技术领域本发明属于基因工程技术领域，具体一对特异性识别猪IGF2基因内含子的sgRNA及其编码DNA与应用。
背景技术：
猪的生长速度和背膘厚是当前养猪业的重要育种目标之一，具有重要的经济价值。但是猪的生长速度和背膘厚是由不同层次的多基因控制的复杂性状，是多个基因及其产物形成的调控网络的作用结果。目前已经发现MSTN、IGF2、MC4R、JHDM1A、TEF-1、RYR1、COPB1等多个基因都对猪的背膘厚以及生长速度等经济性状有着显著的影响，且上述基因中都含有对背膘厚以及生长速度两种性状有重要影响的QTN位点。如此多的基因，如果通过传统育种技术和方法进行育种选育，将需要几十年甚至上百年的选育时间。IGF2(Insulin-likegrowthfactors-2)基因，即胰岛素样生长因子2，又称为生长调节素(SomatomedinA)。在猪中，IGF2基因(登录号AYO44828)位于猪的2号染色体短臂，约23.8kb，5’端是INS(胰岛素)基因，3’端是H19基因。该基因有4个启动子，10个外显子，前7个外显子(Exon1到Exon6加上Exon4b)是不编码蛋白的前导外显子(Leaderexon)，外显子7-9编码pre-proIGF2，共182个氨基酸。外显子1，4，5，6前各有一个启动子，共可以转录出7种转录本。四个不同启动子的不同时空表达使得IGF2基因的组织和时空表达呈现高度复杂性。另外，猪的IGF2内含子序列较为保守，尤其是内含子2，3，4，5与人的序列比较同源性分别为68％，66％，74％和73％。猪的QTL分析表明IGF2基因内含子3第3072位碱基由G(鸟嘌呤)到A(腺嘌呤)的单碱基突变对猪的生长速度、瘦肉率、背膘厚、背最长肌面积以及心脏重量等性状有着非常显著的影响。其主要原因是转录因子ZBED6能够结合到IGF2基因内含子3的3072位附近的未被甲基化的GCTCG序列，从而下调出生后个体的IGF2基因的表达量。当发生G到A单碱基的突变时，转录因子ZBED6不能结合到该位置，从而提高猪出生后IGF2基因的表达量约3倍，使猪的肌肉含量增加15～30％，背膘厚减少10～20％。CRISPR/Cas9技术是细菌和古细菌在漫长的进化过程中形成的一种抵御噬菌体以及外来核酸分子的获得性免疫系统。目前常用的CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和一小段单链RNA(sgRNA)组成，单链RNA负责识别靶标DNA序列，Cas9蛋白则会在单链RNA识别的靶位点上将双链DNA切开，从而降解外来核酸分子。Mali等证明CRISPR/Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种哺乳动物细胞中进行精确的靶向切割，且打靶效率远超ZFN和TALEN技术，是进行基因功能研究、动植物基因组编辑、培育动植物新品种、制作生物反应器和疾病模型的有效工具。
技术实现要素：
本发明一个目的是提供成套sgRNA。本发明提供的成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成；所述sgRNA-L-1中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列1；所述sgRNA-R-2中负责识别靶片段的核苷酸序列为序列2。上述的成套sgRNA中，所述sgRNA-L-1的核苷酸序列为序列5；所述sgRNA-R-2的核苷酸序列为序列6。本发明另一个目的是提供成套DNA分子。本发明提供的成套DNA分子，由编码上述sgRNA-L-1的DNA分子和编码上述sgRNA-R-2的DNA分子组成。上述sgRNA-L-1识别的靶片段，为序列表中序列3所示的核苷酸，为猪IGF2基因内含子3上的ZBED6结合位点上游128bpDNA分子。上述sgRNA-R-2识别的靶片段，为序列表中序列4所示的核苷酸，为猪IGF2基因内含子3上的ZBED6结合位点下游98bpDNA分子。上述的成套sgRNA或上述的成套DNA分子在对猪基因组中IGF2基因内含子3上转录因子ZBED6识别位点进行基因编辑中的应用也是本发明保护的范围。上述的成套sgRNA或上述的成套DNA分子在制备对猪基因组中IGF2基因内含子3上转录因子ZBED6识别位点进行基因编辑产品中的应用也是本发明保护的范。