专利名称：一种道古霉素关键中间体A40926 B<sub>O</sub>组分的纯化制备方法
技术领域：
本发明涉及道古霉素(dalbavancin)关键中间体A40926 B。组分的纯化制备方法， 即可用于道古霉素合成的、色谱纯度大于97%的A40926 B。组分的制备方法。
背景技术：
道古霉素(Dalbavancin)是第二代新型半合成糖肽类抗生素，其结构与万古霉 素、替考拉宁相似，用于革兰氏阳性病原菌引起的严重系统组织感染。道古霉素是由放线菌 次级代谢产物A40926的氏组分经过结构修饰而得，在体内外较万古霉素和替考拉宁具有 更广泛的抗菌谱，对包括葡萄球菌、链球菌、肠球菌以及甲氧西林耐药菌株在内的所有凝固 酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative stapHycoccus, CoNS)均有效，且活性明显优于万古 霉素和替考拉宁，尤为适用于治疗由耐MRSA、CoNS以及链球菌(str印tococcus)，包括耐青 霉素的肺炎球菌等革兰氏阳性菌引起的严重感染。动物实验及国外的一些临床实验研究结 果表明道古霉素在高于治疗剂量数倍的静脉给药中显示出良好的耐受性，且道古霉素在 体内呈现良好的药物动力学特征，有高而持久的血药浓度，成为唯一可隔周给药的注射抗 生素。从A40926 B0组分出发，经酯化、酰胺化、水解，最后才能得到道古霉素，因此制备 高纯度A40926 B。组分是道古霉素合成的关键。道古霉素关键中间体A40926 B。组分为放 线菌的次级代谢产物，是通过微生物发酵获得的。由于微生物发酵产物成分复杂，再加上 A40926 B。组分结构复杂，对热、酸稳定性差等特点，因此，制备高纯度A40926 B。组分难度 非常大，同时，这也是道古霉素制备工艺的关键所在，目前尚无A40926 B。组分制备相关的 文献报道。A40926 B。组分的结构式如下 R1:-(CH2)8(CH(CH3)2
Ma -D-mannopyranosyl
发明内容
本发明的主要目的是为了解决道古霉素关键中间体A40926 B。组分纯化问题，并 提供用于制备道古霉素的高纯度A40926 B0组分(色谱纯度大于97% )。为了达到上述目的，本发明提供了一种高纯度道古霉素关键中间体A40926B。组分 的制备方法，该方法包括以下步骤步骤一将粗品进行凝胶层析、大孔吸附分离以得到A40926 B0组分的半纯品。步骤二 将上述A40926半纯品进行反相柱层析，减压浓缩，可得高纯度A40926 B0 组分，其色谱纯度可达97%以上。根据本发明，凝胶层析采用葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶进行层析。根据本发明，大孔吸附分离采用平均孔径为70 100埃的多孔性吸附树脂D140、 D141进行分离。根据本发明，反相柱为C8或C18柱，其柱料的粒径为20 50iim。根据本发明，所述反相柱层析上样方法为用5%左右的乙醇溶液溶解样品，溶解 后样品的浓度为5g/L左右，然后再加入分析纯的氯化钠，使氯化钠的浓度为5%左右，然后 用1N氢氧化钠调节pH至7. 5 8. 5，然后上样。根据本发明，反相层析柱在上样前先用5%的乙醇溶液平衡柱子，上样后用10% 乙醇加5%氯化钠的水溶液冲洗柱子，冲洗3 8个柱体积。根据本发明，反相柱层析的解析剂为10 15%乙醇溶液。根据本发明，减压浓缩温度为45 70°C，典型的浓缩温度为55 60°C。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行更进一步详细说明，但不是对本发明的限定。另外， 除非另有说明，在本说明书中，一般操作均是在室温条件下进行的，室温是指5-30°C。实施例1将15g A40926粗品溶解于200ml碳酸钠碳酸氢钠=0. 05M 0. 01M的缓冲溶 液中，过滤得200ml滤液，对该滤液进行HPLC分析，A40926B0组分的含量为8. 47g，该滤液 pH值为9. 2，把上述滤液以0. 2BV/hr的流速滴在填充了 200mls印haroSe-6B凝胶的柱上 (小3mmX30mm)，再分别以4BV的碳酸钠碳酸氢钠=0. 05M 0. 01M的缓冲溶液、4BV含
三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以2BV/hr的流速进行预洗，最后用含三羟甲基氨 基甲烷的上述缓冲液以2BV/hr的流速洗脱。得A40926粗品洗脱液400ml，经高效液相分 析，洗脱液中A40926 B0组分峰面积占总面积的82. 7%，得到高纯度粗提物7. 51g，回收率 为 88. 7%。实施例2将15g A40926粗品溶解于200ml碳酸钠碳酸氢钠=0. 05M 0. 01M的缓冲溶 液中，过滤得200ml滤液，对该滤液进行HPLC分析，A40926 B0组分的含量为8. 47g，该滤液 pH值为9. 2，把上述滤液以0. 2BV/hr的流速滴在填充了 200ml葡聚糖凝胶G-25的柱上，再 分别以4BV的碳酸钠碳酸氢钠=0. 05M 0. 01M的缓冲溶液、4BV含1 %三羟甲基氨基甲
4烷的上述缓冲液以2BV/hr的流速进行预洗，最后用含三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液 以2BV/hr的流速洗脱。得A40926粗品洗脱液500ml，经高效液相分析，洗脱液中A40926 B0 组分峰面积占总面积的81. 4%，得到高纯度粗提物7. 58g，回收率为89. 5%。实施例3将实施例1中经凝胶层析得到的工艺液，调pH至7. 0，通过大孔树脂D141 (平均孔 径80埃)，用4BV pH = 3的盐酸溶液，流速为2BV/hr洗涤该树脂柱，再用4BV 10 %的乙醇 溶液以流速为2BV/hr洗涤，然后用60%乙醇溶液以lBV/hr的流速洗脱，得到320ml洗脱 液，溶出液中B。组分的峰面积为总峰面积的87. 7%，回收了 A40926 B0组分6. 85g，回收率 为91. 2%，55 60°C减压浓缩，得A40926B。组分的半纯品7. 8g。