专利名称：新的取代酰胺、其制备以及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的酰胺，所述化合物是酶抑制剂，尤其是半胱氨酸蛋白酶例如钙蛋白酶(calpain)(即钙依赖性半胱氨酸蛋白酶)及其同工酶和组织蛋白酶例如组织蛋白酶B和L的抑制剂。
钙蛋白酶是属于半胱氨酸蛋白酶类的细胞内蛋白水解酶，并存在于多种细胞内。钙蛋白酶是由钙浓度增加而激活的，其分为由μ摩尔级浓度钙离子激活的钙蛋白酶I或μ-钙蛋白酶和由毫摩尔级浓度钙离子激活的钙蛋白酶II或m-钙蛋白酶(P.Johnson，Int.J.Bioehem.1990，22(8)，811-22)。现在有人提出还存在其它钙蛋白酶同工酶的假说(K.Suzuki等人，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，1995，376(9)，523-9)。
有人怀疑钙蛋白酶在多种生理过程中起重要作用。这些作用包括裂解调控蛋白例如蛋白激酶C、细胞骨架蛋白例如MAP2和血影蛋白、肌肉蛋白、类风湿性关节炎中的蛋白降解、血小板活化中的蛋白、神经肽代谢、有丝分裂中的蛋白、以及在M.J.Barrett等人，Life Sci.1991，48，1659-69和K.K.Wang等人，Trends in Pharmacol.Sci.，1994，15，412-9中列出的蛋白。
已经在多种病生理过程中检测到了钙蛋白酶水平增高，例如心脏局部缺血(例如心肌梗塞)、肾局部缺血或中枢神经系统局部缺血(例如中风)、炎症、肌肉营养不良、眼睛内障、中枢神经系统损伤(例如创伤)、阿尔茨海默氏病等(参见上述K.K.Wang的文献)。人们怀疑这些疾病与细胞内钙水平持续增高有关。钙水平持续增高导致钙依赖性过程被过度激活，从而不再受生理调控的支配。因此，钙蛋白酶过度活化也可能引起病生理过程。
所以有人提出钙蛋白酶抑制剂可用于治疗这些疾病的假说。各种研究证实了这个假说。Seung-Chyul Hong等人，Stroke 1994，25(3)，663-9和R.T.Bartus等人，Neurological Res.1995，17，249-58表明了钙蛋白酶抑制剂在急性神经变性疾病或局部缺血例如中风后发生的局部缺血中的神经保护作用。同样，实验性脑损伤后，钙蛋白酶抑制剂改善了记忆力缺陷以及所发生的神经运动障碍的恢复(K.E.Saatman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，3428-3433)。C.L.Edelstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，7662-6发现了钙蛋白酶抑制剂对由于氧不足导致的肾损伤的保护作用。Yoshida，Ken Ischi等人，Jap.Circ.J.1995，59(1)40-8能表明钙蛋白酶抑制剂对由局部缺血或再灌注引起的心脏损害的有利作用。因为钙蛋白酶抑制剂抑制β-AP4蛋白的释放，所以有人提出其在治疗阿尔茨海默氏病中的潜在应用(J.Higaki等人，Neuron，1995，14，651-59)。钙蛋白酶抑制剂还抑制白细胞介素-1α的释放(N.Watanabe等人，Cytokine 1994，6(6)，597-601)。此外，还发现钙蛋白酶抑制剂具有对肿瘤细胞的细胞毒性作用(E.Shiba等人，20thMeeting Int.Ass.Breast Cancer Res.，Sendai Jp，1994，25-28Sept.，Int.J.Oncol.5(Suppl.)，1994，381)。K.K.Wang，Trendsin Pharmacol.Sci.，1994，15，412-8中列出了钙蛋白酶抑制剂的其它可能应用。
文献中已经描述过钙蛋白酶抑制剂。然而，这些抑制剂主要是不可逆抑制剂或肽类抑制剂。不可逆抑制剂通常是烷基化物质，其缺点是在生物体内非选择性地反应，或者不稳定。因此这些抑制剂通常会表现出不利的副作用、例如毒性，从而限制了其应用或者根本不可使用。不可逆抑制剂包括例如环氧化物E64(E.B.McGowan等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，158，432-5)、α-卤代酮(H.Angliker等人，J.Med.Chem.1992，35，216-20)或二硫化物(R.Matsueda等人，Chem.Lett.1990，191-194)。
在半胱氨酸蛋白酶例如钙蛋白酶的已知可逆抑制剂中，有很多是肽醛，尤其是二肽和三肽醛，例如Z-Val-Phe-H(MDL 28170)(S.Mehdi，Trends in Biol.Sci.1991，16，150-3)。在生理条件下，肽醛的缺点是，由于具有高度反应性，它们通常是不稳定的，可迅速代谢，并且倾向于参与可能引起毒性作用的非特异性反应(J.A.Fehrentz和B.Castro，Synthesis 1983，676-78)。
