯化如下进行通过离心去除细胞。然后将去除了细胞的上清液通过0.22(im的过滤器过滤除菌。经过滤除菌后的上清液在10mM，pH4.5的醋酸钠中稀释5倍。每5升稀释后的上清液加入10ml浓缩的醋酸调整pH。在将该溶液应用于阳离子交换柱之前其离子强度应该在8mS/cm以下。将稀释后的上清液以90cm/h的线性流速装载到已用50mM，pH4.5的醋酸钠平衡的SP-sepharoseFF(Pharmacia)柱上，直到该柱的洗出液达到稳定的UV和基线导电性水平。用所述平衡緩沖液洗柱直到柱流出液的UV吸光度和导电性达到稳定水平，从而去除未结合的物质。用线性梯度；30个柱体积；0-80%的緩沖液B(50mMNaAc，pH4.5,750mMNaCl)以45cm/h的流速将结合的G-CSF蛋白从柱子上洗脱下来。根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果将包含G-CSF的组分汇集。加入氯化钠直到该溶液的离子强度在80mS/cm以上。将上述蛋白溶液装载到已用50mMNaAc,pH4.5，750mMNaCl平衡的PhenylToyoPearl650S柱上。用该平衡緩冲液洗下未结合的物质。通过应用MilliQ水的逐步梯度进行G-CSF的洗脱。将包含G-CSF的组分汇总。通过应用上述2步冲洗(downstream)的策略，能获得90%以上纯度的G-CSF。然后纯化的蛋白通过在280nm的分光光度^^测和/或通过氨基酸分析进行定量。将包含G-CSF的组分汇总。用VivaSpin浓缩器(mwco:5kDa)进行緩冲液交换和浓缩。实施例5蕃定希定量#偶炎娄和偶联至乂AC7-CSF及^f傳SDS聚丙烯酰胺凝月交电泳对纯化并浓缩的G-CSF进行SDS-PAGE分析。明显可见一种表观分子量大约17kDa的单一条带。吸光度通过分光光度测量法评估G-CSF浓度。通过4企测在280nm的吸光度和应用0.83的理论消光系数可以计算出蛋白的浓度。氨基酸分析通过氨基酸分析更准确测定蛋白。对纯化的G-CSF所进行的氨基酸分析揭示，经实验确定的氨基酸组分与根据DNA序列推测的氨基酸组成是一致的。实施例6^G-CSF和G-CSyf沐的爐丄。/-7^尸^1潘^定用MALDI-TOF质i普测定法评估连接到PEG化wtG-CSF和所选择的PEG化G-CSF变体上的PEG基团数。WtG-CSF包含5个预计为SPA-PEG连接位点的伯氨基(N末端氨基和K16，K23,K34和K40上的s氨基)。wtG-CSF用SPA-PEG5000PEG化后,MALDI-TOF质镨检测显示主要存在连接有4,5和6个PEG基团的wtG-CSF变体，此外，连接7个PEG基团的wtG-CSF变体也清晰可见，但量较少。具有K16R，K34R,K40R,Q70K，Q90K,和Q120K取代的G-CSF变体也包含5个伯氨基(N末端氨基和K23,K70,K卯和K120上的e氨基)。这种G-CSF变体被SPA-PEG5000PEG化后，MALDI-TOF质谱检测显示主要存在连接有4,5和6个PEG基团的G-CSF变体，此外，连接7个PEG基团的G-CSF变体也清晰可见，但量较少。具有K16R，K34R,和K40R取代的G-CSF包含2个伯氨基(N末端氨基和K23上的e氨基)。该G-CSF变体用SPA-PEG12000PEG化后，MALDI-TOF质谱检测显示主要存在连接有2和3个PEG基团的G-CSF变体，此外，连接4个PEG基团的G-CSF变体也清晰可见，但量较少。上述观察清楚地显示除包含氨基的氨基酸残基外，其它的氨基酸残基在所应用的PEG化条件下有时也可以进行PEG化。上述观察还显示在引入氨基的部位进行PEG化具有一定重要性。这在wtG-CSF和G-CSF变体的SDS-PAGE分析中也已观察到。如实施例11所述，当应用SPA-PEG化学法时组氨酸170完全被PEG化。此外，K23和S159被部分PEG化。这解释了除hG-CSF及其变体中已经形成的伯氨基外，还有1-2个另外的PEG化位点。实施例7尸五G化和#尸五G化G-CSFf谬的^杀^为了绘制G-CSF和G-CSF变体上另外的SPA-PEG连接位点，应用以下策略。为了将预期的PEG化位点数降至最少，选择具有少量氨基的G-CSF变体。所选择的G-CSF变体具有K16R,K34R，K40R和H170Q取代。除了K23上的在先资料显示无任何程度PEG化的s胺基外，该变体仅仅包含一个N末端伯胺。所以，在该G-CSF变体中胺基基团上的PEG化背景明显降低。应用SPA-PEG5000对G-CSF变体进行PEG化。PEG化后，使G-CSF变体变性，使其二硫键还原，使所得巯基垸基化，然后用谷氨酸特异性蛋白酶降解已烷基化并PEG化的蛋白。最后，所形成的肽通过反相HPLC分离。平行地对具有K16R,K34R,和K40R取代的非PEG化G-CSF变体进行同样的处理，以获得一个HPLC参考层析图。对PEG化G-CSF变体和非PEG化G-CSF变体的降解的HPLC层析作图比较应该揭示出在PEG化时哪个肽消失。通过对非PEG化G-CSF变体的肽进行N末端氨基酸测序而对这些肽进行的鉴定可间接指出PEG化位置。原则上，优选应用具有K16R，K34R,K40R和H170Q所有这些取代的非PEG化G-CSF变体，但实践中不必如此。更具体地，将大约img具有K16R，K34R,K40R和H170Q取代的PEG化G-CSF变体和大约500吗具有K16R,K34R,和K40R取代的非PEG化G-CSF变体在SpeedVac浓缩器中干燥。将两种样品分别溶解在400(^16M胍，0.3MTrisHCl，pH8.3中，然后37。C变性过夜。变性后，通过加入50^10.1MDTT的6M胍，0.3MTris-HCl，pH8.3溶液还原蛋白质中的二石克4定。室温下温育2小时后，加入50nl0.6M碘乙酰胺的6M胍，0.3MTris-HCl,pH8.3溶液，使原有巯基烷基化。烷基化在室温下进行30min，然后用NAP5柱将已还原并烷基化的蛋白的緩冲液换成50mMNH4HC03。在SpeedVac浓缩器中样品的体积降低到大于200^1后，分别加入20吗和10iig谷氨酸特异性蛋白酶。谷氨酸特异性蛋白酶的降解在37。C进行16小时。所产生的肽应用PhenomenexJupiterC18柱(0.2x5cm)以0.1%TFA水溶液中的线性乙腈梯度洗脱，从而进行反相HPLC分离。通过MALDI-TOF质语法分析所收集的组分，随后对所选择的肽进行N末端氨基酸序列分析。对PEG化G-CSF变体和非PEG化G-CSF变体的降解的HPLC层析作图比较揭示，在PEG化时仅二个组分消失。对非PEG化G-CSF变体的这两个组分进行N末端氨基S吏序列分析显示，这两种肽都来源于G-CSF的N末端。其中一种肽由意外切割Glnll之后的残基所产生的氨基酸残基1-11组成。另一种肽由按照预期切割Glul9之后的残基所产生的氨基酸残基1-19组成。