靶向EGFR和/或HER2的单价抗原结合构建体及其用途的制作方法与工艺

相关申请的交叉引用本申请要求2013年11月13日提交的美国临时申请号61/903,825的权益，所述美国临时申请据此以引用的方式整体并入本文。序列表本申请含有已通过EFS网提交，并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝于20XX年某月XX日创建，名为XXXXXPCT_sequencelisting.txt，并且大小是X,XXX,XXX字节。背景人表皮生长因子受体(也称为HER-1或Erb-B1)是一种由c-erbB原癌基因编码的170kDa跨膜受体，并且展现固有酪氨酸激酶活性(Modjtahedi等,Br.J.Cancer73:228-235(1996)；Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002))。SwissProt数据库条目P00533提供EGFR的序列。也存在EGFR的亚型和变体(例如选择性RNA转录物、截短形式、多态形式等)，包括但不限于用Swissprot数据库条目号P00533-1、P00533-2、P00533-3和P00533-4标识的那些。已知EGFR结合配体，包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin)、肝素结合性EGF(hb-EGF)、β细胞素(betacellulin)和上皮调节蛋白(epiregulin)(Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002)；Mendelsohn和Baselga,Oncogene19:6550-6565(2000))。EGFR通过酪氨酸激酶介导的信号传导路径调控众多细胞过程，包括但不限于控制细胞增殖、分化、细胞存活、凋亡、血管生成、有丝分裂发生和转移的信号传导路径的活化(Atalay等,Ann.Oncology14:1346-1363(2003)；Tsao和Herbst,Signal4:4-9(2003)；Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002)；Modjtahedi等,Br.J.Cancer73:228-235(1996))。已报道在包括膀胱癌、脑癌、头颈部癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌的众多人恶性病状中，EGFR过表达。(Atalay等,Ann.Oncology14:1346-1363(2003)；Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002)Modjtahedi等,Br.J.Cancer73:228-235(1996))。在这些病状中的许多中，EGFR的过表达与患者的不良预后相关联或有关。(Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002)Modjtahedi等,Br.J.Cancer73:228-235(1996))。EGFR也在正常组织，特别是皮肤、肝和胃肠道的上皮组织的细胞中表达，但水平通常低于恶性细胞中(Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002))。已报道用以靶向EGFR以及阻断EGFR信号传导路径的各种策略。小分子酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和CI-1033)阻断细胞内酪氨酸激酶区域中EGFR的自体磷酸化，由此抑制下游信号传导事件(Tsao和Herbst,Signal4:4-9(2003))。另一方面，单克隆抗体靶向EGFR的细胞外部分，此导致阻断配体结合以及由此抑制下游事件，诸如细胞增殖(Tsao和Herbst,Signal4:4-9(2003))。包含来自两个或更多个不同物种(例如小鼠和人)的抗体的各部分的的嵌合抗体已作为“缀合”抗体的替代物被开发。举例来说，美国专利号5,891,996(MateodeAcostadelRio等)讨论一种针对EGFR的小鼠/人嵌合抗体R3，并且美国专利号5,558,864讨论鼠类抗EGFRMAb425的嵌合和人源化形式的产生。此外，ErbituxTM是一种嵌合小鼠/人抗EGFR单克隆抗体(基于在人临床试验中产生HAMA应答的小鼠M225单克隆抗体)，其已被报道在各种人异种移植模型中显示抗肿瘤功效。(Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002))。ErbituxTM的功效已被归因于若干机理，包括抑制由EGFR信号传导路径调控的细胞事件，以及可能增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性(Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002))。ErbituxTM也用于临床试验中，包括与放射疗法和化学疗法组合(HerbstandShin,Cancer94:1593-1611(2002))。Abgenix,Inc.(Fremont,Calif.)已开发用于癌症疗法的ABX-EGF。ABX-EGF是一种完全人抗EGFR单克隆抗体。(Yang等,Crit.Rev.Oncol./Hematol.38:17-23(2001))。美国专利号8,097,436提供EGFR靶向抗体的其它实例。已知用抗EGFR单克隆抗体和其它EGFR抑制剂进行的疗法伴有皮肤毒性高发，所述皮肤毒性被认为由于EGFR在表皮、皮脂腺和毛囊上皮的正常组织上表达而发生。最常报道的副作用是见于多达90％的患者中，主要在皮脂溢区域中的丘疹脓疱性皮疹，其中30％足够严重以需要进行医学干预。在一些情况下，皮肤学副作用足够严重以致用抗EGFR单克隆抗体进行的疗法被中止，在降低剂量下继续，或中断。(Boone等,Oncology72:152-159(2007))。本申请也与下列共同拥有的专利申请相关：2011年11月4日提交的PCT/CA2011/001238、2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780、2013年5月10日提交的PCT/CA2013/00471和2013年5月8日提交的PCT/CA2013/050358，所述专利申请各自的整个公开内容据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。概述本文提供一种治疗患有表皮生长因子受体(EGFR)表达性肿瘤的受试者的方法，其包括：使所述肿瘤与有效量的分离的单价EGFR结合构建体接触，所述构建体包含至少一个包含重链可变结构域，以或不以接头偶联于异二聚Fc的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽结合或特异性结合EGFR，并且其中相较于结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体，所述构建体以更大的Bmax结合EGFR。在一些方面，Fc是具有链A中的突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(根据EU编号)和链B中的突变T350V_T366L_K392L_T394W(根据EU编号)的异二聚人IgG1Fc，其中抗原结合多肽结合位于EGFR的细胞外结构域中的表位，其中相较于用结合或特异性结合EGFR的分离的相应单特异性二价抗原结合构建体治疗的受试者，受试者经受较小的由治疗所致的皮肤毒性，并且其中肿瘤表达的第一细胞表面EGFR水平等于或小于一种或多于一种下列细胞系的第二细胞表面EGFR水平：A431、A549、BT474、CACO2、HCT116、JIMT1、MDA-MB-231、SKOV3、MCF7或SKBR3。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体是OA-CTX(v4353)或OA-EG2(v1323)。在一些方面，Fc是异二聚IgG1Fc，Fc包含至少两个CH3序列，其中Fc以或不以接头偶联于抗原结合多肽。在一些方面，Fc是具有链A中的突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(根据EU编号)和链B中的突变T350V_T366L_K392L_T394W(根据EU编号)的人异二聚IgG1Fc。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体包含CDR1、CDR2和/或CDR3，并且其中所述CDR1、CDR2和/或CDR3是表B中所示的相应序列。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体结合位于EGFR的细胞外结构域中的表位。在一些方面，构建体是本文所述的构建体，例如分离的单价EGFR结合构建体。在一些方面，单价EGFR结合构建体是无岩藻糖基化的。在一些方面，使单价EGFR结合构建体缀合于药物，任选其中所述药物是美登木素(maytansinoid)或DM1。在一些方面，用具有增加的功效和降低的不利作用的分离的单价EGFR结合构建体治疗受试者的时期大于用结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体治疗的时期。在一些方面，肿瘤是表皮细胞源性癌、肺癌、乳腺癌、三重阴性乳腺癌、导管性乳腺导管癌、胃癌、卵巢癌、HER2+癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、肾癌、子宫癌或结肠直肠癌。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断EGF结合肿瘤上的EGFR。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断肿瘤中组成性EGFR信号传导。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致ADCC。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致分离的单价EGFR结合构建体的内化。在一些方面，肿瘤表达的第一细胞表面EGFR水平等于或小于或小于一种或多于一种下列细胞系的第二细胞表面EGFR水平：A431、A549、BT474、CACO2、HCT116、JIMT1、MDA-MB-231、SKOV3、MCF7或SKBR3。在一些方面，肿瘤的样品表达小于或等于3+、小于或等于2+、或小于或等于1+的中值EGFR水平，如使用免疫组织化学(IHC)染色所评估。在一些方面，肿瘤表达中值为每个细胞3.5x106或更少、2.8x106或更少、1.2x106或更少、2.4x105或更少、2.6x105或更少、或4.2x104或更少个的EGFR。在一些方面，治疗导致使肿瘤萎缩，抑制肿瘤生长，增加肿瘤进展时间，延长受试者的无疾病存活期，降低转移，增加受试者的无进展存活期，或增加受试者群体的总体存活率。在一些方面，受试者被施用固定剂量的构建体，并且相较于用固定剂量的结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体治疗的受试者，经受较小的由治疗所致的皮肤毒性，并且任选其中所述固定剂量基于摩尔数确定。在一些方面，相较于用固定剂量的结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体治疗的受试者，在用固定剂量的构建体治疗之后，受试者的角质化细胞的生长的降低程度较小，并且任选其中所述固定剂量基于摩尔数确定。在一些方面，肿瘤对曲妥珠单抗(trastuzumab)和/或帕妥珠单抗(pertuzumab)和/或西妥昔单抗(cetuximab)具有抗性，或为其所难治。在一些方面，受试者是人受试者。在一些方面，方法进一步包括提供另外的药剂。在一些方面，另外的药剂结合HER2。在一些方面，另外的药剂是帕妥珠单抗或曲妥珠单抗。在一些方面，同时提供单价EGFR结合构建体和另外的药剂。在一些方面，分开提供单价EGFR结合构建体和另外的药剂。在一些方面，另外的药剂是第二分离的抗原结合构建体。在一些方面，第二分离的抗原结合构建体结合或特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。在一些方面，第二分离的抗原结合构建体结合或特异性结合HER2的ECD2和/或ECD4。在一些方面，治疗导致使肿瘤萎缩，抑制肿瘤生长，增加肿瘤进展时间，延长受试者的无疾病存活期，或增加受试者的存活期。在一些方面，第二分离的抗原结合构建体与本文所述的分离的单价EGFR结合构建体相同，例外之处是第二分离的抗原结合构建体的抗原结合多肽结合或特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。本文也描述一种分离的单价抗原结合构建体，其包含：至少一个包含重链可变结构域的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽结合或特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)；以及异二聚Fc，所述Fc包含至少两个CH3序列，其中所述Fc以或不以接头偶联于所述抗原结合多肽；其中相较于结合或特异性结合EGFR的分离的相应单特异性二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体以更大的Bmax选择性和/或结合或特异性结合EGFR；并且其中二聚化CH3序列具有约68℃或更高的解链温度(Tm)。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体是OA-CTX(v4353)或OA-EG2(v1323)。在一些方面，在大于构建体的观察平衡常数(Kd)直至饱和浓度的浓度下观察到在构建体与靶标比率1:1下，本文所述的构建体相对于单特异性二价抗原结合构建体在Bmax方面增加。在一些方面，相对于结合或特异性结合EGFR的分离的相应单特异性二价抗原结合构建体，分离的单价抗原结合构建体对EGFR具有较低亲和力。在一些方面，分离的单价抗原结合构建体结合位于EGFR的细胞外结构域1、2、3或4或EGFR的细胞外结构域中的表位。在一些方面，抗原结合多肽进一步包含轻链可变结构域、轻链CL1结构域和/或重链CH1结构域。在一些方面，重链可变结构域的氨基酸序列与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽重链可变结构域的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一，并且其中轻链可变结构域的氨基酸序列与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽轻链可变结构域的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一。在一些方面，轻链CL1结构域的氨基酸序列与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽轻链CL1结构域的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一，并且其中重链CH1结构域的氨基酸序列与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽重链CH1结构域的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一。在一些方面，抗原结合多肽是能够结合抗原的Fab片段、scFv、sdAb、抗原结合肽或蛋白质结构域。在一些方面，抗原结合多肽包含重链多肽和轻链多肽。在一些方面，重链多肽包含与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽重链的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一的氨基酸序列，并且轻链多肽包含与表B中所列的EGFR特异性抗原结合多肽轻链的氨基酸序列至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一的氨基酸序列。在一些方面，本文所述的构建体对EGFR具有小于或等于1.16E-8M至8.51E-10M的结合亲和力(KD)。在一些方面，本文所述的构建体在结合于EGFR时相对于对照抑制A431细胞生长，和/或相对于对照增加对BT-474细胞的ADCC介导的靶标细胞溶解％，和/或导致EGFR的内化，和/或导致EGFR的下调。在一些方面，在结合细胞上的EGFR后，构建体被内化至所述细胞中。在一些方面，Fc通过接头融合于抗原结合多肽。在一些方面，接头是多肽接头。在一些方面，接头包含IgG1铰链区。在一些方面，EGFR是EGFR亚型A或EGFRvIII。在一些方面，使构建体缀合于至少一种药物。在一些方面，药物是美登木素。在一些方面，美登木素是DM1。在一些方面，通过SMCC接头使美登木素缀合于构建体。在一些方面，构建体或抗原结合多肽是中和性的。在一些方面，构建体或抗原结合多肽是非中和性的。在一些方面，Fc是人Fc。在一些方面，人Fc是人IgG1Fc。在一些方面，二聚化CH3序列具有约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的解链温度(Tm)。在一些方面，Fc是在表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是在通过单细胞表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，异二聚Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰。在一些方面，异二聚Fc结构域在至少一个CH3序列中包含一个或多个促进形成稳定性与野生型同二聚Fc类似的异二聚体的修饰。在一些方面，异二聚Fc结构域包括/是具有链A中的突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(根据EU编号)和链B中的突变T350V_T366L_K392L_T394W(根据EU编号)的异二聚IgG1Fc。在一些方面，异二聚Fc进一步包含至少一个CH2结构域。在一些方面，异二聚Fc的CH2结构域包含一个或多个修饰。在一些方面，异二聚Fc包含一个或多个用以促进Fc-γ受体的选择性结合的修饰。本文也描述一种与本文所述的分离的单价抗原结合构建体竞争结合EGFR的第二分离的单价抗原结合构建体，任选其中所述第二分离的单价抗原结合构建体将根据任何前述构建体权利要求的分离的单价抗原结合构建体置换大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。本文也描述一种分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体的特征在于下列中的一个或多个：当细胞被构建体所接触时，a.相较于结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体，对BT474细胞、HCT116细胞、MDA-MB-234细胞或SKOV3细胞中的一个或多个的如通过FACS测定的细胞表面结合(BMAX)较高，b.相较于由结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体介导的抗体依赖性细胞细胞毒性，介导对BT-474细胞的增加的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，或c.由JIMT1细胞内化。本文也描述一种分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体是无海藻糖岩藻糖基化的，并且其中相比于由结合或特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体介导的ADCC，所述构建体介导的对A549细胞的ADCC增加1.9倍和/或对HCT116细胞的ADCC增加1.4倍。在一些方面，抗原结合构建体包含至少一个修饰，并且其中修饰是无岩藻糖基化。本文也描述包含至少一种编码本文所述的分离的单价抗原结合构建体的序列的一种分离的多核苷酸或一组分离的多核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸或所述一组多核苷酸是cDNA。本文也描述包含本文所述的多核苷酸或各组多核苷酸中的一个或多个的一种载体或一组载体。在一些方面，载体选自由质粒、病毒载体、非游离性哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体组成的组。本文也描述一种分离的细胞，其包含本文所述的多核苷酸或一组多核苷酸或本文所述的载体。在一些方面，细胞是杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。本文也描述一种包含本文所述的分离的单价抗原结合构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，组合物进一步包括一种或多种选自由下列组成的组的物质：缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂。在一些方面，组合物进一步包括第二分离的抗原结合构建体。在一些方面，第二构建体特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。在一些方面，第二构建体特异性结合HER2的细胞外结构域(ECD)2和/或ECD4。在一些方面，第二构建体与本文所述的分离的单价EGFR结合构建体相同，例外之处是抗原结合多肽特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。本文也描述一种用于医学中的包含本文所述的构建体的药物组合物。在一些方面，组合物用于治疗癌性病状。在一些方面，癌性病状是EGFR表达性癌、上皮细胞源性癌、乳腺癌、HER2表达性癌、肺癌、三重阴性乳腺癌、导管性乳腺导管癌、胃癌、卵巢癌、头颈部癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、肾癌、子宫癌、胰腺癌或结肠直肠癌。本文也描述一种获得本文所述的分离的单价抗原结合构建体的方法，所述方法包括下列步骤：(a)获得宿主细胞培养物，其中所述宿主细胞包含一种或多种编码所述抗原结合构建体的核酸序列；(b)在足以表达所述分离的单价抗原结合构建体的条件下培养所述宿主细胞培养物；以及(c)从所述宿主细胞培养物回收所述抗原结合构建体。本文也描述一种治疗受试者的与EGFR和/或HER信号传导相关的癌症或病症的方法，其包括向有需要的受试者提供有效量的本文所述的药物组合物或构建体。在一些方面，癌症是EGFR表达性癌、上皮细胞源性癌、乳腺癌、HER2表达性癌、肺癌、三重阴性乳腺癌、导管性乳腺导管癌、胃癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、肾癌、子宫癌或结肠直肠癌。在一些方面，方法包括除另外的药剂之外也提供分离的单价构建体。在一些方面，分离的单价构建体与另外的药剂同时提供。在一些方面，分离的单价构建体与另外的药剂分开提供。在一些方面，另外的药剂是第二不同的分离的抗原结合构建体。在一些方面，第二构建体特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。在一些方面，第二构建体特异性结合HER2的ECD2和/或ECD4。在一些方面，第二构建体与权利要求1的分离的单价抗原结合构建体相同，例外之处是抗原结合多肽特异性结合HER2或HER2的细胞外结构域。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断EGF结合肿瘤上的EGFR。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断肿瘤中组成性EGFR信号传导。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致ADCC。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致分离的单价EGFR结合构建体的内化。本文也描述一种抑制肿瘤生长、使肿瘤萎缩或增加患有肿瘤的受试者的存活期的方法，其包括使所述肿瘤与有效量的本文所述的组合物或构建体接触。在一些方面，肿瘤是上皮细胞源性肿瘤或HER2+肿瘤。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断EGF结合肿瘤上的EGFR。在一些方面，分离的单价EGFR结合构建体阻断肿瘤中组成性EGFR信号传导。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致ADCC。在一些方面，使肿瘤与分离的单价EGFR结合构建体接触导致分离的单价EGFR结合构建体的内化。本文也描述一种抑制、降低或阻断细胞中EGFR和/或HER信号传导的方法，其包括使所述细胞与有效量的本文所述的构建体或组合物接触。在一些方面，细胞是EGFR表达性癌细胞、乳腺癌细胞、上皮细胞源性肿瘤细胞、HER2+肿瘤细胞、肺癌细胞、三重阴性乳腺癌细胞、导管性乳腺癌细胞、胃癌细胞以及头颈部癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、子宫颈癌细胞、肾癌细胞、子宫癌细胞或结肠直肠癌细胞。本文也描述一种试剂盒，其包括本文所述的分离的抗原结合构建体和使用说明书，以及任选进一步包括第二分离的抗原结合构建体。本文也描述一种用于制造用以治疗疾病的药剂的如本文所述的分离的抗原结合构建体，任选其中所述疾病是癌，例如EGFR表达性癌、上皮细胞源性癌、乳腺癌、HER2表达性癌、肺癌、三重阴性乳腺癌、导管性乳腺导管癌、胃癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、肾癌、子宫癌或结肠直肠癌。附图简述本发明的这些和其它特征、方面和优势将关于下列描述和附图而变得被更充分了解，其中：图1描绘对示例性单臂抗EGFR抗体(OA-EGFR)v4353和1323的纯度的评估。图1A显示v4353的SEC图谱，其中主峰在保留体积79.95ml处。图1B显示v1323的SEC图谱，其中主峰在保留体积84.74ml处。图1C显示对v4353与v1323两者的SDS-PAGE分析，其中各物质分别在约110kDa和66kDa处。图1D是呈v4353形式的示例性单臂抗EGFR抗体的示意图。图1E是呈v1323形式的示例性单臂抗EGFR抗体的示意图。图1E是呈v7180形式的二价(全尺寸)抗EGFR抗体的示意图。图2描绘示例性中和和非中和OA-EGFR抗体结合EGFR的能力，如通过表面等离子体共振(SPR)所测量。图2A和2B分别描绘v4353(中和抗体)以及它能够结合EGFR和缺乏与HER2的结合的传感图。图2C和2D分别描绘v1323(非中和)以及它能够结合EGFR和缺乏与HER2的结合的传感图。图3描绘示例性OA-EGFR抗体以浓度依赖性和可饱和方式结合HER23+EGFR表达性乳腺癌BT-474细胞的能力。相较于全尺寸二价抗EGFR抗体ErbituxTM，OA-EGFR抗体显示更高Bmax。图4描绘示例性中和和非中和OA-EGFR抗体历经5天暴露来抑制表达EGFR的A431肺癌细胞的生长的能力，其中以中和OA-EGFRv4353而非非中和OA-EGFRv1323观察到抑制。图5描绘在效应细胞与靶标细胞E:T比率25:1下，示例性中和和非中和OA-EGFR抗体介导对乳腺BT-474癌细胞的浓度依赖性ADCC的能力。图6描绘示例性OA-EGFR抗体被内化以及下调EGFR表达的能力的测量结果。图6A显示20nMv4353在JIMT-1细胞中内化和下调EGFR表达的效应。图6B显示100nM和200nMv4353单独或与其它抗体组合在JIMT-1细胞中内化和下调EGFR表达的效应。对于6A和6B中的各实验组，左侧棒条是在4C度下的表面；中间棒条是在37C度下的表面；并且右侧棒条是在37C度下的内部。图7描绘示例性OA-EGFR与OA-HER2抗体的组合在小鼠异种移植模型中抑制产生CTX抗性的卵巢肿瘤SKOV3的生长的能力。图8描绘Kaplan-Meier图，其显示图7的SKOV3异种移植模型中暴露于示例性OA-EGFR与OA-HER2抗体的组合的小鼠的存活率数据。图9显示在蛋白A和SEC纯化之后，示例性无岩藻糖基化OA-EGFRv4353(v7192)抗体的UPLC-SEC色谱图。图10显示示例性无岩藻糖基化OA-EGFRv4353最终产物(v7192)的UPLC-SEC色谱图(图10A和10B)和非还原性SDS-PAGE(图10C)。图11显示通过LC-MS对示例性无岩藻糖基化抗体v7192的胰蛋白酶消化物的聚糖分析。图12显示未缀合的v7104和DM1缀合的v7192示例性OA-EGFR抗体的HIC-HPLC色谱图的重叠图。图13显示未缀合的v7104和缀合的v7192示例性OA-EGFR抗体的HPLC-SEC色谱图的重叠图。图14显示关于各种人肿瘤细胞系的全细胞饱和结合。相较于相应二价抗体，在结肠直肠HCT116(图14A)、三重阴性乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231(图14B)和卵巢SKOV3(图14C)中，OA-EGFR的Bmax增加倍数分别是1.55、1.68和1.38。图15A和15B显示示例性OAA关于Caco2细胞系的在PBMC效应细胞与靶标Caco2细胞E:T比率50:1下评估的浓度依赖性ADCC剂量反应曲线。图16显示无岩藻糖基化(v7192)和非无岩藻糖基化(v4353)示例性OA-EGFR关于TNBCMDA-MB-231细胞的在NK92(CD16a:158V/V)效应细胞与靶标TNBCMDA-MB-231细胞E:T比率5:1下评估的ADCC剂量反应曲线。图17显示示例性OAADC关于人三重阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的生长抑制剂量反应曲线。图18A显示在血清存在下，相较于ErbituxTM和HerceptinTM，示例性OA-EGFR抗体v4353和v7192关于永生化HACAT角质化细胞系的生长抑制剂量反应曲线。图18B显示在不存在血清下，相较于ErbituxTM的生长抑制剂量反应曲线，OA-EGFR抗体v1323的生长抑制剂量反应曲线。