专利名称：一种glp-1衍生物dlg3312及其固相化学合成方法
技术领域：
本发明属于生物、化学工程技术领域，具体地涉及一种具有人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)活性的GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。
背景技术：
1929年，Zunz和Labbare将-类从肠道中分离出来的、可以促进葡萄糖刺激胰岛素分泌的体液因子命名为肠降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1是由肠道L细胞分泌的胰高血糖素前原基因的产物，其在食物摄入后分泌。体内主要存在两种生物活性形式:GLP-1 (7 36) amide和GLP-1 (7 37)，GLP-1约80%的循环活性来自前者。GLP-1作为一种激素，通过刺激分泌胰岛素降低餐后血糖，同时抑制胰高血糖素的分泌。并且，其具有抑制胃肠道食物的清空和食物的摄入，此外，其能够引起胰岛β细胞的增殖。GLP-1适用于二型糖尿病的治疗，其降低血糖的效应是血糖依赖性的，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复至正常值则不再继续发挥降糖作用，所以在用药过程中不会出现低血糖。通过长期治疗，能够有效改善二型糖尿病患者的糖化血红蛋白量，对二型糖尿病的预防和治疗具有良好的应用前景。在实际应用中，根据以往研究结果，GLP-1进入体内后的半衰期为2分钟，其原因在于体内的多种蛋白酶对GLP-1的降解，目前DPP-4是其中最主要关注的酶。为抵抗此酶对GLP-1的降解，延长在体内的药效时间，已有多种方法，如氨基酸的定点突变、分子修饰等。如CJC-1131使GLP-1半衰期延长至18小时，其通过化学合成利用接头分子将多肽与血浆蛋白相连接而大大延长半衰期；LY315902是在GLP-1上连接I个8C脂肪链，在狗体内半衰期为3-6小时；利拉鲁肽(Liraglutide)，其于GLP-1的26位的赖氨酸处连接I个16C脂肪酸侧链，并将34位突变为赖氨酸，在人体内半衰期为8小时；PEG修饰后的GLP-1比天然GLP-1血浆半衰期要长40 倍等。虽然通过对GLP-1的序列进行改造能够延长药效时间，但是由于改造后的分子与天然GLP-1的同源率低，差异较大导致不同程度的副作用，如过敏、呕吐、胃肠不适等。现有技术中已有采用DNA重组技术制备GLP-1衍生物，名称为“一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”发明专利(200610024355.X)中存在以下缺点:利用大肠杆菌作为GLP-1衍生物表达的宿主菌，在后续纯化过程中，需要检测和控制大肠杆菌内毒素以及大肠杆菌DNA的残留量，增加了生产步骤和成本。GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1 (7-36) amide,由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1 (7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者均有生物学活性。本发明涉及的GLP-1指 GLP-1 (7-37)，其序列如下:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。本发明改进了 GLP-1序列及结构，提出了一种GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。本发明提出的GLP-1衍生物DLG3312解决了天然GLP-1体内活性时间短的问题，且具有良好生物学活性，其原因主要在于:本发明GLP-1衍生物DLG3312的结构X-Y-X中，X与Y的连接方式为2个X的碳端羧基分别与Y的2个氨基缩合连接，形成由2个X与I个Y构成的特定结构的U型同源二聚体。本发明中，二聚体与受体的亲和力相对于单体有较大提高，从而能够更为有效地激活受体；二聚体中包含突变的氨基酸，同时，二聚结构就其本身而言，能阻碍与体内多种酶与其的结合，从而降低对其的降解速率；二聚体与单体相t匕，具有相对较大的分子量，由此相对延长因肾小球滤过作用对其清除的时间，使之在体内停留时间增加，延长药效时间。并且，在安全性方面也避免了目前所使用的多种糖尿病药物具有的副作用，如造成低血糖、体重增加，引起胰岛素抵抗、胰岛β细胞衰竭等等。相反的，本发明DLG3312具有改善胰岛素抵抗和抑制胰岛β细胞凋亡的功能，从根本改善糖尿病病人的糖代谢能力。另外，现有技术制备GLP-1衍生物方法中存在步骤多、成本高等缺陷，而本发明提出的制备方法具有操作简便、成本低廉等优势，具有更大的应用潜力。
发明内容
本发明提出了一种GLP-1衍生物DLG3312，包括其互变异构体、溶剂化物和药物学可接受盐；所述GLP-1衍生物DLG3312的结构为Χ_Υ_Χ ;其中，X表示的序列为H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中:Χ8 是 A、G、dA 或 V 中的任意一个，dA 表示 D-Ala ；Y 表示二氨基羧酸，包括Lys、0rn ;所述GLP-1衍生物DLG3312通过所述X的碳端羧基与所述Y的氨基缩合连接成同源二聚体。其中，
当X8为A，则序列X为Seq ID N0.1 ；
当X8为G，则序列X为Seq ID N0.2 ；
当X8为dA,则序列X为Seq ID N0.3 ；
当X8为V，则序列X为Seq ID N0.4。其中，
序列X为Seq ID N0.1时，当Y为Lys，所述的GLP-1衍生物为DLG3312-1如下结构式
(1)所示；当Y为Orn，所述的GLP-1衍生物为DLG3312-5如下结构式(5)所示:
权利要求
1.一种GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于，所述GLP-1衍生物DLG3312包括其互变异构体、溶剂化物和药物学可接受盐；所述GLP-1衍生物DLG3312的结构为X_Y_X ;其中， X 表示的序列为 H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中:Χ8 是 A、G、dA 或 V 中的任意 Ivj dA 是 D-Ala ； Y表示二氨基羧酸，包括Lys、Orn ； 所述GLP-1衍生物DLG3312通过所述2个X的碳端羧基与所述Y的氨基缩合连接成同源二聚体。