预期G-CSF的N末端肽可用该方法鉴定，因为N末端氨基容易被PEG化。然而，用该方法没有鉴定出SPA-PEG5000的其它连接位点。间接鉴定PEG5000连接位点的另一种做法是直接鉴定PEG化肽中的连接位点。然而，在对降解的PEG化G-CSF变体进行HPLC分离时，包含PEG化肽的组分彼此之间没有分开且未能与几个包含非PEG化肽的组分分开。所以，对这些组分的N末端氨基酸序列分析除了提示K23能被部分PEG化外没获得任何有用的数据。为克服这些问题，从第一次HPLC分离的组分中制备两份PEG化肽的汇集物。将这二个汇集物在SpeedVac浓缩器中干燥，溶解在200^1新鲜配制的50mMNH4HC03中并用l吗糜蛋白酶进一步降解。所产生的肽应用PhenomenexJupiterC18柱(0.2x5cm)以0.1%TFA水溶液中的线性乙腈梯度洗脱，从而经反相HPLC分离。通过MALDI-TOF质谱法分析所收集的级分，随后对所选择的肽进行N末端氨基酸序列分析。经N末端氨基酸序列测定，K23和S159都被部分PEG化。无法确定这两个位置上PEG化实际程度，但因为从最初的HPLC分离中鉴定出K23和S159未被修饰的肽并已测序，所以可确定PEG化仅仅是部分的。实施例8vi^G-CSF和G-CSFf谬的;lt差化当通过MALDI-TOF质镨分析对纯化的wtG-CSF和G-CSF变体进行分析时总是能观察到比所分析的G-CSF分子的质量大了约324Da的另一组分。因为具有最小质量的组分始终具有G-CSF分子的质量且因为G-CSF分子有正确的N末端氨基酸序列，所以可以得出这样的结论，上述另外的成分是携带二个己糖残基的经过修饰的G-CSF分子。在许多情况下，未经修饰的G-CSF分子产生最强的信号但在一些情况下经过修饰的G-CSF分子的信号强度是最强的。为鉴定额外PEG化位点而制备的肽在进行分析时，从每次降解中鉴定出两个可用于鉴定糖基化位点的肽。在两种HPLC分离中，这两种肽相继被洗脱出，MALDI-TOF质谱检测显示这两种肽有约324Da的质量差异。质语4企测数据提示，该肽跨越氨基酸残基124-162。对所有4种肽进行的N末端氨基酸序列分析显示，这种分配是正确的，且Thrl33是唯一的修饰位点。在带有非修饰肽的质量的肽中，Thrl33在序列中清晰可见，但在额外带有324Da质量的肽中第133位未排布氨基酸残基。因为所有其它氨基酸残基都能排布在该序列中，所以可以得出这样的结论，即Thrl33是唯一的修饰位点。这个糖基化位点以前曾报道用于表达在CHO细胞中的重组G-CSF中，但此聚糖与酵母中连接的聚糖不同。非糖基化wtG-CSF利用反相HPLC与糖基化wtG-CSF分离，具体是应用Vydacds柱(0.21x5cm)以51%乙腈的0.1%TFA溶液经等度洗脱为一个经MALDI-TOF质镨分析显示仅含非糖基化wtG-CSF的级分。实施例9为\^与不厨炎量的尸五GG-GSF分f共价偶联4，5或6个PEG基团的G-CSF分子如下分离。用20mM柠檬酸钠pH2.5平衡SPsepharoseFF柱，然后将20mM柠檬酸钠，pH2.5中的PEG化蛋白装载到上述SPsepharoseFF柱上。任何未结合的物质都被从柱子上洗掉。洗脱用pH梯度进行。PEG化G-CSF在大约pH3.8时开始从柱子中洗脱且继续洗脱在pH3.8到4.5的级分中。对这些级分进行SDS-PAGE和质谱分析。这些分析表明PEG化程度最高的G-CSF存在于"低pH级分"中。PEG化程度较低的G-CSF洗脱在"高pH级分"中。对PEG化G-CSF所进行的氨基酸分析显示，消光系数的理论值与实验测定值非常一致。实施例10将hG-CSF中的氨基酸特异性取代为其它氨基酸残基，例如在上文的一般描述中所讨论的特异性取代，是用本领域已知的标准DNA技术引入的。用包含hG-CSF编码基因、但不带有HIS标记物的质粒pG-CSFcerevisiae作为PCR反应中的DNA模板，可制备新的G-CSF变体。使这些变体在酿酒酵母中表达，并且如实施例4所述纯化。所构建的G-CSF变体有一部分在以下列举(参见实施例12和13)。实施例11^57^-户五G与AG-CSF减其f体共,偶联如上所述("hG-CSF及其变体在溶液中的PEG化，，)使人G-CSF及其变体共i"介连接SPA-PEG5000,SPA-PEG12000和SPA-PEG20000(Shearwater)。偶联物的体外活性在实施例13中列举。实施例12遞i^t^谬f和應^对遂化f沐的尸五G化来鉴定G-C5T^井的SE4-尸五G遂凝在,《可以将SPA-PEG连接到G-CSF中除赖氨酸之外的其它氨基酸残基上。为确定SPA-PEG是否连接到组氨酸，丝氨酸，苏氨酸和精氨酸上，制备一些变体，使其中的这些氨基酸被取代为赖氨酸，丙氨酸或谷氨酸。使这些变体在酿酒酵母中表达，纯化和PEG化，然后在SDS-PAGE上分析连接的SPA-PEG分子的数量。该分析通过目测SDS-PAGE凝胶来完成，所有凝胶都包含3条主要的带。根据这些带的相对大小，估计每条带的PEG化程度，偏差最接近5%。给定氨基酸被谷氨酸或丙氨酸取代后，连接SPA-PEG的数量的下降，这强有力地提示该氨基酸通过SPA-PEG被PEG化，且这种现象进一步得到将该氨基酸取代成赖氨酸后PEG化程度不变的结果的支持。所分析的变体在以下列举。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>以上数据显示除N末端，K16，K34和K40之外，SPA-PEG也可共价结合到H170上。进一步地，上述数据显示仅仅10%的可利用的K23氨基酸残基被PEG化，大约10%的S159被PEG化。实施例13^偶联^々偶联型/zG-CSF及其f伴的体,Ai參夢活'/i如以上"初步试验2-体外hG-CSF活性检测"所述对非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体外生物学活性进行检测。对SPA-PEG5000与可利用的PEG化位点偶联和不偶联所产生的每个变体的体外生物学活性(用EC50测量值来表示)在以下列举。这些值已经相对于非偶联的hG-CSF(Neupogen⑧)标准化，即表中数值表示相对于非偶联hG-CSF的％活性。每次在同样的检测条件下检测该值以及变体的值。在所述检测中hG-CSF的EC50值是30pM。