分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子标记及其应用。具体地，本发明涉及水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记，用于检测该分子标记的引物对和试剂盒，前述分子标记、引物对、试剂盒在水稻育种中的用途，检测水稻直链淀粉含量性状的方法以及水稻辅助育种方法。
背景技术：
：水稻(Oryzasativa)是我国最重要的粮食作物之一，水稻生产水平的提高一直是关系我国农业发展和民生安定的重大问题。随着经济高速发展，人们生活水平不断提高，我国水稻生产必须在兼顾产量的同时进一步培育口味、外形更为优质的新品种。传统育种技术在水稻遗传改良方面取得了显著成就，但其选择效率较低、周期长等因素，已不能满足当前水稻生产对优良品种的需求。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现，为水稻的遗传研究及育种开辟了新的思路和手段。开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择育种研究，将对提高我国水稻育种水平起到促进作用。在我国，稻米品质的指标体系主要包括碾磨品质、外观品质、蒸煮品质和营养品质。在众多品质研究中，水稻糯性是很重要的一个方面，是稻米品质遗传研究最早和最集中的形状，同时也使影响稻米蒸煮品质的重要因素。如美国，日本，澳大利亚等国家对糯性的研究作了大量的工作。糯性影响着水稻的品质和口感，水稻直链淀粉含量是影响稻米糯性最主要的因素，除糯米的直链淀粉小于2％外，一般稻米的直链淀粉含量变异于6％-34％之间。一般认为水稻直链淀粉是影响米饭质地的最重要的因素。直链淀粉越高，米饭硬，粘性小，饭粒干燥蓬松，色泽较暗；相反，米饭软，粘性大，饭粒光泽好。已有研究表明，水稻糯性基因位于第6号染色体上，且水稻糯性wx基因相对于非糯性Wx基因为隐性，在育种过程中当两者处于杂合状态时从外观上无法区别，因而，如果有与水稻糯性性状密切相关的分子标记，将能够快速识别糯性基因是否存在，从而可以加快水稻糯性育种进程，为糯性改良提供准确依据。然而，现阶段与水稻糯性基因紧密连锁的分子标记，仍有待挖掘。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种与水稻直链淀粉含量性状相关，能够有效用于水稻选育的分子标记。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记。根据本发明的实施例，所述分子标记表现为SEQIDNO：1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。根据本发明的实施例，SEQIDNO：1所示核苷酸序列如下(254bp)：ATCCACAGTAACATGGCTTCTACGTGGCGAGTATAGCCGCTAACTAAGTAGAAGAATTGTTCGTGACCTAACTGAACCGCTCGGTAACAGTCTAACAGAATTACTTCATTGTCCCCCCTAAAAGAAAACCTAAGGCCTTGTTTAGATCCCAAAAAATTTTGGTCAAAAACATTACATCAAATGTTTGGACACATATATGGGACATTAAATGTGGAAAAAAAAACAATTGCACAGTTTACATGTAGATTACAAGA(SEQIDNO：1)。根据本发明的实施例，具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为直链淀粉含量低于14％；缺失SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为直链淀粉含量高于22％；具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点杂合的个体，表现为直链淀粉含量在14％-22％之间。发明人发现，通过检测水稻基因组DNA是否具有上述分子标记，能够有效地确定其直链淀粉含量。具体地，如前所述，不具有所述分子标记且在所述分子标记位点纯合的水稻种子直链淀粉含量高于22％，具有该分子标记且在所述分子标记位点纯合的水稻种子直链淀粉含量低于14％，具有该分子标记且在所述分子标记位点杂合的水稻种子直链淀粉含量在14％-22％之间，从而，检测到待测水稻不具有该分子标记时，则能够确定其种子直链淀粉含量高于22％，而当检测到待测水稻具有该分子标记时，则能够确定其种子直链淀粉含量低于14％(在该分子标记位点纯合)或直链淀粉含量在14％-22％之间(在该分子标记位点杂合)。进一步，当采用针对该分子标记的特异性引物对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，通过目的条带的条数和长度，能够有效地确定待测水稻的直链淀粉含量，具体地，当目的条带为一条，且所述目的条带长约850bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量低于14％；当目的条带为一条，且所述目的条带长约600bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量高于22％；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为约600bp和850bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量在14％-22％之间。由此，发明人确定，本发明的分子标记与水稻的直链淀粉含量紧密相关，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种中对直链淀粉含量的需求，对水稻育种材料进行早期选择，进一步有效提高育种的效率和准确性，提高水稻繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出水稻优 良品种。例如，利用该分子标记的特异性引物对待测水稻植株进行扩增、凝胶电泳，选择扩增产物目的条带为一条且长约850bp的水稻，即可容易地筛选获得直链淀粉含量低于14％的水稻植株，从而可以直接应用于分子育种实践。