用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用。该方法以肝素钠为合成模板，通过与聚乙烯亚胺结合形成纳米凝胶，并在表面进行硫辛酸修饰，得到用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。该纳米凝胶粒径小，稳定性好，便于通过控制原料组成而控制纳米凝胶的粒径，可通过加入硼氢化钠或DTT进行二硫键的还原，用于贵金属纳米颗粒的稳定吸附。本发明的制备方法简便、反应条件温和，重现性好，成本低，形貌均一且毒性低，得到的纳米凝胶具有很好的生物相容性，可应用于环境监测、医学诊断学或肿瘤光热治疗等【技术领域】中，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用
【【技术领域】】
[0001]本发明属于纳米医药【技术领域】，特别涉及一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用。
【【背景技术】】
[0002]医用凝胶体系在临床应用方面有大量研究，包括各种可注射医用凝胶，温度敏感微凝胶等。活性成分如肿瘤化疗药物与纳米凝胶载体的结合有多种形式，包括均匀分散(即药物等活性成分均匀的分散于凝胶载体体系中，随着凝胶的降解或解离而进行药物的缓控制释放)、胶囊式载药(即药物分布在纳米载体体系的内核，外部进行凝胶聚合物的包裹，随着凝胶体系的理化性质变化而释放药物)和化学键交联载药(即将活性分子与载体通过化学键进行结合，将药物成分变成凝胶载药体系的一部分，随便化学键的断裂进行药物的有效释放)。活性成分的选取多种多样，可以是疏水性的分子或亲水性的小分子，也可以是基因药物、蛋白药物或无机金属材料颗粒等。将贵金属纳米材料如银用于凝胶体系，可以药用杀灭细菌；将金棒等纳米颗粒进行化学吸附，可利用金颗粒的光热转化实现温敏凝胶的智能控制；将无机介孔材料置于纳米凝胶体系，可以增加介孔材料的生物相容性，更好的实现药物的有效控制释放。
[0003]随着材料学以及医学的发展，将凝胶体系与金颗粒复合而开发新的功能化凝胶成为新的研究方向。凝胶的形成有很多种，如自由基引发、两亲性聚合物自组装以及聚合物内部正负电荷相互吸引等。凝胶作为一大类生物相容性好的材料，在药物装载以及组织工程方面具有多种用途。将聚合物凝胶与贵金属如金纳米棒结合，通过金纳米棒的光热转化，实现凝胶体系的温度敏感响应，完成药物释放或环境监测。在已有的技术和方法中，凝胶体系较大，一般都在500nm以上 ，不利于广泛的生物医学应用。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法。
[0005]本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。
[0006]本发明的再一目的在于提供所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的应用。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤:
[0008](I)纳米凝胶的表面修饰:将硫辛酸按5~50mg/ml溶于二甲亚砜中，加入二环己基二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，10~40°C活化过夜，得到活化液；将活化液加入肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液中，室温反应36h，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶；所述硫辛酸、二环己基二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.5:1.5~1:10:12，所述肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液中的水与所述二甲亚砜的体积比为2~5 ;
[0009](2)还原剂处理纳米凝胶:往步骤(1)的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入0.5~5wt%还原剂,氮气保护下O~4011C搅拌IOmin~24h后透析,得到用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。
[0010]步骤(1)中:
[0011]所述肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束采用以下方法进行制备:将500~5000mg支链聚乙烯亚胺溶于5~50mL去离子水中后以2~20滴/min加入20~100mL、浓度为5~100mg/mL肝素钠溶液中，室温搅拌12~36h，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液。
[0012]优选的，所述肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束采用以下方法进行制备:将2g支链聚乙烯亚胺溶于15mL去离子水中，然后加入50mL、浓度为100mg/mL肝素钠溶液中，室温搅拌12h，0.22 μ m滤膜过滤并透析(截留分子量3000Da)，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液；
[0013]所述支链聚乙烯的分子量优选为600、1800或25000Da ；
[0014]所述肝素钠溶液优选采用以下方法进行活化:将肝素钠按5~50mg/ml加入IOOmL的2-吗啉乙磺酸水溶液中，分别加入N-羟基琥珀酰亚胺和1_乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，活化2~12h，得到活化后的肝素钠溶液；所述肝素钠、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.5:1.5~1:12:10 ；
[0015]所述2-吗啉乙磺酸水溶液(MES水溶液)优选为pH为5.5的、含有0.05M2-吗啉乙磺酸的水溶液；
[0016]所述过滤优选采用0.45 μ m或0.22 μ m滤膜过滤；
[0017]所述透析优选采用截留分子量大于3000Da的透析袋进行透析；
