一种融合多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

一种融合多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种融合多肽，是由多肽Ⅰ和多肽Ⅱ构成的融合多肽，其中，多肽Ⅰ为一段NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示的序列之一或其组合；多肽Ⅱ为HIV-TAT蛋白转导域，其序列如SEQIDNO.1所示。本发明的融合多肽，为针对于DYRK1A磷酸化的NFAT2的竞争性抑制剂，体外试验表明该融合多肽可以使肿瘤细胞中NFAT2蛋白水平下降，从而抑制肿瘤细胞的迁移。本发明为抗肿瘤新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路。
【专利说明】一种融合多肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能抑制DYRK1A对T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NAFT)蛋白表达和转录活性的作用的融合多肽，及其应用，属于生物医药技术领 域。

【背景技术】
[0002] 肿瘤是危害人类健康的头号杀手。恶性肿瘤细胞的快速生长和向周围组织器官的 侵润及远处转移是肿瘤导致病人死亡的主要原因。抑癌基因所编码的蛋白具有抑制肿瘤生 长和抑制肿瘤侵袭转移的功能，成为抗肿瘤药物的候选药物。多肽药物由于分子小、易合 成、构效关系研究较容易、易被改造以及针对性强和疗效明显等优势，得到了广泛的关注。 近年来，随着生物技术及多肽合成技术的不断改进，多肽药物的纯度高、毒副作用低、几乎 没有免疫原性且合成成本较低，产业化开发优势明显，故多肽药物的适应症广泛且疗效显 著，有广泛的应用市场。目前，世界范围内已有超过60多种多肽药物被批准上市，另外 有大量的多肽药物已进入或是完成临床研究。多肽药物市场发展迅速，年增长率达20%， 为制药企业带来了丰厚利润，这预示着未来治疗类多肽药物的市场供求会有巨大的提升。
[0003] 活化 T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cell, NFAT)是一类与转 录密切相关的因子，普遍表达在多种哺乳动物细胞和组织内，能够参与调控淋巴细胞的发 育和活化、心肌细胞的分化等过程中重要基因的表达。NFAT家族作为细胞内多信号转导通 路的基础分子，在调节肿瘤细胞转化和生长、肿瘤血管生成、肿瘤转移等方面也发挥着重要 的作用。
[0004] NFAT 家族包括 5 名成员：NFAT1 (NFATc2, NFATp), NFAT2 (NFATcl, NFATc)， NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATc3, NFATx)和 NFAT5 (TonEBP, OREBPhNFAT信号活化的 方式主要表现为核转位以及与DNA结合，通过与其他结合分子相互协同，调节多种目的基 因的表达。NFAT作为细胞信号转导中一种重要的中间途径因子，其活化状态对于成纤维细 胞增殖和存活、肿瘤上皮细胞浸润和迁移、内皮细胞生长和血管生成都非常重要，针对NFAT 的干预有可能成为人类肿瘤临床治疗的重要途径之一。中国专利CN102805867A公布了转 录因子NFATc3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用。实验结果表明，NFATc3抑制 齐[J(CFK-506、CyclosporinA、VIVIT)对肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且上 述抑制剂本身在使用剂量范围内毒副作用很小。
[0005] 双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A (DYRK1A)，位于HSA21q22. 2中，是果蝇 minibrain基因在哺乳动物中的同源基因。DYRK1A包括转录因子（FKHR / Fox01，STAT3， CREB1)，剪接子（CyclinL2,3Bl，SF2/ASF)，蛋白质合成起始因子eIF2B和参与染色体结合 功能的蛋白质如动力蛋白、两性蛋白、突触伸蛋白和突触核蛋白。研究证明DYRK1A降低 NFAT1、NFAT3和NFAT4的转录活性（21号染色体上DSCR1和DYRK1A剂量增加引起NFAT调 节异常·冷(2006)441: 595-600 (Arron JR, Winslow MM, Polleri A, Chang CP, Wu H, Gao X, Neilson JR, Chen L, Heit JJ, Kim SK, Yamasaki N, Miyakawa T, Francke U, Graef IA, Crabtree GR (2006) NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Tfeiare1 441: 595-600);果妮全基因组 RNAi 扫描确定 NFAT的调节子DYRK激酶家族.冷(2006) 441: 646-650)。