杂交瘤细胞株及其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的制作方法

专利名称：杂交瘤细胞株及其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体。
背景技术：
心血管疾病尤其是冠心病严重威胁人类生命和健康。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction, AMI)是心血管疾病的主要类型，发病突然，急性期死亡率约为30%。AMI作为冠心病常见的急危重症，发病早期快速得到确诊并进行再灌注治疗是降低病死率和改善预后的关键。心电图和心肌酶学的动态变化检测是临床重要的辅助检查手段，然而心电图呈非特异性改变的AMI患者，心肌标志物则成为诊断的重要条件。目前AMI的心肌梗死标志物研究取得很大进展，肌酸激酶同工酶MB (creatine kinase isoenzymeMB,CK-MB)、心肌肌I丐蛋白 T(cardiac troponin T, cTnT)、心肌肌I丐蛋白 I (cardiac troponinI，cTnl)和肌红蛋白(Myoglobin，Mb)等在临床应用十分广泛。其中MB出现时间早，约胸痛2 3h浓度升高，但对骨骼肌和心肌损伤不能区分，而cTnl虽特异性高，但在胸痛6 8h后浓度才升高。心脏型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid binding protein,H-FABP)则克服了以上两缺点，对于早期诊断AMI具有特异性和敏感性，成为目前国内外研究较多的理想的AMI早期诊 断生化指标。FABP (人脂肪酸结合蛋白)是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子量为12-16kD，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中。自R. K. Ockner等人1972年发现脂肪酸结合蛋白以来，已经将其分为不同的类型，如小肠型(1-FABP)、心脏型(H-FABP)、肝脏型(L-FABP)、肾脏型(K-FABP)等。不同型FABP的序列有较大的同源性。其中H-FABP是一种可溶性细胞质蛋白，分子量为14-15kD。它特异地大量存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的4-8%，正常人每克湿重心肌中含H-FABP约0. 52±0.06 mg，主要存在于心室中，心房含量较少。H-FABP是一种酸性蛋白质，其等电点(Pl)为5.1。人H-FABP由133个氨基酸残基组成，它将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，使脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。H-FABP正成为很多疾病诊断的有效标志物，并可弥补CK-MB、cTnT, cTnl和Mb检测的不足，对于AMI的早期诊断更具有特异性和敏感性。为了进一步研究H-FABP在疾病的诊断和疗效判定中的意义，需要大量的H-FABP蛋白分子和单克隆抗体。从心肌组织中提取天然H-FABP,能最好的还原天然蛋白的结构和功能，但受产率限制，且不易纯化，应用受到了限制。自1996年Schaap F. G.等人在大肠杆菌中表达H-FABP以来，国内外先后有不同的表达报道。基因工程制备出适用于免疫学检测工作标准品的H-FABP重组蛋白，可为下一步H-FABP单克隆抗体和多克隆抗体的制备提供抗原，并可用于H-FABP特性的研究。H-FABP对于AMI的早期诊断更具有特异性和早期敏感性，有望成为理想的AMI的早期诊断生化指标。免疫检测技术是基于抗原-抗体反应的原理对待测物(抗原/抗体)进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、便捷等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。构建基于免疫检测技术的H-FABP检测体系对于疾病早期诊断、人类健康等都具有重要的意义，同时具有巨大的社会和经济意义。而市场上出售的用于检测H-FABP的酶联免疫(ELISA)试剂盒，多采用国外进口 H-FABP抗体，价格比较高，且均为科研用试剂盒，难以大面积开展实验。因此，制备高特异性的H-FABP单克隆抗体成为迫切需要。实现H-FABP免疫检测的关键问题是如何获得其单克隆抗体及多克隆抗体以及作为免疫检测的抗原标准品，所以进行预测选择H-FABP区域的B细胞免疫表位尤为重要
发明内容