[0018]步骤(2)中:
[0019]所述还原剂优选为硼氢化钠或二硫苏糖醇(DTT)；
[0020]所述透析优选采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析；
[0021]所述贵金属优选为金。
[0022]一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶，由上述制备方法得到。
[0023]所述用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶可应用于环境监测、医学诊断学或肿瘤光热治疗等【技术领域】中。
[0024]本发明的发明机理:本发明以阴离子聚合物与阳离子聚合物的相互作用为基础，以极负的肝素作为合成骨架，通过其中的羧基形成酰胺键，在其上引入带正电荷的聚乙烯亚胺，由于正负电的相互作用，形成具有纳米尺度、表面带正点的纳米凝胶体系，在纳米凝胶表面的氨基位置进行小分子硫辛酸修饰，在还原剂的作用下，使得纳米凝胶表面的基团由氨基转变为巯基，完成对金纳米颗粒的吸附。
[0025]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0026](1)本发明以肝素钠为合成模板，通过与聚乙烯亚胺结合形成纳米凝胶，并在表面进行硫辛酸修饰，得到用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。该纳米凝胶粒径小，稳定性好，便于通过控制原料组成而控制纳米凝胶的粒径，可通过加入硼氢化钠或DTT进行二硫键的还原，用于贵金属纳米颗粒的稳定吸附。
[0027](2)本发明的制备方法简便、反应条件温和，重现性好，成本低，形貌均一且毒性低，得到的纳米凝胶具有很好的生物相容性，可应用于环境监测、医学诊断学或肿瘤光热治疗等【技术领域】中，具有良好的市场应用前景。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0028]图1是本发明中纳米凝胶合成与修饰过程的示意图。[0029]图2是实施例1的肝素-聚乙烯亚胺(高分子量，25kDa)纳米凝胶TEM检测结果图(磷钨酸负染)。
[0030]图3是实施例1的肝素-聚乙烯亚胺(25kD)_硫辛酸纳米凝胶DTT处理后吸附金棒复合物--Μ检测结果图。
[0031 ] 图4是实施例2的肝素-聚乙烯亚胺(ISOODa)-硫辛酸纳米凝胶DTT处理后吸附金纳米棒的TEM图。
[0032]图5是实施例3的肝素-聚乙烯亚胺(ISOODa)-硫辛酸纳米凝胶硼氢化钠处理后吸附金棒的TEM图。
【【具体实施方式】】
[0033]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。
[0034]实施例1
[0035](I)金纳米棒的合成
[0036]种子金纳米颗粒的合成:将5mL0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与5mL0.5mmol/L的氯金酸混合，400转/分钟边搅拌边加入0.6mL0°C保存的0.01mol/L的硼氢化钠，1000转/分钟搅拌5min，室温静置2h，得到种子金纳米颗粒，命名为GNP-R0。
[0037]CTAB模板法合成短的金纳米棒:取7个25mL的样品瓶(分别标记为GNP-Rl、GNP-R2、GNP-R3、GNP-R4、GNP-R5、GNP-R6、GNP-R7),分别加入 5mL0.2mol/L 的 CTAB 水溶液，对应编号加入不同量4mmol/L的AgNO3水溶液(0.050,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30和0.40mL)，再分别加入5mLlmmol/L的氯金酸水溶液，此时溶液颜色变成金黄色，接着分别加Λ 70 μ L0.0788mol/L的抗坏血酸，溶液变成无色。最后分别加入12 μ L的种子金纳米颗粒分散液，在27°C静置反应2h，得到金纳米棒，室温、避光保存，备用。
[0038](2)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备
[0039]I)配制 MES 水溶液 IOOmL (ρΗ5.5、0.05Μ)；
[0040]2)肝素钠溶液的活化:取0.5g肝素钠溶解于50mL MES (IOOmL圆底烧瓶)中，加入300mg N-羟基琥珀酰亚胺和200mgl-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，活化2h，得到活化后的肝素钠溶液；
[0041]3)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备:将Ig支链聚乙烯亚胺(分子量25kDa)溶于50mL去离子水中，并置于恒压漏斗中，加入步骤(2)的活化后的肝素钠溶液中，室温搅拌12h ;过滤并离心，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶；结果如图2所示；从图2可以看出，能形成纳米级凝胶，且分布均匀。[0042](3)纳米凝胶的表面硫辛酸修饰:
[0043]将IOOmg硫辛酸溶解于20mL 二甲亚砜中，加入200mg 二环己基碳二亚胺和220mgN-羟基琥珀酰亚胺，过夜活化并滤纸过滤后加入上述得到的肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束中，室温反应36小时，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶。冻干样品，通过样品质量称重测定纳米凝胶产物的浓度。结果:能形成稳定的纳米凝胶，沉淀物较少。
[0044](4)纳米凝胶表面巯基的释放与金纳米颗粒的吸附:
[0045]往2mL步骤(3)中的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入0.1mM DTT300 μ L，对二硫键进行还原，然后加入2mL步骤(1)的金纳米棒,透析I天后，检测贵金属纳米颗粒的吸附效果；结果如图3所示，肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶对金纳米棒具有良好的吸附效果。
[0046]实施例2
[0047](I)金纳米棒的合成