JP 08183771(CA 1996，605307)和EP 520336描述了衍生自4-哌啶酰基酰胺类和1-羰基-4-哌啶酰基酰胺类、并且是钙蛋白酶抑制剂的醛类化合物。然而，在本申请中要求保护的、并且衍生自具有杂芳族取代基的通式I酰胺的醛类化合物在现有技术中没有被公开过。
肽酮衍生物也是半胱氨酸蛋白酶抑制剂、尤其是钙蛋白酶抑制剂。例如，已知其中酮基是由吸电子基团例如CF3活化的酮衍生物是丝氨酸蛋白酶抑制剂。对于半胱氨酸蛋白酶，具有通过CF3或类似基团活化的酮的衍生物有很小活性或没有任何活性(M.R.Angelastro等人，J.Med.Chem.1990，33，11-13)。令人惊奇的是，迄今为止，人们发现只有其中一方面α-位离去基团引起不可逆抑制作用、并且另一方面羧酸衍生物活化酮基的酮衍生物是有效的钙蛋白酶抑制剂(参见上述M.R.Angelastro等人的文献；WO92/11850；WO92/12140；WO94/00095和WO95/00535)。然而，迄今为止，据报道只有这些酮基酰胺和酮基酯的肽衍生物是有效的(Zhaozhao Li等人，J.Med.Chem.1993，36，3472-80；S.L.Harbenson等人，J.Med.Chem.1994，37，2918-29，以及上述M.R.Angelastro等人的文献)。
酮基苯甲酰胺已经在文献中公开过。因此，WO 91/09801、WO94/00095和WO 92/11850中已经描述了酮基酯PhCO-Abu-COOCH2CH3。然而，在M.R.Angelastro等人.，J.Med.Chem.1990，33，11-13中，发现类似的苯基衍生物Ph-CONH-CH(CH2Ph)-CO-COCOOCH3仅是弱的钙蛋白酶抑制剂。J.P.Burkhardt，Tetrahedron Lett.，1988，3433-36中也描述了该衍生物。然而，鉴于此迄今为止，人们从来没有研究过取代苯甲酰胺的重要性。
在很多治疗中，例如中风的治疗中，活性组分是静脉内给药的，例如以输液形式给药。鉴于此，需要提供在水中具有适当溶解度的钙蛋白酶抑制剂来制备输液。然而，许多现有技术中的钙蛋白酶抑制剂的缺点是在水中的溶解度很小或根本不溶解，因此不适于静脉内给药。这种活性物质只能与可促进其在水中溶解的辅助物质一起给药(参见R.T.Bartus等人，J.Cereb.Blood Flow Metab.1994，14，537-544)。然而，这些辅助物质例如聚乙二醇通常具有副作用，或甚至不能耐受。因此无需辅助物质即可溶于水的非肽类抑制剂具有显著优点。这类抑制剂在现有技术中没有描述过，并因此是新的。
本发明描述了非肽醛、酮基羧酸酯和酮基酰胺衍生物。这些化合物是新的，并且通过合并上刚性结构片段而令人惊奇地表现出获得半胱氨酸蛋白酶、例如钙蛋白酶的有效非肽类抑制剂的可能性。此外，所有本发明通式I化合物都具有至少一个脂肪胺基团，因此可与酸形成盐。这改善了本发明化合物在水中的溶解性，因此本发明化合物表现出了静脉内给药、例如中风治疗中的静脉内给药所需的必要特性。
本发明涉及通式I所示具有杂环取代基的酰胺、其互变异构体和异构体、可能的对映异构体和非对映异构体、以及可能的生理可接受盐， 其中各变量具有下述含义A代表-(CH2)p-R1，其中R1可以是吡咯烷、吗啉、六氢氮杂、哌啶、-NR5R6和 其中所述环状胺可被1个或2个R15取代，R15是氢、C1-C6-烷基、O-C1-C6-烷基和苯基，且R5、R6和R7可分别独立地为氢、C1-C4-烷基、环己基、环戊基、CH2Ph、Ph、CH2CH2Ph，其中所述苯基环可被R6取代，且p可以是1和2，B可以是苯基、吡啶基、吡嗪基(pyrazyl)、嘧啶基和哒嗪基(pyridazyl)，其中所述环可被最高达2个R8取代，并且A和B也可一起形成 其中R16是氢、C1-C6-烷基和(CH2)14-苯基，该苯基环可被最多2个R6取代，D可以是一个键、-(CH2)0-2-O-(CH2)0-2、-(CH2)m-、-CH＝CH-、-C≡C-，R2是氯、溴、氟、C1-C6-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、NHSO2-C1-C4-烷基、NO2、-O-C1-C4-烷基和NH2，R3是直链或支链-C1-C6-烷基，该烷基可携带SCH3、苯基环、咪唑基环、吲哚基环和环戊基、环庚基或环已基环，所述环可被最多2个R8取代，其中R8是氢、直链或支链C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、-NHSO2-C1-C4-烷基、和-SO2-C1-C4-烷基，Y是苯基、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪，R4是氢、COOR9、和CO-Z，其中Z是NR10R11和 