荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法
【专利摘要】本发明属于材料科学与工程和生物分离工程领域，具体来说是一种荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法。以细乳液聚合法将以藻蓝蛋白作为模板的分子印迹与磁敏感性和荧光性材料相结合，即得到藻蓝蛋白分子印迹聚合物磁性和荧光性的复合微球。应用本发明细乳液聚合的方法，在分子印迹聚合物微球中复合有磁和荧光双响应材料，对藻蓝蛋白具有特异性识别与自主吸附，选择性好，吸附效率高，速度快，并在外加磁场作用下方便、快速分离，重复使用性能好，且在较宽的pH范围内进行荧光实时检测和荧光成像。同时所得磁性核壳印迹微球形貌规则、粒径均一。本发明具有成本低、操作简便快捷、重现性好等优点，具有广泛的应用前景。
【专利说明】荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于材料科学与工程和生物分离工程领域，具体来说是一种荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法。
【背景技术】
[0002]分子印迹技术是指制备对某一特定目标分子具有特异选择性的聚合物即分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)的程序,常被形象地描绘为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”的技术。由于蛋白质结构灵活、构象复杂，极易受到温度等环境因素的影响，另外高交联度材料会阻止蛋白类大分子自由进出聚合物网络，一方面导致模板分子难以脱除，另一方面造成模板分子难以进入印迹位点与之重新结合等一系列问题，这些都导致蛋白质分子印迹材料的开发受到阻碍。
[0003]20 世纪 70 年代初期，美国 Lehigh 大学的 Ugelstad、El-Aasser 和 Vanderhoff等一批学者，提出了新的粒子成核机理一在亚微单体液滴中引发成核，开发了细乳液(miniemuls1n)聚合新技术。细乳液聚合兼具常规乳液聚合的大部分优点，并具有以下优势:体系稳定性高，有利于工业生产的实施；产物胶乳的粒径较大，而且通过助乳化剂的用量很容易控制；聚合速率适中，生产易于控制；在体系中引进了助乳化剂，并采用了微乳化工艺，这样使原来较大的单体液滴被分散成更小的单体亚微米液滴。
[0004]用于分离工程领域的不含磁性组分的分子印迹聚合物微球大多是进行静态分离或动态分离，需经离心等过程分离，操作过程烦琐、复杂。而在聚合物微球内部埋入磁响应性材料时，复合微球则具有在外加磁场作用下简便、快速的磁分离特性。当在复合微球中埋入磁响应性材料后，便可在其完成对模板分子的“主动”吸附与识别后在外加磁场作用下很容易将其分离出来，达到自主识别和分离简便的目的。
[0005]藻蓝蛋白是仅存在于蓝藻中的一种非常少见的天然营养素。荧光藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离纯化的、具有独特光学性质的新型荧光标记物，具有优异的性质:在较宽光谱范围内有较高吸收系数；在较宽的PH范围内有较高的荧光产率；它们的荧光不因其它生物分子的存在而消失；有较好的水溶性；液体或固体状态存在时都极为稳定，且能保存较长时间。藻蓝蛋白因而受到广泛关注。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用细乳液聚合制备荧光蛋白印迹磁性复合微球的方法。
[0007]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0008]一种荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，以细乳液聚合法将以藻蓝蛋白作为模板的分子印迹与磁敏感性和荧光性材料相结合，即得到藻蓝蛋白分子印迹聚合物磁性和荧光性的复合微球。
[0009]所述荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备:
[0010]a.Fe3O4磁性材料制备:将FeCl3.6H20溶于乙二醇中，并以醋酸钠作为还原剂，聚乙二醇为高分子稳定剂经超声振荡溶解，而后于密闭水热反应釜中反应，即得到黑色Fe3O4磁性材料；