本发明的目的是提供两株可产生抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所提供的可产生抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株1-F10 (亚类IgG2a)和杂交瘤细胞株3-H5 (亚类IgG2b)，已经于2012年09月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号分别为 CCTCC NO:C2012139 和 CCTCC N0:C2012140。杂交瘤细胞株1-F10和3-H5分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1-F10所产生的单克隆抗体，该单克隆抗体的亚类属于IgG2a。本发明还提供一种由杂交瘤细胞株3-H5所产生的单克隆抗体。该单克隆抗体的亚类属于IgG2b。本发明还提供杂交瘤细胞株1-Fio和/或3-H5所产生的单克隆抗体制备心肌梗死诊断或检测制剂中的应用。本发明还提供一种用于诊断或检测心肌梗死的制剂，其包含杂交瘤细胞株1-F10和/或3-H5所产生的单克隆抗体。本发明还提供一种用于诊断或检测心肌梗死的试剂盒，其包含杂交瘤细胞株1-F10和3-H5所产生的单克隆抗体。本发明具体通过下述技术方案完成本发明的目的1. H-FABP重组蛋白的制备从GENEBANK中获得人H-FABP编码序列，通过扩增人心型脂肪酸结合蛋白H-FABP的基因片断，将目的基因与原核表达载体连接，构建原核表达重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达人心肌型脂肪酸结合蛋白。鉴定重组蛋白的可溶性后纯化重组蛋白并进行纯度、浓度和活性鉴定，得到高纯度的H-FABP重组蛋白。2.利用B细胞表位在线预测软件，综合分析蛋白结构β_转角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韧性，蛋白抗原性，疏水性及线性抗原表位，选择具有较强抗原特异性的H-FABP区段肽I (32-47aa)，将肽I与BSA偶联后作为免疫原与重组H-FABP —起免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株并检测其细胞培养上清的效价。之后进行抗体亚类鉴定和抗体的特异性实验，证实得到的抗体是特异性针对H-FABP的。3.建立H-FABP的ELISA检测体系利用已制备的抗H-FABP抗体作为捕获抗体和检测抗体，以H-FABP重组蛋白作为检测抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测天然H-FABP的配对抗体并以此成功建立了检测H-FABP的双抗体夹心ELISA方法。本发明通过H-FABP蛋白中抗原表位的预测，制备了抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-H5 — 1-F10，可以分泌相应的检测用抗体，能进行成功配对和检测天然血清，初步建立了检测H-FABP的双抗体夹心ELISA方法。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。


图1为H-FABP基因逆转录PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。其中，M为DNAMarker ;1_5 为五个退火温度 62°C、61°C、60°C、59°C、58°C。图2为pET28a-H-FABP用Xh0l及NC0l双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果分析图。其中，M 为 DNA marker ;泳道 I 为 pET28a,泳道 2 为 pET28a_H_FABP。图3为重组H-FABP蛋白诱导表达、可溶性表达鉴定的SDS-PAGE电泳图；其中，M为分子量标准；1为BL21-pET28a-H-FABP未诱导表达；2为BL21-pET28a-H_FABP诱导表达；3为破菌后上清；4为破菌后沉淀。图4为重组H-FABP蛋白纯化图。其中I为紫外吸收曲线,2为溶液电导,3为纯化抗体浓度，F1、F2、F3分别为指不同时间抗体纯化出现的吸收峰。

图5为纯化后重组H-FABP蛋白的SDS-PAGE鉴定。其中，M为分子量标准；泳道I为纯化后H-FABP。图6为重组H-FABP蛋白的Western blotting鉴定。其中，泳道I为BSA ;泳道2为重组H-FABP。图7为ELISA鉴定单克隆抗体3-H5检测H-FABP重组蛋白。其中，左I孔为空白对照，左 2 12 孔分别为抗体稀释倍数 1:1000,1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000。图8为ELISA鉴定单克隆抗体1-F10检测H-FABP重组蛋白。其中，左I孔为空白对照，左 2 12 孔分别为抗体稀释倍数 1:1000,1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000。图9为Western blot鉴定单克隆抗体3-H5结合H-FABP重组蛋白；其中，泳道I为重组蛋白H-FABP ;泳道2为心肌匀浆；3为BSA。图10为Western blot鉴定单克隆抗体1-F10结合H-FABP重组蛋白。其中，泳道I为重组蛋白H-FABP ;泳道2为心肌匀浆；3为BSA。图11为标准ELISA检测重组蛋白的标准曲线。图12为标准ELISA检测临床标本中H-FABP结果(正常人与AMI患者比较)。
具体实施方式