NFAT2具有致癌活性（NFAT 转录因子作为致癌基因和抑癌基因的双重角色.分子细胞生物学（2006)28: 7168-7181) Gwack Y, Sharma S, Nardone J, Tanasa B, Iuga A, Srikanth S, Okamura H, Bolton D, Feske S, Hogan PG, Rao A (2006) A genome-wide Drosophila RNAi screen identifies DYRK-family kinases as regulators of NFAT. Tfeitfre 441: 646-650)。在某些肿瘤如 伯基特淋巴瘤和胰腺癌中可观察到NFAT2的激活。目前尚无文献报道DYRK1A是否磷酸化 NFAT2或者影响后者的活性。
[0006] HIV-TAT蛋白转导域为一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度为几个至 几十个氨基酸不等，多数小于20个氨基酸，被命名细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs)。细胞穿膜肽也被称之为蛋白转导域（protein transduction domain，PTD),或Trojan horse peptides,可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受 体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，且在一定浓度范围内不会造成细胞损 伤。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类，细胞穿膜肽的研究始于1988年，Green 和Frankel分别证实HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1997 年，Vives等发现HIV-TAT中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密 切相关天然存在的CPPs。


【发明内容】

[0007] 针对上述现有技术，本发明提供了一种融合多肽，其能抑制DYRK1A对NAFT2蛋白 表达和转录活性，从而可达到抗肿瘤的目的。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种融合多肽，是由多肽I和多肽II构成的融合多肽，其中，多肽I为一段NFAT2上的 特异性氨基酸序列，其作用为：进入细胞内部后，选择性与DYRK1A结合，与NFAT2蛋白竞争 DYRK1A，从而降低DYRK1A对NFAT2的磷酸化作用，降低DYRK1A促进NFAT2的作用，而NFAT2 可促进肿瘤细胞增长，降低NFAT2的磷酸化后，可抑制肿瘤细胞的迁移；多肽II为HIV-TAT 蛋白转导域，其序列如SEQ ID NO. 1所示，其作用为：跨膜传递。多肽I的N-末端与多肽II 的C-末端的氨基酸缩合形成肽键。
[0009] 所述NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3或SEQ ID NO. 4所示的序列之一或其组合。相对应地，融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7所示(对应于NFAT2上的特异性氨基酸序列分别为SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的序列）。
[0010] SEQ ID NO: 1 (HIV-TAT 蛋白转导域序列）： 三字符缩写：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg ; 单字符缩写：YGRKKRRQRRR。
[0011] SEQ ID NO ：2 (NFAT2-1)： ：Ala-Arg-Ser-Ser-Arg-Pr〇-Ala-Ser-Pr〇-Cys-Asn-Lys-Arg-Lys-Tyr ； 单字符缩写：ARSSRPASPCNKRKY。
[0012] SEQ ID NO :3 (NFAT2-2): ：Asn-Gly-Arg-Gln-Pr〇-Pr〇-Tyr-Ser-Pr〇-His-His-Ser-Pr〇-Thr-Pro ； 单字符缩写：NGRQPPYSPHHSPTP。
[0013] SEQ ID NO :4 (NFAT2-3): ：Pr〇-Lys-Pr〇-Leu-Ser-Pr〇-Thr-Ser-Tyr-Met-Ser-Pr〇-Thr-Leu ； 单字符缩写：PKPLSPTSYMSPTL。
[0014] SEQ ID NO :5 (融合多肽 TAT-NFAT2-1): 三字符缩写： Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ser-Ser-Arg-Pr〇-Ala-Se r-Pr〇-Cys-Asn-Lys-Arg-Lys-Tyr ； 单字符缩写：YGRKKRRQRRRARSSRPASPCNKRKY。