[0011]b.一步细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子:上述粒子包裹油酸，加入甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙二酯混匀，混匀后加入到十二烷基磺酸钠和十六醇溶液体系中，形成细乳液，细乳液滴加至十二烷基磺酸钠溶液中，除氧，而后再加入过硫酸铵，进行聚合反应，洗涤后干燥收集，待用；
[0012]c.载体粒子表面修饰:
[0013](I)氨基化:将上述所得超顺磁性载体粒子分散至DMF中，再加入乙二胺反应，洗涤；
[0014](2)醛官能化:将上述氨基化的粒子加入乙酸和乙酸钠的缓冲溶液，除氧，除去缓冲液，加至戊二醛中，反应，洗涤；
[0015]d.固定模板分子:上述制备的醛官能化的聚合物颗粒，用磷酸盐缓冲液洗涤，力口入藻蓝蛋白模板溶液反应，洗涤；
[0016]e.两步细乳液聚合合成外壳层:上述粒子加入甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙二酯混匀，加入到十二烷基磺酸钠和十六醇溶液体系中，形成细乳液，细乳液滴加至十二烷基磺酸钠溶液中，除氧，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，反应，洗涤；
[0017]f.模板分子洗脱:将上述粒子加入到NaOH溶液中，水解，洗涤并干燥。
[0018]进一步的说,所述步骤a.Fe3O4磁性材料制备:称取3.0Og FeCl3.6H20充分溶于SO-1OOmL乙二醇中，加入7.2g醋酸钠，超声并机械搅拌溶解均匀，然后加入2.0-4.0g聚乙二醇，在60°C缓慢搅拌至溶解，溶剂热后将黄色液体全部转移到带有聚四氟乙烯内胆的密闭水热反应釜中，于190-210°C下反应8-12h，反应后冷却至室温，即得到磁性黑色Fe3O4磁性材料。
[0019]所述磁性黑色Fe3O4磁性材料依次用超纯水和无水乙醇各洗涤4-8遍，将所得产物干燥12-24h，收集干燥的Fe3O4磁性材料。
[0020]进一步的说，所述步骤b.—步细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子:取1.0g上述Fe3O4磁性材料与ImL油酸充分混合得到黑色的粘性凝胶，所得黑色的粘性凝胶中再加入按摩尔比为1:4-6混合的甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二酯(优选，所得黑色的粘性凝胶中再加入1.28mL甲基丙烯酸甲酯和9.05mL 二甲基丙烯酸乙二酯)，充分混合均匀，混匀后在65%的功率下超声处理90-100s ；
[0021]经超声处理后逐滴加入到50mL的0.01mol/L十二烷基硫酸钠和0.03mol/L十六醇的混合溶液中，滴加后剧烈摇晃,混匀后再经65%的功率下超声90-100s形成细乳液；
[0022]将上述所得细乳液逐滴入到600mL的0.05%十二烷基磺酸钠中，滴加后在65°C下氮气吹扫10-15min，氮气处理后加入0.5g硫酸铵，引发聚合反应，聚合反应1_1.5h后升温至70°C继续反应24h，即得细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子。
[0023]所述聚合所得聚合物载体粒子用超纯水洗涤3-5次，用50%的乙醇洗2-3次，再用超纯水洗2-3次，自然干燥24h，待用。
[0024]进一步的说,所述步骤c.载体粒子表面修饰:
[0025]用DMF将上述制备的Ig聚合物载体颗粒洗涤并均匀分散到20mL的DMF中，随后，向混合物中加入20mL的乙二胺，在100-120°C下以200-400r/min的转速下机械搅拌回流反应12h ;产物用超纯水洗涤1-2次，用50%的乙醇洗2-3次，再用超纯水洗2-3次；
[0026](2)醛官能化:将经氨基化处理的聚合物载体颗粒Ig浸泡在1mL的缓冲溶液中，并在室温下脱气10-15min，然后除去缓冲液，将颗粒分散在新制的5%的戊二醛中，使混合物在室温200-400r/min的转速机械搅拌下反应12h ;超纯水洗涤2_3次；所述缓冲溶液为pH值为5 ± 0.1的乙酸和乙酸钠缓冲溶液。