本发明通过RT-PCR扩增人心型脂肪酸结合蛋白H-FABP的基因片断，将目的基因与原核表达载体pET28a连接，构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导表达人心肌型脂肪酸结合蛋白。利用pET28a构建的H-FABP原核表达质粒在BL21实现了高效可溶性表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，表达的重组蛋白分子质量约为15kD。采用离子交换层析柱纯化H-FABP重组蛋白，通过Q-HP柱(pHll. 5)纯化后得到高纯度H-FABP重组蛋白，含量约为O. 48mg/mL。Western blotting鉴定纯化后重组蛋白特异性结果表明，所得重组蛋白与商品化的H-FABP单抗呈特异性反应。本发明利用B细胞表位在线预测软件，综合分析蛋白结构β_转角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韧性，蛋白抗原性，疏水性及线性抗原表位，选择具有较强抗原特异性的H-FABP区段肽I (32-47aa)，将肽I与BSA偶联后作为免疫原与重组H-FABP —起免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化，所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-F10 (亚类IgG2a)和杂交瘤细胞株3-H5 (亚类IgG2b)(于2012年09月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉武汉大学，保藏编号分别为CCTCC NO: C2012139和CCTCC NO: C2012140), 2株单抗效价均在1:256000 以上，亲和力分别为 6· 53X IO8IT1 和 9. (^XlO9M' Western blotting 鉴定表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。本发明建立了 H-FABP的ELISA检`测体系应用抗H-FABP抗体3-H5为捕获抗体，抗H-FABP抗体1-F10为检测抗体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，能够成功检测天然血清中的H-FABP，并以此成功建立了检测H-FABP的双抗体夹心ELISA方法。材料和来源实验动物Balb/C小鼠和新西兰大白兔购自第三军医大学实验动物中心(中国重庆)。菌株和质粒大肠杆菌克隆菌株DH5a和大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)均购自天根生化科技(北京)有限公司，pET-28a和pET_28a购自Novagen公司。酶及试剂盒限制性内切酶Xhol及Ncol和质粒抽提试剂盒购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根公司。其它试剂HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。实施例1. H-FABP重组蛋白的制备
I) H-FABP编码序列全基因获得根据GeneBank提供的H-FABP基因序列(NM_004102 )，利用软件与肝型、小肠型、脑型、银雪病相关型及脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因序列相比较，观察同源性，确定心脏型脂肪酸结合蛋白基因拟克隆序列(SEQ ID NO:1)ATGGTGGACG CTTTCCTGGG CACCTGGAAG CTAGTGGACA GCAAGAATTT CGATGACTAC 60ATGMGTCAC TCGGTGTGGG TTTTGCTACC AGGCAGGTGG CCAGCATGAC CMGCCTACC 120ACMTCATCG AAMGMTGG GGACATTCTC ACCCTAAAM CACACAGCAC CTTCMGMC 180ACAGAGATCA GCTTTMGTT GGGGGTGGAG TTCGATGAGA CMCAGCAGA TGACAGGMG 240GTCMGTCCA TTGTGACACT GGATGGAGGG AMCTTGTTC ACCTGCAGM ATGGGACGGG 300
CMGAGACCA CACTTGTGCG GGAGCTMTT GATGGAAMC TCATCCTGAC ACTCACCCAC 360GGCACTGCAG TTTGCACTCG CACTTATGAG AMGAGGCAT GA402设计H-FABP全长弓I物分别为SEQ ID NO: 3和4所示H-FABP-1 :5，-CATGCCATGGTGGACGCTTTCCTGGG-3’H-FABP-2 :5’ -CCGCTCGAGTTATCATGCCTCTTTCTCATAAGTGCG-3’引物分别含酶切位点H-FABP-1=NcoI ；H-FABP-2 :XhoI。由 Invitrogen 公司合成各 20D。 