[0048]种子金纳米颗粒的合成:将5mL0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与5mL0.5mmol/L的氯金酸混合，400转/分钟边搅拌边加入0.6mL0°C保存的0.01mol/L的硼氢化钠，600转/分钟搅拌5min，室温静置2h，得到种子金纳米颗粒，命名为GNP-R0。
[0049]CTAB模板法合成短的金纳米棒:取7个25mL的样品瓶(分别标记为GNP-Rl、GNP-R2、GNP-R3、GNP-R4、GNP-R5、GNP-R6、GNP-R7),分别加入 5mL0.2mol/L 的 CTAB 水溶液，对应编号加入不同量4 mmol/L的AgNO3水溶液(0.050,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30和
0.40mL)，再分别加入5mLlmmol/L的氯金酸水溶液，此时溶液颜色变成金黄色，接着分别加Λ 70 μ L0.0788mol/L的抗坏血酸，溶液变成无色。最后分别加入12 μ L的种子金纳米颗粒分散液，在27°C静置反应2h，得到金纳米棒，室温、避光保存，备用。
[0050](2)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备
[0051]I)配制 MES 水溶液 IOOmL (ρΗ5.5、0.05Μ)；
[0052]2)肝素钠溶液的活化:取0.5g肝素钠溶解于IOOmL MES (IOOmL圆底烧瓶)中，加入4.5mg N-羟基琥珀酰亚胺和7.2mgl-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，活化12h，得到活化后的肝素钠溶液；
[0053]3)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备:将0.5g支链聚乙烯亚胺(分子量1800Da)溶于5mL去离子水中后加入步骤(2)的活化后的肝素钠溶液中，并置于恒压漏斗中，室温搅拌24h ;过滤并透析(透析袋截留分子量3500Da)，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束。
[0054](3)纳米凝胶的表面硫辛酸修饰:
[0055]将IOOmg硫辛酸溶解于2mL 二甲亚砜中，加入150mg 二环己基碳二亚胺和85mgN-羟基琥珀酰亚胺，过夜活化后加入上述得到的肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束中，室温反应36小时，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶。冻干样品，通过样品称重测定纳米凝胶产物的浓度。结果:能形成稳定的纳米凝胶，沉淀物较少。
[0056](4)纳米凝胶表面巯基的释放与金纳米颗粒的吸附
[0057]往步骤(3)中的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入0.5mM DTT，对二硫键进行还原，透析I天后加入2mL步骤(1)的金纳米棒,使用TEM检测贵金属纳米颗粒的吸附效果，结果如图4所示；从图4可以看出，制备得到的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶对金纳米棒具有良好的吸附效果。[0058]实施例3
[0059](I)同实施例1的步骤(1)；
[0060](2)制备硫辛酸修饰的纳米凝胶:[0061]I)配制 MES 水溶液 IOOmL (ρΗ5.5、0.05Μ)；
[0062]2)肝素钠溶液的活化:取5g肝素钠溶解于50mL MES (IOOmL圆底烧瓶)中，加入IOOmg N-羟基琥珀酰亚胺和150mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，过夜活化8h，得到活化后的肝素钠溶液；
[0063]3)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备:将5g支链聚乙烯亚胺(分子量ISOODa)溶于50mL去离子水中，并置于恒压漏斗中，加入步骤(2)的活化后的肝素钠溶液中，室温搅拌12h ;过滤并透析(透析袋截留分子量3500Da)，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶。
[0064]4)纳米凝胶的表面硫辛酸修饰:
[0065]将IOOmg硫辛酸溶解于IOmL 二甲亚砜中，加入Ig 二环己基碳二亚胺和700mgN-羟基琥珀酰亚胺，过夜活化并滤纸过滤后加入上述得到的肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束中，室温反应36小时，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶。冻干样品，通过样品质量称重测定纳米凝胶产物的浓度。结果:能形成稳定的纳米凝胶，沉淀物较少。
[0066](3)纳米凝胶表面巯基的释放与金纳米颗粒的吸附
[0067]往步骤(2)中的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入0.5mM硼氢化钠，对二硫键进行还原，随后对纳米凝胶溶液透析出去硼氢化钠并加入2mL步骤(1)的金纳米棒，25°C、氮气保护下搅拌12小时，取澄清溶液进行TEM扫描，结果如图5所示；从图5可以看出，制备得到的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶对金纳米棒具有良好的吸附效果。
[0068]对比实施例
[0069]( I)金纳米棒的合成
[0070]种子金纳米颗粒的合成:将5mL0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与5mL0.5mmol/L的氯金酸混合，400转/分钟边搅拌边加入0.6mL0°C保存的0.01mol/L的硼氢化钠，600转/分钟搅拌5min，室温静置2h，得到种子金纳米颗粒，命名为GNP-R0。