[0027]所述述缓冲溶液为pH值为5±0.1的乙酸和乙酸钠缓冲溶液为按体积比为3:6.8-7.2混合的0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸钠。
[0028]进一步的说，所述步骤e.两步细乳液聚合合成外壳层:将1.28mL甲基丙烯酸甲酯、9.05mL 二甲基丙烯酸乙二酯和1.0g的表面改性的超顺磁性核颗粒混合，然后将混合物以40-50%功率超声90-100S，充分混合均匀后，将所得混合物逐滴加入到50mL的0.0lmol/L的十二烷基硫酸钠和0.03mol/L的十六醇的混合溶液，将混合物剧烈摇晃，65%的功率下超声90s形成细乳液，细乳液逐滴加进600mL的0.05%的十二烷基磺酸钠中，而后在40°C下氮气吹扫10-15min，将按质量比为1:1混合的过硫酸铵和亚硫酸氢钠加入到该混合物中，引发聚合反应，反应16_24h，完成后，洗涤烘干待用。
[0029]本发明所具有的优点:
[0030]本发明克服了蛋白质分子印迹和细乳液聚合的种种困难，最终得到的复合微球对模板蛋白的特异性吸附效率最高以及复合微球的重复性强。所得磁性核-壳印迹微球形貌规则，粒径均一，本发明具体是应用细乳液聚合的方法，在分子印迹聚合物微球中复合有磁性和荧光双响应材料，对藻蓝蛋白有特异性吸附。
[0031]具体的是本发明通过细乳液聚合法将蛋白质分子印迹技术与磁敏感性以及荧光性相结合，赋予分子印迹聚合物微球一定的磁性和荧光双重响应特性，达到蛋白质分子印迹聚合物磁性复合微球特异性识别与自主吸附，并在外加磁场作用下方便、快速分离，使用荧光光谱等荧光仪器实时轻松检测的目的。
[0032]本发明所得分子印迹聚合物微球中复合有磁性和荧光双响应材料，对藻蓝蛋白有特异性吸附，选择性好，吸附效率高，传质速率快，重复使用性能好。其中复合有磁强度为10.770emu/g的Fe3O4磁性纳米材料；同时模板蛋白荧光性能稳定，在较宽光谱范围内有较高吸收系数，在较宽的PH范围内有较高的荧光产率，水溶性好，利于快速测定分析，并用于其它物质标记。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为本发明实施例提供的核壳印迹磁性复合微球制备过程示意图。
[0034]图2A为本发明实施例提供的磁性复合微球吸附蛋白效果图；
[0035]图2B为本发明实施例提供的磁性复合微球吸附蛋白磁滞回线图。
[0036]图3A为本发明实施例提供的pH对藻蓝蛋白的荧光的影响效果图；
[0037]图3B为本发明实施例提供的对0.lmg/L-0.7mg/L浓度范围藻蓝蛋白溶液的荧光响应图谱。
[0038]图4为本发明实施例提供的核壳印迹磁性复合微球在SDS-PAGE电泳中的应用图，其中I号泳道为蛋白质mark泳道，2号为原始蛋白溶液的泳道，3号为经核壳印迹磁性复合微球吸附后的蛋白溶液，4号为经非核壳印迹磁性复合微球吸附后的蛋白溶液。
[0039]图5为本发明实施例提供的核壳印迹磁性复合微球在海拉细胞环境中吸附藻蓝蛋白溶液的荧光图像；其中A、B、C分别为海拉细胞、海拉细胞添加藻蓝蛋白、海拉细胞添加藻蓝蛋白并用核壳印迹磁性复合微球吸附后在559nm激发的荧光照片，G、H、I分别为A、B、C在明场下的照片，D为A和G的合成图片，E为B和H的合成图片，F为C和I的合成图片。
【具体实施方式】
[0040]本发明首先采用一步细乳液聚合合成Fe3O4基的超顺磁性载体粒子，将其进行表面氨基化和醛官能化修饰，固定具有荧光性质的藻蓝蛋白模板分子，然后采用两步细乳液聚合合成外壳层，所得磁性核壳印迹微球形貌规则，粒径均一。应用细乳液聚合的方法，在分子印迹聚合物微球中复合有磁和荧光双响应材料，对藻蓝蛋白具有特异性识别与自主吸附，选择性好，吸附效率高，速度快，并在外加磁场作用下方便、快速分离，重复使用性能好，且在较宽的pH范围内进行荧光实时检测和荧光成像。本法具有成本低、操作简便快捷、重现性好等优点，具有广泛的应用前景。
[0041]实施例1
[0042]a.Fe3O4磁性材料制备:称取3.0Og的FeCl3.6H20溶于90mL乙二醇中，加入7.2g醋酸钠，超声并机械搅拌溶解。然后加入3.9g聚乙二醇在60°C下以400r/min搅拌至溶解。溶解后将黄色液体全部转移到带有聚四氟乙烯内胆的密闭水热反应釜中，于200°C干燥箱中反应10h。冷却至室温后，磁性收集黑色物质，依次用超纯水和无水乙醇各洗涤6次，将所得产物干燥24h，收集干燥的Fe3O4磁性材料。
