一种细胞因子突变体融合抗体的制备及其应用的制作方法

背景技术：

肿瘤细胞的发生发展离不开新生血管的营养供给，而新生血管的生长离不开各种细胞因子及其受体的相互作用。现有研究表明，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体(VEGF/VEGFR)信号通路对于新生血管的生成具有关键性的调节作用。VEGFR2作为VEGF的主要受体，调节血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和通透性的改变。

人血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2，也称为VEGFR2或KDR、Flk-1，本文称作“VEGFR2”)是230kDa的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶超家族，是血管生长因子(VEGF)的主要功能受体，主要分布在血管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，VEGF刺激内皮细胞增殖、增加血管通透性和新血管生成的作用主要通过结合和激活VEGFR2来实现，同时VEGFR2在一些肿瘤细胞表面也有表达。靶向VEGFR2药物主要有两类：一类是直接作用于受体细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要包括Sunitinib、Ceritinib等；另一类是阻断配体结合到受体胞外功能域的单克隆抗体(mAb)，包括雷莫卢单抗(Ramucirumab)等。

干扰素(interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，它具有广谱的抗病毒、抗肿瘤活性，同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，是目前主要的抗肿瘤生物制品之一。但是干扰素因半衰期短、系统性毒副作用强等缺点限制了其在临床上的应用。借助基因重组技术将干扰素与靶向VEGFR2的全长抗体偶联，既可以延长干扰素体内半衰期，同时可以借助抗体的靶向作用将干扰素富集于肿瘤及肿瘤新生血管部位，降低其系统毒副作用，令其更有效地发挥抗肿瘤及免疫调节作用。本课题组已经基于该原理表达出这种具有抗血管生成活性和抗肿瘤活性的融合抗体anti-VEGFR2-，即JZA01。

虽然野生型干扰素有很强的生物学功能，但由于其与受体亲和力低，它发挥作用受到一定限制。干扰素α的受体有IFNAR1和IFNAR2，它们位于干扰素分子对立的两侧，几乎不相互影响。与IFNAR1的亲和力主要决定抗增殖能力；与IFNAR2的亲和力主要决定抗病毒能力。干扰素与两个受体的联合亲和力，是与IFNAR1和IFNAR2的单独亲和力的乘积；且干扰素与两个受体形成的三聚体复合物的稳定性与介导的抗增殖能力成正比。干扰素与IFNAR1是低亲和力的，提高该亲和力可以明显增强干扰素的抗增殖能力。通过对野生型干扰素进行YNS突变(突变位点：H57Y、E58N、Q61S)，它与IFNAR1的亲和力可以提高60倍，与IFNAR2的亲和力与突变前相当；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍。

技术实现要素：

发明目的

本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的全人源抗人VEGFR2的融合抗体。本发明蛋白的特征为特异性结合人VEGFR2胞外区，偶联的IFNα突变体其抗病毒、抑增殖及免疫调节功能强于野生型IFNα，在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖及部分肿瘤细胞的增殖，且效果强于JZA01。

技术方案

一种全人源的抗VEGFR2的融合抗体，其特征在于：以抗VEGFR2的全长抗体JZB00和IFNα突变体蛋白为基础，通过基因重组技术以柔性肽将两者连接。

其中一条链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNα突变体蛋白以柔性肽连接组成，其氨基酸序列为SEQ NO.1；另一条为抗VEGFR2的全长抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ NO.2。

一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的融合抗体。

一种表达载体，含有上述的核酸(该遗传资源取自人，自行采集于中国药科大学1518实验室)。

一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。

上述任一项的抗体或抗体片段的应用，选择性地与VEGFR2结合或抑制VEGFR2与VEGFR2配体的结合或中和VEGFR2。

上述任一项的抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。

上述任一项的抗体或抗体片段的偶联物。

上述任一项的抗体或抗体片段的突变体。

靶向VEGFR2融合抗体在肿瘤治疗方面的应用。

发明进一步说明：

本发明中全人源抗VEGFR2融合抗体重链由抗VEGFR2的全长抗体的重链与IFNα突变体以柔性肽(GGGGS)连接，轻链为抗VEGFR2的全长抗体的轻链。IFNα经YNS突变后，与IFNAR1的亲和力可以提高60倍，与IFNAR2的亲和力与突变前相当；抗增殖能力可以提高150倍，抗病毒能力提高3.5倍，因此在抗肿瘤及抗病毒方面比IFNα更体现出优势，从而导致JZA02的抗肿瘤及抗病毒效果优于JZA01。

含有本发明血管内皮生长因子受体2融合抗体基因的表达载体和宿主细胞属于本发明的保护范围。扩增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗血管内皮生长因子受体2抗体的方法。

Western Blot鉴定分离纯化得到的JZA02；检测融合抗体加对人静脉内皮细胞HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用。