R9是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R10是氢、可被苯基环和 取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R11是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可带有R9基团，R12可以是氢、支链或直链C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、-NHCO-C1-C4-烷基、-NHCO-苯基、-NHSO2-C1-C4-烷基、-NHSO2-苯基、-SO2-C1-C4-烷基、和-SO2-苯基，R13是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R14是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，n是0、1或2，且m和q分别独立地为0、1、2、3或4。
优选的通式I化合物是其中各变量定义如下的通式I化合物 其中A代表-CH2-R1，其中R1可以是吡咯烷子基(pyrrolidino)、哌啶子基、-NR5R6和 且R5、R6和R7可独立地为氢和C1-C4-烷基，B是苯基，D是-CH＝CH-，R2是氢，R3是苄基、CH2CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH2CH3，Y是苯基和吡啶，R4是氢和CO-NH2，且所有剩余变量的定义同权利要求1所述。式I化合物可以作为外消旋体、对映异构纯化合物或非对映异构体使用。如果需要对映异构纯化合物，可通过例如用适当的旋光性碱或酸将式I化合物或其中间体进行常规外消旋体拆分来获得对映异构纯化合物。另一方面，对映异构化合物可通过使用市售化合物例如旋光性氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸来制得。
本发明还涉及式I化合物的内消旋体或互变异构体，例如其中式I上的醛或酮基呈烯醇互变异构体的式I化合物。
本发明还包括式I化合物的生理可接受盐，所述盐可通过将通式I化合物与适当酸或碱反应来制得。适当酸和碱的实例列在例如Fortschritte der Arzneimittelforschung，1966，BirkhuserVerlag，Vol.10，pp.224-285中。这些酸和碱包括例如盐酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、马来酸、富马酸等，和氢氧化钠、氢氧化锂、以及氢氧化钾等。
具有醛基的本发明酰胺I可依据在合成方案1中概述的多种方法制得。
合成方案1 将杂环羧酸II与适当氨基醇III连接以形成相应的酰胺IV。在该反应中使用常规肽偶合方法，例如在C.R.Larock，ComprehensiveOrganic Transformations，VCH Publisher，1989，pages 972 et seq.，或Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，4th Edition，E5，Chapter V中描述的常规肽偶合方法。优选使用其中羧基COOH被转化成COL的II的“活化”酸衍生物。L是离去基团例如Cl、咪唑和N-羟基苯并三唑。然后将该活化酸与胺反应以生成酰胺IV。该反应在无水惰性溶剂例如二氯甲烷、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中于-20-+25℃温度下进行。
可将这些醇衍生物IV氧化以生成本发明醛衍生物I。可采用多种常规氧化反应(参见C.R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publisher，1989，page 604 f.)，例如Swern氧化和类Swern氧化(T.T.Tidwell，Synthesis，1990，857-70)、使用次氯酸钠/TEMPO进行氧化(上文中S.L.Harbenson等人的文献)、或Dess-Martin氧化(J.Org.Chem.1983，48，4155)。根据所采用的方法(参见上述文献)，优选在惰性非质子传递溶剂例如二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷中用氧化剂例如DMSO/吡啶×SO3或DMSO/草酰氯于-50-+25℃温度下进行该氧化反应。