实施例4将实施例2中经凝胶层析得到的工艺液，调pH至7. 0，通过大孔树脂D140 (平均孔 径100埃)，用4BV pH= 3的盐酸溶液，流速为2BV/hr洗涤该树脂柱，再用4BV 10%的乙 醇溶液以流速为2BV/hr洗涤，然后用60%乙醇溶液以lBV/hr的流速洗脱，得到320ml洗脱 液，溶出液中B。组分的峰面积为总峰面积的87. 1%，回收了 A40926 B0组分6. 93g，回收率 为91. 4%，55 60°C减压浓缩，得A40926B。组分的半纯品7. 95g。实施例5将实施例3中的A40926 B0组分半纯品用1000ml 5%的乙醇溶液溶解样品，向样 品溶液再加入分析纯的氯化钠5g，用1N氢氧化钠调节pH至7. 5，然后上反相柱。C18 反相柱柱料(日本富 士公司)规格Lot.No :R050517 ；Pro. No :SMB100 20/45 ；Size 20 45 ii m。量取C18反相柱料600ml，用5%乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕，用10%乙 醇加5%氯化钠的水溶液冲洗柱子3000ml，用10%乙醇溶液解析，洗脱7000ml后开始收集， 总计收集7000ml后停止收集，合并收集液，55 60°C减压浓缩，得A40926 B0组分高纯品 4. 8g, HPLC 纯度 97. 66 %，收率 68. 4 %。实施例6将实施例4中的A40926 B0组分半纯品用1000ml 5%的乙醇溶液溶解样品，向样 品溶液再加入分析纯的氯化钠5g，用1N氢氧化钠调节pH至8. 0，然后上反相柱。C18 反相柱柱料(日本富 士公司)规格Lot.No :R050517 ；Pro. No :SMB100 20/45 ；Size 20 45 ii m。量取C18反相柱料600ml，用5%乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕，用10%乙 醇加5%氯化钠的水溶液冲洗柱子3000ml，用12%乙醇溶液解析，洗脱6000ml后开始收集， 总计收集5500ml后停止收集，合并收集液，55 60°C减压浓缩，得A40926 B0组分高纯品 4. 71g, HPLC 纯度 97. 35%，收率 66. 2% 0实施例7将按实施例4方法制备的A40926 B0组分半纯品用1000ml 5%的乙醇溶液溶解样 品，向样品溶液再加入分析纯的氯化钠5g，用1N氢氧化钠调节pH至8. 5，然后上反相柱。C18 反相柱柱料(日本富 士公司)规格Lot.No :R050517 ；Pro. No :SMB100 20/45 ；Size 20 45 ii m。量取C18反相柱料600ml，用5%乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕，用10%乙醇加5%氯化钠的水溶液冲洗柱子3000ml，用15%乙醇溶液解析，洗脱3000ml后开始收集， 总计收集3800ml后停止收集，合并收集液，55 60°C减压浓缩，得A40926 B0组分高纯品 的HPLC纯度为97. 26 %，收率69. 1 %。
权利要求
一种道古霉素关键中间体A40926 B0组分的纯化制备方法，其特征在于包括如下两个步骤1)将A40926 B0组分粗品进行凝胶层析、大孔吸附分离以得到A40926 B0组分的半纯品。2)将上述A40926 B0半纯品进行反相柱层析，减压浓缩，得高纯度A40926B0组分，色谱纯度大于97％。
2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述凝胶层析采用葡聚糖凝胶进行层析。
3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述凝胶层析采用琼脂糖类凝胶进行层析。
4.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述大孔吸附分离采用孔径为70 100 埃的多孔性吸附树脂进行分离。
5.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述反相层析柱为C8，其柱料的粒径为 20 50iim。
6.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述反相层析柱为C18柱，其柱料的粒径 为 20 50iim。
7.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述反相柱层析的上样方法为用5%的 乙醇溶液溶解样品，溶解后样品的浓度为5g/L左右，再加入分析纯的氯化钠，使氯化钠的 浓度为5%，用1N氢氧化钠调节pH至7. 5 8. 5，然后上样。
8.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述反相柱层析在上样前先用5%的乙醇 溶液平衡柱子，上样后用10%乙醇加5%氯化钠的水溶液冲洗柱子。
9.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述反相柱层析的解析剂为10 15%乙 醇溶液。
10.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述减压浓缩温度为55 60°C。
全文摘要
本发明公开了一种道古霉素关键中间体A40926 BO组分的纯化制备方法，其包括如下两个步骤1、将A40926 BO组分粗品进行凝胶层析、大孔吸附分离以得到A40926 BO组分的半纯品；2、将上述A40926 BO半纯品进行反相柱层析，减压浓缩，可得高纯度A40926 BO组分，色谱纯度大于97％。
文档编号C07K9/00GK101851277SQ20091005857
公开日2010年10月6日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者刘巍, 朱宇, 朱辉, 杨旭臣, 王元桦, 莫洪, 邹敬源, 陶永祥, 韩晓彤 申请人:成都雅途生物技术有限公司