[0043]b.一步细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子:1.0g上述Fe3O4磁性材料与ImL的油酸混合得到黑色的粘性凝胶。摩尔比为1:4的甲基丙烯酸甲酯(1.28mL)和二甲基丙烯酸乙二酯(9.05mL)加入油酸包覆的磁性材料，并充分混合。然后将混合物在65%的功率下超声处理80s。混合均匀后，将所得混合物以2-3滴/秒的速率逐滴加入到50mL的0.01mol/L十二烷基磺酸钠和0.03mol/L的十六醇的混合溶液中。将混合物剧烈摇晃，65%的功率下超声处理90s形成细乳液。细乳液以2-3滴/秒的速率逐滴加入到600mL的0.05%十二烷基磺酸钠中。将该反应混合物转移到一个IL的三颈圆底烧瓶中，在65°C下氮气吹扫15min，将过硫酸铵(0.5g)加入到反应混合物中，引发聚合反应，反应1-1.5h后升温至70°C继续反应，持续24h。完成后，聚合物载体粒子用超纯水洗涤3次，用50%的乙醇洗3次，再用超纯水洗3次。自然干燥24h，收集。
[0044]c.载体粒子表面修饰:
[0045](I)氨基化:用DMF将Ig上述制备的聚合物载体颗粒洗涤两次并分散到20mL的DMF中。随后，向混合物中加入20mL的乙二胺，以400r/min的转速，在110°C下，机械搅拌回流反应12h。产物用超纯水洗涤I次，用50%的乙醇的洗2次，再用超纯水洗2次。
[0046](2)醛官能化:配制pH值为5的乙酸和乙酸钠的缓冲溶液(即为按体积比为3:7混合的0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸钠)。将Ig上述的聚合物载体颗粒浸泡在1mL的缓冲溶液中，并在室温下脱气lOmin。然后除去该缓冲液，将该颗粒分散在新制的1mL的5%的戊二醛中。将该混合物在室温400r/min的转速下机械搅拌反应12h。然后，用超纯水洗涤3次。
[0047]d.固定模板分子:上述制备的醛官能化的聚合物颗粒，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤I次。向20mL的藻蓝蛋白溶液(lmg/mL冲加入1.0g上述颗粒。所得混合体系置于4°C，在300r/min的转速下机械搅拌3h，进行耦合反应。反应完成后用超纯水洗涤该固定藻蓝蛋白模板3次。
[0048]e.两步细乳液聚合合成外壳层:甲基丙烯酸甲酯(1.28mL)、二甲基丙烯酸乙二酯(9.05mL)和1.0g的上述固定有模板分子的表面改性的超顺磁性核颗粒混合。然后将混合物以45%的功率超声90s，以确保彻底混合。混合均匀后，将所得混合物以2-3滴/秒的速率逐滴加入到50mL的0.01mol/L的十二烷基磺酸钠和0.03mol/L的十六醇的混合溶液中。将混合物剧烈摇晃，65%的功率下超声90s形成细乳液。细乳液以2-3滴/秒的速率逐滴加入到600mL的0.05%的十二烷基磺酸钠中。将该反应混合物转移到一个IL的三颈圆底烧瓶中，在40°C下氮气吹扫15min，将过硫酸铵(0.25g)和亚硫酸氢钠(0.25g)加入到该混合物中以引发聚合反应，反应24h。完成后，将该聚合物的磁性核-壳微球用超纯水洗涤3次，用50%的乙醇洗3次，再用超纯水洗3次。自然干燥24h，收集。
[0049]f.模板分子洗脱，即通过碱水解除去固定的藻蓝蛋白模板分子，具体为:20mL的
1.0moI/L的NaOH溶液中加入1.0g的磁性核-壳微球。在35°C下以300r/min的转速搅拌水解混合物，反应5h。将这些表面印迹的颗粒用超纯水洗涤3次，自然干燥24h，即得荧光蛋白印迹磁性复合微球(参见图1)。
[0050]非印迹聚合物制备:按照上述操作规程，只是不加模板分子藻蓝蛋白之外，其他步骤同上。
[0051]实施例2
[0052]称取藻蓝蛋白20mg，用重蒸水定容在IL的容量瓶中，得到20mg/L的藻蓝蛋白溶液，取1mL的藻蓝蛋白溶液加入到20mL的罗口小瓶中，加入10mg的荧光蛋白印迹磁性复合微球，振荡吸附lOmin，用磁铁在小瓶的一侧吸附2min，即可把复合微球吸附到一侧，得到澄清的溶液(参见图2A)。说明该复合微球对藻蓝蛋白具有强吸附能力，且分离过程快速、简单，参见图2B所示该微球磁强度较高。
[0053]实施例3