或者，可将羧酸II与氨基异羟肟酸衍生物VI反应以生成苯甲酰胺VII。用与制备IV相同的方式进行该反应。异羟肟酸衍生物VI可通过将保护的氨基酸V与羟基胺反应而制得。在该制备中，也使用已经描述过的酰胺制备方法。通过常规方法，例如用三氟乙酸除去保护基X、例如Boc。可通过还原将由此获得的酰氨基异羟肟酸VII转化成本发明醛I。例如，在-60-0℃、在惰性溶剂例如四氢呋喃或乙醚中使用氢化锂铝作为还原剂来进行该方法。羧酸或羧酸衍生物例如酯IX(P＝COOR’、COSR’)可通过与后一方法类似的方法制得，并且可同样通过还原而转化成本发明醛I。R.C.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publisher，1989，page 619-26中描述了这些方法。
具有杂环取代基、并且具有酮基酰胺或酮基酯基团的本发明酰胺I可依据在合成方案2和3中概述的多种方法制得。
适当时，可在室温或高温下、例如在25-100℃，在水介质或水与有机溶剂如醇或四氢呋喃的混合物中，用酸或碱例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾将羧酸酯IIa转化成酸II。
采用常规条件，例如在Houben-Weyl，Methoden der organi schenChemie，4thEdition，E5，Chapter V和C.R.Larock，ComprehensiveOrganic Transformations，VCH Publisher，1989，Ch.9中描述的常规条件，将这些酸II与α-氨基酸衍生物连接。
例如，将羧酸II转化成“活化的”酸衍生物IIb(COOH→COL)，其中L是离去基团例如Cl、咪唑和N-羟基苯并三唑，然后通过加入氨基酸衍生物H2N-CH(R3)-COOR将这些活化的酸衍生物转化成衍生物XI。该反应在无水惰性溶剂例如二氯甲烷、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中于-20-+25℃温度下进行。
合成方案2 通过与上述水解类似的水解方法，将通常是酯的衍生物XI转化成酮基羧酸XII。酮基酯I’是在与Dakin-West反应类似的反应中，使用Zhaozhao Li等人，J.Med.Chem.，1993，36，3472-80的方法制得的。在该方法中，将羧酸例如XII与草酸单酯酰氯在溶剂例如四氢呋喃中于高温下(50-100℃)反应，然后将所得产物与碱例如乙醇钠在乙醇中于25-80℃温度下反应，以生成本发明酮基酯I’。可如上所述将所得酮基酯I′例如水解，以生成本发明酮基羧酸。
还可采用类似于Zhaozhao Li等人(参见上文)的方法进行反应以生成酮基苯甲酰胺I’。在惰性溶剂例如二氯甲烷中于室温下，使用路易斯酸催化剂例如三氟化硼合乙醚、通过加入1，2-乙烷二硫醇将I’中的酮基保护，形成了二噻烷。在极性溶剂例如醇中于0-80℃温度下将这些衍生物与胺R3-H反应，以形成酮基酰胺I(R4＝Z或NR10R11)。
合成方案3 合成方案3中描述了另一方法。采用常规肽偶合方法(参见上文中的Houben-Weyl)，将酮基羧酸II与氨基羟基羧酸衍生物XIII反应(对于XIII的制备，参见S.L.Harbenson等人，J.Med.Chem.1994，37，2918-29或J.P.Burkhardt等人，Tetrahedron Lett.1988，29，3433-3436)，形成了酰胺XIV。可将这些醇衍生物XIV氧化，以生成本发明酮基羧酸衍生物I。可采用多种常规氧化反应(参见C.R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publisher，1989，page 604 f.)，例如Swern氧化和类Swern氧化，优选在溶剂例如二氯甲烷或四氢呋喃中、适当时加入二甲亚砜，优选用二甲亚砜/吡啶×SO3复合物于室温或-50-+25℃温度下进行该氧化反应(T.T.Tidwell，Synthesis，1990，857-70)，或用次氯酸钠/TEMPO进行氧化(参见上文中的S.L.Harbenson等人)。
对于α-羟基酯XIV(X＝O-烷基)，可用与上述方法类似的方法，但是优选在水/四氢呋喃混合物中于室温下用氢氧化锂将这些酯水解，以生成羧酸XV。其它酯或酰胺XVI是通过在上述偶合条件下与醇或胺反应而制得的。可将醇衍生物XVI氧化，以生成本发明酮基羧酸衍生物I。
上文已在一些实例中描述过一些羧酸酯II的制备，或者其是通过常规化学方法制得的。