本发明第三个目的是提供一种对猪基因组中IGF2基因内含子3上转录因子ZBED6识别位点进行基因编辑的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的成套sgRNA和Cas9蛋白mRNA导入猪中，实现对猪基因组中IGF2基因内含子3上转录因子ZBED6识别位点的基因编辑。上述中，所述IGF2基因内含子3上转录因子ZBED6识别位点的核苷酸序列为序列8第306-310位。本发明的实验证明，本发明提供了一对特异性识别猪IGF2基因内含子3上的ZBED6结合位点的sgRNA，特异性强。在进行序列敲除时，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。本发明提供的该对sgRNA，能通过/Cas9系统在细胞或者个体水平对猪基因的内含子进行修饰，不仅能用于培育高瘦肉率新品种猪，而且能用于猪IGF2基因功能的研究。附图说明图1为sgRNA-L-1与sgRNA-R-2共同敲除IGF2基因内含子3上ZBED6结合区示意图。图2为琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA-L-1与sgRNA-R-2敲除效率。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成。sgRNA-L-1的核苷酸序列为序列5，其包括sgRNA-L，sgRNA-L的核苷酸序列为序列1，其靶序列为序列3，序列3为猪IGF2基因内含子3(内含子3部分序列为序列8)上的ZBED6结合位点(序列8第306-310位)上游128bpDNA分子；sgRNA-R-2的核苷酸序列为序列6，其包括sgRNA-R，sgRNA-R的核苷酸序列为序列2，其靶序列为序列4，序列4为猪IGF2基因内含子3上的ZBED6结合位点下游98bpDNA分子。图1为sgRNA-L-1与sgRNA-R-2共同敲除IGF2基因内含子3上ZBED6结合区示意图。实施例1、成套sgRNA及其应用一、Cas9系统介导删除猪胚胎中的IGF2基因内含子3中ZBED6结合位点的成套sgRNA的制备1、体外转录载体构建根据猪胚胎中的IGF2基因内含子3作为打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送可信赖的商业引物合成公司进行合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下：(1)IGF2-sgL2：IGF2-sgL-up2：TAGGACTGGTTTCGCCCTCCTCCGIGF2-sgL-dn：AAACCGGAGGAGGGCGAAACCAGT(2)IGF2-sgR2：IGF2-sgR-up2：TAGGAGCAGCGCCCCGACGCGCCCIGF2-sgR-dn：AAACGGGCGCGTCGGGGCGCTGCT将以上两对oligoDNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段IGF2-sgL2以及IGF2-sgR2。用限制性内切酶BsmBI对pT7-sgRNA(addgene,Plasimd65565)载体进行酶切，回收酶切后的片段。将IGF2-sgL2以及IGF2-sgR2片段分别连接到酶切回收后的pT7-sgRNA载体中，得到体外转录载体pT7-IGF2-sgL与pT7-IGF2-sgR。经过测序，pT7-IGF2-sgL载体为将序列1所示sgRNA-L的编码基因的插入pT7-sgRNA载体的BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-L-1；pT7-IGF2-sgR载体为将序列2所示sgRNA-R的编码基因插入pT7-sgRNA载体的BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-R-2。2、体外转录sgRNA分别取步骤1中的体外转录载体pT7-IGF2-sgL与pT7-IGF2-sgR，XmnI限制性内切酶(NewEnglandBiolabs，R0194V)单酶切进行线性化，并进行胶回收。