[0015] SEQ ID NO :6 (融合多肽 TAT-NFAT2-2): 三字符缩写： Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Asn-Gly-Arg-Gln-Pr〇-Pr〇-Tyr-Se r-Pr〇-His-His-Ser-Pr〇-Thr_Pro ; 单字符缩写：YGRKKRRQRRR NGRQPPYSPHHSPTP。
[0016] SEQ ID NO :7 (融合多肽 TAT-NFAT2-3): 三字符缩写： Tyr-Gly-Ar-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pr〇-Lys-Pr〇-Leu-Ser-Pr〇-Thr-Se r-Tyr-Met-Ser-Pr〇-Thr-Leu ； 单字符缩写：YGRKKRRQRRR PKPLSPTSYMSPTL。
[0017] 所述融合多肽，制备时，常规方法人工合成，或使用重组表达系统的合成方法合成 即可。均为现有技术中的成熟技术。如采用固相合成方法，所述融合多肽的合成可以使用 用于有机合成的设备来进行。该方法为Merrifield的固相合成方法（J. Am. Chem. Soc. 85， 2149-21,54,1963)，在该方法中，使用半自动肽合成仪（Peti-Syzer Model PSS-510)通过 使位于C-末端和N-末端的氨基酸发生缩合来合成所述融合多肽。
[0018] 具体的，所述固相合成是从多肽的羧基末端开始的，通过将一个α氨基被保 护的氨基酸偶联到适当的树脂上。本文中，所述α氨基被保护的氨基酸通过酯键被偶 联到羟甲基树脂或者氯甲基树脂上。使用Fmoc(9-芴甲氧羰基）作为α氨基的保护 基团，并且Fmoc-保护的氨基酸可以从Beadtec Company商购获得。例如，精氨酸的氨 基是有活性的。使用被适当的基团如叔丁基（t-Bu)或者2,2,5,7,8_五甲基二氢吡 喃-6&6]1丨311161：1171〇111'01]^11-6，？111〇-6)保护的？1]10〇-氨基酸，作为甘氨酸、赖氨酸或者谷氨 酰胺的活性残基。在肽的这种合成方法中，将用于连接到固体支持物树脂上的肽链的氨基 末端的保护基团，随后用试剂一例如，三氯乙酸（TFA)或者酚除去。所述肽可以用二乙醚 在TFA溶液中进行萃取并被分离出来，并且可以通过高效液相色谱（HPLC)来纯化。
[0019] 使用生物方法来制备融合多肽的方法步骤如下：(a)将所述融合多肽的基因克隆 到能够表达特定肽的表达载体PPET中，以制备能够表达所述融合多肽的重组载体；使用所 述的pPET-PTD-SBS(VBD)表达载体在大肠杆菌中表达大量的重组转运蛋白-PTD-SBS(VBD) 肽，然后分离和纯化表达的肽。在这一点上，编码所述融合多肽的用于制备重组载体的碱基 序列可以容易地由本领域的技术人员从本文公开的氨基酸序列中推导出来。此外，用于插 入所述碱基序列的克隆载体的选择方法和一般的技术详细资料、使用克隆技术制备的重组 表达载体、使用重组载体进行转化以表达靶融合多肽的宿主细胞、用重组载体对所述宿主 细胞进行转化的方法、在转化的宿主细胞中表达所述靶融合多肽的方法、以及从得到的产 品中收集所述靶融合多肽的方法，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
[0020] 本发明还提供了上述融合多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0021] 优选的，所述肿瘤可以是淋巴瘤、神经胶质瘤等肿瘤，最优选神经胶质瘤。
[0022] 本发明还提供了一种包含上述融合多肽的药物组合物，该药物组合物除含有上述 融合多肽外，还进一步地包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
[0023] 上述融合多肽、药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用。具体应用 时，上述融合多肽注射到肿瘤局部或通过系统给药到达肿瘤部位后，可发挥抗肿瘤效应。
[0024] 本发明的融合多肽具有抗肿瘤活性的作用原理为：在HIV-TAT的作用下，融合多 肽被带入细胞内部，然后NFAT2上的特异性氨基酸序列与NFAT2蛋白竞争DYRK1A，降低 DYRK1A对NFAT2的磷酸化作用，进而降低DYRK1A促进NFAT2的作用，而NFAT2能够促进肿 瘤细胞的增长，降低NFAT2的磷酸化后，可抑制肿瘤细胞的迁移。本发明的融合多肽作为针 对于DYRK1A磷酸化的NFAT2的竞争性抑制剂，体外试验表明该融合多肽可以使肿瘤细胞中 NFAT2蛋白水平下降。本发明为抗肿瘤新药的设计提供了新的靶点，为肿瘤多药耐药的逆转 提供了新的思路。

【专利附图】

【附图说明】
[0025] 图1 :NFAT2上的DYRK1A作用位点；其中，（A) :NFAT2的RPX(S/T)P结构域和截短 片段，AD :激活域；SRR :丝氨酸丰富序列；SP :丝氨酸-脯氨酸重复序列；SPRIEIT :钙结合序 列；NLS :核定位序列。（B) :NFAT2的截短片段和pCMV-DYRKlA共转染HEK293细胞，M2抗体 免疫杂交检测NFAT2蛋白；DY1A代表DYRK1A。（C):免疫沉淀实验研究NFAT2的截短片段和 DYRK1A的相互作用。（D) :NFAT2截短片段的丝氨酸突变体与pCMV-DYRKlA共转染HEK293 细胞，M2抗体免疫杂交检测NFAT2截短片段的丝氨酸突变体。