其中C是一个键的化合物是通过常规芳香偶合制得的，例如采用钯催化的用硼酸衍生物和卤化物进行的Suzuki偶合，或铜催化的芳香卤化物偶合。烷基桥连基团(C＝-(CH2)m-)可通过将类似的酮还原，或通过将有机锂化合物例如邻苯基噁唑烷或其它有机金属化合物烷基化而制得(参见I.M.Dordor等人，J.Chem.Soc.Perkins Trans.I，1984，1247-52)。
醚桥连衍生物是通过用卤化物将相应的醇或酚烷基化而制得的。烯和炔桥连化合物是通过例如将芳香卤化物和相应的烯和炔进行Heck反应而制得的(参见例如I.Sakamoto等人，Chem.Pharm.Bull.，1986，34，2754-59)。
本发明具有杂环取代基的酰胺I是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，尤其是半胱氨酸蛋白酶例如钙蛋白酶I和II以及组织蛋白酶B和L的抑制剂。
已经用文献中记载的常规酶测试法测定了具有杂环取代基的酰胺I的抑制作用，以酶活性被抑制50％时所测定的抑制剂浓度(IC50)作为作用标度。以该方式测定酰胺I抑制钙蛋白酶I、钙蛋白酶II和组织蛋白酶B的作用。
组织蛋白酶B测试按照类似于S.Hasnain等人，J.Biol.Chem.1993，268，235-40的方法测定组织蛋白酶B抑制作用。
将用抑制剂和DMSO制得的2μL抑制剂溶液(终浓度100μM-0.01μM)加到88μL组织蛋白酶B(得自人肝脏的组织蛋白酶B(Calbiochem)，在500μM缓冲液中稀释至5单位)中。将该混合物在室温(25℃)预培养60分钟，然后通过加入10μL 10mM Z-Arg-Arg-pNA(在含有10％DMSO的缓冲液中)来启动反应。用微量滴定板读数计在405 nM监视反应30分钟。然后由最大梯度确定IC50。
钙蛋白酶I和II测试在含有50mM tris-HCl、0.1M NaCl、1mM二硫苏糖醇、0.11mMCaCl2、pH为7.5的缓冲液中，用萤光钙蛋白酶底物Suc-Leu-Tyr-AMC(溶于DMSO中，浓度为25mM，Bachem/Switzerland)测定钙蛋白酶抑制剂的抑制特性。从红细胞中分离出人μ-钙蛋白酶，经过几个色谱法纯化步骤(DEAE-琼脂糖，苯基琼脂糖，Superdex 200和BlueSepharose)之后，获得了纯度＞95％的酶，其中该酶的纯度是通过SDS-PAGE、Western印迹分析和N-末端序列分析测定的。在Spex-Fluorolog荧光计中于λex＝380nm和λem＝460nm处测定裂解产物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的荧光度。在60分钟的测定期间内，底物的裂解与时间呈线性关系，并且如果测试是在12℃进行的话，钙蛋白酶的自动催化活性很低。将抑制剂和钙蛋白酶底物以DMSO溶液形式加到该测试混合物中，其中DMSO的终浓度不能超过2％。
在测试混合物中，将10μl底物(终浓度为250μM)和10μlμ-钙蛋白酶(终浓度为2μg/ml，即18nM)依次加到含有缓冲液的1ml比色杯中。测定15-20分钟钙蛋白酶介导的底物裂解。然后加入10μl抑制剂(50-100μM的DMSO溶液)，测定40分钟对裂解的抑制。
Ki值是依据可逆抑制的经典公式确定的Ki＝I/(vo/vi)-1；其中I＝抑制剂浓度，vo＝加入抑制剂前的初速度，vi＝平衡中的反应速度。
速度是由v＝AMC释放/时间，即高度/时间计算的。
钙蛋白酶是细胞内半胱氨酸蛋白酶。为了阻止细胞内蛋白被钙蛋白酶降解，钙蛋白酶抑制剂必须穿越细胞膜。有些已知的钙蛋白酶抑制剂例如E64和亮抑蛋白酶肽只能非常困难地越过细胞膜，因此，虽然它们是良好的钙蛋白酶抑制剂，但是在细胞内的作用很弱。人们的目标是发现能更好地穿过细胞膜的化合物。我们使用人血小板来确定钙蛋白酶抑制剂穿越膜的能力。
钙蛋白酶介导的血小板中酪氨酸激酶pp60src的断裂血小板活化后，酪氨酸激酶pp60src被钙蛋白酶裂解。Oda等人在J.Biol.Chem.，1993，268，12603-12608中描述了对此的详细研究。这表明calpeptin—一种钙蛋白酶抑制剂可阻止pp60src的裂解。我们按照在该出版文章中使用的方法测定了本发明化合物的细胞有效性。将用柠檬酸盐处理的新鲜人血以200g的转速离心15分钟。收集富含血小板的血浆，并用血小板缓冲液(血小板缓冲液68mMNaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2×6H2O、0.24mM NaH2PO4×H2O、12mM NaHCO3、5.6mM葡萄糖、1mM EDTA、pH7.4)进行1∶1稀释。离心并用血小板缓冲液洗涤后，将血小板浓度调节至107个细胞/ml。在室温分离人血小板。