图19显示无岩藻糖基化(v7192)示例性OA-EGFR和ErbituxTM(v7180)关于A431细胞、A549细胞和HCT116细胞的ADCC剂量反应曲线，所述细胞在它们的细胞表面上分别表达高、中和低水平的EGFR。详述本文提供包含单价结合抗原的抗原结合多肽构建体的单价抗原结合构建体。在一些方面，构建体包括二聚Fc多肽构建体，其包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽；其中相较于具有两个抗原结合区域的相应单特异性二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的结合密度和Bmax增加，并且其中相较于相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示优越功效和/或生物活性，并且其中所述优越功效和/或生物活性是结合密度增加以及所引起的对靶标细胞的装饰(decoration)增加的结果。由此处提供的单价抗原结合构建体达成的Bmax或结合密度增加以及所引起的靶标装饰增加是特异性靶标结合的效应而非归因于非特异性结合。在某些实施方案中，最大结合发生在靶标与抗体比率1:1下。在某些实施方案中，本文提供的单价抗原结合构建体具有至少一种或多种下列属性：相较于相应单特异性二价抗原结合构建体(FSA)，Bmax增加；Kd与相应FSA类似；相较于相应FSA，解离速率相同或较缓慢；具有降低或部分的激动作用；无靶标交联和二聚化；对目标靶标细胞具有特异性和/或选择性；完全或部分或不抑制靶标细胞生长；具有能够诱导效应物活性的完整Fc；以及能够由靶标细胞内化。在某些实施方案中，本文提供的单价抗原结合构建体具有下列最小属性：相较于相应FSA，Bmax增加；Kd与相应FSA类似；相较于相应FSA，解离速率相同或较缓慢；具有降低或部分的激动作用；无靶标交联和二聚化；对目标靶标细胞具有特异性和/或选择性；完全或部分或不抑制靶标细胞生长；具有能够诱导效应物活性的完整Fc；以及任选能够由靶标细胞内化。本文提供一种单价抗原结合构建体，其中所述构建体是下列至少一个：单价溶解性抗体、单价内化性抗体及其组合。在一些实施方案中，抗原结合构建体视这些抗体显示的在下列功效因素之间的平衡而定是单价溶解性抗体和/或单价内化性抗体：a)单价抗原结合构建体被内化的能力，b)单价抗原结合构建体的Bmax和Kd/缔合-解离速率增加，以及c)单价抗原结合构建体的激动作用/部分激动作用的程度。本文提供一种增加至少一种靶标细胞中抗体浓度的方法，其包括向所述靶标细胞提供单价抗原结合构建体，其包含：单价结合抗原的抗原结合多肽构建体；二聚Fc结构域；其中相较于具有两个抗原结合区域的相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示更好治疗功效，并且其中所述功效不由抗原交联、抗原二聚化、防止抗原调节或防止抗原活化引起。相反，对立面是真实的，即功效可由抗原调节或抗原活化引起，只要这些作用不胜过净杀灭作用即可。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体不展现亲合力。本文提供一种分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中相较于具有两个抗原结合区域的相应FSA构建体，所述单价抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的结合密度和Bmax(最大结合)增加，其中相较于相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示优越功效和/或生物活性，并且其中所述优越功效和/或生物活性是结合密度增加的结果。在某些实施方案中，提供一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中在大于观察平衡常数(Kd)的浓度下以及在抗体的饱和浓度下观察到相对于单特异性二价抗体，结合密度和Bmax增加。在一些实施方案中，优越功效和/或生物活性是相较于所述相应二价抗原结合构建体，FcγR或补体(C1q)结合增加以及较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个的结果。在特定实施方案中，分离的单价抗原结合构建体具有抗增殖性，并且被内化。在某些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中相对于FSA，所述结合密度和Bmax增加不取决于靶标细胞上抗原的密度。在一些实施方案中，提供一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中靶标细胞是癌细胞或EGFR和/或HER2表达性患病细胞。在一实施方案中，本文所述的分离的单价抗原结合构建体不展现亲合力。定义应了解本发明不限于本文所述的特定方案；细胞系、构建体和试剂，并且因此可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的将仅由随附权利要求限制的范围。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与为本发明所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的方法、装置和材料类似或等效的任何方法、装置和材料都可用于实施或测试本发明，但现在描述优选方法、装置和材料。本文提及的所有公布和专利都出于描述和公开的目的以引用的方式并入本文，例如公布中所述的构建体和方法可能与目前描述的本发明关联使用。本文讨论的公布仅由于它们的公开内容在本申请的提交日期之前而加以提供。本文中没有内容应被解释为认可由于先前发明或因为任何其它原因而使本发明者无权先于所述公开。“二聚体”或“异二聚体”是包含至少第一单体多肽和第二单体多肽的分子。在异二聚体的情况下，所述单体中的一个与另一单体有至少一个氨基酸残基不同。在某些实施方案中，二聚体的装配由表面积包埋驱动。在一些实施方案中，单体多肽借助于通过有利于所需二聚体形成和/或不利于其它非所需试样形成来驱动二聚体形成的静电相互作用和/或盐桥相互作用进行彼此相互作用。在一些实施方案中，单体多肽借助于通过有利于所需二聚体形成和/或不利于其它装配类型形成来驱动所需二聚体形成的疏水性相互作用进行彼此相互作用。在某些实施方案中，单体多肽借助于共价键形成进行彼此相互作用。在某些实施方案中，在天然存在或引入的半胱氨酸之间形成驱动所需二聚体形成的共价键。在本文所述的某些实施方案中，在单体之间不形成共价键。在一些实施方案中，多肽借助于通过有利于所需二聚体形成和/或不利于其它非所需实施方案形成来驱动二聚体形成的堆积/尺寸互补/钮入孔/突起-空腔类型相互作用进行彼此相互作用。在一些实施方案中，多肽借助于驱动二聚体形成的阳离子-π相互作用进行彼此相互作用。在某些实施方案中，个别单体多肽在溶液中不能以分离的单体形式存在。如本文所用的术语“Fc结构域”或“Fc”通常是指包含免疫球蛋白重链的C末端多肽序列的二聚体复合物，其中C末端多肽序列是可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的序列。Fc结构域可包含天然或变异Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可能变化，但人IgG重链Fc序列通常被界定为从在约位置Cys226处的氨基酸残基或从约位置Pro230至Fc序列的羧基末端的链段。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两种恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，并且任选包含CH4结构域。就本文“Fc多肽”来说，其意指一种构成Fc结构域的多肽。Fc多肽可从任何适合免疫球蛋白，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得。在一些实施方案中，Fc多肽包含野生型铰链序列的一部分或全部(通常在它的N末端)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能性或野生型铰链序列。抗体“效应物功能”是指可归因于抗体的Fc结构域(天然序列Fc结构域或氨基酸序列变异Fc结构域)的那些生物活性。抗体效应物功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)识别靶标细胞上结合的抗体，并且随后导致所述靶标细胞的溶解。“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下使靶标溶解。补体活化路径由补体系统的第一组分(C1q)结合与同源抗原复合的分子(例如抗体)引发。“抗体依赖性细胞吞噬”和“ADCP”是指通过单核细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用来破坏靶标细胞。术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合抗体的Fc结构域的受体。举例来说，FcR可为天然序列人FcR。通常，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有主要在其细胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列。其它同种型的免疫球蛋白也可由某些FcR结合(参见例如Janeway等,ImmunoBiology:theimmunesysteminhealthanddisease,(ElsevierScienceLtd.,NY)(第4版,1999))。活化性受体FcγRIIA在它的细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在它的细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(综述于Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中)。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods4:25-34(1994)；以及deHaas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其它FcR(包括待在未来鉴定的那些)在本文中由术语“FcR”涵盖。所述术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)；以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。“病症”是将受益于用本发明的抗体或方法治疗的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所论述病症的那些病理学病状。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴性恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星型胶质细胞、下丘脑和其它腺性、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；以及炎症性、免疫和其它血管生成相关病症。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长/增殖不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤/神经胶质瘤(例如间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、间变性寡树突神经胶质细胞瘤、间变性寡树突星形细胞瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)以及各种类型的头颈部癌。如本文所用，“治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可为达成防治而进行，或在临床病变的过程期间进行。合乎需要的治疗作用包括防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓和或改进预后。在一些实施方案中，本发明抗体用于延迟疾病或病症的发展。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法实现肿瘤消退。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法实现对肿瘤/癌生长的抑制。“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源性多核苷酸而与用于插入的方法无关的细胞，所述方法例如直接摄取、转导、f交配或本领域中已知用以产生重组宿主细胞的其它方法。外源性多核苷酸可以例如质粒的非整合载体形式维持，或者，可整合至宿主基因组中。如本文所用，术语“介质(medium/media)”包括可供养或含有包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)宿主细胞的任何宿主细胞和细胞内含物的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性载体。因此，所述术语可涵盖其中已生长有宿主细胞的培养基，例如蛋白质已分泌至其中的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂，诸如在其中本文所述的抗原结合构建体在细胞内产生，并且宿主细胞被溶解或破坏以释放异多聚体的情况下。如本文所用，术语“调节的血清半衰期”意指由本文所述的抗原结合构建体包含的抗原结合多肽相对于它的天然形式，在循环半衰期方面有正性或负性变化。通过在施用构建体之后在各个时间点获取血液样品，以及测定各样品中那个分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间关联允许计算血清半衰期。血清半衰期合乎需要地增加至少约两倍，但较小增加可为适用的，例如当它使得能够达成满意给药方案或避免毒性作用时。在一些实施方案中，增加是至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。如本文所用的术语“调节的治疗半衰期”意指由本文所述的单价抗原结合构建体包含的抗原结合多肽相对于它的非修饰形式，在治疗有效量的半衰期方面有正性或负性变化。通过在施用之后在各个时间点测量分子的药物动力学和/或药力学性质来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期合乎需要地使得能够达成特定有益给药方案、特定有益总剂量，或避免非所需作用。在一些实施方案中，增加的治疗半衰期由效价增加、修饰的分子与它的靶标的结合增加或降低、诸如蛋白酶的酶对分子的分解增加或降低、或非修饰分子的另一参数或作用机理的增加或降低、或受体介导的分子清除的增加或降低所致。术语“分离的”在应用于核酸或蛋白质时表示所述核酸或蛋白质不含至少一些它在天然状态下与其相伴的细胞组分，或所述核酸或蛋白质已在大于它的体内或体外产生浓度的程度上加以浓缩。它可呈均质状态。分离的物质可呈干燥或半干燥状态，或呈包括但不限于水溶液的溶液形式。它可为包含其它药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物的组分。通常使用分析化学技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是大致上纯化的。特定来说，分离的基因与侧接所述基因，并且编码除目标基因以外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生大致上一个条带。特定来说，这可意指核酸或蛋白质的纯度是至少85％纯度、至少90％纯度、至少95％纯度、至少99％或更大纯度。术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有类似结合性质，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式加以代谢。除非另外明确限制，否则所述术语也指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等)。除非另外指示，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，涉及多肽的描述同等适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖具有任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基由共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构，即结合于氢的碳、羧基、氨基和R基团的化合物，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。所述类似物具有修饰的R基团(诸如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。提及氨基酸包括例如天然存在的形成蛋白的L-氨基酸；D-氨基酸、化学修饰的氨基酸，诸如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非形成蛋白的氨基酸，诸如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域中已知为氨基酸所特有的性质的化学合成化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如磺基丙氨酸)。将非天然氨基酸(包括合成非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸)并入本发明的蛋白质中可在许多不同方面有利。含有D-氨基酸的肽等相较于含有L-氨基酸的对应物展现体外或体内稳定性增加。因此，当需要或要求较大细胞内稳定性时，构建并有D-氨基酸的肽等可为特别适用的。更具体来说，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，由此在所述性质合乎需要时提供改进的分子生物可用度和延长的体内寿命。另外，D-肽等不能被高效处理以达成向T辅助细胞进行II类主要组织相容性复合物限制的递呈，并且因此在整个生物体中诱导体液免疫应答的可能性较小。氨基酸在本文中可通过它们的通常已知三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可通过它们的通常接受的单字母代码来提及。“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列与核酸序列两者。就特定核酸序列而言，“保守修饰的变体”是指编码同一或基本上同一氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上同一序列。由于遗传密码的简并性，许多在功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由某一密码子指定的每个位置处，所述密码子可改变成所述任何相应密码子而不改变编码的多肽。所述核酸变化是“沉默变化”，其是一种保守修饰的变化。本文每个编码多肽的核酸序列也描述核酸的每个可能的沉默变化。本领域普通技术人员将认识到核酸中的各密码子(除AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子)之外)可被修饰以产生在功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变化隐含于各所述序列中。关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸的缺失，氨基酸的添加，或氨基酸被化学类似氨基酸取代。提供功能类似氨基酸的保守性取代表为本领域普通技术人员所知。所述保守修饰的变体除了并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。提供功能类似氨基酸的保守性取代为本领域普通技术人员所知。下列八组各自含有彼此是保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins:StructuresandMolecularProperties(WHLreeman&Co.；第2版(1993年12月))。术语“同一”或“同一性”百分比在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下是指两个或更多个序列或子序列是相同的。如使用一种下列序列比较算法(或可为本领域普通技术人员所用的其它算法)或通过手动比对和目视检查所测量，如果序列在比较和对准以达成历经比较窗或指定区域的最大对应时具有某一百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即历经指定区域约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，那么它们是“大致上同一的”。这个定义也涉及测试序列的互补序列。同一性可历经长度是至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或历经长度是75-100个氨基酸或核苷酸的区域，或当未指定时跨越多核苷酸或多肽的整个序列而存在。编码本发明的多肽(包括来自除人以外的物种的同源物)的多核苷酸可通过包括下列步骤的方法获得：在严格杂交条件下用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记的探针筛选文库，以及分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。所述杂交技术为熟练技术人员所熟知。对于序列比较，通常一个序列充当测试序列与其进行比较的参照序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用缺省程序参数，或可指定替代性参数。序列比较算法接着基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。如本文所用的“比较窗”包括提及具有选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的任一数目的连续位置的区段，其中在两个序列最优对准之后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参照序列进行比较。对准序列以进行比较的方法为本领域普通技术人员所知。可包括但不限于通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444的类似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行程序(WisconsinGenetics软件包(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手动比对和目视检查(参见例如Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(1995补编))来进行供比较的序列的最优比对。适于确定序列同一性百分比和序列类似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1997)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402以及Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过在万维网处在ncbi.nlm.nih.gov下可用的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用字长(W)11、预期值(E)10、M＝5、N＝-4以及比较两个链作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和预期值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对值(B)50、预期值(E)10、M＝5、N＝-4和比较两个链作为缺省值。BLAST算法通常在关闭“低复杂性”过滤下进行。BLAST算法也进行两个序列之间的类似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种类似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供对在两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配所具有的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参照核酸比较时的最小总和概率小于约0.2、或小于约0.01、或小于约0.001，那么核酸被视为与参照序列类似。短语“选择性(或特异性)杂交于”是指在严格杂交条件下，当特定核苷酸序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时，分子仅与那个序列结合、双链化或杂交。短语“严格杂交条件”是指DNA、RNA或其它核酸序列或其组合在如本领域中所知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将杂交于复杂核酸混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中它的靶标子序列，而不杂交于所述复杂混合物中其它序列。严格条件依赖于序列，并且在不同情况下将不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的一详尽指南见于Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes,\Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays\(1993)中。如本文所用，术语“真核生物”是指属于系统发生域真核域的生物体，诸如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、小孢子虫目、原生生物等。如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等)系统发生域或古细菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、盐杆菌属(Halobacterium)(诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和盐杆菌属种NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、掘越氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrumpernix)等)系统发生域。如本文所用的术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，并且在其它实施方案中是指人。动物可为伴侣动物(例如狗、猫等)农场动物(例如母牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。如本文所用的术语“有效量”是指所施用的单价抗原结合构建体的将在一定程度上减轻所治疗疾病、病状或病症的一种或多种症状的那个量。含有本文所述的构建体的组合物可被施用以达成防治性、增强性和/或治疗性治疗。术语“增强(enhance/enhancing)”意指在效价或持续时间方面增加或延长所需作用。因此，关于增强药物分子或治疗剂的作用，术语“增强”是指能够在效价或持续时间方面增加或延长治疗剂对系统的作用。如本文所用的“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂或药物在所需系统中的作用的量。当用于患者中时，有效达成这个用途的量将取决于疾病、病症或病状的严重性和过程、先前疗法、患者的健康状态和对药物的响应、以及治疗医师的判断。如本文所用的术语“修饰”是指对给定多肽进行的任何变化，诸如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的变化，对多肽的共翻译修饰或翻译后修饰。形式“(修饰)”术语意指所讨论的多肽任选被修饰，也就是说所讨论的多肽可被修饰或未修饰。术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸的在这种氨基酸已并入多肽链中之后对它进行的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。如本文所用的术语“单特异性二价抗原结合构建体”是指具有两个抗原结合结构域(二价)的抗原结合构建体，所述结构域两者均结合相同表位/抗原(单特异性)。抗原结合结构域可为但不限于蛋白质构建体，诸如Fab(抗原结合片段)、scFv(单链Fv)和sdab(单结构域抗体)。单特异性二价抗原结合构建体在本文中也称为“全尺寸抗体”或“FSA”。在一些实施方案中，单特异性二价抗原结合构建体是针对其来衡量单价抗原结合构建体的性质的参照。在其它实施方案中，两种单特异性二价抗原结合构建体的组合是针对其来衡量两种单价抗原结合构建体的组合的性质的参照。在其中使用两种单特异性二价抗原结合构建体的组合的情况下，单特异性二价抗原结合构建体结合EGFR上非重叠表位。在一些实施方案中，当使用两种单特异性二价抗原结合构建体的组合时，单一单特异性二价抗原结合构建体被用作参照，其中所述单一单特异性二价抗原结合构建体代表护理标准(SOC)疗法，例如爱必妥(Erbitux)。短语构建体“特异性结合”靶标是指在其它生物物质的异质群体存在下确定存在所述靶标的结合反应。因此，在指定免疫测定条件下，指定构建体特异性结合特定靶标，并且不大量结合样品中存在的其它生物物质。在所述条件下，抗原结合构建体与靶标特异性结合要求抗原结合构建体对靶标具有特异性。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗原结合构建体。