_<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>K16/40R505K16/23/34R5010K16/23/40R505K16/34/概3530K16/23/34/40R2015K16/34/概L3K5025K16/34/機E45K低水平未测K16/34/40RE46K101K16/34/40RS53K0.5K16/34/40RS62K100.5K16/34/40RS66K202K16/34/40RQ67K100.2K16/34/40RQ70K3020K16/34/40RS765020K16/34/40RQ7710K16/34/40RS80K100.2K16/34/概，K3020K16/34/40RE98K低水平未测K16/34/40RD104K100.9K16/34/40RT105K3010K16/34/概Q120K3020K16/34/40RQ131K低水平未测K16/34/40RT133K3010K16/34/概Q134K100.2K16/34/概S142K207K16/34/40RR147K201K16/34/40RS155K201K16/34/概Q15820K16/34/40RS159K203K16/34/40RQ70KQ90K未测20K16/34/40RQ70KQ120K2525K16/34/40RQ卯KT105K4010K16/34/40RQ90KQ120K2515K16/34/40RQ90KS159K45未测K16/34/概T105KQ120K208K16/3機RT105KS159K4020K16/34/40R()120KT133K208K16/34/40RQ120KS142K102K16/34/40RQ70KQ90KT105K10469<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>以上数据显示K23取代成精氨酸不增加偶联蛋白的活性。这是由于这样一个事实，即仅有10%的K23被PEG化，偶联后的K23R变体基本与hG-CSF具有相同的的PEG基团连接数和相同的PEG化位置。在K16,K34和K40位置上去除赖氨酸产生了在PEG化后具有明显活性的G-CSF变体。该变体与SPA-PEG5000偶联后与未偶联的变体相比不明显降低活性。所以，用SPA-PEG5000使N末端和H170发生PEG化(参见实施例12)不降低hG-CSF的活性。由此决定应用hG-CSFKl6RK34RK40R作为插入新PEG化位点的主链。在该主链中，L3和H159残基之间引入了24个新的PEG化位点。这些残基分布在hG-CSF中不与G-CSF受体相互作用的部位。在L3,Q70,S76，Q90，T105，Q120，T133和S142位置引入新的PEG化位点,得到被SPA-PEG5000PEG化后仍保持明显活性的hG-CSF变体。所以，其中一些这样的新PEG化位点组合至具有2或3个新PEG化位点的hG-CSF变体中。此外，可使SPA-PEG12000和SPA-PEG20000与一组选定的hG-CSF变体连接。体外活性列举如下(Neupogen⑧的％)。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>实施例14#偶戟型^偶联^/;G-CS尸及^f沐^沐力芋老^非偶联的hG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K，以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K的体内半寿期如上文(测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内半寿期)所述进行检测。结果见图1和2。Neupogen⑧的体内半寿期经测定分别为2.01小时和1.40小时。在一项较早的类似实验(US5，824,778)中，测得hG-CSF的体内半寿期为1.79小时。本文所述实验的结论因此可以直接与该实验进行比较。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ卯KQ120K以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ卯KT105KS159K的体内半寿期经测定分别为12.15小时和16.10小时。因此，在hG-CSF中引入新的PEG化位点和将它们与SPA-PEG5000偶联，都导致体内半寿期显著增加。在上述较早的实验(US5，824，778)中，与较大的N-末端结合型PEG分子(10kDa)偶联的hG-CSF，经测定的体内半寿期为7.05小时。因此，SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K，相比较于Neupogen⑧和具有10kDa的N末端偶联PEG分子的hG-CSF，体内半寿期显著增加。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K都除去了三个内源PEG化位点，并引入了三个新的PEG化位点，因此大小相同。这两种化合物之间的唯一区别是体外活性，分别是Neupogen的12%和5%。这一区别导致SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K比SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ卯KQ120K具有更长的体内半寿期。由于体外活性与这些化合物的受体结合亲和力相关，故可以得出结论SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K的受体介导的清除比SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K的慢。因此，增加G-CSF的大小并降低其体外活性，这两方面综合可以得到比以前所知的G-CSF化合物具有显著更长体内半寿期的G-CSF化合物。实施例15在健康大鼠中非偶联型和偶联型hG－CSF及其变体的体内生物学活性非偶联型hG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120K,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120KT133K，以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KQ120KT133K,它们的体内生物学活性如上文(在健康大鼠中测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性)所述进行检测。结果见图3和4。在t=0小时每kg体重注射lOOjxg，之后第48小时未检测出Neupogen的活性。初次注射后，直到72小时都能检测出SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120K、SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KQ120KT133K、SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120KT133K的活性，而直到96小时，SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K仍保留体内活性。