在该测试混合物中，将分离的血小板(2×106)与不同浓度的抑制剂(溶于DMSO中)在37℃预培养5分钟。然后用1μM离子载体A23187和5mM CaCl2将血小板活化。培养5分钟后，以13000rpm转速将血小板短暂离心，把血小板小丸置于SDS样本缓冲液中(SDS样本缓冲液20mM Tris-HCl、5mM EDTA、5mM EGTA、1mM DTT、0.5mM PMSF、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂、10％甘油和1％SDS)。在12％浓度凝胶中分离蛋白，通过Western印迹法鉴定pp60src及其52kDa和47kDa裂解产物。使用购自Biomol Feinchemikalien(Hamburg)公司的多克隆兔子抗-Cys-src(pp60c-rc)抗体。用偶合有HRP的山羊第二代抗体(Boehringer Mannheim，FRG)检测该初生抗体。依据已知方法进行Western印迹测定。
通过光密度法定量测定pp60src的裂解，所用对照是未活化血小板(对照1未裂解)和用离子载体与钙处理的血小板(对照2相当于100％裂解)。ED50值是颜色反应的强度降低50％时抑制剂的浓度。
皮层神经元中谷氨酸盐诱导的细胞死亡该测试是按照Choi D.W.，Maulucci-Gedde M.A.和KriegsteinA.R.，“谷氨酸盐在皮层细胞培养物中的神经毒性”.J.Neurosci.1989，7，357-368中描述的方法进行的。从15天大小的小鼠胚胎中把皮质解剖为两半，通过酶处理(胰蛋白酶)分离到了独立细胞。将这些细胞(神经胶质和皮层神经元)接种到24孔板上。3天(涂布昆布氨酸(laminin)的培养板)或7天(涂布鸟氨酸的培养板)后，用FDU(5-氟-2-去氧尿嘧啶核苷)进行有丝分裂处理。将细胞培养15天后，加入谷氨酸盐来诱导细胞死亡(15分钟)。除去谷氨酸盐后，加入钙蛋白酶抑制剂。24小时后，通过测定细胞培养物上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)来确定细胞损伤。
有人提出钙蛋白酶也在细胞程序死亡中起作用的假说(M.K.T.Squier等人，J.Cell.Physiol.1994，159，229-237；T.Patel等人，Faseb Journal 1996，590，587-597)。因此，在另一模型中，在钙离子载体存在下用钙诱导人细胞系中的细胞死亡。钙蛋白酶抑制剂必须进入细胞内并抑制其中的钙蛋白酶以阻止所诱导的细胞死亡。
NT2细胞中钙介导的细胞死亡可在人细胞系NT2中，在离子载体A 23187存在下、用钙诱导细胞死亡。在实验前20小时，将细胞以105个细胞/孔的量置于微量滴定板中。20小时后，在2.5μM离子载体和5mM钙存在下、将细胞与不同浓度的抑制剂培养。5小时后，将0.05ml XTT(细胞增殖试剂盒II，Boehringer Mannheim)加到该反应混合物中。约17小时后，依据制造商的使用说明，用SLT Easy Reader EAR 400测定光密度。细胞死亡一半时的光密度是由不使用抑制剂、含有细胞、并且这些细胞是在或不在离子载体存在下培养的两个对照组计算的。
在很多神经性疾病或心理障碍中，都发生谷氨酸盐活性增加，并导致中枢神经系统(CNS)过度兴奋或毒性作用。谷氨酸盐通过多种受体介导其作用。其中有两种受体通过其特异性激动剂被划分为NMDA受体和AMPA受体。因此，这些谷氨酸盐介导作用的拮抗剂可用于治疗这些疾病，尤其是治疗神经变性疾病例如亨廷顿氏舞蹈病和帕金森氏病，低氧、缺氧、局部缺血和损伤后发生的神经毒害疾病，例如中风和创伤后发生的神经毒害，或用作抗癫痫剂(参见Arzneim.Forschung 1990，40，511-514；TIPS，1990，11，334-338；Drugs of the Future 1989，14，1059-1071)。抗兴奋性氨基酸诱导的脑过度兴奋的保护作用(小鼠中的NMDA或AMPA拮抗作用)脑内给予兴奋性氨基酸(EAA)，结果诱导了严重的过度兴奋，导致动物(小鼠)在短时间内痉挛和死亡。可通过系统给予例如腹膜内给予中枢活性物质(EAA拮抗剂)来抑制这些症状。因为中枢神经系统中EAA受体的过度激活在多种神经性疾病的发病机制中起重要作用，所以可从已在体内证实的EAA拮抗作用得出这样的结论，即这种物质可用于治疗这些CNS疾病。为了测定这种物质的效力，通过提前腹膜内给予测试物质，确定50％动物的由给予固定剂量NMDA或AMPA引起的症状被消除时的ED50值。
