一种智慧基因的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种智慧基因的检测试剂盒。

背景技术：

智慧(即认知能力)，是人脑加工、储存和提取信息的能力，即人们对事物的构成、性能、与他物关系、发展动力、发展方向以及基本规律的把握能力。知觉、记忆、注意、思维和想象的能力都被认为是认知能力，它是人们成功的完成活动最重要的心理条件。人们的智慧特点对于社会经济状况都有显著的影响，增强人们的智慧也已经被发现与财富增长和预期寿命的增加有关。

近年来分子生物学技术的发展和遗传医学的研究表明，人类的智力发育和大脑各部分功能的发展与完善受遗传和环境因素的共同影响和制约，其中大约40-50％受遗传因素的影响。由于遗传因素人们无法改变，而环境因素却可以人为去创造，因此我们可以根据儿童本身的遗传因素为其量身打造外部环境(社会环境和自然环境等)，强化优势天赋，因材施教，进行个性化教育培养。

目前对智慧相关基因的检测技术主要是直接测序法，但该方法不仅费用较高而且操作繁琐、周期长。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种智慧基因的检测试剂盒，利用简单、快速、价格低廉且易于判读的检测方法，在PCR体系中即可完成两个位点不同基因型的检测，无需开管操作，减少了PCR产物污染的可能性。具体地，

一种智慧基因的检测试剂盒，试剂盒包括基因检测的PCR试剂，所述PCR试剂包括基因位点SNP检测的特异性引物和荧光探针，所述特异性引物检测的基因位点包括JMJD1C基因位点rs7923609，LRRC14基因位点rs2721173中的一种或两种，根据NCBI的Genbank数据库公开的基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)序列为模板，采用Primer 5软件设计引物和探针，引物在多态性位点的上下游进行设计，且目的片段的长度控制在100bp左右，保证探针序列包含多态性位点，具体如下：

①当检测JMJD1C基因位点rs7923609时，

正向引物：5'-CAAACAAGCATTCTCACTTC-3' SEQ ID NO.1，

反向引物：5'-CATAGTTTGCTTAGCCAGTT-3' SEQ ID NO.2，

JMJD1C荧光探针：5'-TAATGACAATATCCCGTTGC-3' SEQ ID NO.5；

②当检测LRRC14基因位点rs2721173时，

正向引物:5'-AGGTTGAAAAGACCGAGAC-3' SEQ ID NO.3，

反向引物:5'-TTTAGGCCAGTGGTAAGG-3' SEQ ID NO.4，

LRRC14荧光探针：5'-TCCGTGCTTGGTGACGCTCTG-3' SEQ ID NO.6。

本发明引物和探针也可为本发明上述核苷酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的互补序列。

进一步地，所述的JMJD1C荧光探针和LRRC14荧光探针分别为5'末端区域具有荧光基团，3'末端区域具有淬灭基团的双标记探针。

进一步地，所述的5'末端区域采用：FAM，TET，VIC，HEX，ROX，JOE，CY3或CY5其中的一种荧光基团标记；3'末端区域采用：BHQ，DABCYL或TAMRA其中的一种淬灭基团标记。

进一步地，所述的PCR试剂中各引物和探针在PCR试剂中的浓度为：JMJD1C正向引物的终浓度为0.08-0.15μM，JMJD1C反向引物的终浓度0.45-0.13μM，JMJD1C荧光探针的终浓度为0.04-0.25μM；LRRC14正向引物的终浓度为0.45-0.13μM，LRRC14反向引物的终浓度为0.08-0.15μM，LRRC14荧光探针的终浓度为0.04-0.25μM。

进一步地，试剂盒还包括PCR缓冲液、阴性对照品、阳性对照品、核酸DNA提取试剂、PCR反应所需的Taq聚合酶、dNTP中的一种或多种。

进一步地，试剂盒的检测程序为37℃5min，95℃15min；然后95℃20sec，51℃30sec，72℃30sec收集荧光，40个循环；熔解曲线分析：95℃30sec，40℃30sec，40-75℃收集荧光。

本发明具有如下优点：

1.本发明技术方案中的设计出一种新的检测人智慧基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)基因多态性的检测引物和相应的荧光探针，PCR检测特异性非常高，能够实现高度特异性扩增，采用“不对称PCR技术”进行PCR扩增，结合实时荧光PCR技术，分析熔解曲线产生的熔解峰，通过特定熔解峰的有无方便的判读不同的基因型。

2.本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，在不影响特异性的前提下，单个基因仅需单条荧光探针即可实现基因多态性的检测。

3.本发明技术方案在实验过程中只需单管就可完成不同基因型的检测，操作简单；且无需进行PCR产物的后续分析，检测成本低、周期短、效率高，同时还降低了PCR产物污染引起的假阳性风险。