[0026] 图2 :DYRK1A在HEK293细胞中增加 NFAT2蛋白质的表达；其中，⑷： p-NFAT2mycflag 与 pCMV-DYRKlA 或 pGFP-V-RS-shDYRKlA 共转染 HEK293 细胞，M2 抗体免疫 杂交检测NFAT2蛋白。柱形图为电泳图量化结果。（B): pCMV-DYRKlA转染HEK293细胞， anti-NFAT2抗体免疫杂交检测内源性NFAT2蛋白。柱形图为电泳图量化结果。
[0027] 图3 :DYRK1A通过磷酸化作用影响NFAT2的泛素化和稳定性；蛋白酶抑制剂乳 胞素（lactacystin, lac)作用于转染 p-NFAT2mycflag 的 HEK293 细胞，NFAT2 的表达 同乳胞素之间的时间依赖（A)及剂量依赖（B)。（C)免疫共沉淀实验研究NFAT2和泛素 (ubiquitin，ubi)的相互作用。（D)免疫沉淀实验研究DYRK1A与NFAT2的相互作用。（E) 免疫沉淀实验研究DYRK1A和NFAT2的磷酸化水平。柱形图为电泳图量化结果。（F)免疫沉 淀实验研究DYRK1A和NFAT2的泛素化水平。柱形图为电泳图量化结果。
[0028] 图 4 :DYRK1A 增加 NFAT2 转录活性；p-NFAT2mycf lag 和 pCMV-DYRKlA (A)或者 pGFP-V-RS-shDYRKlA (B)共转染 HEK293 细胞，RT-PCR 检测 FasL，IL-2 和 TNF α 靶基因的 表达。图（Α)中的柱形图为电泳图量化结果。图（Β)中的柱形图为电泳图量化结果。（C) p-NFAT2mycflag，pIL2-luc 和 pCMV-DYRKlA 共转染 HEK293 细胞。转染 48h 后，双荧光素酶 检测。NF2 代表 NFAT2。DY1A 代表 DYRKlA，shDYlA 代表 shDYRKlA。
[0029] 图5 :DYRK1A高表达促进肿瘤细胞迁移，融合多肽TAN-NFAT2在肿瘤细胞中抑制 DYRK1A 对 NFAT2 的作用。p-NFAT2mycflag 和 pCMV-DYRKlA(A)或者 pGFP-V-RS-shDYRKlA (B)共转染HEK293细胞，transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。p_NFAT2mycflag 和 pCMV-DYRKlA 共转染 HEK293 细胞，转染后 24 小时加入 TAT-NF2-1 (C)、TAT-NF2-2 (D) 和TAT-NF2-3(E)融合多肽（20μΜ)，Μ2抗体检测NFAT2蛋白。图（C)中的柱形图为电泳图 量化结果。图（D)中的柱形图为电泳图量化结果。图（E)中的柱形图为电泳图量化结果。 p-NFAT2mycflag 和 pCMV-DYRKlA(F)共转染 HEK293 细胞，转染后 24 小时加入 TAT-NF2-1、 TAT-NF2-2和TAT-NF2-3融合多肽（20 μ M)，transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力。

【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0031] 实施例1 :融合多肽TAT-NFAT2的制备及纯化 (一）确定NFAT2上DYRK1A作用位点 1、DYRK1A作用底物(底物指DYRK1A可以磷酸化的蛋白，也就是靶蛋白）包含一个保守 的RPX (S/T) P结构域(即精氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-丝氨酸或苏氨酸-脯氨酸的氨基酸 序列)。如图1A所示，ClustalW2软件对NFAT2蛋白的序列分析显示其有三个类似的RPX(S/ T)P结构域。为确定NFAT2上DYRK1A的作用位点或者叫靶点，构建NFAT2载体(序列如SEQ ID Ν0. 27所示）和NFAT2缺失载体l-272aa(序列如SEQ ID Ν0. 28所示）、l-308aa (序列 如SEQIDN0·29所示）、l-433aa(序列如SEQIDN0·30所示）、307-716aa(序列如SEQID NO. 31 所示）和 424-716aa(序列如 SEQ ID NO. 32 所示）。
[0032] NFAT2载体构建如下，引物对（上游引物：5' -cgcggatccgccacc ATGCCAAGCACCAGCTTT-3'和下游引物 5'-ccgctcgag GAAAAAGCACCCCACGC -3'，其序列如 SEQ ID N0. 8、9所示）以人源cDNA (货号4352575 ;公司名称：ABI)为模板进行PCR扩增， 扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后连接入经BamH I和Hind III酶切、电 泳和回收后的pCMV6_mycflag载体，命名为p_NFAT2mycflag。