通过Trizol Reagent法提取心脏组织T-RNA :称取2g心脏组织，液氮中研磨至粉末状，加入2μ L Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；12000rpm离心5min，留取上清；按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿,震荡混勻后室温放置15min ；4°C, 12000rpm离心15min ;吸取上层水相至另一离心管中；按O. 5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混勻，室温放置 5-10min ;4°C, 12000rpm离心 IOmin,弃上清,RNA沉于管底；按 lmL75% 乙醇/mL Trizol加入75%乙醇，温和震荡离心管重悬沉淀；4°C，8000rpm离心5min，弃尽上清，室温晾干或真空干燥5-10min ;用50 μ L DH20, 55_60°C水浴放置5_10min。取10 μ L用紫外分光光度计测OD值定量RNA浓度。通过逆转录获得心脏cDNA，逆转录体系变性后的RNA12 μ L，5 X RT Buffer2 μ L, dNTP Mixturel μ L, RNase Inblbitorl μ L, ReverTraAcel μ L,瞬间离心得心肌组织cDNA。通过PCR扩增获得人H-FABP，PCR体系模板I μ L，引物3’ I μ L，引物 5，IyL, 2 X Taq plus, 12. 5 μ L，DH209. 5 μ L，设置五个退火温度 62°C、61°C、60°C、59°C、58°C，进行PCR。取25 μ L PCR产物1%TAE电泳进行分析(图1)。使用北京天根的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱型)回收PCR产物向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L平衡液BL，1200rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液；将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶中加入3倍体积溶胶液PN (终体积600-800μ L)，50°C水浴放置lOmin，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保充分溶解。注胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因吸附柱在较高温度时，结合DNA的能力较弱；将上一步所得溶液加入平衡后的CA2吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将CA2放入收集管中；重复上述漂洗步骤；将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温或37°C数分钟，彻底的晾干以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；将吸附柱CA2放入到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40-50 μ L洗脱缓冲液EB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液；将收集的DNA溶液吸取后，再滴加到吸附膜上，重新洗脱一次，即得扩增出的H-FABP基因片段。2) H-FABP重组质粒构建及酶切鉴定将pET_28a载体及H-FABP全长基因分别用Ncol和Xhol双酶切消化Ih后用T4DNA连接酶4°C过夜连接，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5a菌200μ 1，冰浴，吸取I μ I连接产物加入管中，转化DH5 a菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42°C水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800 μ I室温的无抗LB培养液混匀，37°C摇床220rpm振荡培养lh, 4000rpm离心后弃800 μ I上清，将菌液混匀后涂于含卡那霉素的LB培养板上，37°C恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基扩大培养过夜。
提取质粒5mL菌液IOOOrpm离心lmin,弃去培养液，加入250 μ L Solution I/RNase A重悬菌体；加入250 μ L Solution II，轻轻颠倒数次后，静置2min，浑浊的菌液变澄清黏稠;加入350yL Solution III,轻轻颠倒，出现白色絮状沉淀；IOOOrpm离心IOmin ;上清转入HiBind Miniprep Column (I)(已装入收集管中)，IOOOrpm离心lmin,弃掉废液；加A 500 μ L buffer HBlOOOrpm 离心 lmin ;弃掉废液，加入 700 μ L DNAwash buffer, IOOOrpm离心lmin，重复洗涤一次；弃掉废液，空柱13000rpm离心2min ;换新的1. 