举例来说，固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗原结合构建体(例如单克隆抗体)。对于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork。术语“亲合力”在此处用于指代治疗性单特异性二价抗体的结合亲和力与关键结构和生物属性的组合协同强度。缺乏亲合力以及损失协同结合强度可导致表观靶标结合亲和力降低。另一方面，在具有固定抗原数目的靶标细胞上，由多价(或二价)结合所致的亲合力导致相对于显示单价结合的抗体，在较低抗体分子数目下达成靶标抗原占位增加。在施加二价溶解性抗体时，在较低数目的抗体分子结合于靶标细胞的情况下，抗体依赖性细胞毒性杀灭机理可能不高效发生，从而导致功效降低。无足够抗体被结合来介导ADCC、CDC、ADCP，因为这些类型的效应物功能通常被视为具有Fc浓度阈值依赖性。在激动性抗体的情况下，亲合力降低使它们用以交联和二聚化抗原以及活化路径的效率降低。“单结构域抗体”或“Sdab”-单结构域抗体，诸如骆驼科VhH结构域，是个别免疫球蛋白结构域。Sdab十分稳定以及易于作为融合配偶体与抗体的Fc链一起表达(HarmsenMM,DeHaardHJ(2007).\Properties,production,andapplicationsofcamelidsingle-domainantibodyfragments\.Appl.MicrobiolBiotechnol.77(1):13-22)。如本文所用，术语“EGFR”是指表皮生长因子受体(也称为HER-1或Erb-B1)，包括人形式(Ulrich,A.等,Nature309:418-425(1984)；SwissProt登记号P00533；二级登记号：O00688、O00732、P06268、Q14225、Q92795、Q9BZS2、Q9GZX1、Q9H2C9、Q9H3C9、Q9UMD7、Q9UMD8、Q9UMG5)以及其天然存在的亚型和变体。所述亚型和变体包括但不限于EGFRvIII变体、选择性剪接产物(例如如用SwissProt登记号P00533-1、P00533-2、P00533-3、P00533-4所标识)、变体GLN-98、ARG-266、Lys-521、ILE-674、GLY-962和PRO-988(Livingston,R.J.等,NIEHS-SNPs,environmentalgenomeproject,NIEHSES15478,DepartmentofGenomeSciences,Seattle,Wash.(2004))以及用下列登记号标识的其它亚型和变体：NM005228.3、NM201282.1、NM201283.1、NM201284.1(REFSEQmRNA)；AF125253.1、AF277897.1、AF288738.1、AI217671.1、AK127817.1、AL598260.1、AU137334.1、AW163038.1、AW295229.1、BC057802.1、CB160831.1、K03193.1、U48722.1、U95089.1、X00588.1、X00663.1；H54484S1、H54484S3、H54484S2(MIPS集合)；DT.453606、DT.86855651、DT.95165593、DT.97822681、DT.95165600、DT.100752430、DT.91654361、DT.92034460、DT.92446349、DT.97784849、DT.101978019、DT.418647、DT.86842167、DT.91803457、DT.92446350、DT.95153003、DT.95254161、DT.97816654、DT.87014330、DT.87079224(DOTS集合)。本文参照的所有登记号都取自截至2013年11月8日的NCBI数据库(或其它相关参照数据库)。“HER受体”是属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，并且包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体将通常包含细胞外结构域，其可结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守细胞内酪氨酸激酶结构域；和具有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号传导结构域。HER2的细胞外(ecto)结构域包括四个结构域，即结构域I(ECD1，约1-195的氨基酸残基)、结构域II(ECD2，约196-319的氨基酸残基)、结构域III(ECD3，约320-488的氨基酸残基)和结构域IV(ECD4，约489-630的氨基酸残基)(在无信号肽下进行残基编号)。参见Garrett等Mol.Cell.11:495-505(2003)；Cho等Nature421:756-760(2003)；Franklin等CancerCell5:317-328(2004)；Tse等CancerTreatRev.2012年4月；38(2):133-42(2012)；或Plowman等Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，并且是指例如描述于Semba等,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)以及Yamamoto等Nature319:230-234(1986)中的人HER2蛋白(Genebank登记号X03363)。术语“erbB2”和“neu”是指编码人ErbB2蛋白的基因，p185或p185neu是指neu基因的蛋白质产物。优选HER2是天然序列人HER2。就“HER配体”来说，其意指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别关注的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等,J.Biol.Chern.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等,Science223:1079-1082(1984))；双调蛋白，也称为许旺氏瘤(schwanoma)或角质化细胞自分泌生长因子(Shoyab等Science243:1074-1076(1989)；Kimura等Nature348:257-260(1990)；以及Cook等Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；β细胞素(Shing等,Science259:1604-1607(1993)；以及Sasada等Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等,Science251:936-939(1991))；上皮调节蛋白(Toyoda等,J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995)；以及Komurasaki等Oncogene15:2841-2848(1997))；调蛋白(heregulin)(参见下文)；神经调节蛋白(neuregulin)-2(NRG-2)(Carraway等,Nature387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等Oncogene18:2681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞素、HB-EGF和上皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括β细胞素、上皮调节蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。“调蛋白”(HRG)在本文中使用时是指由调蛋白基因产物编码的多肽，如美国专利号5,641,869或Marchionni等,Nature,362:312-318(1993)中所公开。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等,Science,256:1205-1210(1992)；以及美国专利号5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles等Cell69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性物(ARIA)(Falls等Cell72:801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等,Nature,362:312-318(1993))；感觉和运动神经元源性因子(SMDF)(Ho等J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等Oncogene15:1385-1394(1997))。所述术语包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列变体，诸如其EGF样结构域片段(例如HRGβ1177-244)。“HER活化”或“HER2活化”是指任何一种或多种HER受体或HER2受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号传导(例如由HER受体的细胞内激酶结构域引起的使所述HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基磷酸化的信号传导)。HER活化可通过HER配体结合包含目标HER受体的HER二聚体来介导。HER配体结合HER二聚体可活化二聚体中一个或多个HER受体的激酶结构域，并且由此导致一个或多个HER受体中的酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽(诸如Akt或MAPK细胞内激酶)中的酪氨酸残基的磷酸化。抗体的“Fab片段”(也被称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含抗原结合中涉及的互补决定环(CDR，也被称为高变区)。Fab'片段与Fab片段因在重链CH1结构域的羧基末端添加有少许残基而不同，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽进一步包含在VH结构域与VL结构域之间的使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于scFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458中。非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供者抗体)的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含不见于接受者抗体中或供者抗体中的残基。这些修饰被进行以进一步改善抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且全部或大致上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选也将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定区。对于其它细节，参见Jones等,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或曲妥珠单抗如以引用的方式明确并入本文的美国专利号5,821,337的表3中所述；人源化520C9(WO93/21319)和20'人源化2C4抗体，如美国专利公布号2006/0018899中所述。“表位2C4”是HER2的细胞外结构域中抗体2C4所结合的区域。为筛选结合2C4表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定，诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow和DavidLane编(1988)中所述的测定。或者，可使用本领域中已知的方法进行表位定位以评估抗体是否结合HER2的2C4表位，和/或可研究抗体-HER2结构(Franklin等CancerCell5:317-328(2004))以观察HER2的什么结构域被抗体结合。表位2C4包含来自HER2的细胞外结构域中的结构域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的接合处结合HER2的细胞外结构域。Franklin等CancerCell5:317-328(2004)。“表位4D5”是HER2的细胞外结构域中抗体4D5(ATCCCRL10463)和曲妥珠单抗所结合的区域。这个表位接近于HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定，诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow和DavidLane编(1988)中所述的测定。或者，可进行表位定位以评估抗体是否结合HER2的4D5表位(例如从约残基529至约残基625(包括端值)的区域中任何一个或多个残基，参见美国专利公布号2006/0018899的图1)。“表位7C2/F3”是在HER2的细胞外结构域的N末端，在结构域I内7C2和/或7F3抗体(各自保藏在ATCC，参见下文)所结合的区域。为筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可进行常规交叉阻断测定，诸如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow和DavidLane编(1988)中所述的测定。或者，可进行表位定位以确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2的从约残基22至约残基53的区域中任何一个或多个残基，参见美国专利公布号2006/0018899的图1)。如本文所用的术语“抗原调节”是指通过内化或下调来使表面受体密度变化或损失，诸如在ADC的情况下。抗原结合构建体在某些实施方案中，提供一种结合具有低EGFR和/或HER2表达的靶标细胞上的EGFR和/或HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合EGFR和/或HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的EGFR和/或HER2的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在某些实施方案中，具有低EGFR和/或HER2表达的靶标细胞是癌细胞。在一些实施方案中，具有低EGFR和/或HER2表达的靶标细胞是上皮细胞源性癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、三重阴性乳腺癌细胞、导管性乳腺导管癌细胞、胃癌细胞、头颈部癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或结肠直肠癌细胞。在一些实施方案中，具有低EGFR和/或HER2表达的靶标细胞是乳腺癌细胞。在某些实施方案中，单价结合抗原的抗原结合多肽构建体可源于已知抗体或抗原结合结构域，或可源于新型抗体或抗原结合结构域。对用于单价抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体的鉴定基于对靶标细胞的选择以及对在靶标细胞表面上表达的抗原的选择。举例来说，一旦已选择靶标细胞，那么选择下列抗原：a)在靶标细胞的细胞表面上表达，但不在其它细胞的表面上表达，或b)以较高水平在靶标细胞的细胞表面上表达，但以较低水平在其它细胞的表面上表达。这允许选择性靶向靶标细胞。EGFR结合构建体在一些实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体被设计以靶向表达EGFR的细胞，并且抗原结合多肽构建体结合EGFR。EGFR是属于人表皮生长因子受体(EGFR)家族的原致癌基因，并且常常在一子组癌症中过表达。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是低、中或高EGFR表达性细胞。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是低EGFR表达性细胞。在另一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是与二价EGFR结合抗体的结合降低的低EGFR表达性细胞。在另一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是低EGFR表达性细胞。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是癌细胞。在某一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是上皮细胞源性癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、三重阴性乳腺癌细胞、导管性乳腺导管癌细胞、胃癌细胞、头颈部癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或结肠直肠癌细胞。在本文所述的单价抗原结合构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异二聚的。在所述单价抗原结合构建体的一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合至少一个EGFR细胞外结构域。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合由作为低、中或高EGFR表达性细胞的靶标细胞表达的EGFR。在某些实施方案中，EGFR表达性细胞显示与二价EGFR结合抗体的结合降低。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR，并且靶标细胞是与二价EGFR结合抗体的结合降低的雌激素受体阴性细胞、孕酮受体阴性细胞和抗EGFR抗体抗性肿瘤细胞中的至少一个。在本文所述的单价抗原结合构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异二聚的。在本文所述的单价抗原结合构建体的某些实施方案中，单价抗原结合多肽构建体是能够结合抗原的Fab片段、scFv和sdAb、抗原结合肽或蛋白质结构域。在一些实施方案中，提供一种如本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中单价抗原结合多肽构建体是包含重链多肽和轻链多肽的Fab片段。本文提供一种结合EGFR的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合EGFR的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合EGFR的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的EGFR的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价EGFR结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在某些实施方案中，提供一种结合具有低EGFR表达的靶标细胞上的EGFR的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合EGFR的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合EGFR的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的EGFR的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价EGFR结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在某些实施方案中，具有低EGFR表达的靶标细胞是癌细胞。在一些实施方案中，具有低EGFR表达的靶标细胞是上皮细胞源性癌细胞。在一实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中抗原结合构建体抑制靶标细胞增殖。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述单价EGFR结合多肽构建体是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一个。在一些实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个的程度高于具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体。在一些实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的至少约105％。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的大于约110％。HER2结合构建体在一些实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体被设计以靶向表达HER2的细胞，并且抗原结合多肽构建体结合HER2。HER2是属于人表皮生长因子受体(EGFR)家族的原致癌基因，并且常常在一子组乳腺癌中过表达。HER2蛋白也称为neu基因的产物、EGFR2、CD340、ErbB2和p185。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是低、中或高HER2表达性细胞。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是低HER2表达性细胞。在另一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是与二价HER2结合抗体的结合降低的低HER2表达性细胞。在另一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是与曲妥珠单抗的结合降低的低HER2表达性细胞。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是癌细胞。在某一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是乳腺癌细胞。在本文所述的单价抗原结合构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异二聚的。在所述单价抗原结合构建体的一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合至少一个HER2细胞外结构域。在某些实施方案中，细胞外结构域是ECD1、ECD2、ECD3和ECD4中的至少一个。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合由作为低、中或高HER2表达性细胞的靶标细胞表达的HER2。在某些实施方案中，HER2表达性细胞显示与二价HER2结合抗体的结合降低。在一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2，并且靶标细胞是与二价HER2结合抗体的结合降低的雌激素受体阴性细胞、孕酮受体阴性细胞和抗HER2抗体抗性肿瘤细胞中的至少一个。在本文所述的单价抗原结合构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异二聚的。在本文所述的单价抗原结合构建体的某些实施方案中，单价抗原结合多肽构建体是能够结合抗原的Fab片段、scFv和sdAb、抗原结合肽或蛋白质结构域。在一些实施方案中，提供一种如本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中单价抗原结合多肽构建体是包含重链多肽和轻链多肽的Fab片段。本文提供一种结合HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价HER2结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在某些实施方案中，提供一种结合具有低HER2表达的靶标细胞上的HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价HER2结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在某些实施方案中，具有低HER2表达的靶标细胞是癌细胞。在一些实施方案中，具有低HER2表达的靶标细胞是乳腺癌细胞。本文提供一种结合HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：在是ECD1、ECD2和ECD3-4中的至少一个的细胞外结构域(ECD)处单价结合HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的HER2ECD1、2、和3-4中的至少一个的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价HER3结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。本文提供一种结合HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：在是ECD1、ECD2、ECD3和ECD4中的至少一个的细胞外结构域(ECD)处单价结合HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽融合于至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽；其中所述抗原结合构建体具有抗增殖性，并且由靶标细胞内化，其中相较于结合HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的HER2ECD1、2、3和4中的至少一个的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价HER2结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。在一实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中抗原结合构建体抑制靶标细胞增殖。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述单价HER2结合多肽构建体是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一个。在一些实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个的程度高于具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体。在一些实施方案中的是本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的至少约105％。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的大于约110％。靶标细胞的选择基于单价抗原结合构建体的预定用途选择靶标细胞。在一个实施方案中，靶标细胞是在癌症、感染性疾病、自体免疫疾病或炎症性疾病中活化或扩增的细胞。在一个实施方案中，当单价抗原结合构建体意图用于治疗癌症时，靶标细胞源于展现EGFR和/或HER23+过表达的肿瘤。在一个实施方案中，靶标细胞源于展现EGFR和/或HER2低表达的肿瘤。在一个实施方案中，靶标细胞源于展现EGFR和/或HER2抗性的肿瘤。在一个实施方案中，靶标细胞源于是三重阴性(ER/PR/HER2)肿瘤的肿瘤。在其中单价抗原结合构建体意图用于治疗癌症的实施方案中，靶标细胞是代表EGFR和/或HER23+过表达的癌细胞系。在一个实施方案中，靶标细胞是代表EGFR和/或HER2低表达的癌细胞系。在一个实施方案中，靶标细胞是代表EGFR和/或HER2抗性的癌细胞系。在一个实施方案中，靶标细胞是代表乳腺癌三重阴性的癌细胞系，例如MDA-MD-231细胞。在一个实施方案中，本发明的单价抗原结合构建体被设计以靶向乳腺癌细胞或上皮细胞源性癌细胞。在一个实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体被设计以靶向胃腺癌和食道腺癌。示例性组织学类型包括：具有肠表型的HER2阳性近端胃癌和HER2阳性远端弥漫性胃癌。胃癌细胞的示例性类别包括但不限于(N-87、OE-19、SNU-216和MKN-7)。在另一实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体被设计以靶向脑中转移性HER2+乳腺癌肿瘤。胃癌细胞的示例性类别包括但不限于BT474。在其中本发明的单价抗原结合构建体被设计以靶向癌细胞的实施方案中，抗原结合多肽构建体单价结合在所述癌细胞的表面上表达的抗原。适合抗原包括但不限于EGFR和/或HER2。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合的表位是靶标细胞上靶标抗原的细胞外结构域。在其中单价抗原结合构建体包含结合EGFR的抗原结合多肽构建体的实施方案中，所述抗原结合多肽构建体结合EGFR或EGFR的特定结构域或表位。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合EGFR的细胞外结构域。抗体的选择在其中单价抗原结合构建体包含结合EGFR的抗原结合多肽构建体的实施方案中，所述抗原结合多肽构建体可源于呈各种形式的已知抗EGFR抗体或抗EGFR结合结构域，包括Fab片段、scFv和sdab。