[0033] NFAT2 缺失载体 l-272aa、l_308aa 和 l_433aa 构建如下，引物 T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3，，其序列如 SEQ ID 勵.10所示）分别与引物 1-272(5'-(^8 ctcgagCTGCACCTCAATCCGMG-3'，其序列如SEQIDN0·ll所示)，引物l-308(5'-ccgctcgag GGTGTACTGGGTGGTGTT-3'，其序列如SEQIDN0·12所示），引物l-433 (5'-ccgctcgag GCCGTTGAGGCTGTACTT-3'，其序列如 SEQ ID N0. 13 所示）成对，以 p-NFAT2mycflag 质粒为 模板进行PCR扩增，扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后连接入经BamH I和 Hind III酶切、电泳和回收后的p-NFAT2mycf lag载体，分别命名为pNFAT2-l-272mycflag、 pNFAT2-l-308mycflag, pNFAT2-l-433mycflag〇
[0034] NFAT2 缺失载体 307_716aa 和 424_716aa 构建如下，引物 307-716 (5, -cgcgga tccgccaccatgCCGTATGAGCTTCGGATT-3'，其序列如 SEQ ID Ν0· 14 所示）和引物 424-716 (5'-cgcggatccgccaccatgTACACCAGCTCGGCCAT-3'，其序列如SEQIDN0·15所示）分 别与 XL39 引物（5' -ATTAGGACAAGGCTGGTGGG-3'，其序列如 SEQ ID NO. 16 所示）成对，以 p-NFAT2mycf lag质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物经BamH I和Hind III酶切、电泳和回 收后连接入经BamH I和Hind III酶切、电泳和回收后的p-NFAT2mycflag载体，分别命名 为 pNFAT2-307-716mycflag、pNFAT2-424-716mycflag。
[0035] pCMV-DYRKlA(这是一个DYRK1A的表达载体，目的是让DYRK1A在细胞里面高表达） 由本实验室构建（参见文献 Lu, Μ，Zheng, L·，Han, B·，Wang, L·，Wang, P·，Liu, H·， and Sun, X. (2011) The Journal of biological chemistry 286, 10755-10763 (REST 负反馈环路调控DYRK1A.生物化学杂志（2011)286，10755-10763))。
[0036] pCMV-DYRKlA与NFAT2缺失载体共转染HEK293细胞，37°C、5% C02环境下培养 48小时，提取总蛋白。通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。通过M2抗体和 anti-DYRKlA抗体免疫沉淀检测DYRK1A和NFAT2缺失片段之间的相互作用（抗体与抗原之 间的免疫结合)。如图1B和1C显示，预测的三个结构域与DYRK1A的作用有关。
[0037] 2、为确定NFAT2上DYRK1A的作用位点或者叫靶点，构建NFAT2突变体和缺失突 变体载体S261A(序列如SEQ ID N0. 33所示）、S261/403A(序列如SEQ ID N0. 34所示）、 l-272aa-S261A(序列如SEQIDN(λ35所示）、l-308aa-S261A(序列如SEQIDN(λ36所示）、 l-308aa-S278A(序列如SEQIDN0·37所示）、307-716aa-S403A(序列如SEQIDN0·38所 示）和 307-716aa-S409A(序列如 SEQ ID Ν0· 39 所示）。
[0038] NFAT2突变体S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三版)》的实验方 案(第1109-1103页）：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引 物，FM 为 5' -CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3'， RM 为 5' -CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCT GGAG-3'，其序列如SEQ ID N0. 17、18所示，模板为p-NFAT2mycflag，构建的载体命名为 p-NFAT2-S261Amycflag〇
[0039] NFAT2突变体S261/403A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三版)》的实验 方案(第1109-1103页）：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引 物，FM 为 5' -AGCCCAAGCCCCTGGCCCCTACGTCCTACATG-3'，RM 为 5' -CATGTAGGACGTAGGGGCCAGG GGCTTGGGCT-3'，其序列如SEQ ID勵.19、20所示，模板为口-即4了2-526认11^〇打38，构建的 载体命名为 p-NFAT2-S261/403Amycflag。