本发明得到的抗血管内皮生长因子受体2与人静脉内皮细胞HUVEC表面血管内皮生长因子受体2具有高特异性结合，体外抑制HUVEC及部分肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的融合抗体可以明显抑制HUVEC及部分肿瘤细胞的生长，且抑制效果强于JZA01。本发明为治疗和诊断以血管内皮生长因子受体2抗原的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。

附图说明

图1是JZA02结构示意图。

图2JZA02-H chain质粒大量提取的核酸凝胶电泳图。

图3显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的JZA01和JZA02分别通过ProteinA亲和层析柱进行分离纯化的结果。Lane1为JZA01，Lane2为JZA02。

图4展示利用Western Blot鉴定纯化后的JZA02。图A、图B分别为用HRP偶联的羊抗人Fc段的抗体检测，得到的JZA01、JZA02、JZA00的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。图C、图D分别为用兔抗人κ链的抗体为一抗，HRP偶联的羊抗兔二抗得到的JZA01、JZA02、JZA00的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。

图E、图F分别为用鼠抗人IFNα的抗体为一抗，HRP偶联的羊抗鼠二抗得到的JZA01、JZA02、JZA00的非还原(NR)与还原(R)电泳，其中Lane1、2、3、4分别为JZA01、JZA02、JZA02、JZA00。

图5是一曲线图，描述JZA01和JZA02对HUVEC细胞的生长抑制作用。

图6是一曲线图，描述JZA01和JZA02对HCT-116和SW620这两种肿瘤细胞在常氧条件下的生长抑制作用。

具体实施方式

实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。

实施例1全人源抗VEGFR2融合抗体基因的构建

本课题组已成功得到了抗VEGFR2融合抗体JZA01的重组质粒。JZA01为在抗体Fc段的C端通过G₄S Linker偶联了IFNα的融合抗体，在其重链表达质粒中，表达IFNα部分的两端含有酶切位点BamHI和PmeI。基于此，先通过对质粒的双酶切获得表达IFNα的序列，然后，以获得的IFNα为模板，设计突变引物，利用overlap PCR获得IFNαmut，再通过两端的酶切位点替换JZA01-H chain的野生型IFNα部分，得到了表达载体JZA02-H chain。将得到的突变体表达载体以及共有的轻链L chain大量提取，准备转染CHO细胞。

实施例2抗VEGFR2融合抗体的表达、纯化及SDS鉴定

轻重链瞬时转染CHO细胞，通过加压筛选和两次有限稀释法挑选稳定高产的单克隆细胞株。将稳定高产细胞株扩大培养，收集上清，6000rpm，4℃离心30min后用0.22μm滤膜过滤，ProteinA亲和层析柱纯化，洗脱液洗脱蛋白。纯化得到的JZA02与JZA01分别与非还原型SDS-PAGE上样缓冲液以4∶1(20μl∶5μl)的比例在Eppendorf管中混合，100℃水浴放置5min后3000rpm离心5min，蛋白样品制备好后待用。配置10％的SDS-PAGE胶，进行电泳，80mA恒流30min、120min恒流30min后停止电泳。卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2h；加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上，每20min更换一次脱色液(10ml冰乙酸；45ml乙醇；45ml蒸馏水)至完全脱净。凝胶成像仪(Tanon 1600B)拍照。

实施例3抗VEGFR2融合抗体的Western Blot鉴定

纯化得到的JZA01、JZA02、JZA00进行SDS-PAGE电泳，80V恒压30min、120V恒压30min、转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)转印结束，将膜在5％MTBS(含有5％脱脂牛奶的TBS)中室温封闭2h；用5％MTBS按1∶2000稀释一抗(A&B图为HRP偶联的羊抗人Fc段的抗体，无二抗；C&D图为兔抗人κ链的抗体；E&F图为鼠抗人IFNα的抗体)(购自abcam)，室温孵育1.5h，TBST洗涤三遍，TBS洗涤3遍，每次10min；用5％MTBS按1∶5000稀释二抗(C&D图为HRP偶联的羊抗兔的二抗；E&F图为羊抗鼠的二抗)(购自联科生物)，室温孵育1.5h，TBST洗涤三遍，TBS洗涤3遍，每次10min；用DAB显色，结果如图3所示。

实施例4抗VEGFR2融合抗体对HUVEC及部分肿瘤细胞的生长抑制作用

将细胞制备成3×10⁴cells/ml细胞悬液，接种96孔细胞培养板，100μl/孔，在37℃ 5％CO₂培养箱中培养24h。共一个对照组和两个实验组。用2％胎牛血清培养基配制药物，共有JZA01和JZA02两组，每组设置0.01nM，0.1nM，1nM，10nM，100nM，200nM共6个浓度。将培养的细胞弃去上清，按照分组加入药物，每孔100μl，每组药物每个浓度设置三个平行孔，继续培养72h，每孔加入11μl的MTT，37℃继续培养4h，小心倾去上清，每孔加入150μl DMSO，在酶标仪570nm/630nm波长处测定光吸收值(OD值)，计算药物对细胞增殖的抑制率。JZA01和JZA02的生物活性由细胞生长的抑制率评价。抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。