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体可源于这些抗体的人源化或嵌合形式。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源于曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗或其人源化形式的Fab片段。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源于scFv。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源于sdab。FC抗原结合构建体可包含Fc，例如二聚Fc。术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C末端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。除非另外规定，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽中的一个，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区，能够稳定自身缔合的多肽。举例来说，二聚IgGFc的Fc多肽包含IgGCH2和IgGCH3恒定结构域序列。Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列，一个来自二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。CH2结构域包含两个CH2序列，一个来自二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面，Fc以或不以一个或多个接头偶联于第一抗原结合构建体和/或第二抗原结合构建体。在一些方面，Fc是人Fc。在一些方面，Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面，Fc是异二聚Fc。在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH2序列。在一些方面，Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰。在一些方面，Fc在至少一个CH2序列中包含一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单一多肽，例如其中二聚体的两个多肽由多肽接头连接的二聚Fc。在一些方面，Fc是多个肽，例如两个多肽。在一些方面，Fc是专利申请PCT/CA2011/001238(2011年11月4日提交)或PCT/CA2012/050780(2012年11月2日提交)中所述的Fc，所述专利申请各自的整个公开内容据此出于所有目的以引用的方式整体并入本文。修饰的CH3结构域在一些方面，本文所述的抗原结合构建体包含异二聚Fc，其包含修饰的CH3结构域，所述结构域已被不对称修饰。异二聚Fc可包含两个重链恒定结构域多肽：第一Fc多肽和第二Fc多肽，其可被可互换使用，前提是Fc包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。通常，第一Fc多肽包含第一CH3序列，并且第二Fc多肽包含第二CH3序列。当两个CH3序列二聚化时，包含一个或多个以不对称方式引入的氨基酸修饰的两个CH3序列通常产生异二聚Fc而非同二聚体。如本文所用，“不对称氨基酸修饰”是指下列任何修饰：其中在第一CH3序列上特定位置处的氨基酸不同于第二CH3序列上在相同位置处的氨基酸，并且第一和第二CH3序列优先配对以形成异二聚体而非同二聚体。这个异二聚化可为仅修饰在各序列上相同相应氨基酸位置处的两个氨基酸中的一个；或修饰各序列上在第一和第二CH3序列中的各个上的相同相应位置处的两个氨基酸的结果。异二聚Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或多于一个不对称氨基酸修饰。表A提供人IgG1Fc序列的氨基酸序列，对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。通常，Fc可包括两个能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包括一个或多个在下列位置处的突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号。在一些方面，Fc包括表A中所示的突变序列。在一些方面，Fc包括变体1A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体2A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体3A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体4A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体5A-B的突变。表A：IgG1Fc序列参照全长人IgG1重链的氨基酸231至447，第一和第二CH3序列可包含如本文所述的氨基酸突变。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T394处具有氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有一个或多个选自L351Y、F405A和Y407V的氨基酸修饰，并且第二CH3序列具有一个或多个选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，并且第一或第二CH3序列中的一个在位置Q347处进一步包含氨基酸修饰，而另一CH3序列在位置K360处进一步包含氨基酸修饰。在另一实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，第一或第二CH3序列中的一个在位置Q347处进一步包含氨基酸修饰，而另一CH3序列在位置K360处进一步包含氨基酸修饰，并且所述CH3序列中的一个或两个进一步包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，并且所述第一和第二CH3序列中的一个进一步包含氨基酸修饰D399R或D399K，而另一CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个。在另一实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列中的一个进一步包含氨基酸修饰D399R或D399K，而另一CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个，并且所述CH3序列中的一个或两个进一步包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，其中所述CH3序列中的一个或两个进一步包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，其包含下列氨基酸修饰，其中“A”代表对第一CH3序列的氨基酸修饰，并且“B”代表对第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392M_T394W，A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392M_T394W，A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V，和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。一个或多个不对称氨基酸修饰可促进形成异二聚Fc，其中异二聚CH3结构域具有与野生型同二聚CH3结构域类似的稳定性。在一实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进形成异二聚Fc结构域，其中所述异二聚Fc结构域具有与野生型同二聚Fc结构域类似的稳定性。在一实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰促进形成异二聚Fc结构域，其中所述异二聚Fc结构域具有在差示扫描量热法研究中通过解链温度(Tm)观察的稳定性，并且其中解链温度在对于相应对称野生型同二聚Fc结构域观察的解链温度的4℃内。在一些方面，Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个促进形成稳定性与野生型同二聚Fc类似的异二聚Fc的修饰。在一个实施方案中，CH3结构域的稳定性可通过例如通过差示扫描量热法(DSC)测量CH3结构域的解链温度来评估。因此，在另一实施方案中，CH3结构域具有约68℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约70℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约72℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约73℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约75℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约78℃或更高的解链温度。在一些方面，二聚化CH3序列具有约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的解链温度(Tm)。在一些实施方案中，相较于表达产物中的同二聚Fc，包含修饰的CH3序列的异二聚Fc可以至少约75％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约80％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约85％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约90％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约95％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约97％的纯度形成。在一些方面，Fc是在表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是在通过单细胞表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。用于修饰单体Fc多肽以促进异二聚Fc形成的其它方法描述于国际专利公布号WO96/027011(钮入孔)、Gunasekaran等(GunasekaranK.等(2010)JBiolChem.285,19637-46，用以实现选择性异二聚化的静电设计)、Davis等(Davis,JH.等(2010)ProtEngDesSel；23(4):195-202，链交换工程改造结构域(SEED)技术)以及Labrijn等[EfficientgenerationofstablebispecificIgG1bycontrolledFab-armexchange.LabrijnAF,MeestersJI,deGoeijBE,vandenBremerET,NeijssenJ,vanKampenMD,StrumaneK,VerploegenS,KunduA,GramerMJ,vanBerkelPH,vandeWinkelJG,SchuurmanJ,ParrenPW.ProcNatlAcadSciUSA.2013年3月26日；110(13):5145-50)中。在一些实施方案中，本文所述的分离的抗原结合构建体包含结合抗原的抗原结合多肽构建体；以及二聚Fc，其相对于不包括相同二聚Fc的抗原结合构建体具有优越生物物理学性质，如稳定性和制造便利性。本领域中已知Fc区中用于选择性改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力的许多氨基酸修饰。在一些方面，Fc包含一个或多个用以促进选择性结合Fcγ受体的修饰。这些类型的氨基酸修饰通常位于抗原结合构建体的CH2结构域或铰链区中。CH2结构域Fc的CH2结构域是表A中所示的序列的氨基酸231-340。下列列出示例性突变：·S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(LuY,VemesJM,ChiangN,等JImmunolMethods.2011年2月28日；365(1-2):132-41)；·F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(StavenhagenJB,GorlatovS,TuaillonN,等CancerRes.2007年9月15日；67(18):8882-90；NordstromJL,GorlatovS,ZhangW,等BreastCancerRes.2011年11月30日；13(6):R123)；·F243L(StewartR,ThomG,LevensM,等ProteinEngDesSel.2011年9月；24(9):671-8.)、S298A/E333A/K334A(ShieldsRL,NamenukAK,HongK,等JBiolChem.2001年3月2日；276(9):6591-604)；·S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(LazarGA,DangW,KarkiS,等ProcNatlAcadSciUSA.2006年3月14日；103(11):4005-10)；·S239D/S267E,S267E/L328F(ChuSY,VostiarI,KarkiS,等MolImmunol.2008年9月；45(15):3926-33)；·S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及以引用的方式并入本文的WO2011/120134和WO2011/120135中所列的其它突变。TherapeuticAntibodyEngineering(由WilliamR.Strohl和LilaM.Strohl所著,Woodhead生物医学出版丛书第11辑,ISBN1907568379,2012年10月)在第283页列出突变。在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个用以促进选择性结合FcγR的不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域允许分离和纯化本文所述的分离的构建体。用以改进效应物功能的其它修饰。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体可被修饰以改进它的效应物功能。所述修饰在本领域中是已知的，并且包括无岩藻糖基化，或工程改造Fc对活化受体(对于ADCC来说，主要是FCGR3a)以及对C1q(对于CDC来说)的亲和力。下表B1概述文献中报道的用于效应物功能工程改造的各种设计。因此，在一个实施方案中，本文所述的构建体可包括包含一个或多个如表B1中指示的赋予改进的效应物功能的氨基酸修饰的二聚Fc。在另一实施方案中，构建体可被无岩藻糖基化以改进效应物功能。表B1：CH2结构域和效应物功能工程改造。降低FcγR和/或补体结合和/或效应物功能的Fc修饰在本领域中是已知的。新近出版物描述已用于工程改造效应物活性被降低或沉默的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009),CurrOpinBiotech20:685-691；以及Strohl,WR和StrohlLM,“AntibodyFcengineeringforoptimalantibodyperformance”,TherapeuticAntibodyEngineering,Cambridge:WoodheadPublishing(2012)中,第225-249页)。这些策略包括通过改进糖基化，使用IgG2/IgG4骨架，或在Fc的铰链或CH2区中引入突变来降低效应物功能。举例来说，美国专利公布号2011/0212087(Strohl)、国际专利公布号WO2006/105338(Xencor)、美国专利公布号2012/0225058(Xencor)、美国专利公布号2012/0251531(Genentech)以及Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述用以降低FcγR或补体与Fc的结合的特定修饰。已知氨基酸修饰的特定非限制性实例包括下表中标识的那些：表C：用以降低FcγR或补体与Fc的结合的修饰在一个实施方案中，Fc包含至少一个在上表中标识的氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中的至少一个的氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc在L234、L235和D265处包含氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A和D265S。FcRn结合和PK参数如本领域中所知，与FcRn结合使被胞饮的抗体从内体再循环回血流中(Raghavan等,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ghetie等,2000,AnnuRevImmunol18:739-766)。这个过程与由于全长分子的尺寸较大而阻碍肾过滤联合产生在1周至3周的范围内的有利抗体血清半衰期。Fc与FcRn结合也在抗体转运中起关键作用。因此，在一个实施方案中，本文所述的抗原结合构建体能够结合FcRn。接头本文所述的抗原结合构建体可包括一个或多个可操作地偶联于本文所述的Fc的抗原结合多肽构建体。在一些方面，Fc以一个或多个接头偶联于一个或多个抗原结合多肽构建体。在一些方面，Fc直接偶联于一个或多个抗原结合多肽构建体。在一些方面，Fc通过接头偶联于各抗原结合多肽的重链。在一些方面，一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。抗原结合构建体的用以改进功能的其它修饰在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽构建体；以及包含CH3结构域并进一步包含变异CH2结构域的二聚Fc多肽构建体。在一些实施方案中，变异CH2结构域包含用以促进选择性结合FcγR的不对称氨基酸修饰。在某一实施方案中，变异CH2结构域允许分离和纯化本文所述的分离的单价抗体。在某一实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽；并且其中所述抗原结合多肽通过多肽融合于包含CH2和CH3结构域的单体Fc多肽。在某一实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽；并且其中所述抗原结合多肽是Fab，其中所述Fab的重链通过多肽融合于包含CH2和CH3结构域的单体Fc多肽，并且所述Fab的轻链通过多肽融合于包含CH2和CH3结构域的第二单体Fc多肽。在某一实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽；并且其中所述抗原结合多肽融合于包含CH2和CH3结构域的单体Fc多肽和不能结合任何抗原的第二多肽；其中所述第二多肽融合于包含CH2和CH3结构域的第二单体Fc多肽；其中两个单体Fc多肽配对以形成二聚体。在一些实施方案中，本发明的单价抗原结合构建体可被修饰以改进它们的效应物功能。所述修饰在本领域中是已知的，并且包括无岩藻糖基化，或工程改造抗体的Fc部分对活化受体(对于ADCC来说，主要是FCGR3a)以及对C1q(对于CDC来说)的亲和力。下表A3概述文献中报道的用于效应物功能工程改造的不同设计。因此，在一个实施方案中，单价抗原结合构建体可包括包含一个或多个如上表中指示的赋予改进的效应物功能的氨基酸修饰的二聚Fc多肽构建体。在另一实施方案中，单价抗原结合构建体被无岩藻糖基化以改进效应物功能。产生在Fcγ糖基化位点(Asn297，EU编号)上几乎不具有或不具有岩藻糖的抗原结合构建体而不改变氨基酸序列的方法在本领域中是熟知的。技术(ProBioGenAG)基于将使细胞岩藻糖生物合成路径偏转的酶的基因引入用于产生抗原结合构建体的细胞中。这阻止由抗原结合构建体产生性细胞向N连接的抗体碳水化合物部分添加糖“岩藻糖”。(vonHorsten等(2010)Glycobiology.2010年12月；20(12):1607-18)。用以获得具有降低水平的岩藻糖基化的抗原结合构建体的另一方法可见于美国专利8,409,572中，所述专利教导选择能够在抗原结合构建体上产生较低水平的岩藻糖基化的用于产生抗原结合构建体的细胞系。抗原结合构建体可被完全无岩藻糖基化(这意味着它们不含有可检测岩藻糖)，或它们可被部分无岩藻糖基化，这意味着分离的抗体含有的岩藻糖的量是通常对于由哺乳动物表达系统产生的类似抗体检测的岩藻糖的量的小于95％、小于85％、小于75％、小于65％、小于55％、小于45％、小于35％、小于25％、小于15％或小于5％。在其中可合乎需要的是增加抗原结合多肽构建体对它的同源抗原的亲和力的情况下，本领域中已知的方法可用于增加抗原结合多肽构建体对它的抗原的亲和力。所述方法的实例描述于下列参考文献中：Birtalan等(2008)JMB377,1518-1528；Gerstner等(2002)JMB321,851-862；Kelley等(1993)Biochem32(27),6828-6835；Li等(2010)JBC285(6),3865-3871；以及Vajdos等(2002)JMB320,415-428。这种方法的一个实例是亲和力成熟。一种用于HER2抗原结合结构域的亲和力成熟的示例性方法描述如下。曲妥珠单抗/HER2(PDB编码1N8Z)复合物和帕妥珠单抗/HER2复合物(PDB编码1S78)的结构用于建模。分子动力学(MD)可用于评估WT复合物在水性环境中的固有动力学性质。平均场和死端消除方法连同柔性骨架一起可用于优化和制作待筛选的突变体的模型结构。在堆积之后，将对许多特征评分，包括接触密度、抵触评分、疏水性和静电学。一般化Born方法将允许对溶剂环境的影响准确建模，并且计算在蛋白质中特定位置突变成替代性残基类型之后的自由能差异。接触密度和抵触评分将提供作为有效蛋白质堆积的一个关键方面的互补性的量度。筛选程序采用基于知识的势能以及依赖于成对残基相互作用能量和熵计算结果的联合分析流程。已知会增强HER2结合的文献突变及其组合概述于下表中：表A4.曲妥珠单抗-HER2系统的已知的增加与HER2结合的曲妥珠单抗突变。突变报道的改进H_D102W(H_D98W)3.2XH_D102Y3.1XH_D102K2.3XH_D102T2.2XH_N55K2.0XH_N55T1.9XL_H91F2.1XL_D28R1.9X表A5.帕妥珠单抗-HER2系统的已知的增加与HER2结合的帕妥珠单抗突变。突变报道的改进L_I31A1.9XL_Y96A2.1XL_Y96F2.5XH_T30A2.1XH_G56A8.3XH_F63V1.9X一旦本文所述的单价抗原结合构建体结合靶标细胞，它们即被内化。在一个实施方案中，相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，单价抗原结合构建体在类似程度上被内化。在一些实施方案中，相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，单价抗原结合构建体被更高效内化。解离常数(KD)和最大结合(BMAX)在一些实施方案中，通过包括但不限于解离常数和最大结合的功能特征来描述抗原结合构建体。如本文所用的术语“解离常数(KD)”意指特定配体-蛋白质相互作用的平衡解离常数。如本文所用，配体-蛋白质相互作用是指但不限于蛋白质-蛋白质相互作用或抗体-抗原相互作用。KD衡量两个蛋白质(例如AB)可逆解离成较小组分(A+B)的倾向，并且定义为解离速率(也称为“解离速率(off-rate)(k解离)”)与缔合速率(或“缔合速率(on-rate)(k缔合)”)的比率。因此，KD等于k解离/k缔合，并且表示为摩尔浓度(M)。由此可见KD越小，结合亲和力越强。因此，相较于1nMKD，1mMKD指示微弱结合亲和力。抗原结合构建体的KD值可使用本领域中明确确定的方法确定。一种用于确定抗原结合构建体的KD的方法是通过使用表面等离子体共振(SPR)，通常利用生物传感器系统，诸如系统。等温滴定量热法(ITC)是可用于确定的另一方法。抗原结合构建体的结合特征可通过各种技术测定。其中一种技术是通过流式细胞计量术(FACS，荧光激活的细胞分选)测量与表达抗原的靶标细胞的结合。通常，在这种实验中，使表达目标抗原的靶标细胞与不同浓度的抗原结合构建体一起孵育，洗涤，与用于检测抗原结合构建体的二级试剂一起孵育，洗涤，并且在流式细胞仪中分析以测量代表细胞上检测信号强度的中值荧光强度(MFI)，转而使其与结合于细胞的抗原结合构建体的数目相关联。接着将抗原结合构建体浓度对MFI数据拟合成饱和结合等式以产生两个关键结合参数，即Bmax和表观KD。表观KD或表观平衡解离常数代表观察到半数最大细胞结合所处的抗原结合构建体浓度。显然，KD值越小，为达到最大细胞结合所需的抗原结合构建体浓度越小，并且因此抗原结合构建体的亲和力越高。表观KD取决于细胞结合实验的条件，诸如细胞上表达的不同受体水平和孵育条件，并且因此表观KD通常不同于由诸如SPR和ITC的无细胞分子实验确定的KD值。然而，在不同方法之间存在大体上良好一致。术语“Bmax”或最大结合是指在抗原结合构建体饱和浓度下细胞上的最大抗原结合构建体结合水平。这个参数可以任意单位MFI报道以达成相对比较，或借助于标准曲线换算成对应于结合于细胞的抗原结合构建体的数目的绝对值。在一些实施方案中，抗原结合构建体显示的Bmax是参照抗原结合构建体的Bmax的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍。对于本文所述的抗原结合构建体，相对于FSA在Bmax方面的最明显区别发生在饱和浓度下以及当Bmax不再能随FSA增加时。在非饱和浓度下，显著性较小。在一个实施方案中，相较于参照抗原结合构建体，抗原结合构建体的Bmax和KD增加不取决于靶标细胞上靶标抗原表达水平。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的抗原结合构建体，其中相较于相应参照抗原结合构建体，所述抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的Bmax(最大结合)增加。在一些实施方案中，所述Bmax增加是相应参照抗原结合构建体的Bmax的至少约125％。在某些实施方案中，Bmax增加是相应参照抗原结合构建体的Bmax的至少约150％。在一些实施方案中，Bmax增加是相应参照抗原结合构建体的Bmax的至少约200％。在一些实施方案中，Bmax增加是相应参照抗原结合构建体的Bmax的大于约110％。抗原结合构建体和抗体药物缀合物(ADC)在某些实施方案中，使抗原结合构建体缀合于药物，例如毒素、化学治疗剂、免疫调节剂或放射性同位素。制备ADC(抗体药物缀合物或抗原结合构建体药物缀合物)的若干方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利8,624,003(锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中。在一些实施方案中，药物选自美登素(maytansine)、奥莉斯汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物。在其它实施方案中，药物是选自DM1和DM4的美登素。以下描述其它实例。在一些实施方案中以SMCC接头(DM1)或SPDB接头(DM4)使药物缀合于分离的抗原结合构建体。以下描述其它实例。药物与抗原结合蛋白比率(DAR)可为例如1.0至6.0或3.0至5.0或3.5-4.2。在一些实施方案中，使抗原结合构建体缀合于细胞毒性剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。所述术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu放射性同位素)、化学治疗剂和毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。以下描述其它实例。药物用于ADC的各种实施方案中的药物或有效载荷的实例包括DM1(美登素，N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-或N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、mc-MMAD(6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基-单甲基奥莉斯汀-D或N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-(9Cl)-L-缬氨酰胺)、mc-MMAF(顺丁烯二酰亚胺基己酰基-单甲基奥莉斯汀F或N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-N-甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲氨基)庚酰基-(αR,βR,2S)-β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯烷丙酰基-L-苯丙氨酸)和mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-顺丁烯二酰亚胺基己酰基-ValcCit-(对氨基苯甲氧基羰基)-单甲基奥莉斯汀E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-L-缬氨酰基-N5-(氨基羰基)-L-鸟氨酰基]氨基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-缬氨酰基-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯基乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]-1-吡咯烷基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。