[0054]取200yL的100mg/L藻蓝蛋白溶液7份，分别置于1mL的塑料离心管中，然后分别向各管中加入不同PH值的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4和NaH2PO4分别为0.2mol/L,体积比1:1)9.8mL，稀释得到pH值分别为5.6,6.0,6.4,6.8,7.2、7.6和8.0的2mg/L藻蓝蛋白溶液，用荧光分光光度计分别测定其相应荧光强度，可得到在PH值为6.4时具有最大的荧光强度(参见图3A)，且随着藻蓝蛋白的浓度增大，荧光强度逐渐增大(参见图3B)。
[0055]实施例4
[0056]称取溶菌酶(LZM)、鸡血清白蛋白(CEA)、牛血清蛋白(BSA)和藻蓝蛋白(PC)各6mg,混合,然后加入6mL重蒸水,得到lmg/mL的混合蛋白溶液。分别取2mL混合溶液加入到三个玻璃离心管中，标号为2、3、4。另取一个玻璃离心管标号为1，加入mark蛋白溶液。2号离心管中不进行任何处理，3号加入20mg的磁性印迹微球，4号加入20mg的非印迹聚合物，而后将离心管分别置于振荡器上振荡吸附6h，离心取上清液40 μ L，进行SDS-PAGE电泳实验。参见图4，4号的泳道相比2号泳道，4种蛋白的条带基本没有变化，而3号泳道PC的条带明显减弱，其他蛋白条带没有明显变化。结果表明该印迹复合微球对藻蓝蛋白具有高选择性，可进行特异性吸附。
[0057]实施例5
[0058]培养海拉细胞，在24孔的细胞培养板上加入盖玻片，分别取9份ImL的细胞液加入到细胞培养板上培养，并标注1-9号，待细胞在盖玻片上正常生长，以1-3号作为对照组，不加任何溶液，取60μ L的10mg/mL的藻蓝蛋白溶液加入4_9号中，培育6h，往7_9号样品加入ΙΟΟμ L的0.lmg/mL的非印迹聚合物进行吸附，轻微振荡，取其中的盖玻片在荧光共聚焦显微镜下进行观察。参见图5，没有处理的样品，在细胞间隙中荧光强度很大；加入印迹复合微球之后，细胞环境中荧光强度明显减弱，出现的几个荧光亮点为印迹微球，说明该印迹复合微球可以在细胞环境中特异性吸附藻蓝蛋白。
【权利要求】
1.一种荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:以细乳液聚合法将以藻蓝蛋白作为模板的分子印迹与磁敏感性和荧光性材料相结合，即得到藻蓝蛋白分子印迹聚合物磁性和荧光性的复合微球。
2.按权利要求1所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备: a.Fe304磁性材料制备:将FeCl3.6H20溶于乙二醇中，并以醋酸钠作为还原剂，聚乙二醇为高分子稳定剂经超声振荡溶解，而后于密闭水热反应釜中反应，即得到黑色Fe304磁性材料； b.一步细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子:上述粒子包裹油酸，加入甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙二酯混匀，混匀后加入到十二烷基磺酸钠和十六醇溶液体系中，形成细乳液，细乳液滴加至十二烷基磺酸钠溶液中，而后再加入过硫酸铵，进行聚合反应，洗涤后干燥收集，待用； c.载体粒子表面修饰: (1)氨基化:将上述所得超顺磁性载体粒子分散至N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入乙二胺反应，洗漆; (2)醛官能化:将上述氨基化的粒子加入乙酸和乙酸钠的缓冲溶液，加至戊二醛中，反应，洗涤； d.固定模板分子:上述制备的醛官能化的聚合物颗粒，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入藻蓝蛋白模板溶液反应，洗涤； e.两步细乳液聚合合成外壳层:上述粒子加入甲基丙烯酸甲酯、二甲基丙烯酸乙二酯混匀，加入到十二烷基磺酸钠和十六醇溶液体系中，形成细乳液，细乳液滴加至十二烷基磺酸钠溶液中，除氧，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠，反应，洗涤； f.模板分子洗脱:将上述粒子加入到NaOH溶液中，水解，洗涤并干燥。