故可以看出，这些偶联变体比Neupogen⑧具有更长时间的体内生物学活性，SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K维持体内活性的时间是Neupogen⑧的两倍。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120KT133K，以及SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KQ120KT133K,这两者的体外活性都是Neupogen⑧的2%(实施例13),它们在给药后的最初12小时内，并不诱导出Neupogen,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ120K、SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K给药所能见到的相同水平的白细胞形成。因此，仅有Neupogen⑧的2%体外活性或更低活性的化合物不能够在刚刚给药后就完成对白细胞形成的刺激。此外，如上文("在健康大鼠中测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性")所述，对Neupogen⑧，SPA-PEG12000偶联型hG-CSFK16RK34RK40R和不同剂量SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K的体内生物学活性进行了检测。结果见图5。与较早时观察到的一样，在以每kg体重IOO吗最初注射后48小时未检测出Neupogen⑧的活性。每kg体重给药5jigSPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K与Neupogen⑧相比可使体内生物学活性略微延长，而每kg体重给药上述化合物25吗和100吗使得hG-CSF活性在最初注射后各自到72和96小时仍维持活性。故SPA-PEG偶联型hG-CSF化合物的作用时间可通过提高或降低标准剂量方案来控制。SPA-PEG12000偶联型hG-CSFK16RK34RK40R在每kg体重给药lOOpg后直到72小时仍维持体内活性。如实施例6所述，SPA-PEG12000偶联型hG-CSFK16RK34RK40R偶联有2或3个SPA-PEG12000基团，而SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K偶联有5或6个SPA-PEG5000基团。所以，两种化合物的分子量分别是42-54kDa和43-48kDa。这两种化合物的体外活性分别是Neupogen⑧的30%和12%。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K,与具有基本相同分子量的SPA-PEG12000偶联型hG-CSFKl6RK34RK40R相比，体内生物学活性能维持较长时间，这表明，当G-CSF化合物的大小通过PEG化而超过一个特定的分子量数值时，仅仅可以通过降低G-CSF化合物的比活性、并因此降低受体介导的清除来进一步延长其作用时间(实施例14)。此外，如上文(在健康大鼠中测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性)所述，测定Neupogen，SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K，以及SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K的体内生物学活性。结果见图6。正如较早时观察到的，偶联型hG-CSF变体的作用时间显著长于Neupogen。这三种偶联型hG-CSF变体，每一种在给药后，都导致以相同于Neupogen⑧给药后的最初12小时内观察到的速率和水平形成白细胞。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K，以及SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K，它们的体外活性分别是Neupogen的12%,5%和5%，因此具有Neupogen的5%体外活性的化合物能够在给药后充分诱导白细胞的形成。Neupogen,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K,SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90KT105KS159K,SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RT105KS159K,它们在SDS-PAGE上的表观大小分别是18kDa，60kDa,60kDa和〉100kDa。以及的持续时间几乎相同，表明作用的持续时间不因偶联型hG-CSF化合物的分子大小增加到超过约60kDa而延长。相反，当偶联型hG-CSF化合物的表观大小超过约60kDa时，作用的持续时间增加可以降低该化合物的体外活性，并因此降低受体结合亲和力。这种情况(上述)的另一个实例可通过比较SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KQ120K与体内作用维持时间而看出。这两种化合物的表观大小都是60kDa,但体外活性却分别是12%和5%。这种差异直接反映在这两种化合物的作用的体内维持时间中，它们分别是96小时和144小时。实施例16一^在细應减少症的义^*#偶^型^偶^^/zG-CSF及^f沐的傳力^參夢活'/i在具有化疗诱导的中性粒细胞减少症的大鼠中，非偶联型hG-CSF(Neupogen),SPA-PEG5000偶联型hG画CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K和SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K的体内生联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性)所述，用50mg/kg体重的CPA和单一剂量(100^ig/kg体重)的G-CSF进行测量。结果见图7。三种化合物以相同速率诱导白细胞的最初形成。可见，偶联型hG-CSF化合物只需有Neupogen⑧的4%体外活性就足以在刚刚给药后充分刺激白细胞形成。