专利名称：源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶(angiotensin I converting enzyme，略称为ACE)抑制肽以及它的类似物，或者其盐类中的一种所构成的 ACE抑制剂及其应用。
背景技术：
高血压是最常见的心血管疾病之一，它能造成大脑、心血管、肾脏的损害，是引起脑卒中、心力衰竭和冠心病等的重要因素，严重威胁着人类的健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准，延长寿命有着重要的意义。血管紧张素I转换酶在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中， 对血压调节起着重要的作用。ACE可以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K+的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血压升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。综上所述，ACE —方面产生使血压上升的血管紧缩素II，另一方面，使具有血管舒张作用的舒缓激肽失活，这都造成了血压的上升。所以，如果抑制了 ACE的活性，就可以起到降压的作用。现有的作为治疗高血压的合成物卡普托利就是ACE的抑制剂，但它有很多副作用，所以源于食品蛋白中的ACE抑制肽因其无毒副作用，同时具有其它疗效而被广泛应用， 市场前景极好。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于食品，具有高安全性、廉价、可产业化实施的血管紧张素I转换酶抑制剂及制备方法及其应用。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现一种源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂，该物质由对ACE有较强抑制作用的活性单肽组成，该活性单肽的氨基酸序列为Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr。所述血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，将鱼鳞胶原蛋白的酶解产物经超滤、凝胶过滤、C18高效液相色谱分离纯化，分离过程中每一步用ACE活性抑制的测定方法跟踪测定分离样品的活性，取活性最大的成分进行进一步的分离，得到活性单肽。高效毛细管电泳鉴定纯度大于95 %，对ACE有较强的抑制作用，由氨基酸璇光度不同而定义为L型氨基酸和D型氨基酸所形成的不同构型的八肽。所述的凝胶过滤采用kphadex LH-20凝胶过滤柱进行分离，流动相为体积百分比 30%的甲醇水溶液，温度为室温，检测波长为280nm，按时间收集。所述的高效液相色谱分离纯化采用Hypersil Cw柱，流动相A液为0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为0. 1% TFA+100%乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度0-60min :A液100% -50%线性降低，B 液 0% -50%线性升高；60-80min :A 液 0%，B 液 100%。所述的活性单肽用于治疗和预防高血压。所述的活性单肽按常规方法生成的盐类，可用于治疗和预防高血压。所述的活性单肽与酸反应生成的盐，或与金属离子形成的盐类，或与氨基乙醇，三乙氨，或二环乙氨形成的胺类盐。公认的与酸反应产生的盐类，采用的酸如盐酸，硫酸，硝酸，磷酸等无机酸；蚁酸，乙酸，丙酸，甘氨胆酸，苹果酸，柠檬酸，酒石酸，琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公认的与金属离子形成的盐类，包括钠盐，钾盐，钙盐，铵盐；以及氨基乙醇，三乙氨，二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。所述的活性单肽或活性单肽生成的盐类，可与充填剂形成各种形式的制剂散剂， 颗粒剂，片剂，胶囊，水溶液，悬浮液，乳化液，喷剂，或粉剂。所述的制剂，使用时可以采取经口腔和非经口腔的投入方法，非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，或肛肠投入；注射液的制作可以任意选用生理盐水、葡萄糖、安定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂。所述的制剂可以添加到各种食品当中，作为抑制血压的保健食品；食品的形态可以是液体的清凉饮料、乳酸饮料、调味品或汤类，也可以是固体的奶酪、火腿或点心。本发明相关的ACE抑制剂，使用量没有特别的限制，具体根据高血压的程度，患者的年龄、体重、身体状况和给与的方法等因素，适当地确定。与现有技术相比，本发明的有益效果是1、原料来源于食品，无任何毒副作用；原料廉价，具有高安全性、可产业化实施；2、通过动物实验验证，本发明产品用于治疗和预防高血压，具有明显的效果。
