耐高温SOD蛋白及其克隆和纯化方法与流程

本发明涉及基因工程制药领域，尤其是涉及一种耐高温SOD蛋白及其克隆和纯化方法。

背景技术：

超氧化物歧化酶SOD，是英文Superoxide Dismutase的缩写，是体内对抗自由基的第一道防线。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。SOD在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的SOD随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的SOD随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。

SOD的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的SOD资源有：动物血液（牛、猪等），菌类发酵（酵母菌、大肠杆菌等），高等植物（藻类、刺梨等）等。动物提取SOD 的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。

相对于植物来源的SOD，微生物来源的SOD具有比活力高，含量高的优点，微生物的生长也远远快于植物，此外，各种微生物技术属国家重点支持行业，目前也发展迅速，这些因素都对微生物来源的SOD实现产业化具有重大的推动作用。例如，专利号为2011100503115报道了一种用大肠杆菌生产重组人源SOD的方法，但是这个专利集中在重组大肠杆菌的构建，并未公开SOD纯化方法，而从细胞内获取SOD时更是采用超声法，不适合大规模工业化生产。目前，可以通过在重组蛋白上加上标签，例如His标签或GST标签，在微生物发酵、细胞裂解后，通过亲和层析得到较高纯度的蛋白。然而，这种带标签的蛋白存在纯化成本高、纯化结束后标签的切除等后续工艺，使得纯化过程变得昂贵，工艺也变得复杂。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单、可实现工业化大生产的SOD耐高温具体的构建及纯化方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白，该蛋白的cDNA含有600个核苷酸碱基，所述耐高温SOD蛋白的cDNA具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列，氨基酸具体基因序列见序列表中的SEQ ID NO.1。

本发明还提供一对用于扩增从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的编码cDNA的引物，其中：

FW为：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位点；

Rev为：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位点。

本发明还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的克隆方法，包括以下步骤：

（1）对从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的编码cDNA进行大肠杆菌密码子优化编辑进行基因合成Fe-SOD全基因序列，具体基因序列见序列表中的SEQ ID NO.1。

（2）以合成的Fe-SOD全基因序列为模板，使用以下引物进行PCR扩增30个循环反应，得到预期基因片段，其中PCR所用的两种引物为：

FW：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位点；

Rev：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位点。PCR程序如下：第一阶段：95℃ 2min；第二阶段：95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 20s。第二阶段循环30次，最后一个循环的最后一步保持72℃ 5min。

（3）将所述预期基因片段连接到载体上，然后将所述载体转化到重组用大肠杆菌中，并涂布于含有100ug/mL Amp的LB固体培养基平板上，在37℃条件下培养16h～18h进行克隆，挑去单克隆菌落进行鉴定，鉴定为阳性的所述重组用大肠杆菌再经DNA测序验证基因序列正确，得到重组Fe-SOD的质粒。

（4）将所述重组Fe-SOD质粒转化到培育用大肠杆菌中，从而完成菌体的构建。

基于上述，所述重组用大肠杆菌为DH5a菌株、JM109菌株或Top10菌株。

基于上述，所述培育用大肠杆菌为BL21菌株或Rosetta（DE3）Plys菌株。

本发明还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白纯化方法，包括以下步骤：

菌体培育：将转化有重组Fe-SOD质粒的培育用大肠杆菌置于含有100 mmoL/L的 Amp核苷酸的LB液体培养基中，37℃培养12h～16小时后，将培养物按照1：（100～200）的比例接种到500mL 含有100ug/mL Amp新鲜TB培养基中，37℃培养4h至OD600达到0.8～1时，向其中加入IPTG终浓度至0.2 mmoL/L，在20℃下诱导12h～16h，从而完成菌体的培育。

菌体收集匀化：离心并收集所述培育菌体，然后将其重新悬浮于由20 mmoL/L的Tris、100 mmoL /L的 NaCL溶液、1 mmoL/L的EDTA、0.5 mmoL/L的PMSF组成的培育缓冲液中进行匀化处理。