36小时后，经Neupogen⑧处理的大鼠体内的白细胞(WBC)数降至未处理组的水平(<3乂109细胞/升)。这时，大鼠出现中性粒细胞减少。144小时后，两个组的WBC达到正常水平(9乂109细胞/升)。在SPA國PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K处理组以及SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K处理组中，于48小时后WBC水平降至最低值4xl(^细胞/升，然后迅速开始回升。96小时后，这两组的WBC水平都回复至正常值。因此，这两种偶联型hG-CSF化合物能够緩解中性粒细胞减少症并显著减少WBC回复至正常水平所需的时间(中性粒细胞减少症的持续时间)，具体是从Neupogen⑧-处理组的112小时显著减少为SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K处理组或SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K处理组的48小时。SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K更有效缩短中性粒细胞减少症的持续时间。由于这两种分子的表观大小都在60kDa以上(分别是60kDa和80kDa)，这就无法解释为SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K比SPAPEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K的肾清除率低。SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ卯KT105K和SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K的体外活性分别是Neupogen的4%和7%。这意味着，在给药后的最初48小时内，SPAPEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K与SPAPEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K相比，受体结合亲和力，以及因此所致的受体诱导型清除偏低，但白细胞水平增加。因此，当大鼠在48小时后出现中性粒细胞减少时，SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K的体内浓度高于SPA-PEG20000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ90K的。由于仅Neupogen体外G-CSF活性的4-5%这么低的水平就足以完全活化中性粒细胞始祖细胞表面的G-CSF受体(见上文)，这种在48小时后出现的较高G-CSF浓度，解释了SPA-PEG5000偶联型hG-CSFK16RK34RK40RQ70KQ90KT105K-处理组中WBC水平更快速增加的原因。因此，在具有化疗诱导的中性粒细胞减少症的大鼠中，本发明的表观大小至少约60kDa、体外活性为Neupogen⑧的4%的偶联型G-CSF化合物，与具有类似大小的化合物相比更具优势，体外活性更高。实施例17^C戚潘發母培券jh清中^化G-CSF此实施例提供了不同于实施例4的另一种纯化hG-CSF和G-CSF变体的方法。细胞通过在5000rpm、4°C离心10min而除去，澄清后的上清用0.22pm滤膜过滤。将澄清并过滤后的上清浓缩，用10kDa的膜，在50mM乙酸钠，pH4.5中通过切线流过滤(TangentialFlowFiltration)进行渗滤75所得的超滤液加载至已经用至少5个柱体积的50mM乙酸钠平4軒过的SP-sepharose柱(200ml装填床)上。样品以大约20ml/min的流速加载。柱用平衡液洗涤，直至通过测定280nm的吸光度确定获得了稳定的洗脱物(effluent)。利用逐级緩沖液梯度(例如10%,20%，30%和35%的緩冲液)，G-CSF在环境流速(ambientflowrate)时在35%緩沖液条件下洗脱，所述緩沖液是750mMNaCI的50mM乙酸钠溶液。这种一步法产生>95%纯的G-CSF(经SDS-PAGE测定)。实施例18为、庠多重-i^G化^G-CSF上面的实施例9描述了分离与不同数量的PEG基团相连的G-CSF分子的方法。本实施例提供了另一种分离这类多重PEG化G-CSF的方法，以便获得在所连接的PEG基团数目方面具有所需一致性程度的G-CSF产物。将上述与例如SPA-PEG5000(Shearwater)共价连接("hG-CSF及其变体在溶液中的PEG化")的PEG化G-CSF的混合物用20mM柠檬酸盐緩沖液pH2.5稀释。导电性应〈3.5mS/cm。根据需要用稀释的盐酸将pH调整为2.5。用以下緩沖液进行分离緩冲液A:20mM柠檬酸钠，pH2.5(平衡液和洗涤液)。緩沖液B:20mM柠檬酸钠，pH2.5;750mM氯化钠(洗脱緩沖液)将需要分离的样品以2ml/min的流速加载至已经平衡过的SP-sepharoseHP柱(7ml)。用緩沖液A洗柱，直到通过A280监测获得了稳定的基线。多重-PEG化种类如下分离以4ml/min的流速应用0-50%緩沖液B的线性梯度过柱180分钟，收集2ml的级分。所收集的级分用SDS-PAGE进行分析，将具有所需数目的偶联型PEG基团的级分汇总。这使得有可能对包含那些最初与例如3-6个PEG基团偶联的PEG化G-CSF在内PEG化G-CSF混合物进行纯化，从而得到具有例如4或5个偶联型PEG基团的产物，或具有仅单一数量的偶联型PEG基团的产物。实施例19應#^用类似于实施例7的方法，但在胰蛋白酶降解的基础上，本发明G-CSF偶联物的PEG化模式通过肽作图来确定。在这种情况下，多肽在CHO细胞(见实施例3)中产生，它们与天然人G-CSF的序列相比，具有取代K16R,K34R，K40R,T105K和S159K。用5kDaSPA-PEG如上所述进行PEG化，得到经过修饰的蛋白，其中大部分带有3，4或5个PEG组分，少部分带有6个PEG组分。6个可能的PEG连接位点有5个是已知的，它们是N-末端氨基Lys23，Lysl05,Lysl59和Hisl70。这一肽作图分析显示，偶联蛋白基本上在N-末端以及Lysl05和Lysl59充分PEG化，但Lys23仅部分PEG化。尽管Hisl70在前面的实验中显示为部分PEG化，但很意外的是在本实验中未发现这种结果。一个可能的解释是，PEG与His170残基之间的键在肽作图之前进行的样品制备期间不稳定。可能的不稳定PEG化(就象这里所述的情况)，可以通过将组氨酸残基取代为另一种残基来避免，尤其是取代为赖氨酸残基(当希望获得更稳定的PEG化时)，或者取代为谷氨酰胺或精氨酸残基(当希望避免PEG化时)。.