附图说明

图1第1个PCR管在FAM通道出现Tm为53.9的JMJD1C-GG型熔解峰；

图2第1个PCR管在HEX通道出现Tm为52.8℃的LRRC14-AA型熔解峰；

图3第2个PCR管在FAM通道出现Tm为48.4℃的JMJD1C-AA型熔解峰；

图4第2个PCR管在HEX通道出现Tm为63.3℃的LRRC14-GG型熔解峰；

图5第3个PCR管在FAM通道出现Tm为48.8℃和55.2℃的JMJD1C-AG型熔解峰；

图6第3个PCR管在HEX通道出现Tm为53.1℃和62.9℃的LRRC14-GA型熔解峰；

图7第4个PCR管在FAM通道出现Tm为47.7℃和Tm为53.7℃的JMJD1C-AG型熔解峰；

图8第4个PCR管在HEX通道出现Tm为53.4℃和63.4℃的LRRC14-GA型熔解峰；

图9阴性对照管在FAM通道的熔解峰；

图10阴性对照管在HEX通道的熔解峰。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

智慧基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)基因多态性检测

1.DNA提取

人唾液样本采用Chelex-100法提取DNA，具体步骤如下：

A.取300μL唾液加入1.5mL离心管中，13000rpm离心3min，弃上清，向沉淀中加入500μL灭菌双蒸水，剧烈振荡后室温下静置15min，13000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；

B.沉淀中加入100μL核酸提取液，核酸提取液内含颗粒物，每次吸取前应充分摇匀，确保将颗粒一起吸出，在振荡器上反复振荡，56℃保温30min以上；

C.取出后充分振荡，100℃保温8min，取出后充分振荡，13,000rpm离心3min，上清液可直接用于PCR扩增，在4℃下可保存一周，也可存放在-20℃冰箱待用。

样本还可包括体液、组织样品或脱落细胞中的一种，例如血滤纸片、带毛囊的毛发、口腔黏膜刮片或全血样本等，血液样本于-20℃以下保存不超过一年，根据取样方式以及被测样本的不同，可对样本进行相应的预处理。

2.引物和荧光探针的设计

根据NCBI的Genbank数据库公开的基因JMJD1C(rs7923609)和LRRC14(rs2721173)序列为模板，采用Primer 5软件设计引物和探针，引物在多态性位点的上下游进行设计，且目的片段的长度控制在100bp左右，保证探针序列包含多态性位点，具体如下：

引物：JMJD1C正向引物：5'-CAAACAAGCATTCTCACTTC-3'，

JMJD1C反向引物：5'-CATAGTTTGCTTAGCCAGTT-3'，

LRRC14正向引物：5'-AGGTTGAAAAGACCGAGAC-3'，

LRRC14反向引物：5'-TTTAGGCCAGTGGTAAGG-3'，

探针：JMJD1C荧光探针：5'-TAATGACAATATCCCGTTGC-3'，

LRRC14荧光探针：5'-TCCGTGCTTGGTGACGCTCTG-3'。

所述的JMJD1C荧光探针5'末端区域采用FAM荧光基团标记，3'末端区域采用BHQ淬灭基团标记；LRRC14荧光探针5'末端区域采用HEX荧光基团标记，3'末端区域采用BHQ淬灭基团标记。

引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。探针定量后-20℃避光保存。

3.PCR扩增试验

PCR扩增所用的模板为携带JMJD1C基因的纯合突变基因型、纯合野生基因型、杂合突变基因型，及携带LRRC14基因的纯合突变基因型、纯合野生基因型、杂合突变基因型人的基因组DNA。

反应体系如下：PCR缓冲液(2x buffer)10μL，JMJD1C正向引物(10μM)0.2μl，反向引物(10μM)2μl，荧光探针(10μM)0.3μl；LRRC14正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)0.2μl，荧光探针(10μM)0.1μl，模板2μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，dNTP(10mM)0.4μL，ddH₂O 3.5μL。

反应体系包括五个PCR反应管，第一个PCR反应管中，放置有JMJD1C基因纯合突变基因型和LRRC14基因纯合突变基因型的模板(JMJD1C-GG，LRRC14-AA)，第二个PCR反应管中，放置有JMJD1C基因纯合野生基因型和LRRC14基因纯合野生基因型的模板(JMJD1C-AA，LRRC14-GG)，第三个PCR反应管中，放置有JMJD1C基因杂合突变基因型和LRRC14基因杂合突变基因型的模板(JMJD1C-AG，LRRC14-GA)，第四个PCR反应管为阳性对照，以杂合突变阳性对照品为模板，JMJD1C基因和LRRC14基因均为杂合突变基因型(JMJD1C-AG和LRRC14-GA)，第五个PCR反应管为NTC，以双蒸水为模板作为对照。其中，各个PCR反应管中模板浓度相同。

反应程序如下：

用SLAN8.0荧光定量PCR仪按如下程序进行扩增反应：

扩增反应条件：37℃5min，95℃15min；然后95℃20sec，51℃30sec，72℃30sec(收集荧光)，40个循环；

熔解曲线条件：95℃30sec，40℃30sec，40-75℃(收集荧光)。荧光通道选用FAM(465-510nm)和HEX(533-580nm)。

4.检测结果分析

本实施例五个PCR反应管的熔解曲线分别参见附图1-10，结果表明，含有模板的各反应管均出现特异性扩增，各PCR产物的Tm值之间均能够很好的进行区分。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 申请人名称 才赋基因科技（北京）有限公司

<120> 一种智慧基因的检测试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaacaagca ttctcacttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

Catagtttgc ttagccagtt 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggttgaaaa gaccgagac 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttaggccag tggtaagg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

Taatgacaat atcccgttgc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

Tccgtgcttg gtgacgctct g 21