此外，根据本发明的一些实施例，利用本发明的分子标记进行水稻分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的本发明的分子标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物对具有SEQIDNO：2-3所示的核苷酸序列。具体地，本发明的引物对的序列如下所示：5’-CCAAGGCTACAGTGCCTTCT-3’(SEQIDNO：2)；5’-CTGTAAACTGCGAGACGAAT-3’(SEQIDNO：3)。根据本发明的实施例，利用所述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增片段的长度，当所述扩增片段长850bp时，所述待测水稻具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列的插入，表现为直链淀粉含量低于14％；当所述扩增片段长600bp时，所述待测水稻缺失SEQIDNO：1所示核苷酸序列，表现为直链淀粉含量高于22％；当所述扩增片段为600bp和850bp两种时，所述待测水稻的所述分子标记位点杂合，表现为直链淀粉含量在14％-22％之间。根据本发明的实施例，利用凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳，检测所述扩增片段的长度。发明人惊奇地发现，利用本发明的引物对能够有效地对待测水稻的上述与直链淀粉含量性状相关的分子标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序或电泳能够有效实现对该分子标记的检测，确定待测水稻是否具有该分子标记。例如，通过电泳检测时，根据扩增产物目的条带的数量和长度，即能够有效确定待测水稻的直链淀粉含量。具体地，利用上述引物对，对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约600bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量高于22％；当目的条带为一条，且所述目的条带长约850bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量低于14％；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为约600bp和850bp时，可以确定所述待测水稻直链淀粉含量在14％-22％之间。而600bp的扩增产物与850bp的扩增产物相比缺失的序列即为本发明的分子标记，因而本发明的分子标记序列位于850bp的扩增产物中。由此，用于检测前面所述的本发明的分子标记的引物对，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。需要说明的是，本领域技术人员熟知，在上述SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据水稻基因组DNA 上与SEQIDNO：2和SEQIDNO：3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，在SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于检测前面所述的分子标记的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含：前面所述的用于检测本发明的分子标记的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQIDNO：2-3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明的实施例，利用本发明的试剂盒中所包含的引物对，能够有效实现对待测水稻的上述与直链淀粉含量性状相关的分子标记的检测，确定待测水稻是否具有该分子标记，进而能够有效确定待测水稻的直链淀粉含量。具体地，例如利用上述引物对对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约600bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量高于22％；当目的条带为一条，且所述目的条带长约850bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量低于14％；当目的条带为两条，且所述目的条带的长度分别为约600bp和850bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量在14％-22％之间。由此，本发明的用于检测前面所述的本发明的分子标记的试剂盒，能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的本发明的分子标记、引物对或试剂盒，在水稻选育中的用途。如前所述，通过能够用于检测本发明的与水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记的试剂，例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地确定待测水稻是否具有上述分子标记。例如当采用针对该分子标记的特异性引物对待测水稻基因组DNA进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，根据扩增产物目的条带的数量和长度，能够有效确定待测水稻的直链淀粉含量，从而能够有效辅助水稻选育。进而，根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种检测水稻直链淀粉含量的方法。根据本发明的实施例，该方法对待测水稻进行前面所述的分子标记的检测，以便确定待测水稻的直链淀粉含量。