实施例20^^才化^谬羊的^^在叙敏M'少症W义it尹W沐^^參举活'^G-CSF变体的体内生物学活性。所述变体与SEQIDNO:1相比，分别是具有氨基酸取代K16R,K34R,K40R,T105K和S159K(下文称"105/159")，以及具有K16R，K34R,K40R，Q90K,T105K和S159K(下文称"90/105/159")。这两种变体都在酵母(酿酒酵母)中产生，都如上所述与SPA-PEG-5000偶联。检验这两种变体采用单一剂量时的体内生物学活性，与采用每日剂量的非偶联型hGCSF(Neupogen⑧)和对照(赋形剂)相比较。给药G-CSF样品的24小时之前，对大鼠给药50mg/kg体重的CPA。本发明的PEG化变体以100|ag/kg体重的单一剂量在0小时给药，而Neupogen⑧以30(xg/kg体重的每日剂量给药5天(从0小时到96小时)。体内生物学活性如上文所述进行测量("在具有化疗诱导的中性粒细胞减少症的大鼠中测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性")。结果见图8(白细胞计数，WBC)和图9(绝对中性粒细胞计数，ANC)。如图8所示，105/159、90/105/159以及Neupogen⑧给药都导致在最初12小时内'白细胞水平增加，之后白细胞水平由于化疗而下降，于大约48小时后达到最小值。48小时后，所有三个处理组的白细胞数目都增加，但用本发明两种PEG化变体处理的小组的增加速率明显大于用Neupogen⑧处理的小组。用PEG化变体105/159和90/105/159处理在96小时后白细胞水平正常(超过10xl09/L)，而Neupogen⑧处理组在120小时后白细胞水平仍低于10xl09/L。由于5日Neupogen⑧处理的最后一次是在96小时的时候，故该组的白细胞水平在120小时后再次下降。相反，在用单一剂量的本发明PEG化变体进行处理的两个组中，从96小时开始，直到216小时实验结束时，白细胞水平都相对稳定在10xl09/L以上。图9的中性粒细胞数目有类似的变化，该图显示，PEG化变体105/159处理组的中性粒细胞水平增加的速度显著快于Neupogen⑧处理组(未检测90/105/159组的ANC)。实施例21^具才化^谬羊的尹'/S在勿y敏减少症的义葳^的伴/^^:與学活嫂在具有化疗诱导的中性粒细胞减少症的大鼠中，比较非偶联hG-CSF(Neupogen)、具有单个N-末端连接型20kDaPEG基团的hG-CSF(NeulastaW)与本发明的两种PEG化G-CSF变体的体内生物学活性。这两种变体分别在酵母(酿酒酵母)和CHO细胞中产生，它们具有相对于hG-CSF的相同氨基酸取代K16R，K34R，K40R,T105K和S159K,而且它们都与SPA-PEG5000偶联。本发明的PEG化变体最初由具有3-6个PEG组分的多重PEG化种类构成，经过分离后得到更为单一的仅具有4-5个偶联PEG组分的产物。这些变体在下文中称"G20"(产自酵母)和"GW(产自CHO细胞)。G-CSF样品在给药CPA的24小时后给与(卯mg/kg体重)。PEG化变体，即NeulastaTM，G20和G21以100pg/kg体重的单一剂量给药，Neupogen以10(ig/kg体重的每日剂量给药7曰。体内生物学活性如上文(在具有化疗诱导的中性粒细胞减少症的大鼠中测定非偶联型和偶联型hG-CSF及其变体的体内生物学活性)所述进行测量。结果见图IO(白细胞计数，WBC)和图ll(绝对中性粒细胞计数，ANC)。图IO和11显示，所有G-CSF化合物在最初12小时内以几乎相同的速率诱导白细胞和中性粒细胞的最初形成，然后由于化疗导致白细胞和中性粒细胞的水平下降。96小时后，白细胞和中性粒细胞的水平在所有实例中再次升高，但经过G20或G21处理的大鼠的升高速率显著大于经过Neupogen⑧或NeulastaTM处理的大鼠。图10显示，经G20或G21处理的大鼠在144小时后白细胞水平正常(约109/L)，而经Neupogen⑧或Neulasta处理的大鼠在168小时后白细胞未达到该水平。图11显示，中性粒细胞计数有类似变化，即经过G20或G21处理的大鼠比经过Neupogen⑧或NeulastaTM处理的大鼠提早24小时达到中性粒细胞计数的正常水平。因此可以得出结论，本发明这些PEG化G-CSF变体与现有G-CSF产物Neupogen⑧或Neulasta的治疗相比，能在大鼠中将化疗诱导的中性粒细胞减少症的持续时间缩短大约24小时。序列表<110>马克西才艮控股公司(MaxygenHoldingsLtd.)<120>G-CSF偶联物<130>0258<150>US09/904,196<151>2001-07-11<150>DKPA200200447<151>2002-03-22<150>DKPA200200708<151>2002-05-08<160〉15<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>174<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400>1ThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGinSerPheLeuLeuLys151015CysLeuGluGinValArgLyslieGinGlyAspGlyAlaAlaLeuGin202530GluLysLeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuVal354045LeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSerCys505560ProSerGinAlaLeuGinIxuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHisSer65707580GlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylieSer859095ProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspValAlaAsp100105110PheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAlaPro115120125AlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPhe130135140GinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSerPhe145150155160LeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro165170<210>2<211>525<212〉腿<213>人工的<220><221>misc—feature<223>编码hG-CSF的DM,具有大肠杆菌的密码子使用特性<400〉2acccctctgggcccggccagcagtctgcctcagagtttUgtgcgtaaaatccagggcgatggcgcggccctgcaggaaactgtgccatcctgaagaactggtcctgttaggccatagctctg3gUgctgcccgagtcaggccctgcagctggccggctggcUattUtatatcagggcttactgcaggcgttagaagccgaccctggataccttacagttagatgtcgcggattttgatggaagaattaggcatggcgcctgcgtucagcctacccgcgagtgcgtUcagcgtcgcgccggcggcgtgtUgtggctggaagtgagttatcgtgtgtUcgccatctggcccagc<210>3<211>21<212〉PRT<213〉大肠杆菌(Escherichiacoli)<400〉3MetLysLysThrAlalieAlalieAlaValAla1510ThrValAlaGinAla20<210〉4<211〉63<212>DNA<213>人工的81tactgaaatgaactgtgcgctsggcatcccgcctgagtcagc"Ugtccccaccaccatagggcgcc"ccagccatctcttaacUagaacaggacctataaagtgggcgcctgttacatagtggaactgggcUggcagcaggcctgcgtttgcagagcttt60120180240300360420480525LeuAlaGlyPheAla15<220><221>misc_feature<223>编码0mpA信号序列的DM序列<400>4atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcag60gcc63<210〉5<211〉15<212〉PRT<213>人工的<220〉<221〉PEPTIDE<222〉(1)..(15)<223〉合成标记物<400〉5MetLysHisGinHisGinHisGinHisGinHisGinHisGinGin151015<210〉6<211〉45<212〉DM<213〉人工的<220〉<221〉misc—feature<223〉编码SEQIDNO:5标记物的DM<400>6atgaaacaccaacaccaacatcaacatcaacatcaacatcaacag45<210>7<211>30<212>PRT<213〉人(Homosapiens)<220〉<221〉SIGNAL<222>(1)..(30)<223><400>7MetAlaGlyProAlaThrGinSerProMetLysLeuMetAlaLeuGin151015LeuLeuLeuTrpHisSerAlaLeuTrpThrValGinGluAla202530<210〉8<211>615<212>腿<213>人工的<220><221>misc_feature<223〉编码带有SEQIDNO:7信号肽的hG-CSF的序列<400〉8atggccggccctgccacacagtcccccatgaagctgatggccctgcagctgctgctgtgg60cactccgccctgtggacagtgcaggaggccacccctctgggccccgccagctccctgcct120cagtccttcctgctgaagtgcctggagcaggtgagaaagatccagggcgacggcgccgcc180ctgcaggagaagctgtgcgccacatacaagctgtgccaccctgaggagctggtgctgctg240ggccacagcctgggcatcccctgggcccctctgtcceigctgcccctcccaggccctgcag300ctggccggctgcctgtcccagctgcactccggcctgttcctgUccagggcctgctgcag360gccctggagggcatctcccccgagctgggccccacactgg"accctgcagctggacgtg420gccgatttcgccaccaca"ctggcagcag"ggaggagctgggcatggcccctgccctg480cagcctacccagggcgccatgcctgccUtgcctccgcctUcagagacgggccggcggc540gtgctggtggccagccacctgcagagcUtctggaggtgtcctacag3gtgctgcggcac600ctggccc8gccttga615<210〉9<211>6<212〉PRT<213〉人工的<220><221>PEPTIDE<222〉(1)..(6)<223>合成标记物<400〉9HisHisHisHisHisHis15<210>10<211>8<212〉PRT<213〉人工的<220〉<221>PEPTIDE<222>(1).(8)<223>合成标记物<400>10MetLysHisHisHisHisHisHis15<210〉11<211>10<212>PRT<213>人工的<220><221〉PEPTIDE<222〉(1)..(10)<223〉合成标记物<400〉11MetLysHisHisAlaHisHisGinHisHis1510<210〉12<211>14<212>PRT<213>人工的<220〉<221〉PEPTIDE<222>(1)..(14)<223>合成标记物<400>12MetLysHisGinHisGinHisGinHisGinHisGinHisGin1510<210〉13<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><221>PEPTIDE<222>(1)..(10)<223>合成标记物<400〉13GluGinLysLeulieSerGluGluAspLeu1510<210〉14<211>8<212〉PRT<213〉人工的<220><221>PEPTIDE<222〉(1)..(8)<223〉合成标记物<400>14AspTyrLysAspAspAspAspLys15<210>15<211>9<212>PRT<213>人工的<220><221〉PEPTIDE<222>(1).■(9)<223〉合成标记物<400〉15TyrProTyrAspValProAspTyrAla1权利要求1.