5EP管为收集管，加入 30 μ L Elution buffer,室温放置 2min, 13000rpm 离心 lmin,收集质粒，_20°C保存。取16 μ I质粒用Ncol和XhoI双酶切后跑1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切反应体系为=H-FABP 重组质粒 DNA16 μ 1，Ncoll μ 1，XhoIl μ 1，10Xbuffer2y 1，37°C 水浴 lh，在约400bp处可见特异性条带,表明pET28a质粒中已插入大小约为400bp的片段(图2)。3) H-FABP重组质粒目的片断测序将PET28a-H_FABP重组质粒送往上海英骏公司测序，并应用Vector5. O工具将测序结果与GeneBank的H-FABP序列进行同源性分析。测序的结果显示，插入片段长度为402bp,与GeneBank中报道的H-FABP序列完全一致。4) H-FABP重组蛋白的诱导表达及鉴定(I)转化 BL21 菌取上次提取测序正确的H-FABP重组质粒转化BL21 (DE3)菌，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37°C培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB液体培养基扩大培养。(2) H-FABP重组蛋白的诱导表达选取LB液体培养基扩大培养的转化PET28a-H_FABP重组质粒的BL21菌，测细菌OD值达0. 6-0. 8时加 入终浓度为lmmol/L的IPTG，诱导6h收集诱导的细菌，用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为15kD的特异性蛋白条带，与预期H-FABP的分子量值相符，细菌裂解物沉淀中在对应的位置发现特异蛋白条带，证实H-FABP蛋白为可溶性表达(图3)。5) H-FABP重组蛋白的纯化挑取单克隆重组LB菌，将高表达菌株在扩大培养并诱导，将得到的表达菌用20mmol/L pH7. 4的PBS混匀后超声破菌，8000rpm离心20min收集沉淀，且沉淀用20mL20mMTris · Cl pH8. O充分重悬，悬液缓慢滴入加入约IOOmL包涵体溶解液(20mM磷酸钠，0. 5MNaCl，8M尿素，pH7. 4)中，磁力搅拌溶解数小时(视溶解情况而定)，6000rpm离心20min取上清，0.45 μ m滤膜过滤。将溶解的包涵体蛋白与复性液(0. 05M Tris Cl pH8. 5, ImM EDTA,ImM还原型谷胱苷肽，0.1mM氧化型谷胱苷肽，0. 5M精氨酸，0. 15M NaCl)按1:1比例混合后，于4°C放置2h后，装入透析袋，用0. 02M Tris. Cl溶液pH8. 0，4°C透析过夜，期间需更换液3-4次。复性后的蛋白溶液，用0.45μπι滤膜过滤后进行纯化。使用阴离子交换层析柱(Amersham ΧΚ16/20)纯化重组蛋白(图4)。收集得到成品蛋白，然后分别取样行SDS-PAGE电泳(图5)，经HPLC检测其纯度为95%。6) H-FABP重组蛋白浓度、纯度鉴定(I)Lowry法(Folin酚法)测定H-FABP蛋白质含量Lowry法测定重组蛋白浓度1)绘制标曲线。取6个1. 5mL EP管，分别标号为O、1、2、3、4、5，依次配置标准蛋白质(BSA，250y g/mL)溶液浓度为 0、50、100、150、200、250 μ g/mL，并分别加入甲试剂(A液B液=100:1) 500 μ L混合，37°C放置IOmin，分别加入50 μ L乙试剂，立即混合均匀，30min后在650nm波长下比色，以双蒸水为对照管调零，分别测定不同浓度的标准蛋白质的光吸收值。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，由计算机自动绘制标准曲线。将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A260值和A280值。根据公式，蛋白浓度C= (1.45XA280-0. 75 X A260) X稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25-250 μ g范围，按照上表的操作程序反应，测定出650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，在乘以稀释倍数计为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为O. 48g/ml。7 )胶体金试纸条法鉴定重组H-FABP蛋白分子采用胶体金快速检测试纸条检测重组蛋白，重组蛋白能被快速检测试纸条检出，呈强阳性，试纸条对1%BSA检出呈阴性。H-FABP重组蛋白特异性满足实验要求。8) Western blot 鉴定重组 H-FABP 蛋白分子15%SDS_PAGE电泳。电泳操作方法同上述；转膜。首先切PVDF左上角作标记，然后将PVDF膜于无水甲醇中浸泡30s活化膜，之后转印液中浸泡15min，同时将滤纸也浸入转移液中。然后将SDS-PAGE凝胶卸下，保留分离 胶，在转移液中稍稍浸泡一下，按顺序铺上滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE凝胶、滤纸。