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记的试剂，例如前述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测水稻的基因组DNA进行PCR扩增、凝胶电泳，从而根据扩增产物目的条带的数量和长度，能够有效确定待测水稻的直链淀粉含量。其中，如前所述，利用上述引物对或试剂盒，对待测水稻植株进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，当目的条带为一条，且所述目的条带长约600bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量高于22％；当目的条带为一条，且所述目的条带长约850bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量低于14％；当目的条带为两条，且所述目的条带 的长度分别为约600bp和850bp时，可以确定所述待测水稻的直链淀粉含量在14％-22％之间。由此，本发明的检测水稻直链淀粉含量的方法，能够快速、高效、准确地检测水稻直链淀粉含量，进而能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。另外，根据本发明上述实施例的检测水稻直链淀粉含量的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，本发明的检测水稻直链淀粉含量性状的方法进一步包括：利用前面所述的引物对，或者试剂盒，对所述待测水稻基因组DNA进行PCR扩增；检测扩增片段的长度；以及基于所述扩增片段的长度，确定所述待测水稻的直链淀粉含量，其中，当所述扩增片段长850bp时，所述待测水稻为直链淀粉含量低于14％；当所述扩增片段长600bp时，所述待测水稻为直链淀粉含量高于22％；当所述扩增片段为600bp和850bp两种时，所述待测水稻的所述分子标记位点杂合，直链淀粉含量在14％-22％之间。由此，能够高效准确的检测待测水稻是否具有本发明的分子标记，进而能够有效地基于检测结果确定待测水稻的直链淀粉含量。根据本发明的实施例，提取获得待测水稻的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)抽提待测水稻的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。根据本发明的实施例，利用凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳，检测所述扩增片段的长度。由此，方便快捷。发明人发现，本发明的检测水稻直链淀粉含量性状的方法能够有效用于水稻的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种水稻辅助育种方法。根据本发明的实施例，该方法包括通过前面所述的检测水稻直链淀粉含量性状的方法，检测所述分子标记，以便确定所述待测水稻的粒型。由此，利用本发明的水稻辅助育种方法，能够有效确定水稻的直链淀粉含量，进而能够实现短时间、低成本、高准确性地选育水稻优良品种。需要说明的是，本发明的与水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记及其应用具有如下优点：(1)本发明提供的水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记不受水稻的生长阶段的限制，可用于水稻的早期选育，可显著促进水稻的育种进程；(2)检测水稻如SEQIDNO：1所示的水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记的方法， 准确可靠，操作方便；(3)水稻如SEQIDNO：1所示的水稻直链淀粉含量性状相关的分子标记的检出，为水稻生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例，利用具有SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的引物对亲本和杂交F1代的DNA进行PCR扩增的扩增产物的电泳检测结果图；图2显示了根据本发明一个实施例，利用具有SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的引物对F2代水稻植株的DNA进行PCR扩增的部分扩增产物的电泳检测结果。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。实施例1：水稻F2代分离群体的构建父本为香味籼稻R15，为新育成品种，未经品种审定，暂无详细信息。种子粒型长宽比大于4，直链淀粉含量22-23％。母本为籼稻温敏不育系Y58S，该品种属籼型两用核不育系。株高65-85厘米，分蘖力较强。单株有效穗9-12穗，千粒重25克左右。不育株率100％，不育度100％。米质检测：糙米率79.3％，精米率70.9％，整精米率66.8％，粒长6.2毫米，长宽比2.9，垩白粒率5％，垩白度0.8％，透明度2级，碱消值7.0，胶稠度66毫米，直链淀粉含量13.7％，蛋白质含量11.0％。一般每亩繁殖产量300公斤。父本(P1)：种子粒型长宽比大于4，直链淀粉含量高。母本(P2)：种子粒型长宽比小于4，直链淀粉含量低。父本和母本杂交得到F1，F1代自交产生F2代群体，共158个单株。在种子成熟期，对P1、P2及F2群体各单株的水稻种子的直链淀粉含量分别进行检测， 以便确定各个体的直链淀粉含量，根据表型鉴定结果，计算分离比，使用MicrosoftExcel2003软件进行数据统计分析，使用SPSS17.0对结果进行卡方检测。性状调查结果(见表1)：F2群体中有38株直链淀粉含量高于22％，胚乳非糯性，39株直链淀粉含量低于14％，81株直链淀粉含量在14％-22％之间，卡方检测表明，直链淀粉含量的分离比约为1:2:1，符合孟德尔的一对基因的分离规律。因此，直链淀粉含量为隐性单基因控制的质量性状。