DM1是微管蛋白抑制剂美登素的衍生物，而MMAD、MMAE和MMAF是奥莉斯汀衍生物。美登木素药物部分在一些实施方案中，药物是美登木素。美登素化合物通过在有丝分裂期间抑制微管蛋白(tubulin)聚合而抑制微管形成来抑制细胞增殖(Remillard等(1975)Science189:1002-1005；美国专利号5,208,020)。美登素和美登木素具有高度细胞毒性，但它们在癌症疗法中的临床使用已极大限制于它们的主要归因于它们对肿瘤的选择性不良的重度全身性副作用。用美登素进行的临床试验已由于对中枢神经系统和胃肠系统的严重不利作用而中断(Issel等(1978)Can.Treatment.Rev.5:199-207)。美登木素药物部分是抗体-药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)相对易于可通过发酵或化学改性或衍生化发酵产物来制备，(ii)可经受用适于通过非二硫化物接头缀合于抗体的官能团衍生，(iii)在血浆中稳定，以及(iv)对多种肿瘤细胞系有效。适于用作美登木素药物部分的美登素化合物在本领域中是熟知的，并且可根据已知方法从天然来源分离，使用遗传工程改造技术产生(参见Yu等(2002)PNAS99:7968-7973)，或根据已知方法合成制备美登醇和美登醇类似物。示例性美登木素药物部分包括具有改性芳族环的那些，诸如：C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过氢化铝锂还原安丝菌素(ansamitocin)P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌属脱甲基化或使用LAH脱氯来制备)；和C-20-脱甲氧基、C-20-酰基氧基(—OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化来制备)以及在其它位置处具有修饰的那些。示例性美登木素药物部分也包括具有各种修饰的那些，诸如：C-9-SH，通过美登醇与H2S或P2S5反应来制备(美国专利号4,424,219)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰基氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)，由诺卡菌属制备(美国专利号4,450,254)；C-15-羟基/酰基氧基，通过用链霉菌属转化美登醇来制备(美国专利号4,364,866)；C-15-甲氧基，从滑桃树(Trewianudlflora)分离(美国专利号4,313,946和美国专利号4,315,929)；C-18-N-脱甲基，通过用链霉菌属使美登醇脱甲基来制备(美国专利号4,362,663和美国专利号4,322,348)；和4,5-脱氧基，通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备(美国专利号4,371,533)。视连接类型而定，已知美登素化合物上许多位置适用作连接位置。举例来说，对于形成酯键联，具有羟基的C-3位置、用羟甲基改性的C-14位置、用羟基改性的C-15位置和具有羟基的C-20位置全都是适合的。美登木素药物部分的所有立体异构体都被预期用于本发明化合物，即在D的手性碳处的R和S构型的任何组合。ADC的实施方案包括DM1、DM3、DM4(参见US20090202536)。由邻近于DM3和DM4的硫原子的碳上的烷基(诸如甲基)赋予的空间位阻可影响ADC的细胞内裂解速率(US2004/0235840A1)。因此，可变烷基单元(CR2)m可影响体外和体内效价、功效和安全性/毒性。奥莉斯汀在一些实施方案中，药物是奥莉斯汀，诸如奥莉斯汀E(在本领域中也称为多拉司他汀(dolastatin)-10的衍生物)或其衍生物。奥莉斯汀可为例如在奥莉斯汀E与酮酸之间形成的酯。举例来说，可使奥莉斯汀E分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应以产生AEB和AEVB。其它典型奥莉斯汀包括AFP、MMAF和MMAE。示例性奥莉斯汀的合成和结构描述于美国专利号6,884,869、7,098,308、7,256,257、7,423,116、7,498,298和7,745,394中，所述专利各自以引用的方式整体以及出于所有目的并入本文。已显示奥莉斯汀会干扰微管动力学以及核和细胞分裂，并且具有抗癌活性。本发明的奥莉斯汀结合微管蛋白，并且可对5T4表达性细胞或细胞系施加细胞毒性或细胞抑制性作用。存在本领域中已知的可用于确定奥莉斯汀或所得抗体-药物缀合物是否对所需细胞或细胞系施加细胞抑制性或细胞毒性作用的许多不同测定。用于确定化合物是否结合微管蛋白的方法在本领域中是已知的。参见例如Muller等,Anal.Chem2006,78,4390-4397；Hamel等,MolecularPharmacology,199547:965-976；以及Hamel等,TheJournalofBiologicalChemistry,1990265:28,17141-17149。化学治疗剂在一些实施方案中，使抗原结合构建体缀合于化学治疗剂。实例包括但不限于顺铂(Cisplantin)和拉帕替尼(Lapatinib)。“化学治疗剂”是适用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如本多帕(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多帕(meturedopa)和优多帕(uredopa)；亚乙基亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯玛法辛(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，诸如二甲睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如弗罗林酸(frolinicacid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊佛米新(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼代宁(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK7；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2'＝-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞图辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷(taxane)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(docetaxel)(-PoulencRorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶(topoisomerase)抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；视黄酸(retinoicacid)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)以及以上中的任一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这个定义中也包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通(Fareston))；和抗雄激素剂，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上中的任一个的药学上可接受的盐、酸或衍生物。缀合物接头在一些实施方案中，通过接头使药物连接于抗原结合构建体，例如抗体。可以多种方式实现接头与抗体连接，诸如通过表面赖氨酸，还原性偶联于氧化碳水化合物，以及通过以还原链间二硫键加以释放的半胱氨酸残基。本领域中已知多种ADC连接系统，包括基于腙、二硫化物和肽的连接。适合接头包括例如可裂解和非可裂解接头。可裂解接头通常在细胞内条件下易受裂解。适合可裂解接头包括例如可由细胞内蛋白酶，诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解的肽接头。在示例性实施方案中，接头可为二肽接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或顺丁烯二酰亚胺基己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲氧基羰基(mc-Val-Cit-PABA)接头。另一接头是4-[N-顺丁烯二酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸磺基丁二酰亚胺酯(smcc)。磺基-smcc缀合通过顺丁烯二酰亚胺基团发生，所述基团与硫氢基(硫醇，—SH)反应，同时它的磺基-NHS酯与伯胺(如赖氨酸和蛋白质或肽N末端中所见)具有反应性。另一接头是顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)。其它适合接头包括可在特定pH或pH范围下水解的接头，诸如腙接头。其它适合可裂解接头包括二硫化物接头。接头可在使得抗体必须在细胞内降解以释放药物的程度上共价结合于抗体，例如mc接头等。接头可包括用于连接于抗体的基团。举例来说，接头可包括氨基、羟基、羧基或硫氢基反应性基团(例如顺丁烯二酰亚胺、卤代乙酰胺(例如碘代、溴代或氯代)、卤代酯(例如碘代、溴代或氯代)、卤代甲基酮(例如碘代、溴代或氯代)、苯甲基性卤化物(例如碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜和吡啶基硫基)。大体上参见Wong,ChemistryofProteinConjugationandCross-linking；CRCPress,Inc.,BocaRaton,1991。在一个实施方案中，抗体和药物部分的共价连接要求接头具有两个反应性官能团，即在反应性意义上是二价。适用于连接两个或更多个功能性或生物活性部分(诸如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原和报道基团)的二价接头试剂是已知的，并且各方法已描述它们的所得缀合物(BioconjugateTechniques,第3版，由GregT.Hermanson所著,AcademicPress2013ISBN-13:978-0123822390)。在另一实施方案中，接头可被调节溶解性或反应性的基团取代。举例来说，磺酸酯基取代基可增加试剂的水溶性，并且有助于接头试剂与抗体或药物部分的偶联反应，或视用于制备ADC的合成途径而定，有助于Ab-L与D、或D-L与Ab的偶联反应。在另一实施方案中，接头具有反应性官能团，其具有与存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上的适用亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可与抗体上的亲电子基团反应，并且与抗体单元形成共价键。接头上的适用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供用于连接于接头的适宜位点。接头可为包含一个或多个氨基酸单元的肽接头。肽接头试剂可通过肽化学领域中熟知的固相或液相合成方法(E.和K.Lübke,ThePeptides,第1卷,第76-136页(1965)AcademicPress)在自动化合成仪，诸如RaininSymphony肽合成仪(ProteinTechnologies,Inc.,Tucson,Ariz.)或433型合成仪(AppliedBiosystems,FosterCity,Calif.)上来制备，所述方法包括t-BOC化学(Geiser等“Automationofsolid-phasepeptidesynthesis”inMacromolecularSequencingandSynthesis,AlanR.Liss,Inc.,1988,第199-218页)和Fmoc/HBTU化学(Fields,G.和Noble,R.(1990)“Solidphasepeptidesynthesisutilizing9-fluoroenylmethoxycarbonylaminoacids”,Int.J.PeptideProteinRes.35:161-214)。化合物明确涵盖但不限于用下列交叉接头试剂制备的ADC：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SPDB、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB((4-乙烯基砜)苯甲酸丁二酰亚胺酯)，并且包括双顺丁烯二酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)2和BM(PEO)3，其可从PierceBiotechnology,Inc.(CustomerServiceDepartment,P.O.Box117,Rockford,Ill.61105U.S.A,U.S.A1-800-874-3723,International+815-968-0747)商购获得。参见第467-498页,2003-2004ApplicationsHandbookandCatalog。双顺丁烯二酰亚胺试剂允许抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基团以依序或并行方式连接于含有硫醇的药物部分、标记或接头中间体。除顺丁烯二酰亚胺之外，与抗体、美登木素药物部分或接头中间体的硫醇基团具有反应性的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。适用接头试剂也可通过其它商业来源，诸如MolecularBiosciencesInc.(Boulder,Colo.)获得，或根据Toki等(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Firestone等的美国专利号6,214,345；WO02/088172；US2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO03/043583；以及WO04/032828中所述的程序合成。接头可为用于通过分支多官能性接头部分使超过一个药物部分共价连接于抗体的树枝型接头(Sun等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768；King等(2002)TetrahedronLetters43:1987-1990)。树枝状接头可增加药物与抗体的与ADC的效价相关的摩尔比，即荷载。因此，当抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，许多药物部分可通过树枝状接头加以连接。制备ADC可通过若干途径，采用为本领域技术人员所知的有机化学反应、条件和试剂来制备ADC，包括：(1)抗体的亲核基团或亲电子基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，继之以与活化的药物部分D反应；以及(2)药物部分的亲核基团或亲电子基团与接头试剂反应以通过共价键形成药物-接头中间体D-L，继之以与抗体的亲核基团或亲电子基团反应。缀合方法(1)和(2)可与多种抗体、药物部分和接头一起用于制备此处所述的抗体-药物缀合物。制备ADC的方法的若干特定实例在本领域中是已知的，并且描述于美国专利8,624,003(锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中。抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)抗体被糖基化处的糖羟基或氨基。胺基团、硫醇基团和羟基具有亲核性，并且能够与包括下列的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和顺丁烯二酰亚胺基团。某些抗体具有可还原链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用诸如DTT(克雷兰德氏试剂(Cleland'sreagent)，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz等(1999)Anal.Biochem.第273卷:73-80；SoltecVentures,Beverly,Mass.)的还原剂处理而使得抗体具有反应性以与接头试剂缀合。因此，各半胱氨酸二硫桥将在理论上形成两个反应性硫醇亲核体。可通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(特劳特氏试剂(Traut'sreagent))反应，从而导致胺转化成硫醇来将其它亲核基团引入抗体中。也可通过修饰抗体以引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分来产生抗体-药物缀合物。糖基化抗体的糖可例如用高碘酸盐氧化试剂氧化以形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺希夫碱(Schiffbase)基团可形成稳定键联，或可例如用硼氢化物试剂还原以形成稳定胺键联。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中产生可与药物上的适当基团反应的羰基(醛和酮)(Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress:NewYork,第234-242页)。在另一实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，从而导致产生醛而非第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,(1992)BioconjugateChem.3:138-146；美国专利号5,362,852)。可使所述醛与药物部分或接头亲核体反应。同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，其能够与包括下列的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和顺丁烯二酰亚胺基团。可例如使美登素转化成May-SSCH3，其可被还原成游离硫醇May-SH，并且与修饰的抗体(Chari等(1992)CancerResearch52:127-131)反应以产生具有二硫化物接头的美登木素-抗体免疫缀合物。已报道具有二硫化物接头的抗体-美登木素缀合物(WO04/016801；美国专利号6,884,874；US2004/039176A1；WO03/068144；US2004/001838A1；美国专利号6,441,163；美国专利号5,208,020；美国专利号5,416,064；WO01/024763)。二硫化物接头SPP是用接头试剂4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二酰亚胺酯构建。本发明的ADC包括SMCC接头和DM1美登木素药物部分。在Ab-(SMCC-DM1)p的一个实施方案中，平均p是1、2、3或4。(WO2005/037992)。ADC的另一实施方案是Ab-(SIAB-DM1)p。药物具有或被改性以包括与抗体上的缀合点具有反应性的基团。举例来说，药物可通过下列方式连接：烷基化(例如在抗体的ε-氨基赖氨酸或N-末端处)，使氧化碳水化合物还原性胺化，在羟基与羧基之间转酯化，在氨基或羧基处酰胺化，以及缀合于硫醇。在一些实施方案中，每个抗体分子缀合的药物部分的数目p在平均1至8；1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2的范围内。在一些实施方案中，p在平均2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的范围内。在其它实施方案中，p是平均1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，p在平均约1至约8；约1至约7、约1至约6、约1至约5、约1至约4、约1至约3或约1至约2的范围内。在一些实施方案中，p在约2至约8、约2至约7、约2至约6、约2至约5、约2至约4或约2至约3的范围内。对于可用于缀合的化学的实例，参见例如CurrentProtocolsinProteinScience(JohnWiley&Sons,Inc.),第15章(ChemicalModificationsofProteins)(其公开内容以引用的方式整体并入本文)。举例来说，当蛋白质的化学活化导致形成游离硫醇基团时，可用硫氢基反应性试剂使蛋白质缀合。在一个方面，试剂是对游离硫醇基团具有实质上特异性的试剂。所述试剂包括例如顺丁烯二酰亚胺、卤代乙酰胺(例如碘代、溴代或氯代)、卤代酯(例如碘代、溴代或氯代)、卤代甲基酮(例如碘代、溴代或氯代)、苯甲基性卤化物(例如碘化物、溴化物或氯化物)、乙烯基砜和吡啶基硫基。测试单价抗原结合构建体相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，本发明的单价抗原结合构建体可展现增强的效应物功能。可如下测试单价抗原结合构建体的效应物功能。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以评估ADCP、CDC和/或ADCC活性。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以测量FcγR结合。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)的第464页上的表3中。用以评估目标分子的ADCC活性的体外测定的一实例描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确定单价抗原结合构建体是否能够结合C1q，以及因此活化CDC。为评估补体活化，可进行例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的CDC测定。也可使用本领域中熟知的方法对抗体进行FcRn结合(诸如通过SPR)和体内PK测定。可使用ELISA(本领域中已知的一种熟知免疫测定)确定本文所述的抗原结合构建体的存在性和量。在一种将适用于检测/定量本文所述的异多聚体的ELISA方案中，包括下列步骤：用抗人血清白蛋白抗体涂布ELISA板，阻断所述板以防止非特异性结合，洗涤所述ELISA板，添加含有本文所述的蛋白质的溶液(在一种或多种不同浓度下)，添加偶联于可检测标记(如本文所述或另外本领域中已知)的二级抗抗原结合构建体多肽特异性抗体，以及检测二级抗体的存在性。如本文所指示，相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，本文所述的单价抗原结合构建体显示优越功效和/或生物活性。本发明的单价抗原结合构建体的功效和/或生物活性的一个非限制性实例由单价抗原结合构建体抑制靶标细胞生长的能力表示。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体的优越功效和/或生物活性主要是相较于单特异性二价抗原结合构建体，单价抗原结合构建体的效应物功能增加的结果。这个类型的单价抗原结合构建体的实例由单价溶解性抗体(MV-L)表示。可测试的增加的效应物功能包括ADCC、ADCP或CDC中的至少一个。ADCC在一个实施方案中，单价抗原结合构建体比相应单特异性二价抗原结合构建体展现更高程度的通过ADCC达成的细胞杀灭。根据这个实施方案，单价抗原结合构建体展现的ADCC活性比相应单特异性二价抗原结合构建体的ADCC活性增加在约1.2至1.6倍之间。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的通过ADCC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.3倍。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的通过ADCC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.4倍。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的通过ADCC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.5倍。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体，并且展现的ADCC活性比相应单特异性二价抗原结合构建体的ADCC活性增加在约1.2至1.6倍之间。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体，并且展现的通过ADCC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.3倍。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体，并且展现的通过ADCC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.5倍。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的无岩藻糖基化抗原结合多肽构建体，并且展现的ADCC活性相对于相应非无岩藻糖基化抗原结合构建体的ADCC活性得以增加。在一些方面，ADCC增加在约1至3倍之间或更大，例如1、2或3倍。ADCP在一个实施方案中，单价抗原结合构建体比相应单特异性二价抗原结合构建体展现更高程度的通过ADCP达成的细胞杀灭。CPC在一个实施方案中，单价抗原结合构建体比相应单特异性二价抗原结合构建体展现更高程度的通过CDC达成的细胞杀灭。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体，并且展现的通过CDC达成的细胞杀灭比相应单特异性二价抗原结合构建体增加约1.5倍。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的至少约125％。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的至少约150％。在一些实施方案中的是一种本文所述的分离的单价抗原结合构建体，其中所述构建体具有的ADCC、ADCP和CDC中的至少一个是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗原结合构建体的至少约300％。与FcγR的结合能力增加在一些实施方案中，单价抗原结合构建体展现对一种或多种FcγR的较高结合能力(Rmax)。在其中单价抗原结合构建体包含结合HER2的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的对一种或多种FcγR的Rmax比相应单特异性二价抗原结合构建体增加在约1.3至2倍之间。在其中单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的对CD16FcγR的Rmax比相应单特异性二价抗原结合构建体增加在约1.3至1.8倍之间。在其中单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的对CD32FcγR的Rmax比相应单特异性二价抗原结合构建体增加在约1.3至1.8倍之间。在其中单价抗原结合构建体包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗原结合构建体展现的对CD64FcγR的Rmax比相应单特异性二价抗原结合构建体增加在约1.3至1.8倍之间。对FcγR的亲和力增加在一些实施方案中，相较于相应二价抗原结合构建体，本文提供的单价抗原结合构建体具有出乎意料增加的对FcγR的亲和力。由装饰所致的Fc浓度增加与ADCC、ADCP、CDC活性增加一致。在一些实施方案中，单价抗原结合构建体展现对一种或多种FcγR的亲和力增加。在一个实施方案中，当单价抗原结合构建体包含结合HER2的抗原结合多肽构建体时，单价抗原结合构建体展现对至少一种FcγR的亲和力增加。根据这个实施方案，单价抗原结合构建体展现对CD32的亲和力增加。在另一实施方案中的是一种本文所述的单价抗原结合构建体，其相较于相应单特异性二价抗原结合构建体展现内化增加，由此产生优越功效和/或生物活性。药物动力学参数在某些实施方案中，本文提供的单价抗原结合构建体展现与可商购获得的治疗性抗体类似的药物动力学(PK)性质。在一个实施方案中，就血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL而言，本文所述的单价抗原结合构建体展现与已知治疗性抗体类似的PK性质。在一个实施方案中，单价抗原结合构建体显示类似于或大于所述单特异性二价抗原结合构建体的体内稳定性。所述体内稳定性参数包括血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL。在一个实施方案中，相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，本文提供的单价抗原结合构建体显示较高分布体积(Vss)。抗体的分布体积涉及血浆或血液的体积(Vp)、组织的体积(VT)以及组织相对于血浆分配(kP)。在线性条件下，在于动物或人中血管内施用之后，IgG抗体主要分布至血浆区室和血管外流体中。在一些实施方案中，主动转运过程(诸如由新生儿Fc受体(FcRn)摄取)也影响抗体生物在其它结合蛋白中的分布。在另一实施方案中，相较于相应单特异性二价抗原结合构建体，本发明的单价抗原结合构建体显示较高分布体积(Vss)，并且以类似亲和力结合FcRn。