[0071 ] CTAB模板法合成短的金纳米棒:取7个25mL的样品瓶(分别标记为GNP-Rl、GNP-R2、GNP-R3、GNP-R4、GNP-R5、GNP-R6、GNP-R7),分别加入 5mL0.2mol/L 的 CTAB 水溶液，对应编号加入不同量4mmol/L的AgNO3水溶液(0.050,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30和
0.40mL)，再分别加入5mLlmmol/L的氯金酸水溶液，此时溶液颜色变成金黄色，接着分别加Λ 70 μ L0.0788mol/L的抗坏血酸，溶液变成无色。最后分别加入12 μ L的种子金纳米颗粒分散液，在27°C静置反应2h，得到金纳米棒，室温、避光保存，备用。
[0072](2)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备
[0073]I)配制 MES 水溶液 IOOmL (ρΗ5.5、0.5mM)；
[0074]2)肝素钠溶液的活化:取0.5g肝素钠溶解于50mL MES (IOOmL圆底烧瓶)中，加入300mg N-羟基琥珀酰亚胺和200mgl-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，活化2h，得到活化后的肝素钠溶液；
[0075]3)肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶的制备:将2g支链聚乙烯亚胺(分子量ISOODa)溶于IOOmL去离子水中后加入步骤(2)的活化后的肝素钠溶液中，并置于恒压漏斗中，室温搅拌24h ;过滤并透析(透析袋截留分子量3500Da)，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束；[0076](3)纳米凝胶的表面硫辛酸修饰:
[0077]将IOOmg硫辛酸溶解于二甲亚砜中，加入200mg 二环己基碳二亚胺和220mg N-轻基琥珀酰亚胺，过夜活化后加入上述得到的肝素-聚乙烯亚胺纳米胶束中，室温反应36小时，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶。冻干样品，通过样品称重测定纳米凝胶产物的浓度。结果:能形成稳定的纳米凝胶，沉淀物较少。
[0078](4)纳米凝胶表面巯基的释放与金纳米颗粒的吸附
[0079]往步骤(3)中的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入2mM硼氢化钠，对二硫键进行还原，透析I天后加入2mL步骤(1)的金纳米棒,使用TEM检测贵金属纳米颗粒的吸附效果，无明显金棒附着。
[0080]以上所述本发明的【具体实施方式】，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。`
【权利要求】
1.一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)纳米凝胶的表面修饰:将硫辛酸按5~100mg/ml溶于二甲亚砜中，加入二环己基二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，10~40°C活化过夜，得到活化液；将活化液加入肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液中，室温反应36h，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶；所述硫辛酸、二环己基二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1: 1.5:1.5~1:10:12，所述肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液中的水与所述二甲亚砜的体积比为2~5 ; (2)还原剂处理纳米凝胶:往步骤(1)的肝素-聚乙烯亚胺-硫辛酸纳米凝胶加入0.5~5wt%还原剂,氮气保护下O~4(TC搅拌30min~24h后透析,得到用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液采用以下方法进行制备:将500~5000mg支链聚乙烯亚胺溶于5~50mL去离子水中后以2~20滴/min加入20~100mL、浓度为5~lOOmg/mL肝素钠溶液中，室温搅拌12~36h，过滤并透析，得到肝素-聚乙烯亚胺纳米凝胶水溶液。
3.根据权利要求2所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述支链聚乙烯的分子量为600、1800或25000Da。
4.根据权利要求2所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述肝素钠溶液采用以下方法进行活化:将肝素钠按5~100mg/ml加入2-吗啉乙磺酸水溶液中，分别加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，活化2~12h，得到活化后的肝素钠溶 液；所述肝素钠、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1.5:1.5~1:12:10。
5.根据权利要求4所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述2-吗啉乙磺酸水溶液为pH为5.5的、含有0.05M2-吗啉乙磺酸的水溶液。
6.根据权利要求1所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述还原剂为硼氢化钠或二硫苏糖醇。
7.根据权利要求1所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述贵金属为金。
8.一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶，由权利要求1~7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶应用于环境监测、医学诊断学或肿瘤光热治疗【技术领域】中。
【文档编号】C08L5/10GK103497344SQ201310461228
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】蔡林涛, 师帅, 吴蕾, 高冠慧 申请人:深圳先进技术研究院