一种显示G-CSF活性的多肽，该多肽包含与SEQIDNO1中所示的hG-CSF氨基酸序列相比最多15个残基不同的氨基酸序列，并且与SEQIDNO1相比包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K。2.—种显示G-CSF活性的多肽偶联物，其包含根据权利要求1的多肽，并且包含至少1个与该多肽的连接基团相连的聚乙二醇(PEG)组分。3.权利要求2的多肽偶联物，其中所述PEG组分与至少一个赖氨酸残基相连。4.权利要求3的多肽偶联物，其中所述PEG组分与N末端氨基相连。5.权利要求2的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为1-15kDa。6.权利要求3的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为1-15kDa。7.权利要求4的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为l-15kDa。8.权利要求5的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为2-12kDa。9.权利要求6的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为2-12kDa。10.权利要求7的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为2-12kDa。11.权利要求8的多肽偶联物，其中所述PEG組分的分子量为3-10kDa。12.权利要求9的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为3-10kDa。13.权利要求10的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为3-10kDa。14.权利要求11的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为5或6kDa。15.权利要求12的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为5或6kDa。16.权利要求13的多肽偶联物，其中所述PEG组分的分子量为5或6kDa。17.权利要求2的多肽偶联物，其包含1-8个相连的PEG组分。18.权利要求2的多肽偶联物，其包含2-6个相连的PEG组分。19.权利要求2的多肽偶联物，其包含3-6个相连的PEG组分。20.权利要求2的多肽偶联物，其包含2-8个相连的分子量为5000-6000Da的PEG组分。21.权利要求2的多肽偶联物，其包含2-6个相连的分子量为5000-6000Da的PEG组分。22.权利要求2的多肽偶联物，其包含3-6个相连的分子量为5000-6000Da的PEG组分。23.权利要求2的多肽偶联物，其包含4-6个相连的分子量为5000-6000Da的PEG组分。24.权利要求l-23之一的多肽或多肽偶联物，其中所述多肽包括N末端曱硫氨酸残基。25.权利要求2-23任一项的多肽偶联物，所述偶联物具有的体外生物学活性经本文所述萤光素酶试验测定，为非偶联hG-CSF生物学活性的约2-30%。26.权利要求24的多肽或多肽偶联物，所述偶联物具有的体外生物学活性经本文所述萤光素酶试验测定，为非偶联hG-CSF生物学活性的约2-30%。27.—种组合物，包括权利要求1-23任一项的多肽或多肽偶联物，和至少一种可药用载体或赋形剂。28.—种组合物，包括权利要求24任一项的多肽或多肽偶联物，和至少一种可药用载体或赋形剂。29.权利要求1-23任一项的多肽或多肽偶联物，其是用作药物的多肽或多肽偶联物。30.权利要求24的多肽或多肽偶联物，其是用作药物的多肽或多肽偶联物。31.权利要求29的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗患有造血疾病的哺乳动物的多肽或多肽偶联物。32.权利要求29的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗患有造血疾病的哺乳动物的多肽或多肽偶联物。33.权利要求31的多肽或多肽偶联物，其中所述造血疾病是放疗或化疗引发的造血疾病。34.权利要求32的多肽或多肽偶联物，其中所述造血疾病是放疗或化疗引发的造血疾病。35.权利要求29的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗白细胞减少症的多肽或多肽偶联物。36.权利要求30的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗白细胞减少症的多肽或多肽偶联物。37.权利要求35的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗中性粒细胞减少症的多肽或多肽偶联物。38.权利要求36的多肽或多肽偶联物，其是用于治疗中性粒细胞减少症的多肽或多肽偶联物。39.权利要求1-23任一项的多肽或多肽偶联物在制备用于治疗患有造血疾病的哺乳动物的药物组合物中的用途。40.权利要求24的多肽或多肽偶联物在制备用于治疗患有造血疾病的哺乳动物的药物组合物中的用途。41.权利要求39的用途，其中所述造血疾病是放疗或化疗引发的造血疾病。42.权利要求40的用途，其中所述造血疾病是放疗或化疗引发的造血疾病。43.权利要求1-23任一项的多肽或多肽偶联物在制备用于治疗患有白细胞减少症的药物组合物中的用途。44.权利要求24的多肽或多肽偶联物在制备用于治疗白细胞减少症的药物组合物中的用途。45.权利要求43的用途，其中所述白细胞减少症是中性粒细胞减少症。46.权利要求44的用途，其中所述白细胞减少症是中性粒细胞减少症。全文摘要本发明涉及一种显示G-CSF活性的多肽，该多肽包含与SEQIDNO1中所示的hG-CSF氨基酸序列相比最多15个残基不同的氨基酸序列，并且与SEQIDNO1相比包含取代K16R、K34R、K40R、T105K和S159K，本发明还涉及具有G-CSF活性的多肽偶联物，它包含一种多肽，该多肽与人G-CSF的序列相比，至少引入并去除一个赖氨酸残基，并且该多肽与2-6个聚乙二醇组分偶联。所述偶联物具有较低的体外生物学活性，较长的体内半寿期，由受体介导的清除减少，比未偶联的重组人G-CSF更快地刺激白细胞和中性粒细胞的生成。文档编号C07K14/53GK101328213SQ20081012817公开日2008年12月24日申请日期2002年7月10日优先权日2001年7月11日发明者克里斯琴·K·汉森,托本·L·尼森,汉斯·T·沙拜,简·M·米克尔森,金·V·安德森申请人:马克西根控股公司