3.按权利要求2所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述步骤a.Fe304磁性材料制备:称取3.00g FeCl3.6Η20充分溶于70_100mL乙二醇中，加入7.2g醋酸钠，使其溶解均匀，然后加入2.0-4.0g聚乙二醇，在60°C缓慢搅拌至溶解，溶解后将黄色液体全部转移到带有聚四氟乙烯内胆的密闭水热反应釜中，于190-210°C下反应8-12h，反应后冷却至室温，即得到磁性黑色Fe304磁性材料。
4.按权利要求2或3所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述磁性黑色Fe304磁性材料依次用超纯水和无水乙醇各洗4-8遍，将所得产物干燥12-24h，收集干燥的Fe304磁性材料。
5.按权利要求2所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述步骤b.—步细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子:取上述Fe304磁性材料与油酸充分混合得到黑色的粘性凝胶，所得黑色的粘性凝胶中再加入按摩尔比为1:4-6混合的甲基丙烯酸甲酯和二甲基丙烯酸乙二酯，充分混合均匀，混匀后在65%的功率下超声处理90-100S ； 经超声处理后逐滴加入到按摩尔比1:3的比例混合的十二烷基硫酸钠和十六醇的混合溶液中，滴加后剧烈摇晃，混匀后再经65%的功率下超声90-100S形成细乳液； 将上述所得细乳液逐滴加入到600mL的0.05%十二烷基磺酸钠中，滴加后在65°C下氮气吹扫10-15min，氮气处理后加入硫酸铵，引发聚合反应，聚合反应1_1.5h后升温至70°C继续反应24h，即得细乳液聚合合成超顺磁性载体粒子。
6.按权利要求2或5所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述聚合所得聚合物载体粒子用超纯水洗涤3-5次，用50%的乙醇洗2-3次，再用超纯水洗2-3次，自然干燥24h，待用。
7.按权利要求2所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于: 所述步骤c.载体粒子表面修饰: (1)氨基化:用DMF将上述制备的聚合物载体颗粒洗涤并均匀分散到DMF中，随后，向混合物中加入乙二胺，在100-120°C下以200-400r/min的转速下机械搅拌回流反应12h ;产物用超纯水洗涤1-2次，用50%的乙醇洗2-3次，再用超纯水洗2-3次； (2)醛官能化:将经氨基化处理的聚合物载体颗粒浸泡在的缓冲溶液中，并在室温下脱气10-15min，然后除去缓冲液，将颗粒分散在新制的5%的戊二醛中，使混合物在室温200-400r/min的转速机械搅拌下反应12h ;超纯水洗涤2_3次；所述缓冲溶液为pH值为5±0.1的乙酸和乙酸钠缓冲溶液。
8.按权利要求7所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于:所述述缓冲溶液为pH值为5 ±0.1的乙酸和乙酸钠缓冲溶液，即为按体积比为3:6.8-7.2混合的0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸纳。
9.按权利要求2所述的荧光蛋白印迹磁性复合微球的制备方法，其特征在于: 所述步骤e.两步细乳液聚合合成外壳层:将1.28mL甲基丙烯酸甲酯、9.05mL 二甲基丙烯酸乙二酯和1.0g上述表面改性的超顺磁性核颗粒混合，充分混合均匀后，将所得混合物逐滴加入到摩尔浓度比为1:3的十二烷基硫酸钠和十六醇的混合溶液中，将混合物剧烈摇晃，65%的功率下超声80-100S形成细乳液，细乳液逐滴加进600mL的0.05%的十二烷基磺酸钠中，而后在40°C下氮气吹扫10-15min，将按质量比为1:1混合的过硫酸铵和亚硫酸氢钠加入到该混合物中，弓I发聚合反应，反应16-24h，完成后，洗涤烘干待用。
【文档编号】C08F8/28GK104277176SQ201310287723
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2013年7月10日
【发明者】陈令新, 张忠, 李金花 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所