竞争测定抗原结合构建体之间的竞争可通过某一测定来测定，其中所测试的抗原结合构建体抑制参照抗原结合构建体与共同抗原特异性结合(参见例如Junghans等,CancerRes.50:1495,1990)。如在竞争性结合测定中所测量，如果过量测试抗原结合构建体(例如至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制参照抗原结合构建体的结合例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，那么测试抗原结合构建体与参照抗原结合构建体竞争。通过竞争测定鉴定的抗原结合构建体(竞争性抗原结合构建体)包括与参照抗原结合构建体结合相同表位的抗原结合构建体和结合足够邻近于由参照抗原结合构建体结合的表位的邻近表位以达成存在空间位阻的抗原结合构建体。举例来说，可鉴定与本文所述的第一分离的单价抗原结合构建体竞争结合EGFR的第二竞争性分离的单价抗原结合构建体。在某些情况下，如在竞争性结合测定中所测量，第二构建体可抑制第一构建体的结合例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在某些情况下，第二构建体可置换第一构建体大于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。试剂盒本文提供一种用于检测个体中目标生物标志物的存在性的试剂盒，所述试剂盒包括(a)本文所述的分离的单价抗原结合构建体；和(b)使用说明书。在某些实施方案中的是用于检测EGFR和/或HER2及其可溶性ECD中的至少一个的试剂盒，所述试剂盒包括(a)本文所述的分离的单价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体；和(b)使用说明书。在一些实施方案中的是一种用于测定EGFR和/或HER2及其可溶性ECD中的至少一个的浓度的试剂盒，所述试剂盒包括(a)本文所述的分离的单价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体；和(b)使用说明书。产生抗原结合构建体可使用例如如美国专利号4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗原结合构建体。在一个实施方案中，提供编码本文所述的抗原结合构建体的分离的核酸。所述核酸可编码包含抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和/或包含抗原结合构建体的VH的氨基酸序列(例如抗原结合构建体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供一种或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，核酸被提供在多顺反子载体中。在另一实施方案中，提供一种包含所述核酸的宿主细胞。在一个所述实施方案中，宿主细胞包含(例如已用以下转化)：(1)包含编码包含抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗原结合构建体的方法，其中所述方法包括在适于表达所述抗原结合构建体的条件下培养如上提供的包含编码所述抗原结合构建体的核酸的宿主细胞，以及任选从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗原结合构建体。对于重组产生抗原结合构建体，分离编码例如如上所述的抗原结合构建体的核酸，并且插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。所述核酸可易于使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗原结合构建体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。适于克隆或表达抗原结合构建体编码载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。举例来说，抗原结合构建体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于在细菌中表达抗原结合构建体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,N.J.,2003),第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。)在表达之后，可从于可溶性部分中的细菌细胞糊状物分离抗原结合构建体，并且可进一步纯化。除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适于抗原结合构建体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化样式的抗原结合构建体的真菌和酵母菌株。参见Gemgross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)以及Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。适于表达糖基化抗原结合构建体的宿主细胞也源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定众多可与昆虫细胞联合使用的杆状病毒株，特别是对于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说，适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为适用的。适用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是通过SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7)；人胚肾株系(293或293细胞，如例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)中所述)；幼小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(sertolicell)(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞；和FS4细胞。其它适用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。对于适于产生抗原结合构建体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。在一个实施方案中，通过包括下列的方法在稳定哺乳动物细胞中产生本文所述的抗原结合构建体：用编码抗原结合构建体的核酸以预定比率转染至少一种稳定哺乳动物细胞；以及在至少一种哺乳动物细胞中表达核酸。在一些实施方案中，在瞬时转染实验中确定核酸的预定比率以确定输入核酸的导致表达产物中的抗原结合构建体的百分比最高的相对比率。在一些实施方案中的是在如本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生单价抗原结合构建体的方法，其中至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含相较于单体重链或轻链多肽或其它抗体，较大百分比的所需糖基化单价抗体。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，所述方法包括鉴定和纯化所需糖基化单价抗体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱测定法中的一个或两个来达成。如果需要，那么可在表达之后纯化或分离抗原结合构建体。可以为本领域技术人员所知的多种方式分离或纯化蛋白质。标准纯化方法包括使用诸如FPLC和HPLC的系统在常压下或在高压下进行的色谱技术，包括离子交换、疏水性相互作用、亲和、尺寸分级或凝胶过滤和反相。纯化方法也包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和透滤技术与蛋白质浓缩联合也是适用的。如本领域中所熟知，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可在本发明中适用于纯化抗原结合构建体。举例来说，细菌蛋白A和G结合Fc区。同样，细菌蛋白L结合一些抗体的Fab区。纯化可常常通过特定融合配偶体来实现。举例来说，如果采用GST融合，那么可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，那么可使用Ni+2亲和色谱法纯化抗体，或如果使用flag标签，那么可使用固定的抗flag抗体纯化抗体。对于在适合纯化技术方面的一般性指导，参见例如以引用的方式整体并入本文的ProteinPurification:PrinciplesandPractice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994，其以引用的方式整体并入本文。必要的纯化程度将视抗原结合构建体的用途而变化。在一些情况下，不必要纯化。在某些实施方案中，使用包括但不限于下列的阴离子交换色谱法纯化抗原结合构建体：Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、porosHQ、porosDEAF、ToyopearlQ、ToyopearlQAE、ToyopearlDEAE、Resource/SourceQ和DEAE、FractogelQ和DEAE柱色谱法。在特定实施方案中，使用包括但不限于下列的阳离子交换色谱法纯化本文所述的蛋白质：SP-琼脂糖、CM琼脂糖、porosHS、porosCM、ToyopearlSP、ToyopearlCM、Resource/SourceS和CM、FractogelS和CM柱以及它们的等效物和类似物。此外，可使用本领域中已知的技术化学合成本文所述的抗原结合构建体(例如参见Creighton,1983,Proteins:StructuresandMolecularPrinciples,W.H.Freeman&Co.,N.Y以及Hunkapiller等,Nature,310:105-111(1984))。举例来说，可通过使用肽合成仪合成对应于多肽的片段的多肽。此外，必要时，非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代或添加引入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸，诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般来说氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋)或L(左旋)氨基酸。也提供在翻译期间或之后例如通过下列方式差异性修饰的抗原结合构建体：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护基团/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、连接于抗体分子或其它细胞配体等。可通过包括但不限于下列的已知技术进行众多化学修饰中的任一个：用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在衣霉素(tunicamycin)存在下代谢合成；等。本文涵盖的其它翻译后修饰包括例如N连接的或O连接的碳水化合物链、加工N末端或C末端、使化学部分连接于氨基酸骨架、对N连接的或O连接的碳水化合物链化学修饰、以及由于原核宿主细胞表达而添加或缺失N末端甲硫氨酸残基。抗原结合构建体可用可检测标记，诸如酶、荧光、同位素或亲和标记修饰以允许检测和分离蛋白质。适合酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素生物素和抗生蛋白/生物素；适合荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；并且适合放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。在特定实施方案中，使抗原结合构建体或其片段或变体连接于与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。如所提及，可通过诸如翻译后加工的天然过程，或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰本文所述的抗原结合构建体。应了解相同类型的修饰可在相同或不同程度上存在于给定多肽中的若干位点处。本发明的多肽可例如由于泛素化而为分支的，并且它们可为伴有或不伴有分支的环状。环状、分支以及分支环状多肽可由翻译后天然过程产生，或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(如精氨酰化)和泛素化。(参见例如PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson编,AcademicPress,NewYork,第1-12页(1983)；Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。在某些实施方案中，抗原结合构建体也可连接于特别适用于免疫测定或纯化由本发明的白蛋白融合蛋白结合，结合所述白蛋白融合蛋白或与所述白蛋白融合蛋白缔合的多肽的固体载体。所述固体载体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。本文也提供抗原结合构建体的化学修饰的衍生物，其可提供另外的优势，诸如多肽的溶解性、稳定性和循环时间增加或免疫原性降低(参见美国专利号4,179,337)。用于衍生化的化学部分可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇等。蛋白质可在分子内的随机位置处或在分子内的预定位置处加以修饰，并且可包括一个、两个、三个或更多个连接化学部分。聚合物可具有任何分子量，并且可为分支或未分支的。对于聚乙二醇，优选分子量在约1kDa与约100kDa之间(术语“约”指示在聚乙二醇的制剂中，一些分子的称重将比所述分子量大，一些将比所述分子量小)以便处理和制造。视所需治疗概况而定(例如所需持续释放的持续时间、对生物活性的影响(如果有的话)、处理的简易性、抗原性的程度或缺乏以及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物的其它已知影响)，可使用其它尺寸。举例来说，聚乙二醇可具有平均分子量约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、105,500、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、95,000或100,000kDa。在某些实施方案中，提供一种在稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其包括：用编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽缺乏可变结构域；以及编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列转染至少一种稳定哺乳动物细胞，以使所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以预定比率在所述哺乳动物细胞中转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以使所述重链和轻链多肽以所需糖基化单价不对称抗体形式在所述至少一种稳定哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其包括用不同预定比率的所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列转染至少两种不同细胞以使两种细胞各自以不同比率表达重链多肽和轻链多肽。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列的多顺反子载体转染至少一种哺乳动物细胞。在一些实施方案中，至少一种哺乳动物细胞选自由VERO、HeLa、HEK、HEK293、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞及其子类和变体组成的组。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其中第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的预定比率是约1:1:1。在一些实施方案中，第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的所述预定比率是如此以致翻译的第一重链多肽的量约等于第二重链多肽的量和轻链多肽的量。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其中至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含相较于单体重链或轻链多肽或其它抗体，较大百分比的所需糖基化单价抗体。在一些实施方案中的是在本文所述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，所述方法包括鉴定和纯化所需糖基化单价抗体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱测定法中的一个或两个来达成。本文提供一种产生具有改进的ADCC的抗原结合构建体的方法，其包括：用编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽缺乏可变结构域；以及编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列转染至少一种稳定哺乳动物细胞，以使所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以预定比率在所述哺乳动物细胞中转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以使所述重链和轻链多肽以糖基化单价抗体形式在所述至少一种稳定哺乳动物细胞中表达，其中所述糖基化单价不对称抗体相较于相应野生型抗体具有较高ADCC。本文提供一种在稳定哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗原结合构建体的方法，其包括：用编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽缺乏可变结构域；以及编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列转染至少一种稳定哺乳动物细胞，以使所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以预定比率在所述哺乳动物细胞中转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以使所述重链和轻链多肽以所需糖基化单价不对称抗体形式在所述至少一种稳定哺乳动物细胞中表达。也提供被修饰以含有本文所述的用以编码和表达本文所述的单价抗原结合构建体的核酸分子的转基因生物体。药物组合物本文所述的抗原结合构建体可通过为本领域技术人员所熟知以及视应用而定的任何方法来配制和施用。在一些实施方案中，抗原结合构建体以抗原结合构建体和药学上可接受的载体的药物组合物形式配制。术语“药学上可接受”意指由联邦政府或州政府的管理机构核准或列于美国药典或其它通常认可的药典中以在动物中，并且更特定来说在人中使用。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。所述药物载体可为无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些方面，载体是不见于自然界中的人造载体。当静脉内施用药物组合物时，水可被用作载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。必要时，组合物也可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。组合物可用传统粘合剂和载体(诸如甘油三酯)配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合药物载体的实例描述于由E.W.Martin所著的\Remington'sPharmaceuticalSciences\中。所述组合物将含有治疗有效量的优选呈纯化形式的化合物以及适量载体以便提供用于向患者适当施用的形式。制剂应适合施用模式。在某些实施方案中，根据常规程序将包含抗原结合构建体的组合物配制成适合于向人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂(诸如利多卡因)以减轻注射部位处的疼痛。通常，分开或以单位剂型混合在一起来将成分供应于诸如安瓿或药囊的指示活性剂的量的气密容器中，所述单位剂型例如呈干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物待通过输注施用时，它可用含有无菌医药级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可提供含无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可在施用之前加以混合。在某些实施方案中，将本文所述的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括以阴离子形成的盐，诸如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等获得的那些；以及以阳离子形成的盐，诸如由钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等获得的那些。本文所述的组合物的将有效治疗、抑制和预防与蛋白质的表达和/或活性异常相关的疾病或病症的量可通过标准临床技术确定。此外，体外测定可任选用于帮助鉴定最优剂量范围。待用于制剂中的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和各患者的情况来决定。有效剂量是从由体外或动物模型测试系统获得的剂量-反应曲线外推而来。在某些实施方案中的是一种包含本文所述的单价抗原结合构建体和佐剂的药物组合物。在某些实施方案中的是进一步包含缀合于单价抗原结合构建体的药物分子的本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，药物分子用于治疗自体免疫病症。在一些实施方案中，药物分子用于治疗癌症。在一些实施方案中，药物分子是化学治疗剂。生物和治疗用途在某些实施方案中，本文所述的构建体在测定中用于测试一种或多种生物活性。如果构建体在特定测定中展现活性，那么有可能的是由抗原结合构建体包含的抗原结合构建体牵涉于与生物活性相关的疾病中。因此，构建体适用于治疗相关疾病。在某些实施方案中的是本文所述的单价抗原结合构建体用于制造用以抑制抗原分子的多聚化的药剂的用途。在某些实施方案中的是单价抗原结合构建体用于抑制抗原结合它的同源结合配偶体的用途。在某些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症的方法，其包括以有效治疗、预防或改善所述疾病或病症的量向其中需要所述治疗、预防或改善的患者施用本文所述的抗原结合构建体。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗内分泌系统的疾病和/或病症。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗神经系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗免疫系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗呼吸系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗心血管系统的疾病和/或病症。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗生殖系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗消化系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于诊断、预测、预防和/或治疗与血液相关的疾病或病症。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体和/或编码本文所述的抗原结合构建体的多核苷酸用于诊断、检测和/或治疗与包括但不限于下列的活性相关的疾病和/或病症：激素原活化、神经递质活性、细胞信号传导、细胞增殖、细胞分化和细胞迁移。在一方面，本文所述的抗原结合构建体涉及基于抗体的疗法，其涉及向患者施用抗原结合构建体以治疗一种或多种公开的疾病、病症或病状。本文所述的治疗性化合物包括但不限于本文所述的抗原结合构建体、编码本文所述的抗原结合构建体的核酸。在一特定实施方案中的是基于抗体的疗法，其涉及向患者施用本文所述的包含至少抗体的片段或变体的抗原结合构建体以治疗一种或多种疾病、病症或病状，包括但不限于：神经病症、免疫系统病症、肌肉病症、生殖病症、胃肠病症、肺部病症、心血管病症、肾病症、增生性病症和/或癌性疾病和病状和/或如本文其它地方所述的疾病、病症或病状。本文所述的包含至少抗体的片段或变体的抗原结合构建体可单独或与其它类型的治疗(例如放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)组合施用。通常，优选的是施用具有作为与患者的物种相同的物种的物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)的产品。因此，在一实施方案中，向人患者施用人抗体、片段衍生物、类似物或核酸以达成治疗或防治。提供通过向受试者施用有效量的本文所述的抗原结合构建体或药物组合物而达成治疗、抑制和防治的方法。在一实施方案中，抗原结合构建体是大致上纯化的(例如大致上不含限制它的作用或产生非所需副作用的物质)。在某些实施方案中，受试者是动物，包括但不限于诸如母牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，并且在某些实施方案中是哺乳动物，并且最优选是人。各种递送系统是已知的，并且可用于施用本文所述的抗原结合构建体制剂，例如囊封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达化合物的重组细胞，受体介导的胞吞(参见例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))，将核酸构建为逆转录病毒或其它载体的一部分等。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任何适宜途径，例如通过输注或团式注射，通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)进行吸附来施用化合物或组合物，并且可连同其它生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部的。此外，在某些实施方案中，可合乎需要的是通过包括室内和鞘内注射的任何适合途径将本文所述的抗原结合构建体组合物引入中枢神经系统中；室内注射可通过例如连接于储集器(诸如Ommaya储集器)的室内导管来促进。也可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或雾化器以及与气雾化试剂一起配制。在一特定实施方案中，可合乎需要的是向需要治疗的区域局部施用本文所述的抗原结合构建体或组合物；这可通过例如而非限制地在手术期间局部输注，表面施加(例如在手术之后与伤口敷料联合)，通过注射，借助于导管，借助于栓剂，或借助于植入物来实现，所述植入物由多孔性、非多孔性或凝胶状材料制成，包括膜(诸如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意应使用蛋白质不吸附于其上的材料。在另一实施方案中，抗原结合构建体或组合物可于囊泡，特别是脂质体中递送(参见Langer,Science249:1527-1533(1990)；Treat等,LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,NewYork,第353-365页(1989)；Lopez-Berestein(同上),第317-327页；大体上参见同上)。在另一实施方案中，抗原结合构建体或组合物可于控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer(上文)；Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等,Surgery88:507(1980)；Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(编),CRCPres.,BocaRaton,Fla.(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(编),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；也参见Levy等,Science228:190(1985)；During等,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等,J.Neurosurg.71:105(1989))。在另一实施方案中，控制释放系统可被放置在例如脑的治疗靶标的附近，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson,MedicalApplicationsofControlledRelease(上文)中,第2卷,第115-138页(1984))。