用玻璃棒逐出气泡，设置恒流180mA，湿转90min ;封闭。先漂洗，O. 1%TBSTX2次，IOmin/次。封闭封闭液封闭2h ;孵育一抗用抗体稀释液按照I 4000稀释H-FABP单克隆抗体，4°C过夜；孵育二抗先漂洗0. 1%TBSTX4次，15min/次。孵育二抗羊抗鼠抗体稀释液1:10000稀释，室温摇晃2h ;显色。先漂洗0. 1%TBSTX4次，15min/次。显色Millipore Chemilaminescent HRP Substrate A 液 500 μ L, B 液 500 μ L，混勻后，膜的正面显色30s ;曝光暗室曝光IOs,显影lmin,定影lmin,漂洗3min ;凝胶图像分析系统扫描。于抗H-FABP单克隆抗体结合H-FABP蛋白处可见清晰条带(图6)。实施例2.生物信息学分析及检测靶点的确定I)从GENEBANK中查找H-FABP蛋白的氨基酸序列，该蛋白由133个氨基酸残基组成。2 )在线分析H-FABP蛋白中潜在的B细胞表位区域，综合考虑蛋白质的二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，对各区段进行分析评分，选取得分最高的一个区域作为候选B细胞表位区域，为32aa-47aa (肽1，氨基酸序列为SEQ ID N0:2表示QVASMTKPTTIIEKNG)实施例3.抗H-FABP单克隆抗体的制备I)表位肽的合成与交联 化学合成H-FABP B细胞表位肽I，纯化后与BSA交联，得到H-FABP-肽1-BSA2) H-FABP单克隆抗体的制备将合成回来的H-FABP表位肽与BSA的交联产物和重组蛋白H-FABP与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠，进行基础免疫(100 μ g/ml)。2周后，将H-FABP全抗原与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只Balb/c小鼠，进行追加免疫(100 μ g/ml) ；2周后,再采用同样方式追加免疫一次,7天后处死取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8 :1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6%C02中在37°C培养。用ELISA法进行筛选。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆，并置于6%C02中于37°C培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行扩大培养。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡O. 5mL，I周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4 X IO5个/mL,每只Balb/c小鼠腹腔注射O. 5mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。3) H-FABP单克隆抗体的纯化收集腹水后对其进行纯化，具体方案为配置抗体纯化所需buffer =BindingBuffer (A 液))20mmol/L 憐酸钠,0. 8mol/L(NH4)2S04, pH7. 5 ；Elution Buffer (B 液)20mmol/L 憐酸钠，pH7. 5 !Regeneration buffer (C 液):20mmol/L 憐酸钠,pH7. 5,并按体积比30%加入异丙醇；在单抗腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致，
O.45 μ m滤膜过滤等待上样；选用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白纯化仪，A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7. 0-8. O,将抗体分装冷冻于-20°C保存；用regeneration buffer使填料进行再生，然后用binding Buffer进行平衡即可。4)抗H-FABP单 克隆抗体亚类的鉴定米用美国SIgGa 公司 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ReagentsCELISA/Ouchterlony Double Diffusion, StockNo.1S0_2L0T114k4817),操作按说明书进行。a.包被酶标板用包被液将H-FABP重组蛋白稀释为最佳工作浓度5 μ g/mL,每孔加IOOyL抗原液，每株加12孔，于4°C过夜，洗涤5遍，空干。b.封闭每孔加封闭液35(^匕371孵育111 1.511，洗涤5遍，空干。c.每孔加入100 μ I新鲜的杂交瘤细胞培养上清或稀释单抗，室温(20°C 25°C)静置lh，摇洗3min，共5次。d.用抗体稀释液以1:2000稀释IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG、IgA。