粗酶提取液制备：向所述培育缓冲液加入T4溶菌酶进行孕育20 min～40 min，然后向其中加入Tween20至最终浓度为0.5%并在40℃～60℃温度下进行水浴处理15 min～25 min，经离心过滤处理所得上清液即为粗酶提取液。

层析纯化：对所述上清液依次进行过滤、层析柱层析纯化处理，然后对层析后的所述层析柱依次进行冲洗、洗杂和洗脱处理，得到富含Fe-SOD的洗脱液。

基于上述，所述层析柱为金属层析柱、阳离子层析柱或阴离子层析柱。

基于上述，所述层析纯化的步骤还包括：首先对层析后的所述层析柱依次采用质量百分数为0.1%的Triton X-114与10 mmoL/L咪唑混合组成的冲洗液冲洗、采用20 mmoL/L咪唑洗杂和采用300 mmoL/L的咪唑洗脱处理；然后收集富含Fe-SOD的洗脱液并进行超滤、浓缩处理，从而得到高纯度的富含Fe-SOD的洗脱液。

基于上述，所述层析纯化的步骤还包括：按照质量比为1：（1～3）向所述高纯度的富含Fe-SOD的洗脱液中加入含糖物质进行冻干，并进行无菌冷冻、干燥从而制得Fe-SOD冻干粉。

基于上述，所述含糖物质为蔗糖或甘露糖。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明所提供的耐热型SOD蛋白，其来源于蓝藻其属于Fe-SOD蛋白，具有分子量小，分子量仅有25kD、热稳定性能好，70℃仍能保持较高的酶活，更有利于蛋白质的应用。本发明所提供的SOD耐高温纯化方法，根据该耐热SOD蛋白的良好热稳定性，采用加热-离心-层析柱纯化的纯化方法，纯化后蛋白纯度可达到95%以上，酶活性可达到2500 u/mg～3000 u/mg，且在制备粗酶液的过程中，通过溶菌酶的添加及加热处理，同时达到细胞裂解和去除大部分宿主菌中非目的蛋白，达到初步纯化效果，该纯化步骤方法简单，可应用于大规模生产，节约成本。

附图说明

图1、本发明提供的耐高温SOD蛋白的cDNA的PCR扩增结果电泳鉴定图。其中，图中编号说明：泳道1为带His标签的SOD粗酶提取液，检出大小为22kD的条带；泳道2为经层析柱层析后的粗酶提取液；泳道3～9为梯度洗脱液；泳道M为蛋白质marker。

图2、本发明提供的耐高温SOD的蛋白经不同温度和时间处理后的SDS-PAGE电泳鉴定图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白，该蛋白的编码cDNA为SEQ ID NO.1，含有600个核苷酸碱基，所述编码cDNA具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列，具体基因序列见序列表中的SEQ ID NO.1。

其中，用于扩增从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的编码cDNA的一对引物包括：

FW为：5’-GGGTTTCATATGATGGCGTTTGTGCAGGAAC-3’，含NdeI酶切位点；

Rev为：5’-CCCAAGCTTCGCCGCTGCTAAGTTTTTC-3’，含HindIII酶切位点。

本实施例还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的克隆方法，包括以下步骤：

（1）在无菌条件下，将蓝藻藻种2mL接种到1000mL的蓝藻培养基中，于25℃、2000XL光照强度每天光照10小时并每天摇瓶一次，培养20天后取下层培养物，采用SDS-CATB法抽取蓝藻基因组。

（2）对耐热型SOD蛋白进行大肠杆菌密码子优化编辑进行基因合成Fe-SOD全基因序列，其中优化后的Fe-SOD全基因序列见序列表中的SEQ ID NO.1。

（3）以合成的Fe-SOD全基因序列为模板，采用上述引物进行PCR扩增30个循环反应，得到预期基因片段。其中PCR程序如下：第一阶段：95℃ 2min；第二阶段：95℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 20s。第二阶段循环30次，最后一个循环的最后一步保持72℃ 5min。