本发明具有杂环取代基的酰胺I是半胱氨酸衍生物例如钙蛋白酶I和II以及组织蛋白酶B和L的抑制剂，因此可用于控制与钙蛋白酶或组织蛋白酶的酶活性增加有关的疾病。因此本发明酰胺I可用于治疗局部缺血、血管闭塞后再灌注所致的损伤、创伤、蛛网膜下出血和中风后发生的神经变性疾病，和神经变性疾病例如多发性梗塞性痴呆、阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏舞蹈病，和癫痫，以及可用于治疗心脏局部缺血后的心脏损伤、肾局部缺血后的肾脏损伤、骨骼肌损伤、肌肉营养不良、由于平滑肌细胞增殖所导致的损伤、冠状血管痉挛、脑血管痉挛、眼睛内障、和血管成形术后的血管再狭窄。此外，本发明酰胺I可用于肿瘤和肿瘤转移的化学治疗，并且可用于治疗其中白细胞介素-1水平增加的疾病，例如炎症和风湿性疾病。
除了常规药物辅料以外，本发明药物制剂还含有治疗有效量的化合物I。
对于局部外用给药，例如以粉剂、软膏剂或喷雾剂形式给药，制剂中活性组分的浓度可以为常规浓度。按重量计，活性组分的含量一般为0.001-1％，优选为0.001-0.1％。
对于内部给药，制剂以单次剂量给药。每单次剂量为0.1-100mg/kg体重。根据所治疗疾病的类型和严重程度，每天给予一个或多个单次剂量的制剂。
根据所需的给药方式，本发明药物制剂含有除活性组分以外的常规赋形剂和稀释剂。对于局部外用给药制剂，可使用药物辅料例如乙醇、异丙醇、乙氧基化蓖麻油、乙氧基化氢化蓖麻油、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇硬脂酸酯、乙氧基化脂肪醇、液状石蜡、凡士林和羊毛脂。对于内部给药制剂，合适辅料的实例是乳糖、丙二醇、乙醇、淀粉、滑石和聚乙烯吡咯烷酮。
本发明药物制剂还可含有抗氧化剂例如生育酚、叔丁基化甲氧酚以及丁基化羟基甲苯，矫味剂，稳定剂，乳化剂和润滑剂。
本发明药物制剂所含有的除活性组分以外的物质和在药物制剂制备中所使用的物质在毒理学方面是可接受的，并且与活性组分相配伍。本发明药物制剂是以常规方法制得的，例如通过将活性化合物与其它常规赋形剂和稀释剂混合而制得。
本发明药物制剂可以通过多种给药途径给药，例如口服给药，非胃肠道给药例如通过输注的静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药，和局部给药。因此可采用的剂型有片剂、乳剂、输液、注射液、糊剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、洗剂、粉剂和喷雾剂。
实施例按照与上述实施例和方法类似的方式制备下述实施例化合物
权利要求
1.式I酰胺、其互变异构体、可能的对映异构体和非对映异构体、E型和Z型异构体、以及可能的生理可接受盐， 其中各变量具有下述含义A代表-(CH2)p-R1，其中R1可以是吡咯烷、吗啉、六氢氮杂、哌啶、-NR5R6和 其中所述环状胺可被1个或2个R15取代，R15是氢、C1-C6-烷基、O-C1-C4-烷基和苯基，且R5、R6和R7可分别独立地为氢、C1-C4-烷基、环己基、环戊基、CH2Ph、Ph、CH2CH2Ph，其中所述苯基环可被R6取代，且p可以是1和2，B可以是苯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基，其中所述环可被最高达2个R8取代，并且A和B也可一起形成 其中R16是氢、C1-C6-烷基和(CH2)1-4-苯基，该苯基环可被最多2个R6取代，D可以是一个键、-(CH2)0-2-O-(CH2)0-2、-(CH2)m-、-CH＝CH-、-C≡C-，R2是氯、溴、氟、C1-C6-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、NHSO2-C1-C4-烷基、NO2、-O-C1-C4-烷基和NH2，R3是直链或支链-C1-C6-烷基，该烷基可携带SCH3、苯基环、咪唑基环、吲哚基环和环戊基、环庚基或环己基环，所述环可被最多2个R8取代，其中R8是氢、直链或支链C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、NHCO-C1-C4-烷基、-NHSO2-C1-C4-烷基、和-SO2-C1-C4-烷基，Y是苯基、吡啶、哒嗪、嘧啶和吡嗪，R4是氢、COOR9、和CO-Z，其中Z是NR10R11和 R9是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R10是氢、可被苯基环和 