专利名称：一种依非巴特的制备方法
技术领域：
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种新的依非巴特的制备方法。
背景技术：
依非巴特(Eptifibatide)是一个合成的环七肽含有6个氨基酸和一个去氨基半胱氨酸(巯基丙酸)。这个药是在一种barbourin结构的基础上发明出来的。这是一种从东南侏儒型响尾蛇(Sistrurus m. barbouri)的蛇毒中发现的多肽。依非巴特(Eptifibatide)是一种新型的血小板糖蛋白Ilb/IIIa受体拮抗剂，它通过抑制血小板聚集的最后共同途径，具有抗血小板作用强、起效快、不良反应少等优点。依非巴特 (Eptifibatide)和GPIIb/IIIa受体结合的特异性是由于赖氨酸-甘氨酸-门冬氨酸 (KGD)这一多肽序列，和整合素配体中存在的多肽序列RGD只有一个氨基酸的区别。此药对GPIIb/IIIa受体有很高的亲合力和很高的特异性，也有快速的离解率。其结果是清除半衰期较短，依非巴特(Eptifibatide)对血小板的抑制容易逆转,在停止滴入药物2至4小时内血小板功能即恢复到基线水平；不像阿昔单抗，依非巴特(Eptifibatide)没有免疫源性，观察到的血小板减少的发生频率和普通肝素相似。依非巴特(Eptifibatide)是一种特异性GPIIb/IIIa受体阻滞剂，在ACS病人中剂量依赖性地抑制体外血小板的聚集，在健康志愿者和行PCI术的病人中能抑制纤维原与二磷酸腺苷(ADP)活化的血小板的结合。本品对血小板糖蛋白Ilb/IIIa受体的阻滞是可逆的，一旦出现不良反应可立即停药，不良反应轻。依非巴特具有以下的结构Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-CyS-NH2有关依非巴特的制备方法，国内外有报道。中国专利CN200910247949报道了依非巴特的Fmoc固相合成法，采用氨基树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂采用三氟醋酸(TFA)酸解。在本产品结构中有IHarg和I个Gly,在固相法依次接入Fmoc-Gly过程中， 由于GI y自身的特性和保护Har g结构的特性，在产品制备过程产生易产生以下杂质 [+IGly]-依非巴特、[-IGly]-依非巴特、和[-IHarg]-依非巴特,从使粗品纯度大幅度降低，而这些杂质与依非巴特自身的极性相近，增大了纯化的难度，产品总收率无法得到有效提高，同时影响产品纯度，影响用药的安全性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供依非巴特的制备方法，该制备方法使用了新的保护氨基酸片段，直接避免了 [+IGly]-依非巴特、[-IGly]-依非巴特、[-IHarg]-依非巴特杂质的产生，提高了产品收率和纯度，反应效率高、有利于实现规模化的固相合成工艺。本发明依非巴特的制备方法，包括固相多肽合成法制备依非巴特树脂、依非巴特
Rink AmideAM 树脂Rink Amide 树脂
,KH CCh.
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、μ,广,·
树脂酸解得到依非巴特线性肽粗品、经氧化后得到依非巴特粗品，再经纯化和换盐得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制备依非巴特树脂的方法为在氨基树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到依非巴特树脂X-Y-Trp (R1) -Pro-Cys (R2)-氨基树脂其中，R1 SBoc 或H;R2 STrt 或 Acm;X 为 Mpr (R2) -Harg (R3)，R3 为 Pbf 或 H ;Y 为 Gly-Asp(OtBu)。作为本发明优选的方案，接入X片段时，仅用I次固相偶联合成反应，偶联所使用的Fmoc-保护氨基酸或片段为Mpr (Trt) -Harg (R3) -OH ；作为本发明优选的方案，接入Y片段时，I)仅用I次偶联直接接入,Fmoc-保护氨基酸或片段为Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH ； 或2)分2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为第一次为 Fmoc-Asp (OtBu) -0H、第二次为 Fmoc-Gly-OH。本发明接入X和Y以外的其它片段时保护氨基酸分别为=Fmoc-Trp(R1)-OH, R1为 Boc 或 H ；Fmoc-Pro-0H ；Fmoc-Cys (R2) -OH, R2 为 Trt 或 Acm。作为本发明优选的方案，接入各个氨基酸或片段时，保护氨基酸的用量为载体树脂总摩尔数的I. 2 6倍，优选3倍。本发明所述的氨基树脂，其氨基取代值为O. 3 I. 5mmol/g树脂，优选的取代值为
O.5 I. OmmoI /g 树脂。进一步地,氨基树脂选自Rink Amide树脂、Rink Amide AM树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种，优选为RinkAmide MBHA树脂。