2.按权利要求1所述的GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于， 当X8为A，则序列X为Seq ID N0.1 ； 当X8为G，则序列X为Seq ID N0.2 ； 当X8为dA,则序列X为Seq ID N0.3 ； 当X8为V，则序列X为Seq ID N0.4。
3.按权利要求1所述的GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于， 序列X为Seq ID N0.1时，当Y为Lys，所述的GLP-1衍生物为DLG3312-1如下结构式(1)所示；当Y为Orn，所述的GLP-1衍生物为DLG3312-5如下结构式(5)所示:
4.一种如权利要求1-3所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法，其特征在于，先将树脂置入多肽合成仪，将带保护基的二氨基羧酸Y与所述树脂结合，再将带保护基的氨基酸单体按照权利要求1或2所述X序列，从C端向N端排列在多肽合成仪中，合成带侧链保护基的多肽树脂，再经脱保护基、切断树脂、HPLC纯化、冷冻干燥，得到所述的GLP-1衍生物DLG3312 ;其中，所述带保护基的二氨基羧酸Y包括=Fmoc-L-Lys (Fmoc)-0Η、Fmoc-L-Orn (Fmoc) -OH,所述带保护基的氨基酸单体包括:Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -ΟΗλ Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-His(Trt)-ΟΗλ Fmoc-L-1Ie_OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH。
5.按权利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法，其特征在于，当序列 X 为 Seq ID N0.1， 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-1 ； 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OHΛFmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Leu-OHΛFmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-5。
6.按权利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法，其特征在于，当序列 X 为 Seq ID N0.2， 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OHΛFmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、 Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时 ，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-2 ； 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OHΛFmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Leu-OHΛFmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-6。
7.按权利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法，其特征在于，当序列 X 为 Seq ID N0.3， 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OHλFmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、 Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-3 ； 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1Ie-OHΛ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OHλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-7。
8.按权利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法，其特征在于，当序列 X 为 Seq ID N0.4， 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-4 ； 所述带保护基的氨基酸单体依次为:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OHλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 时，所得 GLP-1 衍生物为 DLG3312-8。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3所述GLP-1衍生物DLG3312和药学上可接受的赋形剂。
10.按权利要求1-3所述的GLP-1衍生物DLG3312在制备治疗糖尿病及肥胖症的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物、化学工程技术领域，公开了一种GLP-1衍生物DLG3312，包括其互变异构体、溶剂化物和药物学可接受盐，其结构为X-Y-X；其中，X表示的序列为H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中X8是A、G、dA或V中的任意一个；Y表示二氨基羧酸，包括Lys、Orn。本发明还公开了所述GLP-1衍生物DLG3312的固相化学合成方法。本发明制备的DLG3312具有长于天然GLP-1的体内降血糖时间；本发明固相化学合成的制备方法生产步骤少，生产成本低，特别适于在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分。
文档编号C07K1/06GK103087174SQ20111034335
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者劳勋, 吴自荣, 黄静, 赵丽芬, 李娟 , 赵云, 耿旭, 汪正华 申请人:华东师范大学