[0040] NFAT2缺失突变体l-272aa-S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三 版)》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM 为 5, -CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3，， RM 为 5, -CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCTGGAG-3 ，，其序列如SEQ ID N0. 17、18所示，模板为p-NFAT2-l-272mycf lag，构建的载体命名为 P-NFAT2-1-272-S261A mycflag。
[0041] NFAT2缺失突变体l-308aa-S261A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三 版)》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物， FM 为 5' -CTCCAGACCCGCGGCCCTTGCAACAAG-3'， RM 为 5' -CTTGTTGCAAGGGGCCGCGGGTCTGGAG -3'，其序列如SEQ ID N0. 17、18所示，模板为pNFAT2-l-308mycflag，构建的载体命名为 P-NFAT2-1-308-S261A mycflag。
[0042] NFAT2缺失突变体l-308aa_S278A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三 版)》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物， FM 为 5, -CAGCCGCCCTACGCACCCCACCACTC-3，， RM 为 5, -GAGTGGTGGGGTGCGTAGGGCGGCTG-3 ，，其序列如SEQ ID NO. 21、22所示，模板为pNFAT2-l-308mycflag，构建的载体命名为 P-NFAT2-1-308-S278A mycflag。
[0043] NFAT2缺失突变体307-716aa_S403A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三 版)》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM 为 5, -AGCCCAAGCCCCTGGCCCCTACGTCCTACATG-3，，RM 为 5, -CATGTAGGACGTAGGGGCCAGGGGCTT GGGCT-3'，其序列如 SEQ ID N0. 23、24 所示，模板为 pNFAT2-307-716mycflag，构建的载体 命名为 P-NFAT2-307-716-S403A mycflag。
[0044] NFAT2缺失突变体307-716aa_S409A的构建如下，参考《分子克隆实验指南(第三 版)》的实验方案：重叠延伸产生特异性位点诱变，其中R2为T7引物，F2为XL39引物，FM 为 5, -ACGTCCTACATGGCCCCGACCCTGCCCGCCCTGG-3，，RM 为 5, -CCAGGGCGGGCAGGGTCGGGGCCAT GTAGGACGT-3'，其序列如SEQ ID勵.25、26所示，模板为口即4了2-307-71611^。打38，构建的 载体命名为 P-NFAT2-307-716-S409A mycflag。
[0045] pCMV-DYRKlA与上述NFAT2突变体和缺失突变体载体共转染HEK293细胞，37°C、5% C02环境下培养48小时，提取总蛋白。通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。如 图1D显示，预测的三个结构域都与DYRK1A有关，而S261、S278、S403和S409是NFAT2上 DYRK1A的作用位点。
[0046] (二）制备并纯化融合多肽TAT-NFAT2 本实施例采用固相合成方法，所述融合多肽的合成可以使用用于有机合成的设备来进 行。该方法为]^1^'^1(1的固相合成方法〇.4111.0^111.5〇(3.85,2149-21，54，1963)，在该方 法中，使用半自动肽合成仪（Peti-Syzer Model PSS-510)通过使位于C-末端和N-末端的 氨基酸发生缩合来合成所述融合多肽。
[0047] 具体合成步骤如下： (1)合成顺序：从C端到N端。
[0048] (2)称取X mmol当量的树脂放入反应器中，加入DCM(二氯甲烷）溶胀半小时，然 后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸（X mmol)，2X mmol的DIEA(二异丙基乙胺），适量的 DMF (二甲基甲酰胺）、DCM溶液(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，用氮气鼓泡反应 60min。然后加入约5X mmol当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇洗净。
