专利名称：石杉碱甲的单克隆抗体制备方法及其酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫化学及分析生物技术领域，尤其涉及石杉碱甲的单克隆抗体制备方法及其酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
石杉碱甲(huperzine A, HupA),是从石杉科石杉属植物蛇足石杉[Huperzinaserrata(Thumb. )Trev]的酹性部分中提取的一种新型石松类天然生物碱。作为第二代乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)抑制剂,具有高效、高选择性、可逆性等特点。目前石杉碱甲主要用于阿尔兹海默病(alzheimer’s disease, AD)的治疗,可显著改善记忆功能损伤和行为与心境障碍。国内外学者研究证实，石杉碱甲对血管性痴呆(vascular dementia, VD)、智力低下、精神分裂症、重症肌无力等患者有一定的治疗作用。石杉属植物以石杉碱甲作为药用成分的定量指标，目前最常用的检测方法有薄层扫描法(TLCS)、紫外分光光度法(UV)、核磁共振波谱法(NMR)、高效液相色谱法(HPLC)及其联用技术等，但存在对实验室和仪器化程度要求高，将待测成分从样品中分离提取并去除共存杂质干扰的前处理过程十分复杂，需经提取、分离、纯化和衍生等复杂的样品前处理，并且操作费时，分析成分昂贵，不利于推广使用，难以适应批量样品的快速筛选和检测。因而寻求一种快速、简便、灵敏并且经济实用的分析方法为当前研究的方向。免疫分析法是利用抗原与抗体的特异性结合反应为基础的分析技术，以抗体为核心试剂，具有高选择性、高灵敏度、稳定性强及简单方便经济等特点。国内外已发明各种快速检测试剂盒且技术成熟，可用于微量样品的检测。目前国内外所采用的基本上都是酶联免疫吸附试验(enzyme-1 inked immunosorbentassay, ELISA),它有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，适合复杂物质的分析。国内外有报道采用杂交瘤技术制备中药中有效成分的单克隆抗体，建立以单克隆抗体为基础的免疫分析方法，可用于大规模生产的中药质量控制，中药活性成分的体内药物分析，以及鉴定中药原料并检测其农药残留情况。该技术已被应用于甘草酸、灵芝多糖、柴胡皂苷、人参皂苷等中药有效成分，目前基于抗原抗体反应的酶联免疫分析法逐渐成为药用植物和中药质量控制的一个重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种石杉碱甲含量检测的酶联免疫吸附测定方法，利用制备的石杉碱甲人工抗原免疫动物，将免疫小鼠的皮细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备抗石杉碱甲的单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫检测试剂盒检测石杉碱甲的含量，方法简便易行。本发明的技术方案为提供一种石杉碱甲单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤步骤I利用戊二醛法合成石杉碱甲人工抗原，所述石杉碱甲人工抗原的结构如结构式I所示
权利要求
1.一种石杉碱甲单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤I利用戊二醛法合成石杉碱甲人工抗原，所述石杉碱甲人工抗原的结构如结构式I所示
2.根据权利要求I所述的石杉碱甲单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤I具体为将半抗原石杉碱甲与戊二醛搅拌反应2h ;另取含BSA的0. OlM pH 7. 2磷酸盐缓冲溶液PBS与上述溶液继续搅拌2-3h ;加入硼氢化钠继续搅拌Ih ;然后用蒸馏水或0. OlM pH7.2的PBS透析4-5天；离心得到上清液，即得免疫原；所述的半抗原石杉碱甲与BSA的质量比为3 8。
3.如权利要求I所述的石杉碱甲单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为 步骤21将步骤I所得石杉碱甲人工抗原即免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积乳化后，皮下、肌肉多点免疫Balb/c小鼠，每两周加强免疫一次，免疫4-6次，检测其效价； 步骤22将效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG下融合，获得阳性杂交瘤细胞，并采用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆； 步骤23采用小鼠体内诱导法生产单克隆抗体，将阳性杂交瘤细胞注入预先腹腔注射液体石蜡的小鼠腹腔内，7-10天，腹腔下围穿刺回收腹水； 步骤24采用辛酸硫酸铵沉淀法、免疫亲和层析法(protein G层析柱)纯化抗体，检测抗体效价和纯度。
4.一种石杉碱甲酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括96孔酶标板、石杉碱甲包被抗原、包被缓冲液、封闭液、石杉碱甲标准溶液、抗石杉碱甲单克隆抗体、酶结合物工作液、显色剂、洗涤液、终止液； 所述石杉碱甲包被抗原的结构如结构式I所示 所述结构式I中，R为BSA、OVA、KLH、HSA, BSA是牛血清白蛋白，OVA是卵清蛋白，KLH是钥孔血蓝素，HSA是人血清白蛋白； 所抗石杉碱甲单克隆抗体由权利要求1-3任一项所述的石杉碱甲单克隆抗体的制备方法制得。
5.根据权利要求4所述的石杉碱甲酶联免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述包被缓冲液为PH 9. 6的碳酸盐缓冲液； 所述封闭液为质量百分数为5%的脱脂奶粉； 所述酶结合物工作液为辣根过氧化物标记的羊抗鼠稀释液； 所述显色剂包括显色A液和显色B液，所述显色A液为四甲基联苯胺，显色B液为磷酸-柠檬酸缓冲液； 所述洗涤液为0. OlM pH 7. 2-7. 4的磷酸盐吐温缓冲液； 所述终止液为2M的硫酸溶液。
全文摘要
本发明涉及免疫化学及分析生物技术领域，尤其涉及石杉碱甲的单克隆抗体制备方法及其酶联免疫检测试剂盒。本发明的目的是提供一种石杉碱甲含量的ELISA检测和分析方法，利用制备的石杉碱甲人工抗原免疫动物，将免疫小鼠的皮细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备抗石杉碱甲的单克隆抗体，制备石杉碱甲的酶联免疫检测试剂盒检测石杉碱甲的含量。本发明有益效果本发明特异性强，样品前处理简便，灵敏度高，便于进行现场监测。所需仪器设备简单，检测成本低、时间短、过程简化，样品量少，实用性强，可以满足中医药开发利用及其有关研究单位批量检测相关植物体内石杉碱甲含量的需要。
文档编号C07K16/16GK102977210SQ201210462298
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者余宇燕, 吴水生, 滕海英, 邹艳辉 申请人:福建中医药大学