图1是kphadex LH-20对酶解液的分离相谱图；图2是治疗组和对照组进行灌肠实验的血压随时间变化曲线。
具体实施例方式本发明应用现代分子生物技术对鱼鳞胶原蛋白进行酶解，对具有ACE抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在生物体内对ACE的抑制活性，结果表明此肽有明显的降血压效果。因此，可以将此活性肽及其衍生物或者其盐类作为高血压患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。本发明通过对鱼鳞胶原蛋白酶解液进一步分离、纯化得到了其氨基酸序列为 Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr的活性单肽，高效毛细管电泳鉴定纯度大于95%，是有效的ACE抑制剂。该活性单肽及其盐类可有效治疗和预防高血压。本实施例所述的活性单肽是从可溶性鱼鳞胶原蛋白中分离、纯化得到的。具体步骤如下1)脱脂将新鲜鱼鳞剪碎，加入体积百分比为20%的正丙醇溶液，浸泡Mh，蒸馏水洗，浙干；2)去除非胶原蛋白；在脱脂鱼鳞中加入0. 5mol/l的NaCl溶液，浸泡Mh ；3)胶原蛋白的提取在步骤2)处理后的溶液中再加入体积百分比为1. 5%的醋酸溶液，处理Mh，在6000r/min条件下离心处理lOmin，弃去沉淀后抽滤。再加入固体NaCl 于滤液中盐析，静止24h抽滤得粗胶原蛋白沉淀，流水透析Mh，冷冻干燥得胶原蛋白；
4)胶原蛋白肽的制备
①胶原蛋白经胃蛋白酶酶解24h后，酶解产物经超滤处理，取分子量小于10000道尔顿的组分；
②采用kphadex LH_20凝胶过滤柱进行分离，流动相为体积百分比30%的甲醇溶液，柱温为室温，检测波长为280nm，按时间收集，每20分钟接收一管；
③采用高效液相色谱Hypersil Cw柱进行进一步分离，流动相A液为0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为0. TFA+100%乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度0-60min :A液 100% -50%线性降低，B 液 0% -50%线性升高；60-80min :A 液 0%，B 液 100%。
④A组分具有很好的ACE抑制活性，测定此活性肽的分子量为724. 3，其氨基酸序列为 Gly-Ala-Asp-Glyler-Val-Gly-Tyr。
实施例1
可溶性鱼鳞胶原蛋白的制备
将新鲜鱼鳞剪碎，加入体积百分比20%的正丙醇溶液，浸泡Mh，蒸馏水洗，浙干。 加入0. 5mol/l的NaCl溶液，浸泡Mh，加入体积百分比1. 5%的醋酸溶液，处理时间Mh，在 6000r/min下离心处理lOmin，弃去沉淀后抽滤。加固体NaCl于滤液中盐析，静置24h抽滤得粗胶原蛋白沉淀，流水透析Mh，冷冻干燥得可溶性胶原蛋白。
实施例2
可溶性鱼鳞胶原蛋白的酶解
将上述制得的可溶性鱼鳞胶原蛋白溶于0. 05mol/L的磷酸缓冲液中，用lmol/L的 HCl溶液调pH= 2.0，可溶性鱼鳞胶原蛋白与底物的比，蛋白浓度质量百分比为2.5%。加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与底物的质量比1 50，在温度37°C下酶解M小时。所得酶解液加热至100°C，并保持10分钟，使胃蛋白酶失活。之后调节水解液pH为中性，离心(5000XG， 室温)25分钟，经超滤膜(MW 10000)过滤，透过超滤膜的组分，得到可溶性鱼鳞胶原蛋白的酶解液，酶解液再进行真空冷冻干燥，得到鱼鳞胶原蛋白寡肽，零下20°C保存。
实施例3
酶解产物的分离
1)将可溶性鱼鳞胶原蛋白的酶解液15ml经kphadex Sephadex LH-20凝胶过滤柱进行凝胶过滤，层析分离，如图1所示；用体积百分比30%的甲醇溶液洗脱，按管数收集， 20分钟1管，收集具有较强ACE抑制活性的组分。
2)将上述具有较强ACE抑制活性的组分继续在RP-HPLC上分离纯化。在RP-HPLC 上用Hypersil C18柱，流动相A液为0. 1 % TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相 B液为0. l^TFA+lOO^乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集。洗脱梯度0-60min :A液100% -50%线性降低，B液0% -50%线性升高； 60-80min :A 液 0 %，B 液 100 %。