[0049] (3)加入适量哌啶去除Fmoc (9-芴甲氧羰基）保护基，洗净，茚三酮检测。
[0050] (4)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2X mmol)，2X mmolHBTU (苯并三 氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐）及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，抽掉液体，用DMF， 甲醇洗净，茚三酮检测。
[0051] (5)依步骤3、4的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检 测。
[0052] (6)将树脂用氮气吹干后，从反应柱中取下并称取重量，倒入烧瓶中，然后往烧瓶 中加一定量的95%TFA (三氟乙酸）切割液，震荡反应2 h，目的是将多肽从树脂载体上裂解 下来并去除氨基酸的侧链保护基团。
[0053] (7)滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清 洗即可得到该序列的粗产物。
[0054] (8)分析提纯和质谱检测：用ESI (电喷雾电离）离子源质谱仪检测该序列分子量 的正确性，用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。
[0055] (9)收集纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
[0056] 合成的融合多肽有三种，其序列分别如SEQ ID NO. 5、SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 7 所示。
[0057] 实施例2 :融合多肽TAT-NFAT2在肿瘤细胞中抑制DYRK1A对NFAT2的作用 (一）DYRK1A在肿瘤细胞HEK293中增加 NFAT2蛋白质的表达 1、pGFP-V-RS-shDYRKlA (其为DYRK1A的敲除载体，此载体可以表达一段20个长度的 核苷酸序列，此序列可以降解DYRK1A的mRNA，抑制DYRK1A的蛋白表达）由本实验室构建 (EST负反馈环路调控DYRK1A.生物化学杂志（2011) 286，10755-10763(参见文献Lu，M.， Zheng, L., Han, B., Wang, L., Wang, P., Liu, H. , and Sun, X. (2011) The Journal of biological chemistry 2^6，。
[0058] 利用脂质体 2000 (11668-027 ;Invitrogen)将 p-NFAT2mycflag 分别与 pCMV-DYRKlA、pGFP-V-RS-shDYRKlA 共转染到 HEK293 细胞中，37°C，5% C02 环境下培养 48 小时后收取细胞，用含有〇. 1%SDS的RIPA裂解液裂解细胞获得全蛋白。通过M2抗体免疫 印迹（Westerblot)检测NFAT2的表达，β -actin作为内参，如图2A显示DYRK1A使NFAT2 蛋白表达量增加。
[0059] 2、同样方法将pCMV-DYRKlA转染至HEK293细胞，收取全蛋白及细胞核蛋白、细胞 质蛋白后利用anti-NFAT2抗体检测内源性NFAT2蛋白，β-actin作为内参，如图2B显示， 内源与外源性NFAT2在DYRK1A的作用下变化趋势一致。
[0060] 上述载体构建方法、基因扩增方法、共转染方法、细胞培养方法、Westerblot免疫 方法等实现本发明必须的试验方法，均为本领域通用的方法，例如，可以参见《分子克隆实 验手册》，第三版，科学出版社。
[0061] (二）NFAT2通过泛素蛋白酶体途径进行降解 1、在转染了 P_NFAT2mycflag的HEK293细胞中分别依照不同时间（011、611、1211、2411)与 不同剂量（〇μΜ、2. 5μΜ、5μΜ)加入蛋白酶体抑制剂lactacystin，收取细胞经裂解获得全 蛋白后，通过M2抗体免疫印迹分析，β-actin作为内参。如图3A、图3B显示，NFAT2蛋白 量随着蛋白酶体抑制剂lactacystin处理时间增长与处理剂量增加而增加，NFAT2可以通 过泛素蛋白酶体途径降解。
[0062] 构建 p-Ubiquitin 质粒。将 p_NFAT2mycf lag 和 p-ubiquitin 共转染 HEK293 细胞， 5% C02环境下培养48小时，提取总蛋白，通过M2和anti-ubiquitin抗体免疫共沉淀检测 NFAT2和ubiquitin之间的相互作用。如图3C显示，NFAT2与泛素共定位，NFAT2可以通过 泛素蛋白酶体途径进行降解。
[0063] 2、p-NFAT2mycf lag 与 pCMV-DYRKlA 共转染 HEK293 细胞，37°C、5% C02 环境下培养 48小时，提取总蛋白，通过M2抗体和anti-DYRKlA抗体免疫沉淀检测DYRK1A和NFAT2之间 的相互作用，结果如图3D，DYRK1A和NFAT2可以直接相互作用。