e.每孔加入100 μ L已稀释的抗体，每种抗体均加2孔，室温静置30min，摇洗3min，共5次。f.每孔加入100 μ L1:1000稀释的兔抗羊IgG抗体，室温静置15min，摇洗3min，共5次。g.每孔加入100 μ L底物显色液，室温避光反应IOmin 15min。h.每孔加入50 μ L终止液,观察结果,确定Ig亚类。5)单克隆抗体亲和力鉴定以Friguent法测定亲和力常数，将H-FABP抗原溶解在0. 05mol/L碳酸缓冲液(pH9. 6)中，终浓度为I μ g/ml,以每孔100 μ I的量将溶液加到96孔板中4°C包被过夜，以含1%BSA的PBS溶液对板进行封闭,将板干燥后在4°C保存备用。反应系统的建立反应系统中抗H-FABP单抗的初始浓度为20ngmL。H-FABP抗原的初始浓度从1000ng/ml (1250x 10mol/L)往下倍比稀释，形成8个/反应系统，在37°C反应Ih ;以每孔IOOul将反应液以双孔加入到包被了 H-FABP抗原的免疫反应板，37°C孵育Ih后洗板5次；加人100 μ I山羊抗鼠二抗每结合物溶液37°C反应lh，洗板5次，加人底物显色15min后加人终止液，测定D450值计算各个反应系统的抗原结合率推算亲和力常数，得出 C2012140 亲和力为 6. 53X IO8IT1, C2012139 为 9. 02X IO9M^106) ELISA鉴定抗H-FABP单克隆抗体将纯化的H-FABP抗原用包被稀释液稀释至5 μ g/ml，ELISA条板每孔加入100 μ 1，4°C包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将单克隆抗体1E6作1:1000，1:2000，1:4000，
1:8000,1:16000......，按100 μ I/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37°C孵育
Ih,洗板，加入二抗，1:3000HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100 μ I/孔加入对应条孔中，37°C孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100 μ I/孔，避光显色IOmin,加入终止液50 μ I/孔。结果可见，抗H-FABP单克隆抗体C2012140和C2012139呈现肉眼可见的浓度梯度(图7、图 8)。7)抗H-FABP单克隆抗体的Western blot鉴定a.将 Marker3 μ1、H-FABP 抗原 20 μ1、心肌匀浆 20 μ I, MIF20 μ I 电泳。b.电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡lOmin。c.将0.22μπι PVDF膜先用无水甲醇处理20s,再用ddH20洗漆5min。然后再浸入Transfer Buffer超过5min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。d.转膜从下至上依次排列滤纸PVDF膜-胶滤纸,排出气泡,放入转膜仪，18V恒压电转移1.5h。e.转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH20清洗两遍，TBST洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。f.弃去封闭液，用I X TBST漂洗膜3次，每次15min。g.加入以1: 1000稀释的纯化抗体，4°C孵育过夜。h.1XTBST漂洗膜3次，每次15min。1.加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37°C孵育3h。j. 1父1831'洗涤3次，每次151^11。k.用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。于天然H-FABP和重组H-FABP蛋白处均可见抗H-FABP单克隆抗体结合清晰条带(图9、图10)。实施例4.双抗体夹心ELISA法检测标准中的H-FABPI) HRP标记抗体本法是以NaI04先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下称取IOmgHRP酶，加2mL纯水配置为5mg/ml的HRP液体，按照每mgHRP酶加入34 μ L计算，加340 μ LNaI04，4°C避光放置，Ih后，按照每mgHRP酶加入250 μ L的量加入乙二醇250 μ L，避光放置4°C，30min后转入透析袋中，用ImM醋酸缓冲液(pH4. 0-4. 4)透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。抗体的准备