A组分具有显著的ACE抑制活性，测定此活性肽的分子量为，724. 3，其氨基酸序列为Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr。A组分即为活性单肽。高效毛细管电泳鉴定纯度大于95%，该活性单肽的分子量为724. 3。对ACE有较强的抑制作用，由氨基酸璇光度不同而定义为L型氨基酸和D型氨基酸所形成的不同构型的八肽。静脉注射动物实验选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分成2组，每一组10只，每日按大白鼠体重5-20mg/kg剂量Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr进行静脉注射，结果表明，1周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从195mmHg下降到162mmHg，说明此肽具有明显的降血压效果。灌胃动物实验选择20只自发性高血压大白鼠为实验模型，大白鼠饲养一周后，将其分组，每日按大白鼠体重20-200mg/kg剂量Gly-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr进行灌胃投入，如图 2所示，4周后对照组大白鼠的血压持续升高，而治疗组自发性高血压大白鼠的血压明显下降，高血压大白鼠的平均收缩压从185mmHg下降到160mmHg，说明此肽具有明显的降血压效
权利要求
1.一种源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征在于，该物质由对ACE 有较强抑制作用的活性单肽组成，该活性单肽的氨基酸序列为Gly-Ala-Aap-Gly-Ser-Val-Gly-Tyr0
2.根据权利要求1所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于，将鱼鳞胶原蛋白的酶解产物经超滤、凝胶过滤、C18高效液相色谱分离纯化， 分离过程中每一步用ACE活性抑制的测定方法跟踪测定分离样品的活性，取活性最大的成分进行进一步的分离，得到活性单肽。
3.根据权利要求2所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述的凝胶过滤采用kphadex LH-20凝胶过滤柱进行分离，流动相为体积百分比30%的甲醇水溶液，温度为室温，检测波长为280nm，按时间收集。
4.根据权利要求2所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述的高效液相色谱分离纯化采用Hypersil Cw柱，流动相A液为0. 1% TFA+0%乙腈的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为0. 1% TFA+100%乙腈的水溶液，检测波长215nm，室温，进样体积20 μ 1，采用梯度洗脱，按时间收集；洗脱梯度0-60min :A液 100% -50%线性降低，B if 0% -50%线性升高；60-80min :A 液 0%，B 液 100%。
5.一种权利要求1所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的活性单肽用于治疗和预防高血压。
6.根据权利要求5所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的活性单肽按常规方法生成的盐类，可用于治疗和预防高血压。
7.根据权利要求5或6所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的活性单肽或活性单肽生成的盐类，可与充填剂形成各种形式的制剂散剂，颗粒剂，片剂，胶囊，水溶液，悬浮液，乳化液，喷剂，或粉剂。
8.根据权利要求7所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的制剂，使用时可以采取经口腔和非经口腔的投入方法，非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，或肛肠投入；注射液的制作可以任意选用生理盐水、葡萄糖、安定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂。
9.根据权利要求7所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂的应用，其特征在于，所述的制剂可以添加到各种食品当中，作为抑制血压的保健食品；食品的形态可以是液体的清凉饮料、乳酸饮料、调味品或汤类，也可以是固体的奶酪、火腿或点心。
10.根据权利要求1所述的源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂，其特征在于，所述的活性单肽由氨基酸璇光度不同而定义为L型氨基酸和D型氨基酸所形成的不同构型的八肽。
全文摘要
本发明涉及一种源于鱼鳞胶原蛋白的血管紧张素I转换酶抑制剂及其应用，应用现代分子生物技术对鱼皮胶原蛋白蛋白进行酶解，对具有ACE抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在体内对ACE的抑制活性，结果表明此肽有明显的降血压效果。因此，可以将此活性肽及其衍生物或者其盐类作为高血压患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。
文档编号C07K7/06GK102516358SQ20111040496
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者卢航, 张丽, 李敏镇, 杨杰, 胡建恩 申请人:鞍山嘉鲜农业发展有限公司