（4）将所述预期基因片段连接到载体上，然后转化到大肠杆菌DH5a中，并涂布于含有100 ug/mL Amp的LB固体培养基平板上37℃培养16h进行克隆，挑去单克隆菌落进行鉴定，鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确，制得含有重组Fe-SOD的质粒，然后将含有重组Fe-SOD的质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3中，完成菌体的构建。

本实施例还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

菌体培育：将转化有重组Fe-SOD质粒的大肠杆菌BL21-DE3接种到含有100 ug/mL Amp核苷酸的LB液体培养基中培养12h，然后按照1：100的比例将培养所得物接种到含有500mL的100 ug/mL Amp核苷酸的TB培养基中培养3h，至所述标记后的Fe-SOD单克隆菌体的OD600达到0.8，然后向所述TB培养基中加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）终浓度至0.2 mmoL/L进行诱导12h，得到培育菌体。

菌体收集匀化：离心收集所述培育菌体，将其重新悬浮于培育缓冲液中并加入T4溶菌酶进行孕育30 min，然后向其中加入Tween20，在50℃温度下对其进行水浴处理20 min，经离心过滤处理所得上清液即为粗酶提取液。其中，所述培育缓冲液由20 mmoL/L的Tris（三羟甲基氨基甲烷）、100 mmoL/L的 NaCL溶液、1 mmoL/L的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.5 mmoL/L的PMSF（苯甲基磺酰氟）组合。

粗酶提取液制备：首先采用含有10 mmol /L咪唑的所述粗酶提取液平衡Ni层析柱；然后将所述粗酶提取液通过0.45um的滤膜进行超滤过滤，过滤后的上清穿过平衡后的Ni层析柱，对层析后的所述Ni层析柱依次采用冲洗复合缓冲液冲洗、20 mmoL/L咪唑洗杂和300 mmoL/L的咪唑洗脱处理，得到Fe-SOD的洗脱液；其中，所述冲洗缓冲液有质量百分数为0.1%的Triton X-114（聚氧乙烯单叔辛基苯基醚）与10 mmoL/L咪唑混合而成。

层析纯化：将所述富含Fe-SOD洗脱液经过截留量为10kD的超滤膜系统浓缩处理，然后将浓缩后的Fe-SOD蛋白加入到10倍体积的无菌去离子水再次进行浓缩，反复加水浓缩3次，浓缩至Fe-SOD浓度为20mg/mL得到高纯度的富含SOD的洗脱液。

实施例2

本实施例提供的一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白，该蛋白的编码cDNA序列同实施例1中的基因序列。

本实施例还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的克隆方法，具体步骤同实施例1中的菌体构建步骤。

本实施例提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的纯化方法，具体步骤与实施例1中的步骤大致相同，不同之处在于：

所述菌体培育步骤包括：采用1L的含有浓度为100 ug/mL Amp的LB液体培养基中，37℃诱导所述含有重组Fe-SOD的质粒的大肠杆菌Rosetta（DE3）Plys菌株16h，然后按照1：200的比例将培养所得物接种到含有浓度为100 ug/mL Amp核苷酸的TB培养基中培养3h，至所述标记后的Fe-SOD单克隆菌体的OD600达到1.0，然后向所述TB培养基中加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）终浓度至0.2 mmoL/L进行诱导12h，得到培育菌体。

所述菌体收集匀化步骤包括：离心收集所述培育菌体，将其重新悬浮于培育缓冲液中并加入T4溶菌酶进行孕育30 min，然后向其中加入Tween20至最终浓度0.5%，在45℃温度下对其进行水浴处理20min，经离心过滤处理所得上清液即为粗酶提取液。其中，所述培育缓冲液由20mmoL/L的Tris（三羟甲基氨基甲烷）、100mmoL /L的 NaCL溶液、1mmoL /L的EDTA（乙二胺四乙酸）、0.5mmoL /L的PMSF（苯甲基磺酰氟）组合。