在某些实施方案中，以与结合靶标表位不重叠的另一单臂单价或多价抗体组合形式施用本文所述的单臂单价抗原结合构建体。在一些实施方案中的是一种治疗免疫系统病症的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。在某些实施方案中的是一种抑制肿瘤的生长的方法，其包括使所述肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗原结合构建体的组合物接触。提供一种使肿瘤萎缩的方法，其包括使所述肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗原结合构建体的组合物接触。在一些实施方案中的是一种抑制抗原分子的多聚化的方法，其包括使所述抗原与包含有效量的本文所述的单价抗原结合构建体的组合物接触。本文提供一种抑制抗原结合它的同源结合配偶体的方法，其包括使所述抗原与包含足以结合所述抗原的量的单价抗原结合构建体的组合物接触。本文提供一种增加至少一种靶标细胞中抗体浓度的方法，其包括向所述靶标细胞提供单价抗原结合构建体，其包含：单价结合抗原的抗原结合多肽构建体；二聚Fc结构域；其中相较于具有两个抗原结合区域的相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示更好治疗功效，并且其中所述功效不由抗原交联、抗原二聚化、防止抗原调节或防止抗原活化引起。本文提供分离的单价抗原结合构建体，其包含单价结合抗原的抗原结合多肽构建体；以及包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体；其中相较于具有两个抗原结合区域的相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示对展示所述抗原的靶标细胞的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于相应二价抗原结合构建体，所述单价抗原结合构建体显示更好治疗功效，并且其中所述功效不由抗原交联、抗原二聚化、防止抗原调节或防止抗原活化引起。本文提供结合EGFR和/或HER2的分离的单价抗原结合构建体，其包含：单价结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体；以及包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体；其中所述抗原结合构建体由靶标细胞内化，其中相较于二价结合EGFR和/或HER2的相应二价抗原结合构建体，所述构建体显示对展示在所述靶标细胞上的EGFR和/或HER2的结合密度和Bmax(最大结合)增加，并且其中相较于所述相应二价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体，所述构建体显示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一个。也提供一种通过使抗原结合于本文提供的单价抗原结合构建体来防止抗原细胞外结构域蛋白水解裂解的方法。治疗癌症本文提供本文所述的单价抗原结合构建体用于制造用以治疗癌症的药剂的用途。也提供本文所述的单价抗原结合构建体用于制造针对免疫系统病症的药剂的用途。在某些实施方案中的是本文所述的单价抗原结合构建体用于制造用以抑制肿瘤生长的药剂的用途。在某些实施方案中的是本文所述的单价抗原结合构建体用于制造用以使肿瘤萎缩的药剂的用途。本文提供本文所述的单价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体用于制造用以治疗癌症的药剂的用途。在某些实施方案中，癌症是低EGFR和/或HER2表达性癌症。在某些实施方案中，癌症对用二价EGFR和/或HER2抗体治疗具有抗性。本文提供本文所述的单价EGFR和/或HER2结合抗原结合构建体用于制造用以治疗对用曲妥珠单抗治疗具有抗性的癌症的药剂的用途。在一个实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体用于治疗癌症。在一个实施方案中，本文所述的包含EGFR和/或HER2结合多肽构建体的单价抗原结合构建体适用于治疗与EGFR和/或HER功能障碍，包括HER1功能障碍、HER2功能障碍、HER3功能障碍和/或HER4功能障碍相关的癌症或任何增生性疾病。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、三重阴性乳腺癌、KRAS突变阳性癌症、胃癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、表皮源性癌症、膀胱癌、头颈部癌、胰腺癌中的至少一个，或是至少一种类型的癌瘤。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体用于处理乳腺癌细胞。在某些实施方案中，EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体用于制备用以向罹患癌症的个体施用的药物组合物。在一些实施方案中的是通过向个体提供有效量的至少一种本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体来治疗所述个体的癌症。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体用于治疗对当前疗法起部分响应的患者。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体用于治疗对当前疗法具有抗性的患者。在另一实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体用于治疗对当前疗法显现抗性的患者。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体适用于治疗对当前疗法不响应的患者。在某些实施方案中，这些患者罹患三重阴性癌症。在一些实施方案中，三重阴性癌症是具有较低至可忽略的雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和Her2的基因表达的乳腺癌。在某些其它实施方案中，任选与一种或多种当前抗HER2疗法组合向对当前疗法不响应的患者提供本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体。在一些实施方案中，当前抗HER2疗法包括但不限于抗HER2或抗HER3单特异性二价抗体、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、双特异性HER2/HER3scFv或其组合。在一个实施方案中，本文所述的单价抗原结合构建体用于治疗不对单独或组合的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、抗HER2或抗HER3起响应的患者。在一个实施方案中，包含结合EGFR和/或HER2的抗原结合多肽构建体的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体可用于治疗患有转移性乳腺癌的患者。在一个实施方案中，EGFR和/或HER2结合单价抗体适用于治疗患有局部晚期或晚期转移性癌症的患者。在一个实施方案中，EGFR和/或HER2结合单价抗体适用于治疗患有难治性癌症的患者。在一个实施方案中，当采用先前抗HER2疗法的患者已进展时，向所述患者提供EGFR和/或HER2结合单价抗体以治疗转移性癌症。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗体可用于治疗患有三重阴性乳腺癌的患者。在一个实施方案中，本文所述的EGFR和/或HER2结合单价抗体用于治疗患有晚期难治性HER2扩增性调蛋白阳性癌症的患者。在一些类型的EGFR表达性癌症中，如果EGFR表达水平较高，那么例如使用二价抗EGFR抗体西妥昔单抗的非小细胞肺癌疗法更有效针对癌症(Pirker等,Lancet13:33-42(2102))。本领域中已知用于测定细胞的EGFR表达水平以及用于测定肿瘤中EGFR表达水平的方法，并且商业试剂盒可用于这个目的，例如DAKOpharmDX试剂盒(Glostrup,Denmark)。可针对样品中个别肿瘤细胞的膜染色强度(在1+至3+的标度上)以及所述样品中在各强度下染色的肿瘤细胞的分数对肿瘤评分。如下对膜染色分级：0＝不染色；1+＝仅在高放大倍数下可见的微弱染色；2+＝在1+与3+之间；3+＝以低放大倍数可见的深色线性膜染色。Pirker等报道其中将肿瘤样品中染色强度与染色频率整合的研究。使用下式计算各肿瘤样品在1-300的标度上的免疫化学(IHC)评分：1X(1+染色细胞的百分比)+2X(2+染色细胞的百分比)+3X(3+染色细胞的百分比)，从而给出最大评分300(代表100％的3+染色细胞)。IHC评分200或更高的肿瘤被视为高EGFR表达性肿瘤。这个评分方法在随后研究中显示可高度重现性((Ruschoff等ArchPatholLabMed137:1255-1261(2013))。本文也公开一种治疗患有表皮生长因子受体(EGFR)表达性肿瘤的受试者的方法，其包括：使所述肿瘤与有效量的分离的单价EGFR结合构建体接触，所述构建体包含至少一个包含重链可变结构域，以或不以接头偶联于异二聚Fc的抗原结合多肽，其中所述抗原结合多肽特异性结合EGFR。在一些方面，相较于特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体，构建体以更大的Bmax结合EGFR。在某些方面，待通过本文公开的方法治疗的肿瘤表达低水平的EGFR。在某些方面，相对于对照肿瘤，肿瘤表达低水平的EGFR。在一些方面，肿瘤表达的第一细胞表面EGFR水平等于或小于一种或多于一种下列细胞系的第二细胞表面EGFR水平：A431、A549、BT474、CACO2、HACAT、HCT116、JIMT1、MDA-MB-231、SKOV3、MCF7或SKBR3。对于其它细节，参见下表AA。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约3.5x106或更少个的EGFR。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约2.8x106或更少个的EGFR。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约1.2x106或更少个的EGFR。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约2.4x105或更少个的EGFR。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约2.6x105或更少个的EGFR。在某些方面，肿瘤表达中值为每个细胞约4.2x104或更少个的EGFR。在某些方面，当使用免疫组织化学染色评估时，肿瘤的样品表达小于3+的中值EGFR水平。在某些方面，当使用免疫组织化学染色评估时，肿瘤的样品表达小于2+的中值EGFR水平。在某些方面，当使用免疫组织化学染色评估时，肿瘤的样品表达小于1+的中值EGFR水平。在某些方面，当通过Pirker等中所述的方法评估时，肿瘤在300或更小的水平下表达EGFR。在某些方面，当通过Pirker等中所述的方法评估时，肿瘤在200或更小的水平下表达EGFR。在某些方面，当通过Pirker等中所述的方法评估时，肿瘤在100或更小的水平下表达EGFR。在某些方面，相较于用固定剂量的特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体治疗的受试者，通过本文公开的方法治疗并被施用固定剂量的本文公开的分离的单价EGFR结合构建体的受试者经受较小的由治疗所致的皮肤毒性。在某些方面，受试者通过本文公开的方法治疗并被施用固定剂量的本文公开的分离的单价EGFR结合构建体，其中相较于用固定剂量的特异性结合EGFR的相应分离的单特异性二价抗原结合构建体治疗的受试者，在治疗之后，所述受试者的角质化细胞的生长的降低程度较小。在某些方面，用分离的单价EGFR结合构建体治疗的EGFR表达性肿瘤是表皮细胞源性癌、肺癌、乳腺癌、三重阴性乳腺癌、导管性乳腺导管癌、胰腺癌、头颈部癌、胃癌、卵巢癌、HER2+癌或结肠直肠癌。在某些方面，癌症是KRAS突变阳性的。在某些方面，分离的单价EGFR结合构建体是无岩藻糖基化的。在一些方面，治疗结果是使肿瘤萎缩，抑制肿瘤生长，增加肿瘤进展时间，延长受试者的无疾病存活期，或增加受试者的存活期。本文也提供待与用于治疗癌症的其它已知疗法组合施用的EGFR和/或HER2结合单价抗原结合构建体。根据这个实施方案，单价抗原结合构建体可与结合靶标表位不重叠的其它单价抗原结合构建体或多价抗体组合施用以使Bmax和抗体依赖性细胞毒性活性显著增加超过FSA。举例来说，可以下列方式施用本发明的单价EGFR结合构建体：1)与一种或多种单价HER2结合构建体(诸如OA-Tras或OA-Pert)组合，或2)与一种或多种二价HER2结合构建体(诸如帕妥珠单抗或曲妥珠单抗)组合，或3)以针对相同靶标细胞上相同和不同表面抗原的非竞争性抗体的多重组合形式。在某些实施方案中，与选自HerceptinTM、TDM1、无岩藻糖基化抗体、缀合于诸如DM1的毒素的抗体、或PeijetaTM的疗法组合施用本文所述的单价抗原结合构建体。本文提供一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。在一个实施方案中，待治疗的疾病是癌症。在另一实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌，例如其中所述乳腺癌的细胞以高、中或低密度表达HER2蛋白。下表A6描述若干代表性乳腺癌细胞系上的HER2表达水平(Subik等(2010)BreastCancer:BasicClinicalResearch:4；35-41；Prang等(2005)BritishJournalofCancerResearch:92；342-349)。如表中所示，MCF-7和MDA-MB-231细胞被视为低HER2表达性细胞；SKOV3细胞被视为中HER2表达性细胞，并且SKBR3细胞被视为高HER2表达性细胞。表A6：基因疗法：在特定实施方案中，施用包含编码本文所述的抗原结合构建体的序列的核酸以通过基因疗法的方式治疗、抑制或预防与蛋白质的表达和/或活性异常相关的疾病或病症。基因疗法是指通过向受试者施用表达或可表达的核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸产生它们的介导治疗作用的编码蛋白质。可使用本领域中可用的任何基因疗法方法。在包括编码本文所述的抗原结合构建体的核酸的特定实施方案中，可通过将它构建为适当核酸表达载体的一部分，以及例如通过下列方式来施用它以使它变为在细胞内来体内施用所述核酸以促进它的编码蛋白质的表达：使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂涂布，或通过连接于已知进入核中的同源框样肽来施用它(参见例如Joliot等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868(1991))等。或者，可将核酸引入细胞内，并且通过同源性重组并入宿主细胞DNA内以达成表达。本文引用各种出版物，其公开内容以引用的方式整体并入本文。参考文献：BowlesJA，WangSY，LinkBK，AllanB，BeuerleinG，CampbellMA，MarquisD，OndekB，WooldridgeJE，SmithBJ，BreitmeyerJB，WeinerGJ.Anti-CD20monoclonalantibodywithenhancedaffinityforCD16activatesNKcellsatlowerconcentrationsandmoreeffectivelythanrituximab.Blood.2006Oct15；108(8)：2648-54.Epub2006Jul6.DesjarlaisJR，LazarGA.Modulationofantibodyeffectorfunction.ExpCellRes.2011May15；317(9)：1278-85.FerraraC，GrauS，C，SondermannP，BrünkerP，WaldhauerI，HennigM，RufA，RuferAC，StihleM，P，BenzJ.Uniquecarbohydrate-carbohydrateinteractionsarerequiredforhighaffinitybindingbetweenFcgammaRIIIandantibodieslackingcorefucose.ProcNatlAcadSciUSA.2011Aug2；108(31)：12669-74.HeiderKH，KieferK，ZenzT，VoldenM，StilgenbauerS，OstermannE，BaumA，LamcheH，KüpcüZ，JacobiA，MüllerS，HirtU，AdolfGR，BorgesE.AnovelFc-engineeredmonoclonalantibodytoCD37withenhancedADCCandhighproapoptoticactivityfortreatmentofB-cellmalignancies.Blood.2011Oct13；118(15)：4159-68.Epub2011Jul27.Blood.2011Oct13；118(15)：4159-68.Epub2011Jul27.LazarGA，DangW，KarkiS，VafaO，PengJS，HyunL，ChanC，ChungHS，EivaziA，YoderSC，VielmetterJ，CarmichaelDF，HayesRJ，DahiyatBI.EngineeredantibodyFcvariantswithenhancedeffectorfunction.ProcNatlAcadSciUSA.2006Mar14；103(11)：4005-10.Epub2006Mar6.LuY，VernesJM，ChiangN，OuQ，DingJ，AdamsC，HongK，TruongBT，NgD，ShenA，NakamuraG，GongQ，PrestaLG，BeresiniM，KelleyB，LowmanH，WongWL，MengYG.IdentificationofIgG(1)variantswithincreasedaffinitytoFcγRIIIaandunalteredaffinitytoFcγRIandFcRn：comparisonofsolublereceptor-basedandcell-basedbindingassays.JImmunolMethods.2011Feb28；365(1-2)：132-41.Epub2010Dec23.MizushimaT，YagiH，TakemotoE，Shibata-KoyamaM，IsodaY，IidaS，MasudaK，SatohM，KatoK.StructuralbasisforimprovedefficacyoftherapeuticantibodiesondefucosylationoftheirFcglycans.GenesCells.2011Nov；16(11)：1071-1080.MooreGL，ChenH，KarkiS，LazarGA.EngineeredFcvariantantibodieswithenhancedabilitytorecruitcomplementandmediateeffectorfunctions.MAbs.2010Mar-Apr；2(2)：181-9.NordstromJL，GorlatovS，ZhangW，YangY，HuangL，BurkeS，LiH，CiccaroneV，ZhangT，StavenhagenJ，KoenigS，StewartSJ，MoorePA，JohnsonS，BonviniE.Anti-tumoractivityandtoxicokineticsanalysisofMGAH22，ananti-HER2monoclonalantibodywithenhancedFc-gammareceptorbindingproperties.BreastCancerRes.2011Nov30；13(6)：R123.[Epubaheadofprint]RichardsJO，KarkiS，LazarGA，ChenH，DangW，DesjarlaisJR.OptimizationofantibodybindingtoFcgammaRIIaenhancesmacrophagephagocytosisoftumorcells.MolCancerTher.2008Aug；7(8)：2517-27.SchneiderS，ZachariasM.AtomicresolutionmodeloftheantibodyFcinteractionwiththecomplementC1qcomponent.MolImmunol.2012May；51(1)：66-72.ShieldsRL，NamenukAK，HongK，MengYG，RaeJ，BriggsJ，XieD，LaiJ，StadlenA，LiB，FoxJA，PrestaLG.HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgG1forFcgammaRI，FcgammaRII，FcgammaRIII，andFcRnanddesignofIgG1variantswithimprovedbindingtotheFcgammaR.JBiolChem.2001Mar2；276(9)：6591-604.StavenhagenJB，GorlatovS，TuaillonN，RankinCT，LiH，BurkeS，HuangL，VijhS，JohnsonS，BonviniE，KoenigS.Fcoptimizationoftherapeuticantibodiesenhancestheirabilitytokilltumorcellsinvitroandcontrolstumorexpansioninvivovialow-affinityactivatingFcgammareceptors.CancerRes.2007Sep15；67(18)：8882-90.StewartR，ThomG，LevensM，Güler-GaneG，HolgateR，RuddPM，WebsterC，JermutusL，LundJ.AvarianthumanIgG1-FcmediatesimprovedADCC.ProteinEngDesSel.2011Sep；24(9)：671-8.Epub2011May18.实施例下列是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则本发明的实施将采用属于本领域的技能的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。所述技术充分说明于文献中。参见例如T.E.Creighton，Proteins：StructuresandMolecularProperties(W.H.FreemanandCompany，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(WorthPublishers，Inc.，当前版本)；Sambrook，等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，1989)；MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress，Inc.)；Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版(Easton，Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990)；Carey和SundbcrgAdvancedOrganicChemistry第3版(PlenumPress)第A和B卷(1992)。表AA提供用于本文所示的特定实施方案的实施例中的细胞系的清单。表AA：用于实施例中的细胞系，显示来源以及EGFR和HER2表达水平*表达水平基于报道的免疫组织学染色的结果(当可用时)，遵循对于HercepTest所述的准则。每种细胞的受体计数的参照值报道于McDonagh等MolCancerTher.2012年3月；11(3):582-93；Subik等BreastCancer(Auckl).2010年5月20日；4:35-41；Kurai等ClinCancerRes2007；13(5):1552-61；Gaborit等JBiolChem.2011年4月1日；286(13):11337-45；Spangler等,PNAS2010；107(30):13252-13257；Anido等,ClinCancerRes2003；9:1274-1283；Nakamura等,CancerLetters230(2005)33-46；Bunn等,ClinCancerRes2001；7:3239-3250；Xu等,MolCancerTher2005；4:435-442；Rao等,Oncogene(2012)31,2888-2898；Dragowska等BMCCancer2011,11:420；Tanner等,MolCancerTher2004；3:1585-1592以及Neve等,CancerCell2006年12月；10(6):515-27中。视用于测定的方法而定，已观察到受体计数的一些微小变化。实施例1-制备示例性OA-EGFR抗体和对照表1提供制备的OA-EGFR抗体和对照的标识。表1：OA-EGFR抗体和对照的清单hIgG1(目录号009-000-003)购自JacksonImmunoResearch(WestGrove,PA)。HerceptinTM(曲妥珠单抗)购自Roche。曲妥珠单抗结合HER2的细胞外结构域4(ECD4)。ErbituxTM(西妥昔单抗)购自Bristol-MeyersSquibb。西妥昔单抗结合EGFR的ECD3。FSA-Tras(v506)是在CHO细胞中内部产生的作为对照的野生型曲妥珠单抗。两种FabHER2结合结构域均与曲妥珠单抗相同，并且Fc是野生型同二聚体；抗原结合结构域的表位是HER2的结构域4。OA-Tras(v1040)是单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是链A上的Fab，并且Fc区是具有下列突变的异二聚体：链A中的T350V_L351Y_F405A_Y407V(EU编号)和链B中的T350V_T366L_K392L_T394W(EU编号)；抗原结合结构域的表位是HER2的结构域4。OA-Pert(v4182)是单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是链A上的Fab，并且Fc区是具有下列突变的异二聚体：链A中的T350V_L351Y_F405A_Y407V和链B中的T350V_T366L_K392L_T394W。抗原结合结构域的表位是HER2的结构域2。OA-CTX(v4353)是具有异二聚IgG1Fc的单价抗EGFR抗体。将蛋白质序列源于Genbank登记号1YY8_B和1YY8_A(分别http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/66361248和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/66361247；2014年11月10日访问)的Fab安放在含有T350V_L351Y_F405A_Y407V的重链A上，并且重链B对应于具有T350V_T366L_K392L_T394W的Fc片段。由抗原结合结构域识别的表位是EGFR的结构域3。也预期分子如同西妥昔单抗一样具有中和性，因为它能够防止EGFR的配体依赖性活化与配体非依赖性活化两者(Li等CancerCell.2005年4月；7(4):301-11)。OA-EG2(v1323)是单结构域抗体EG2(Bell等CancerLett.2010年3月1日；289(1):81-90)于异二聚IgG1Fc上的的单臂抗体。将Fab安放在含有T350V_L351Y_F405A_Y407V的重链A上，并且重链B对应于具有T350V_T366L_K392L_T394W的Fc片段。OA-EG2结合EGFR的细胞外结构域，并且不与西妥昔单抗或EGF竞争结合EGFR。OA-CTX-afuco是OA-CTX的无岩藻糖基化形式(参见实施例9)。OA-CTX-afuco-ADC是已缀合于DM1的OA-CTX的无岩藻糖基化形式(参见实施例10)。序列提供于表B中。实施例2：表达和纯化OA-EGFR抗体和对照如下在50mL培养物中表达和纯化实施例1中所述的OA-EGFR抗体和对照。使用针对人/哺乳动物表达加以优化的密码子，通过基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。将最终基因产物亚克隆至哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI,Canada)中，并且在CHO细胞中表达(Durocher,Y.,Perret,S.和Kamen,A.High-levelandhigh-throughputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growingCHOcells.Nucleicacidsresearch30,E9(2002))。编码抗体构建体的重链和轻链的基因的DNA全都通过基因合成产生，例外之处是v1323，其是使用标准分子生物学DNA重组技术加以克隆。用1mg/mL25kDa聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences)水溶液在PEI:DNA比率2.5:1下转染处于指数生长期(1.5至2百万个细胞/mL)的CHO细胞。(RaymondC.等Asimplifiedpolyethylenimine-mediatedtransfectionprocessforlarge-scaleandhigh-throughputapplications.Methods.55(1):44-51(2011))。