O.OlM的PBS缓冲液进行4°C透析过夜，并测定蛋白浓度。标记抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合，加入lmol/LNa2C03缓冲液(1:80)，调解反应的pH为9. 5，25°C反应2_3h。终止新鲜配制O. lmol/LNaH4B (4mg/mL),按照每mgHRP酶加入47 μ I。4°C放置2h后,转入透析袋。用O. OlmolPBS缓冲液(pH7. 0-7. 2)透析过夜，期间至少换液两次，避光。分装保存标记好的抗体用避光EP管分装，并测定抗体效价。_20°C保存。2)抗体配对及临床样本的检测标本收集每天定时从新桥医院收集临床肌红蛋白阳性血清标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，做好标记分装于1. 5ml Ep 管中，-80°c保存，并将病人基本信息录入电脑，做好编号。2)标本检测
选取单克隆抗体3-H5作为捕获抗体，酶标单克隆抗体1-F10作为检测抗体，重组蛋白H-FABP为标准品，样本检测方法如下a.包被酶标板用包被液将抗体稀释为5 μ g/ml，每孔加100μ 1，4°C包被过夜。b.将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。c.封闭每孔加封闭液350μ 1，37°C孵育lh，洗涤3遍，甩干。d.用抗体稀释液将H-FABP重组蛋白从500ng/ml开始倍比稀释，每孔加100μ 1，第一孔为空白对照，做标准曲线。检测26例AMI标本，34例正常标本，每孔加100μ 1，37°C孵育lh。e.洗板3遍，甩干。f.将相对应的酶标二抗以1:5000稀释,每孔加入100 μ I, 37°C孵育30min。g.洗板5遍,甩干。h.每孔加入100 μ I底物显色液，室温避光显色5min。1.每孔加入50 μ I终止液，读板，根据标准曲线确定临床样本中H-FABP的含量。3)统计学分析运用SPSS13. O软件将心梗组合正常对照组用ELISA所测H-FABP结果进行统计学分析。结果表明，利 用配对抗体3-Η5 — 1-F10和H-FABP重组蛋白标准品成功绘制了标准曲线(图11)，并且在对36例正常血清和24例AMI患者血清检测时发现，24例AMI患者(56. 2136±24· 0427ng/ml)显著高于 36 例正常血清(3. 7573±2· 1300ng/ml;P<0. 01)(图12)，说明配对抗体能够成功应用于天然血清中H-FABP的检测。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种产生抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为 C2012139。
2.—种产生抗人心脏型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为 C2012140。
3.根据权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株，其分别由SEQID NO:1和SEQID NO: 2所示的氨基酸序列免疫Balb/c小鼠后脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。
4.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚类属于 IgG2a。
6.一种由权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚类属于 IgG2b。
8.权利要求4所述的单克隆抗体在制备心肌梗死诊断或检测制剂中的应用。
9.权利要求6所述的单克隆抗体在制备心肌梗死诊断或检测制剂中的应用。
10.权利要求4和6所述的单克隆抗体在制备心肌梗死诊断或检测制剂中的应用。
11.一种用于诊断或检测心肌梗死的制剂，其特征在于，其包含权利要求4和/或6所述的单克隆抗体。
12.一种用于诊断或检测心肌梗死的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求4和6所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了杂交瘤细胞株1-F10(保藏号C2012139，保藏单位武汉大学)、3-H5(保藏号C2012140，保藏单位武汉大学)及其产生的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体。通过对H-FABP蛋白中抗原表位的预测，制备了抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株1-F10和3-H5，可以分泌相应的检测用抗体，杂交瘤细胞株1-F10和3-H5所分泌的抗H-FABP单克隆抗体的亚类分别是IgG2a和IgG2b。应用细胞株3-H5和1-F10产生的抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，能够成功检测出健康人与心肌梗死患者血清中H-FABP的区别，可以开发出特异性好、精准度高的早期诊断急性心肌梗死的诊断试剂。
文档编号C07K16/18GK103045541SQ20121042817
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者李淑慧, 胡川闽, 易维京, 韩起 申请人:中国人民解放军第三军医大学