表1水稻F2群体直链淀粉含量性状分离比例χ20.05＝0.1026实施例2：基因组DNA的提取用CTAB法分别提取针对实施例1中的父母本、F1代、以及F2代个体的基因组DNA，具体方法如下：(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB15g1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)75mL0.5mol/L的EDTA30mLNaCl61.4g加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿 色。(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μLTE溶解DNA。(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。(6)将得到的父母本以及F1代、F2代个体的基因组DNA存于-20℃备用。实施例3：基因定位和分子标记开发(1)遗传图谱构建针对实施例2中获得的F2代个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术对F2群体的个体进行基因分型，获得F2群体的基因型数据。用MapMaker3.0软件(ConstructinggeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0，SLincoln,MDaly,ELander-Cambridge,MA:WhiteheadInstitute,1992，通过参照将其全文并入本文)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。(2)基因定位由于父母本在直链淀粉含量上有明显的差异(父本直链淀粉含量高，母本直链淀粉含量低)，对F2个体进行性状分析，并根据性状和marker之间的连锁关系将直链淀粉含量基因定位在遗传图谱上。具体地，针对实施例1中获得的F2群体，将F2群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，从而将水稻糯性基因定位在遗传连锁图谱上。结果显示，水稻糯性基因定位在6号染色体1766194至1770656bp区间内，长度约为4460bp。(3)分子标记开发将母本Y58S进行全基因组重测序(10X)，然后根据RAD-seq的测序结果，利用SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找与日本晴参考基因组片段差异较大的分子标记(与日本晴参考基因组相比，是因为父本没有做过重测序)便于用凝胶电泳区分鉴别。结果，选择靠近直链淀粉含量基因所在区段的标记R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)作为候选。R060174的核苷酸序列如下(254bp)：ATCCACAGTAACATGGCTTCTACGTGGCGAGTATAGCCGCTAACTAAGTAGAAGAATTGTTCGTGACCTAACTGAACCGCTCGGTAACAGTCTAACAGAATTACTTCATTGTCCCCCCTAAAAGAAAACCTAAGGCCTTGTTTAGATCCCAAAAAATTTTGGTCAAAAACATTACATCAAATGTTTGGACACATATATGGGACATTAAATGTGGAAAAAAAAACAATTGCACAGTTTACATGTAGATTACAAGA(SEQIDNO：1)。实施例4：分子标记的粒型相关性验证对实施例3中确定的水稻粒型相关分子标记R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)进行验证，具体如下：针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：正向引物：5’-CCAAGGCTACAGTGCCTTCT-3’(SEQIDNO：2)；反向引物：5’-CTGTAAACTGCGAGACGAAT-3’(SEQIDNO：3)。利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。具体地，以实施例2中提取的父本、母本、F1代、或F2代的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中，PCR反应体系如下：无菌水20.2μl10*Buffer(含Mg2+)2.5μldNTPs(25mM)0.15μlTaq酶(5U/μl)0.15μl正向引物0.5μl反向引物0.5μl模板1.0μl总体积25μlPCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物经纯化后于4℃下保存。接着，将各PCR扩增产物取部分进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2。如图1所示，父本扩增产物约为600bp大小的扩增片段，母本扩增产物约为850bp大小的扩增片段， 杂交F1代则同时含有这两个扩增片段。图2中显示了部分F2代个体的扩增产物的电泳检测结果，直链淀粉含量高于22％的单株均扩增出600bp的条带，直链淀粉含量低于14％的单株均扩增出850bp的条带，直链淀粉含量在14％-22％之间的单株含有两个扩增片段。由此，证明该分子标记R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)在父母本之间具有多态性，该分子标记与水稻直链淀粉含量性状紧密相关。然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果，父本及F2代中直链淀粉含量高于22％的单株扩增条带大小约为600bp，与母本及F2代中直链淀粉含量低于14％的单株扩增条带850bp相比缺失了一些序列，该序列即为分子标记R060174(SEQIDNO：1所示的核酸序列)。该分子标记的引物可以直接应用于糯稻分子育种实践，针对父本R15香稻的非糯性进行定向改良。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3