[0064] p-NFAT2mycf lag 与 pCMV-DYRKlA 共转染 HEK293 细胞，37°C、5% C02 环境下培养 48 小时，提取总蛋白，通过Anti-Phosphoserine抗体免疫印迹检测NFAT2的磷酸化水平，M2抗 体和anti-ubiquitin抗体免疫沉淀检测NFAT2蛋白的泛素化水平，结果如图3E和图3F， DYRK1A可以增加 NFAT2的磷酸化水平，且降低NFAT2的泛素化水平。
[0065] 图3D、图3E和图3F表明，DYRK1A通过磷酸化NFAT2影响其泛素，从而抑制其蛋白 酶体降解。
[0066] (三）DYRK1A增加 NFAT2的转录活性 l、p-NFAT2mycflag 分别与 pCMV-DYRKlA 和 pGFP-V-RS-shDYRKlA 共转染 HEK293 细胞， 37°C、5% C02环境下培养24小时后收集细胞，提取RNA并反转录为cDNA，PCR扩增NFAT2的 靶基因 FasL、IL2和TNF- α，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达。如图4A和图4B显示，DYRK1A 的高表达使NFAT2靶基因的表达增加，而DYRK1A的低表达使NFAT2靶基因的表达减少，表 明DYRK1A可以促进NFAT2的转录活性。
[0067] 2、构建含有NFAT2靶基因 IL2启动子的双荧光素酶报告载体pIL2-luc。pIL2-luc and p-NFAT2mycflag共转染HEK293细胞，37°C、5% C02环境下培养24小时后收集细胞，双 荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度。如图4C显示，DYRK1A可以增加 NFAT2的转 录活性。
[0068] (四）DYRK1A-NFAT2促进癌细胞迁移 p-NFAT2mycflag 分别与 pCMV-DYRKlA 和 pGFP-V-RS-shDYRKlA 共转染 HEK293 细胞和 小胶质瘤细胞BV2,37°C、5% C02环境下培养24小时后收集细胞，transwell肿瘤细胞迁移 实验检测细胞的迁移能力。如图5A和图5B显示，DYRK1A的高表达促进了细胞的迁移，而 DYRK1A的低表达抑制细胞迁移，说明DYRK1A促进NFAT2的转录活性而增加癌细胞的迁移。
[0069] (五）融合多肽TAT-NFAT2抑制DYRK1A对NFAT2的作用 p-NFAT2mycflag与pCMV-DYRKlA共转染小胶质瘤细胞BV2,37°C、5% C02环境下培养 24小时后。分别加入融合多肽TAT-NFAT2-1 (此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2 上面DYRK1A作用的位点1)，TAT-NFAT2-2 (此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2上 面DYRK1A作用的位点2)和TAT-NFAT2-3 (此部分就是前文图1里面标注的三个NFAT2上 面DYRK1A作用的位点3)，终浓度为20uM，作用24小时。提取总蛋白，通过M2抗体免疫印 迹分析，β-actin作为内参，如图5C、图?和图5E显示，三种融合多肽都能抑制DYRK1A对 NFAT2的作用。Transwell肿瘤细胞迁移实验检测细胞的迁移能力，如图5F显示，DYRK1A 促进NFAT2的转录活性而增加癌细胞的迁移，而三种融合多肽能抑制DYRK1A引起的癌细胞 迁移能力的促进。
[0070] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制与以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所做的均等同变换 和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1. 一种融合多肽，其特征在于：是由多肽I和多肽II构成的融合多肽，其中，多肽I为 一段NFAT2上的特异性氨基酸序列，选自SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示 的序列之一或其组合；多肽II为HIV-TAT蛋白转导域，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于：所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7 所示。
3. 权利要求1或2所述的融合多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤是淋巴瘤或神经胶质瘤。
5. -种包含权利要求1或2所述的融合多肽的药物组合物。
6. 根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：该药物组合物除含有融合多肽外， 还包括药学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
【文档编号】C07K19/00GK104193826SQ201410396590
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】刘恒, 孙秀莲 申请人:山东大学齐鲁医院