权利要求
1.一种依非巴特的制备方法，包括固相多肽合成法制备依非巴特树脂、依非巴特树脂酸解得到依非巴特线性肽粗品、经氧化后得到依非巴特粗品，再经纯化和换盐得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制备依非巴特树脂的方法为在氨基树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到依非巴特树脂X-Y-Trp (R1) -Pro-Cys (R2)-氨基树脂其中，R1 为 Boc 或 H ；R2 为 Trt 或 Acm ；X 为 Mpr (R2) -Harg (R3)，R3 为 Pbf 或 H ;Y 为 Gly-Asp (OtBu)。
2.根据权利要求I所述的依非巴特的制备方法，其特征在于接入X片段时，仅用I次固相偶联合成反应，偶联所使用的Fmoc-保护氨基酸或片段为Mpr (Trt) -Harg (R3) -OH, R3为 Pbf 或 H0
3.根据权利要求I或2所述的依非巴特的制备方法，其特征在于接入Y片段时，1)分I次偶联直接接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH;或2)分2次偶联依次接入，Fmoc-保护氨基酸或片段为第一次为Fmoc-Asp(OtBu)-0H、 第二次为 Fmoc-Gly-OH。
4.根据权利要求1-3任一项所述的依非巴特的制备方法，其特征在于接入X和 Y以外的其它的保护氨基酸分别为=Fmoc-Trp (R1) -OH, R1为Boc或H ；Fmoc-Pro-0H ； Fmoc-Cys (R2) -OH, R2 为 Trt 或 Acm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的依非巴特的制备方法，其特征在于接入各个氨基酸片段时，保护氨基酸的用量为载体树脂总摩尔数的I. 2 6倍，优选3倍。
6.根据权利要求I所述的依非巴特的制备方法，其特征在于所述氨基树脂取代值为O.3 I. 5mmol/g树脂，优选的Fmoc-Leu-取代值为O. 5 I. Ommol/g树脂。
7.根据权利要求6所述的依非巴特的制备方法，其特征在于所述氨基树脂选自 RinkAmide树脂、Rink Amide AM树脂、Rink MBHA树脂和Sieber树脂中的一种，优选为 RinkAmide MBHA 树脂。
8.根据权利要求I所述的依非巴特的制备方法，其特征在于所述固相偶联合成法是 前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去保护Fmoc后再与下一个保护氨基酸偶联反应，偶联反应时间为60 300分钟，优选的为100 140分钟。
9.根据权利要求1-8任一项所述的依非巴特的制备方法，其特征在于依非巴特树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基得到依非巴特线性肽粗品Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-CyS-NH20
10.根据权利要求9所述的依非巴特的制备方法，其特征在于依非巴特树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为TFA 的比列为80-95% (V/V)，EDT的比例为I 10% (V/V)，余量为水。
11.根据权利要求I 8任一项所述的依非巴特的制备方法，其特征在于依非巴特线性肽粗品氧化后得到依非巴特粗品时，依非巴特线性肽先用醋酸溶解，过滤后用氧化剂氧化环化,依非巴特线性肽结构中的Mpr中的巯基SH和Cys中的SH经氧化形成二硫键S-S而得到Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2所述氧化剂为碘、hA ^ DMSQ中的至少-种。
全文摘要
本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及依非巴特的制备方法。本发明依非巴特的制备方法，包括固相多肽合成法制备依非巴特树脂、依非巴特树脂酸解得到依非巴特线性肽粗品、经氧化后得到依非巴特粗品，再经纯化和换盐得到依非巴特成品，其中固相多肽合成法制备依非巴特树脂的方法为在氨基树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到依非巴特树脂X-Y-Trp(R1)-Pro-Cys(R2)-氨基树脂其中，R1为Boc或H；R2为Trt或Acm；X为Mpr(R2)-Harg(R3)，R3为Pbf或H；Y为Gly-Asp(OtBu)。本发明产品纯度可达99.5％以上。
文档编号C07K1/06GK102584944SQ20121002519
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月6日 优先权日2012年2月6日
发明者文永均, 王晓莉, 祝传斌, 童光彬, 韩玉 申请人:成都圣诺科技发展有限公司