为确定用于形成Fc异二聚体的最优浓度范围，最初在不同比率下转染重链A(HC-A)、轻链(LC)和重链B(HC-B)的DNA。v4353的最优HC:Fc:LCDNA比率是36:24:40。v1323的最优HC:FcDNA比率是60:40。在5-6天之后收集转染的细胞，其中在4000rpm下离心之后收集培养基，并且使用0.45μm过滤器加以澄清化。将澄清的培养基装载于MabSelectSuRe(GEHealthcare)蛋白A柱上，并且用10个柱体积的PBS缓冲液(pH7.2)洗涤。抗体用10个柱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH3.6)洗脱，其中含有抗体的汇集洗脱份用TRIS(pH11)中和。接着使用Econo-Pac10DG柱(Bio-Rad)使蛋白质脱盐。通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL，并且通过AKTAExpressFPLC(GEHealthcare)在1mL/min的流速下装载于Superdex200HiLoad16/600200pg柱上。在1mL/min的流速下使用PBS缓冲液(pH7.4)。收集对应于纯化抗体的洗脱份，浓缩至约1mg/mL，并且储存在-80℃下。图1A显示v4353在蛋白A纯化之后的SEC图谱，其中主峰保留在79.95处。图1B显示v1323在蛋白A纯化之后的SEC图谱，其中主峰保留在84.74处。图1C显示v4353与v1323两者在蛋白A和SEC纯化之后的纯度，如通过非还原性SDS-PAGE分析所测量，其中各物质分别在约110kDa和66kDa处。下表2提供通过纯化过程产生抗体的概述。表2：当使用优化DNA比率表达时，示例性单臂抗体v4353和v1323不显示大量同二聚体污染物或高分子量聚集体，如在蛋白A纯化步骤之后的SEC色谱图中所见(图1A和B)。汇集的SEC洗脱份的SDS-PAGE指示异二聚Fc具有高纯度水平(图1C)。通过UPLCSEC和质谱分析，纯度被进一步确认为超过95％。V4353按比例扩大至10L产生规模而未出现问题，在蛋白A和SEC纯化之后产生多达97.5mg/L的效价。实施例3：OA-EGFR抗体特异性结合EGFR进行这个实验以评估两种示例性OA-EGFR抗体v4353和v1323特异性结合EGFR的能力。使用BIAcoreT200仪器(GEHealthcare)，根据下述方法利用表面等离子体共振(SPR)测量与EGFR的特异性结合。通过伯胺基团使抗人IgGFc抗体(JacksonImmunoResearch，目录号109-005-098)共价偶联于S系列传感器芯片CM5(目录号BR-1005-30，GEHealthcare)。首先在10μl/min的流速下用HBS-EP(10mMHEPES(pH7.4)、150mMNaCl、3.4mMEDTA、0.005％表面活性剂P20)平衡芯片5分钟。接着通过注射1比1的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)的混合物，在10μl/min下流动7分钟来活化芯片。接着在10μl/min的流速下注射捕集抗体7分钟，并且最后通过在流速10μl/min下注射乙醇胺7分钟来使过量反应性基团去活化。如下测试抗体与抗原结合。芯片表面首先通过3个相同分析循环的HBS-EP操作缓冲液加以稳定化。以100nM在10μl/min下注射样品捕集抗体20秒至2分钟以实现约100RU(应答单位)的捕集水平。接着使用操作缓冲液平衡芯片。接着在递增浓度(例如1、3、9、27至81nM)下在流速30μl/min下历经3至4分钟注射作为HER2细胞外结构域(ECD)或EGFRECD的抗原以测量抗体结合。这继之以解离步骤，其中在30μl/min下使操作缓冲液流动约20分钟或直至抗原完全解离。表面用操作缓冲液再生两次，各次在流速10μl/min下流动0.5分钟，继之以6个在10μl/min下流动0.25分钟的再生缓冲液(盐酸甘氨酸，pH1.7)注射循环。使用下一更高抗原浓度重复此举直至完成一组结合传感图。结果显示于图2A至2D中。在图2B和2D中，确认不存在HER2结合，其中子段‘a’对应于抗体捕集的传感图，并且子段‘b’对应于在HER2注射之后的传感图。OA-EGFR抗体的EGFR结合特征的概述显示于表3中。表3：ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)v1323*3.11E+053.61E-031.16E-08v43539.22E+057.85E-048.51E-10通过SPR定量OA-CTX与EGFR的结合，其中KD是约0.85nM(图2A)。这与使用抗体捕集方案，通过类似SPR实验确定的对于西妥昔单抗报道的表征单价结合相互作用的KD(1nM)类似。未观察到与HER2结合。也测定OA-EG2与EGFR结合，其中KD是约12nM。OA-EG2也与EGFR特异性结合。总之，这些结果证明通过设计，单臂抗体可结合EGFR的不同表位，并且相较于从其获得它们的相应二价抗体，可保留相同单价结合亲和力。实施例4：示例性OA-EGFR抗体结合表达低水平的EGFR(EGFR低)的细胞的能力进行这个实验以评估OA-EGFR抗体与作为表达低水平的EGFR的细胞系的乳腺BT-474癌细胞系的结合(McDonagh等MolCancerTher.2012年3月；11(3):582-93)。如下所述进行实验。在4℃下使BT-474细胞与各种浓度的抗体一起孵育1小时，其中8个浓度点从0.3pM至300nM几何分布。接着用PBS洗涤细胞3次，此后过量添加抗人IgG-FITC。在4℃下在黑暗中再孵育细胞1小时，并且用PBS再次洗涤3次。最后，将细胞再混悬于PBS中，并且使用FACSCalibur(BDBiosciences)测量MFI。结果显示于图3中。表4A提供关于BT-474的细胞结合数据的概述。表4A：FACS结合结果显示朝向饱和浓度，单臂抗体比相应二价抗体显示更高Bmax。OA-CTX比OA-EG2显示更高Bmax，这可通过对EGFR的不同结合和解离动力学来解释。实施例5：评估示例性OA-EGFR抗体抑制作为EGFR表达性A431细胞的细胞的生长的能力进行这个实验以测定示例性OA-EGFR抗体抑制表达高水平的EGFR的表皮样癌细胞系(CRL-1555)的生长的能力。如下所述进行生长抑制测定。将5000个A431细胞接种至96孔板的各孔中。一式三份添加抗体OA-CTXv4353、OA-EG2v1323或ErbituxTM以达到最终浓度300nM、30nM、3nM和0.3nM。生长培养基的最终测定体积是200μL，并且在37℃下孵育96孔板5天。从板移除培养基，并且添加50μLPBS至各孔中。接着，添加50μLCellTiter-(Promega)反应混合物至各孔中，并且将板孵育10分钟。最后，通过Pherastar板读取器读取RLU(相对光单位)值。通过下列方式计算相对于未处理对照的细胞生长百分比：细胞生长％＝100％x(RLU样品)/(RLU未处理)结果显示于图4中。在饱和条件下，OA-CTX抑制A431生长的程度与ErbituxTM相同，而OA-EG2不抑制A431生长。抑制高EGFR表达性A431细胞的EGFR依赖性生长与OA-CTX能够中和EGF，而OA-EG2不能中和EGF一致。差异性活性也反映OAA阻断驱动细胞生长的EGFR组成性受体信号传导的能力不同(视结合表位而定)。实施例6：示例性OA-EGFR抗体介导ADCC的能力在BT-474乳腺导管癌源性细胞系中测量OA-EGFR抗体介导ADCC的能力。如下所述进行ADCC测定。添加靶标BT-474细胞(10,000个细胞，50μl)至96孔板的各孔中，向其中添加从3pM至300nM(最终浓度)几何分布的不同浓度的抗体。将板孵育30分钟，随后添加PBMC效应细胞以达到效应细胞与靶标细胞(E:T)比率25:1。通过交叉振荡来温和混合细胞，并且将板在37℃/5％CO2下再孵育6小时。通过使用LDH试剂盒和Flexstation3测量释放至上清液中的LDH的量来测定溶解的细胞的百分比。在492nm下的吸光度值都用在650nm下的吸光度值进行背景减除。如下所示计算结果，并且在GraphpadPrism中拟合剂量反应曲线参数：细胞溶解％＝100％x(OD样品-OD非特异性)/(ODmax-ODmin)其中：OD样品对应于样品的背景减除值；OD非特异性对应于LDH测定中当使靶标细胞与效应细胞一起孵育而不进行其它处理时的读数；ODmax对应于溶解的靶标细胞的最大量。这个读数通过向与抗体而无效应细胞一起孵育的靶标细胞中添加1％TritonX-100来产生；ODmin对应于溶解的靶标细胞的最小量。在无效应细胞和抗体的测定缓冲液中孵育靶标细胞。结果显示于图5中。相较于ErbituxTM，OA-CTX(v4353)和OA-EG2(v1323)显示更大ADCC介导的细胞溶解。表5提供对BT-474细胞的ADCC溶解的剂量反应参数的概述。表5：最大细胞溶解(％)EC50(nM)爱必妥20*n/aOA-CTXv4353555.2OA-EG2v13235222赫赛汀590.008*在测试的最高抗体浓度下的溶解相较于ErbituxTM，两种示例性OA-EGFR均显示更高百分比的靶标细胞溶解，其中在测试的最高抗体浓度下有约2倍差异。基于如实施例4中所示，对于单臂抗体观察的细胞表面装饰水平比相应全尺寸抗体而增加预期到这个结果。HerceptinTM也作为阳性对照被包括，并且尽管BT-474表达的HER2受体水平比EGFR高13倍，但OA-CTXv4353与OA-EG2v1323两者均能够与HerceptinTM达到类似水平的最大ADCC溶解百分比。这些结果证明单臂抗体能够实现不可由相应全尺寸抗体达到的较高ADCC溶解。这在受体水平通常不足以诱导高效效应物介导的细胞杀灭时将可能是特别重要的。另外，由单臂抗体介导的ADCC水平可匹配由靶向在显著较高水平下于细胞表面上表达的不同受体的全尺寸抗体介导的水平。实施例7：示例性OA-EGFR被内化以及下调表面EGFR表达的能力在曲妥珠单抗抗性乳腺癌JIMT1细胞(表达高水平的EGFR)中测量v4353被内化以及下调表面EGFR表达的能力。进行这个实验以确定示例性单臂抗EGFR抗体是否可被内化于EGFR表达性细胞中，以及表征它与抗HER2抗体组合的性质。根据Schmidt,M.等,Kineticsofanti-carcinoembryonicantigenantibodyinternalization:effectsofaffinity,bivalency,andstability.CancerImmunolImmunother(2008)57:1879-1890中详述的方案遵循直接内化方法。具体来说，根据制造商说明书，使用488蛋白质标记试剂盒(Invitrogen，目录号A10235)直接标记抗体。对于内化测定，12孔板用1x105个细胞/孔接种，并且在37℃/5％CO2下孵育过夜。次日，将标记的抗体在200nM下于DMEM+10％FBS中添加，并且在37℃/5％CO2下孵育24小时。在黑暗条件下，吸出培养基，并且各孔用2x500μLPBS洗涤。为收集细胞，在37℃下添加细胞解离缓冲液(250μL)。将细胞沉淀并再混悬于不具有或具有50pg/mL的抗AlexaFluor488兔IgG部分(MolecularProbes，A11094，批号1214711)的100μLDMEM+10％FBS中，并且在冰上孵育30分钟。在分析之前，添加300μLDMEM+10％FBS，过滤样品，添加4μl碘化丙啶。使用LSRII流式细胞仪分析样品。对于下调测定，也对在4℃下孵育的细胞测量抗体的荧光水平。在20nM下进行的内化和下调实验的结果显示于图6A中。在100nM和200nM的组合下测量的结果显示于图6B中。对于组合，携带荧光团的分子用*标记。1040+4353*的‘表面4度’测量结果不可用。在20nM下，相较于爱必妥，OA-CTX(v4353)在类似程度上被内化，并且OA-CTX(v4353)下调表面EGFR但程度小于爱必妥。在100nM下，ErbituxTM不增强FSA-Tras(v506)的内化，也不增强HER2下调。在200nM下，在OA-CTXv4353+OA-Tras组合的情况下，OA-CTX不影响OA-Tras的内化，也不影响由OA-Tras诱导的HER2受体水平，并且OA-Tras(v1040)似乎略微降低OA-CTX的内化，但不降低EGFR受体水平。OA-CTXv4353在较小程度上下调表面EGFR，如在20nM下所观察。在不同抗体浓度下测试受体下调和内化的程度。在20nM下，当用OA-CTXv4353测试时，53％的EGFR保持在表面上，但ErbituxTM以36％介导略微较高水平的受体下调。然而，两种分子均在几乎相同程度上被内化。也应注意当相较于在200nM下测试的OA-CTX时，观察到受体下调和内化依赖于浓度。在100nM下，测试ErbituxTM对FSA-Tras内化的影响，并且结果显示ErbituxTM不影响FSA-Tras的HER2内化和下调性质。在200nM下，探究单臂抗体组合的行为。此处，OA-CTXv4353不改变由OA-Trasv1040介导的HER2内化和上调，这与对于全尺寸对应物的观察结果一致。然而，OA-Tras似乎略微降低由OA-CTXv4353介导的内化的量，即从1300MFI至1050MFI。也似乎EGFR下调程度在组合的情况下降低。示例性单臂抗体的内化概况指示它可为适于抗体-药物缀合物(ADC)的候选物。实施例8：OA-EGFR和OA-HER2抗体的组合在SKOV3异种移植模型中的抗肿瘤活性进行这个实验以确定OA-EGFR和OA-HER2的组合是否能够在细胞系源性异种移植模型中降低肿瘤体积或增加存活率。人卵巢细胞系源性异种移植模型SKOV-3用于评估呈单一药剂形式或呈组合形式的抗HER2单臂抗体与抗EGFR单臂单克隆抗体组合用以抑制肿瘤生长的抗肿瘤功效。通过在皮下组织中插入1mm3肿瘤片段来用肿瘤接种雌性Fox1n裸小鼠。每两周获取肿瘤测量结果，直至达到200mm3的体积；接着将动物随机分至3个治疗组中。治疗组是：·组(a)非特异性hIgG对照，每周两次给药·组(b)单臂曲妥珠单抗(OA-Tras；v1040)，每周两次持续21天给药，接着在第22天将治疗转换成单臂曲妥珠单抗+单臂帕妥珠单抗(OA-Pert；v4182)·组(c)单臂曲妥珠单抗+单臂西妥昔单抗(OA-CTX；v4353)，每周两次给药治疗组根据它们的给药时程用在T0时负荷剂量15mg/kg和维持剂量10mg/kg静脉内给药直至总计4周时间。通过在治疗时期期间每两周以及在追踪时期期间一周一次测量肿瘤直径来评估肿瘤体积。测定测试群组在第11天的血清浓度。对于组b(OA-Tras)，平均血清浓度是70.9μg/ml(范围35-95μg/ml)，并且对于组c(OA-Tras+OA-CTX)，总测试抗体的平均血清浓度是165.6μg/ml(100-280μg/ml范围)。相较于组a，用组(c)治疗携带SKOV-3肿瘤的小鼠最高效抑制肿瘤生长。OA抗体的组合对肿瘤体积的影响显示于图7中。表6提供在其中发生对所选群组的药物转换的第22天的体内肿瘤生长抑制结果的概述。表6：*各群组间的小鼠体重类似。**x＝从基线开始的TV变化％显示OA抗体的组合对存活率的影响的结果显示于图8中。在SKOV3小鼠异种移植模型中，OA-CTX+OA-Tras组合在抑制产生的肿瘤的生长方面显示最高功效。在治疗2周内产生就对照和其它治疗组而言的统计显著性(图7)。相较于OA-Tras，添加OA-CTX赋予进一步肿瘤生长抑制作用。当通过添加单臂帕妥珠单抗使OA-Tras群组转换成组合组时，与两种抗HER2单臂抗体的组合进行间接比较，在所述添加之后，肿瘤生长速率未显著降低。数据表明当通过靶向不同受体的单臂抗体的组合治疗时，肿瘤生长抑制更加有效。基于示例性单臂抗体的在相同癌细胞系中在体外观察的生物活性，似乎附加功效产生于由另外的细胞表面装饰所致的抗体介导的效应物功能。根据Kaplan-Meier图(图8)，OA-CTX+OA-Tras的功效也是明显的，其中2000mm3的肿瘤体积被用作充当存活率的替代读数的终末终点。如图8中所示，在治疗之后，hIgG对照组中无小鼠存活超过第33天。相比较来说，在第60天，OA-Tras/+OA-Pert组中小鼠的存活率降低至小于33％。然而，在OA-CTX+OA-Tras组中，所有动物都保持活着，从而进一步证明单臂抗体组合的功效。总之，相较于对照，OAA的示例性组合已显示优越体内肿瘤生长抑制性质。依据我们的内部准则，OAA组合群组中的所有肿瘤都对治疗起响应。另外，根据RECIST实体肿瘤生长评估，OAA组合降低进行性疾病的数目以及使达到进展的平均时间延迟至少2.3倍。表7提供Kaplan-Meier图(图8)中所示的结果的概述。表7：表8提供关于肿瘤生长动力学的结果的概述。表8：**出于计算目的，向被鉴定为稳定疾病的肿瘤指定t＝22天作为开始进展的时限实施例9：瞬时CHO表达、纯化和产生无岩藻糖基化示例性抗体已知无岩藻糖基化抗体会增强ADCC和其它抗体效应物功能。使用如实施例2所述的相同瞬时CHO表达系统以及蛋白A和尺寸排阻色谱法纯化程序产生无岩藻糖基化示例性抗体(OA-CTX-afuco，v7192)，其中添加来自绿脓假单胞菌PAO1的编码GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的额外克隆以达到总转染DNA的15％(vonHorsten等Glycobiology(2010)20(12):1607-1618)，即HC:Fc:LC:RMD的最终DNA比率是30.6:20.4:34:15。在10L培养物中表达无岩藻糖基化示例性抗体。在蛋白A纯化(图9A)之后，回收1g蛋白质。在通过使用Superdex200柱进行尺寸排阻色谱法来进一步纯化(图9B)后，回收975mg蛋白质。内毒素水平小于0.001EU/mg。如通过UPLC-SEC评估的纯度是99.81％。图10A和10B显示纯化的v7192的UPLC-SEC色谱图。图10C显示最终v7192产物的非还原性SDS-PAGE。简要来说，通过下列方式来对抗体进行聚糖分析：首先使用10mM二硫苏糖醇(DTT)在56℃下还原样品1小时，在室温下用55mM碘乙酰胺烷基化1小时，接着在37℃下用胰蛋白酶于50mM碳酸氢铵中消化过夜。在Q-TofUltimateMS上的nanoLC-MS/MS上分析消化的样品。用Mascot搜索NCBI数据库以鉴定蛋白质序列。MaxEnt3(MassLynx)用于去卷积糖肽离子，并且定量不同糖形式的相对丰度。通过LC-MS在示例性抗体中未检测到显著岩藻糖基化(>98％无岩藻糖基化)。图11显示通过LC-MS对示例性无岩藻糖基化抗体v7192-afuco的胰蛋白酶消化物的聚糖分析。这些结果显示使用标准程序，示例性OAA抗体可以无岩藻糖基化抗体形式大规模产生，并且纯化至极高纯度。表9概述无岩藻糖基化示例性抗体的纯度和产量。表9：实施例10：示例性抗体缀合于毒性药物有效载荷以产生ADC使用一步程序使示例性OA-CTX-afucov7192缀合于莫坦辛(mertansine，DM1)以形成抗体-药物缀合物(ADC，v7104)。如下进行缀合。首先使用PD-10柱使起始蛋白质样品交换至由50mM磷酸钾(pH6.5)、50mMNaCl和2mMEDTA组成的缓冲液中，并且调整至10mg/ml的蛋白质浓度。接着添加SMCC-DM1(内部制备)溶解于二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM溶液至7.5摩尔当量的蛋白质样品中。再添加DMA以达到10％v/v的最终浓度，并且短暂混合样品。在25℃下在混合下将反应混合物孵育过夜。通过疏水性相互作用色谱法-高效液相色谱法(HIC-HPLC)监测根据未缀合的蛋白质样品的含量确定的反应进展。这是使用TosohTSK凝胶丁基-NPR柱(4.6mmx3.5mmx2.5mm)来进行。使用历经25分钟10-90％缓冲液B，继之以持续4分钟100％缓冲液B的梯度，在1ml/min下进行洗脱。缓冲液A包含20mM磷酸钠、1.5M硫酸铵，pH7.0。缓冲液B包含20mM磷酸钠、25％v/v异丙醇，pH7.0。以小增量添加SMCC-DM1直至未缀合的蛋白质的量小于5％。接着使用PD-10柱使产物交换至由20mM丁二酸钠(pH5.0)组成的缓冲液中，并且基于在252和280nm下的吸光度计算蛋白质浓度和药物与抗体比率(DAR)。将缓冲液调整至20mM丁二酸钠、6％w/v海藻糖和0.02％w/v聚山梨醇酯20(pH5.0)的最终组成。使用TosohG3000-SWXL柱(7.8mmx30cm)，以100mM磷酸钠、300mM氯化钠(pH7.0)在1ml/min的流速下执行高效液相色谱法-尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)以测定ADC的纯度。对234mg无岩藻糖基化示例性抗体进行缀合以产生具有98％纯度和3.09DAR的ADC。存在3.63％的未缀合抗体和4.81％的高分子量(HMW)污染物。回收率是73％，并且内毒素水平<0.25EU/mg。图12显示未缀合的OA-CTX-afucov7192和缀合的OA-CTX-afucov7104的HIC-HPLC色谱图的重叠图。基于由于化学缀合于SMCC-DM1的ADC疏水性增加预期到v7192的延迟洗脱概况。v7192色谱图的宽度也与SMCC-DM1缀合于抗体上随机数目(通常在0-10之间)的可及赖氨酸残基一致。图13显示示例性未缀合无岩藻糖基化OA-CTXv7192和缀合无岩藻糖基化OA-CTXv7104的SEC-HPLC色谱图。色谱图的紧密重合显示抗体的总体结构完整性得以保留，并且示例性OA-CTX-afuco可经受标准缀合程序而不形成任何非所需HMW污染物。这些结果显示示例性抗体可经受标准大规模缀合程序。实施例11：示例性OA-EGFR结合细胞的Bmax高于相应二价抗体进行全细胞结合测定以在示例性OA-EGFR与相应二价抗体之间比较对表达不同水平的靶标抗原EGFR的人肿瘤细胞的结合水平(对于细胞系，参见表1)。如实施例4中所述进行流式细胞计量术，其中修改是孵育初级抗体2小时。此外，AF488抗人IgG(Fc特异性)抗体(JacksonImmunochemicals)被替代地用作用于检测的二级抗体。在测试的所有人肿瘤细胞系中，视测试的细胞系而定，示例性OA-CTXv4353都显示Bmax比相应二价抗体高约1.38-1.68倍。另外，OA-CTX+OA-Trasv1040的组合的Bmax高于单独各个别OAA，并且约等于它们的个别Bmax的总和。图14A、14B和14C显示对结肠直肠HCT116、乳腺MDA-MB-231和卵巢SKOV3细胞系的全细胞结合实验的结果。FACS结合结果显示示例性OA-EGFR可结合人肿瘤细胞的水平高于相应二价抗体，因为更多抗体分子被结合于细胞。细胞结合水平可通过使用不竞争相同结合位点的抗体的组合来进一步增加。实施例12：示例性OAA介导对人结肠直肠癌细胞Caco2的ADCC的能力将示例性抗EGFROAA介导对不同EGFR表达性细胞(即人结肠直肠癌细胞系Caco2)的ADCC的能力与全尺寸二价抗EGFR抗体的能力进行比较。如实施例6中所述进行ADCC测定，例外之处是PBMCE:T比率是50:1。在300nM抗体浓度下，示例性抗EGFROAAv4353与v1323两者均显示靶标细胞溶解％略微高于(即功效高于)二价ErbituxTM。然而，在EC50方面存在较大差异；示例性v1323的显著较低效价与它从细胞表面EGFR的解离速率相对较高一致。然而，在接近饱和浓度下，v1040(单臂抗HER2抗体)与v1323的组合导致略微较高靶标细胞溶解％。图15A和15B显示示例性OAA关于Caco2细胞的ADCC剂量反应曲线。这些结果证明相较于二价抗EGFR抗体，抗EGFROAA介导更高ADCC功效。结合不同表位的抗体的组合也导致较高ADCC功效。这与结合靶标细胞的抗体的水平增加一致。然而，细胞结合与ADCC功效之间的相对增加似乎视靶标细胞的相关受体表达水平而变化。实施例13：示例性OAA显示ADCC功效高于相应二价抗体已知抗体的无岩藻糖基化会增强效应物功能。在关于MDA-MB-231(EGFR中/高)的ADCC测定中相对于非无岩藻糖基化对应物v4353测试示例性无岩藻糖基化OA-CTX-afucov7192以评估由于无岩藻糖基化的功效和效价变化。如实施例6中所述进行ADCC测定，例外之处是NK92/CD16a(158V/V)细胞(由Genscript产生)在E:T比率5:1下用作效应细胞。结果显示于图16中。无岩藻糖基化示例性OAAv7192显示功效高于非无岩藻糖基化对应物v4353(62％对45％靶标细胞溶解)。无岩藻糖基化抗体也更加强力，具有9pM的EC50，这比相应非无岩藻糖基化OAA的EC50低约16倍。相较于ErbituxTM(v7180)，无岩藻糖基化OAAv7192也显示略微更高的靶标细胞溶解％，但它们显示类似效价。这些结果证明示例性OAA的无岩藻糖基化可导致效应物介导的功能(诸如ADCC)的功效和效价增强。实施例14：示例性OA-ADC抑制人三重阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的生长使用体外生长抑制测定来测定示例性OA-CTX-afuco-ADCv7104对人三重阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(EGFR中/高，HER2低，KRASG13D突变体)的效价和功效。简要来说，将2,000个MDA-MB-231细胞接种至96孔板中，并且在37℃、5％CO2下于补充以10％FBS的RPMI中孵育24小时。接着，一式三份添加抗体，从最终浓度30nM开始，连续稀释3倍直至0.00457nM。将细胞再孵育5天。遵循制造商推荐的方案，使用磺酰若丹明B(Sigma)测定测量细胞生长。历经实验过程，未处理的对照细胞生长约6倍。图17中的结果显示相较于在多达10nM下不显示显著生长抑制的阴性对照v6249(IgG-ADC)，示例性OA-CTX-afuco-ADCv7104显示显著生长抑制(多达50％)。在30nM下，对于对照观察到非特异性活性，但示例性OA-CTX-afuco-ADC展现约67％的较高生长抑制水平。未测试更高抗体浓度。估计v7104的EC50是3-10nM，而v6249的EC50是约30nM。T-DM1(v6246，内部产生的曲妥珠单抗美坦辛(emtansine))也作为另一对照加以测试，但它与阴性对照v6249显示相同剂量反应概况。考虑到HER2在MDA-MB-231上的极低表达状态，这并不是惊人的。这些结果证明示例性OA-CTX-afuco-ADC针对EGFR表达性人三重阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231是强力和有效的。结果与抗EGFROAA能够变得由靶标癌细胞内化一致。另外，OA-CTX-afuco-ADC显示对具有KRASG13D突变的细胞系具有功效，已知所述突变赋予对诸如西妥昔单抗的常规抗EGFR治疗剂的抗性。实施例15：示例性OAA以降低的效价抑制角质化细胞生长皮疹是常常在用包括抗EGFR抗体(诸如西妥昔单抗)的EGFR抑制剂治疗的患者之中观察到的副作用。EGFR抑制剂对角质化细胞的直接毒性据信是一种导致皮疹的机理。使用关于HACAT角质化细胞(EGFR中等表达者)的生长抑制测定评估示例性抗EGFROAA的潜在皮肤毒性。如实施例5中所述进行生长抑制测定。简要来说，将5,000或10,000个HACAT细胞接种至各孔中。在过夜孵育之后，用抗体处理细胞，并且在37℃、5％CO2下孵育3或5天。使用CellTiterAQueous非放射性细胞增殖测定(MTS)试剂盒(Promega)测定生长水平。在10％FBS存在下测试OA-CTXv4353和OA-CTX-afucov7192，并且在不存在FBS下测试OA-EG2v1323。结果显示于图18A和18B中。在测试的抗体最高浓度(300nM)下，示例性抗体OA-CTXv4353显示生长抑制性质类似于ErbituxTM。然而，在较低抗体浓度下，相较于ErbituxTM，OA-CTX显示效价降低许多，如通过小得多的细胞生长抑制所证实。OA-CTX-afuco显示剂量反应类似于OA-CTX的剂量反应。相比较来说，在测试的浓度下，OA-EG2不显示显著生长抑制。这与EG2是不中和EGFR的抗体一致。结果指示示例性OA-CTX抗体针对皮肤细胞具有的毒性低于相应二价抗体。实施例14：示例性OAA对表达不同EGFR水平的人癌细胞的ADCC活性进一步测试表达不同水平的EGFR的其它人癌细胞系以证明单价抗EGFROAA具有超过二价对应物的优越ADCC活性。使用AlexaFluor488缀合的AffiniPureFab片段山羊抗人IgG(H+L)作为二级抗体，如实施例11中所述对癌细胞系的相对EGFR表达和抗体结合(在300nM下)水平进行测定。如实施例6中所述进行ADCC测定。A431和A549细胞ADCC采用NK92/FcγR3a(158V/V)细胞，而HCT116细胞采用以IL2预刺激过夜的PMBC。表14.1-人癌细胞系上表示为中值荧光强度(MFI)值的相对EGFR水平。细胞系v4353v7192v7180EGFR水平指示A431230022001700高(3+)A549200200130中(2+)HCT116393010低(1+)测定3种其它人癌细胞系的相对EGFR表达。如上表中所示，测试高、中和低EGFR表达性细胞系。这些定量术语是基于文献报道的A431EGFR水平指定，所述水平约为每个细胞数百万个受体分子，并且被视为高水平的受体表达。在高EGFR表达性A431表皮样癌细胞中，示例性v7192与对照v7180之间的ADCC效价(EC500.09nM比对0.07nM)和功效(53％比对51％)极其类似。在中度EGFR表达性A549肺癌细胞中，v7192与v7180显示类似效价(EC500.13nM比对0.052nM)，但ADCC功效增强1.9倍(68％比对35％)。类似地，在低EGFR表达性HCT116结肠直肠癌细胞中，单价v7192与二价v7180之间的效价是类似的(EC508pM比对4pM)，但OAA赋予1.4倍功效增强。这些结果显示OAA相较于相应二价抗体介导对不同EGFR表达性癌细胞的相等或更好功效。具体来说，单价抗体被预期在高EGFR表达性细胞中类似于二价对应物，但被预期在较低EGFR表达性细胞中显著增强功效而无任何显著效价损失。实施例中采用的试剂通常可商购获得，或可使用本领域中已知的可商购获得的仪器、方法或试剂制备。前述实施例说明本发明的各个方面以及本发明方法的实施。所述实施例不意图提供对本发明的许多不同实施方案的详尽描述。因此，尽管前述本发明已出于明确理解的目的以说明和举例方式较详细地描述，但本领域普通技术人员将易于认识到可在不脱离随附权利要求的精神或范围下对其进行许多变化和修改。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都在本文中以引用的方式并入说明书，所述引用的程度就好像各个别出版物、专利或专利申请被特定地以及个别地指示以引用的方式并入本文一样。当前第1页1 2 3