取回收后的体外转录载体12μL，按照体外转录试剂盒(Ambion,MaxiscriptT7Kit)说明书的要求进行sgRNA的体外转录(无需戴帽和加尾)，得到序列5所示的sgRNA-L-1和序列6所示的sgRNA-R-2。人工合成Cas9的mRNA，核苷酸序列为序列7。二、成套sgRNA在Cas9系统介导下删除猪胚胎中的IGF2基因内含子中的应用1、猪胚胎显微注射取猪体内受精或者体外受精后的离体胚胎，进行胞质显微注射，将上述一制备的sgRNA-R-1、sgRNA-L-2和Cas9的mRNA混合，得到混合体系，且各物质在体系中的终浓度为12.5ng/μLsgRNA-R-1，12.5ng/μLsgRNA-L-2以及125ng/μLCas9的mRNA；将混合体系按照每个胚胎注射量约为10pL注射到猪胚胎中，得到含有sgRNA的猪胚胎。共进行32个猪胚胎的显微注射。注射具体操作参见文献：Lillico,S.G.,etal.,Livepigsproducedfromgenomeeditedzygotes.ScientificReports,2013.3:p.2847.2、PCR检测取步骤1中得到的单个含有sgRNA的猪胚胎，放入单细胞裂解液(北京天恩泽，货号130803-1)中反复吹打几次进行裂解，10000转/分钟离心，取裂解液上清，用以下的两对引物进行巢式PCR反应，扩增胚胎中IGF2基因内含子3部分区域。巢式PCR引物1(扩增长度818bp)：IGF2-F：ACGAAAGGAGACGCTTGACCIGF2-R：CTGGAAGTTAGTGCCCGAAA巢式PCR引物2(扩增长度485bp)：IGF2-MSD-F：GAAAACGAAAGGAGACGCTTGACCIGF2-MSD-R：CACGCTTCTCCTGCCACTGAGAG将巢式PCR第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，对于未发生IGF2基因内含子3中ZBED6结合位点删除的胚胎，扩增片段长度为485bp；对于发生IGF2基因内含子3中ZBED6结合位点删除的胚胎，扩增片段长度约为225bp。统计sgRNA在Cas9蛋白介导下对IGF2基因内含子3中的ZBED6结合位点编辑效率，其为发生删除的胚胎/全部注射用胚胎的比例。结果sgRNA在Cas9蛋白介导下对IGF2基因内含子3中ZBED6结合位点发生删除的胚胎个数为6个，编辑效率为18.75％。实施例2、成套sgRNA的制备也可以按照下述方法制备成套sgRNA：根据sgRNA打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送可信赖的商业引物合成公司进行合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下：(1)IGF2-sgL：IGF2-sgL-up：CACCACTGGTTTCGCCCTCCTCCGIGF2-sgL-dn：AAACCGGAGGAGGGCGAAACCAGT(2)IGF2-sgR：IGF2-sgR-up：CACCAGCAGCGCCCCGACGCGCCCIGF2-sgR-dn：AAACGGGCGCGTCGGGGCGCTGCT将以上两对OligoDNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段IGF2-sgL以及IGF2-sgR。将上述带有粘性末端的双链DNA片段IGF2-sgL和IGF2-sgR分别连入用限制性内切酶BbsI酶切回收后的pX330(addgene,Plasimd42330，该载体含有Cas9蛋白编码基因，可表达Cas9蛋白)载体中，得到pX330-IGF2-sgL载体与pX330-IGF2-sgR载体。经过测序，pX330-IGF2-sgL载体为将序列1所示sgRNA-L的编码基因的插入pX330载体的BbsI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-L-1；pX330-IGF2-sgR载体为将序列2所示sgRNA-R的编码基因插入pX330载体的BbsI酶切位点间得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-R-2。将pX330-IGF2-sgL载体和pX330-IGF2-sgR载体共同转入猪胎儿成纤维细胞，得到表达sgRNA和Cas9核酸酶的转基因细胞。