所述层析纯化步骤还包括：按照质量比为1：1的比例向所述高纯度的富含Fe-SOD的洗脱液溶解混匀后，过滤除菌，无菌分装后冷冻干燥，即得到淡黄色或白色Fe-SOD冻干粉。

实施例3

本实施例提供的一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的编码cDNA序列同实施例1中的基因序列。

本实施例还提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的克隆方法，具体步骤同实施例1中的菌体构建步骤。

本实施例提供一种从蓝藻获取的耐高温SOD蛋白的纯化方法，具体步骤与实施例1中的步骤大致相同，不同之处在于：

所述菌体收集匀化步骤包括：将发酵罐中发酵得到的培育菌体发酵液用管式离心机离心，并收集所述培育菌体，离心收集菌体，并将其重悬于20 mmol /L Tris，100 mmol /L NaCL，1mL EDTA，0.5mmol /L pMSF缓冲液中，加入终浓度0.2 mg/mL的 T4 溶菌酶，在4℃下温育30 min后，再向其中加入Tween 20至终浓度0.5%，混匀后，置于60℃水浴15min，加热期间搅拌数次。将加热后的蛋白溶液在4℃下以10000 rpm离心30min，取上清即为粗酶提取液。所述粗酶提取液可将蛋白纯度提高到60%以上。

所述层析纯化步骤包括：首先采用含有10 mmol /L咪唑的所述粗酶提取液平衡Ni层析柱；然后将所述粗酶提取液通过0.45um的滤膜进行超滤过滤，过滤后的上清穿过平衡后的所述Ni层析柱；对层析后的所述Ni层析柱依次采用冲洗复合缓冲液冲洗10倍柱体积、20 mmoL/L咪唑冲洗5倍柱体积进行洗杂和采用300 mmoL/L的咪唑洗脱处理，重复上述步骤3～5次，得到纯度为95%的Fe-SOD的洗脱液；其中，所述冲洗缓冲液有质量百分数为0.1%的Triton X-114（聚氧乙烯单叔辛基苯基醚）与10 mmoL/L咪唑混合而成。

性能测试

Fe-SOD活性测试

用GB/T5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法中的羟胺法对实施例1～3所得到的Fe-SOD酶进行活性测试，结果表明：经过此方法提取的Fe-SOD酶活可到达2500 u/mg～3000 u/mg。

Fe-SOD热稳定及电泳测试

同时，对实施例1～3所得到的Fe-SOD蛋白进行酶热稳定测试，所述Fe-SOD热稳定测试的步骤包括：首先将0.4L Fe-SOD菌体发酵液超声波破碎，离心取破碎上清液，分别在70℃和90℃下处理15 min、30 min和60 min，将热处理后Fe-SOD发酵液上清液10uL并加水稀释到10mL；然后取50uL稀释后的上清液，分别在常温、50℃、70℃、90℃处理不同时间后，采用南京建成总SOD活性测定试剂盒（羟胺法）进行测定Fe-SOD残留活性及采用10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行电泳测试。其中，Fe-SOD活性的定义为：各处理活性为该处理OD550值减去CK的OD550值,CK为加水活性体系对照；Fe-SOD的相对活性定义为：以Fe-SOD破碎上清的活性（ODsod-ODck）为100%。

电泳结果如图1和图2所示，结果显示，所构建的SOD耐高温菌体能检出大小为22kD的条带产物，可以据此判断出所得产物即为SOD耐高温菌体；同时可以看出：实施例1～3所得到的Fe-SOD酶在低于30℃条件下，可长期稳定保存且保存2个月内酶活性变化不大；在50℃保温60min后，酶活性保持90%以上；在70℃保温15min后，酶活性大于95.5%；在70℃保温30min后酶活性大于89.5%；在70℃保温1小时后酶活性仍大于76.3%；在90℃处理15min后，酶活性仍大于34.6%。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。