取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R11是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可带有R9基团，R12可以是氢、支链或直链C1-C4-烷基、-O-C1-C4-烷基、OH、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、NH2、CN、COOH、COO-C1-C4-烷基、-NHCO-C1-C4-烷基、-NHCO-苯基、-NHSO2-C1-C4-烷基、-NHSO2-苯基、-SO2-C1-C4-烷基、和-SO2-苯基，R13是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，R14是氢、可被苯基环取代的直链或支链C1-C6-烷基，其中该苯基环可被1个或2个R12取代，n是0、1或2，且m和q分别独立地为0、1、2、3或4。
2.权利要求1的式I酰胺，其中A代表-CH2-R1，B是苯基，D是-CH＝CH-，R2是氢，R3是苄基、CH2-CH3、CH2-CH2-CH3、CH2CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH2CH3，Y是苯基，R4是CO-NH2，且所有剩余变量的定义同权利要求1所述。
3.权利要求1的式I酰胺，其中A代表-CH2-R1，B是苯基，D是-CH＝CH-，R2是氢，R3是苄基、CH2-CH3、CH2-CH2-CH3、CH2CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH2CH3，Y是苯基，R4是氢，且所有剩余变量的定义同权利要求1所述。
4.权利要求1的式I酰胺，其中A代表-CH2-R1，B是苯基，D是-CH＝CH-，R2是氢，R3是苄基、CH2-CH3、CH2-CH2-CH3、CH2CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH2CH3，Y是吡啶，R4是氢，且所有剩余变量的定义同权利要求1所述。
5.权利要求1的式I酰胺，其中A代表-CH2-R1，B是苯基，D是-CH＝CH-，R2是氢，R3是苄基、CH2-CH3、CH2-CH2-CH3、CH2CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH2CH3，Y是吡啶，R4是CO-NH2，且所有剩余变量的定义同权利要求1所述。
6.权利要求1-5任一项的式I酰胺在治疗疾病中的应用。
7.权利要求1-5任一项的式I酰胺作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的应用。
8.权利要求6的应用，其中所述应用是作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，例如钙蛋白酶和组织蛋白酶、尤其是钙蛋白酶I和II以及组织蛋白酶B和L的抑制剂的应用。
9.权利要求1-5任一项的式I酰胺在制备用于治疗其中钙蛋白酶活性增加的疾病的药物中的应用。
10.权利要求1-5任一项的式I酰胺在制备用于治疗神经变性疾病和神经元损伤的药物中的应用。
11.权利要求9的应用，其中所述应用是在制备用于治疗由局部缺血、创伤和大出血引起的神经变性疾病和神经元损伤的药物中的应用。
12.权利要求10的应用，其中所述应用是在制备用于治疗中风和颅脑创伤的药物中的应用。
13.权利要求10的应用，其中所述应用是在制备用于治疗阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏舞蹈病的药物中的应用。
14.权利要求10的应用，其中所述应用是在制备用于治疗癫痫的药物中的应用。
15.权利要求1-5任一项的式I酰胺在制备用于治疗下述疾病的药物中的应用心脏局部缺血后的心脏损伤、血管闭塞后的再灌注所致的损伤、肾局部缺血后的肾脏损伤、骨骼肌损伤、肌肉营养不良、由于平滑肌细胞增殖所导致的损伤、冠状血管痉挛、脑血管痉挛、眼睛内障、和血管成形术后的血管再狭窄。
16.权利要求1-5任一项的式I酰胺在制备用于治疗肿瘤以及肿瘤转移的药物中的应用。
17.权利要求1-5任一项的式I酰胺在制备用于治疗其中白细胞介素-1水平增加的疾病的药物中的应用。
18.权利要求1-5任一项的酰胺在治疗免疫性疾病例如炎症和风湿性疾病中的应用。
19.口服、非胃肠道和腹膜内给药的药物制剂，其中每一单位制剂包含至少一种权利要求1-5任一项的式I酰胺和常规药物辅料。
全文摘要
本发明涉及通式(Ⅰ)半胱氨酸蛋白酶抑制剂,其中A是－(CH
文档编号C07C237/22GK1306505SQ99807639
公开日2001年8月1日 申请日期1999年4月20日 优先权日1998年4月20日
发明者W·卢比施, A·梅勒, H·-J·特雷贝尔, M·克诺普 申请人:Basf公司