一种含有24个氨基酸残基的多肽的纯化方法与流程

本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其是涉及一种批量化产业化纯化含有24个氨基酸残基的多肽的方法。

背景技术：

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmunodeficiency

syndrome，aids），是一种由人免疫缺陷病毒引起的，是一种全身免疫系统严重损害的传染性疾病。感染者终生携带病毒，且缺乏治愈该病的有效方法。艾滋病病毒进入人人的身体后，首先进入血液，在血液里专门攻击一种重要的血液细胞－淋巴细胞。淋巴细胞是人体的一种免疫细跑。这种细胞是人体与外来病菌作战的斗士。由于艾滋病病毒可以在淋巴细胞中生存并进行繁殖，然后又从细胞中跑出来侵犯新的细胞，所以血液是艾滋病病毒的重要藏身之地，使用被艾滋病污染了的血染也是传播艾滋病病毒的重要途径。艾滋病病毒还存在于人体的精液、阴道的分泌液中，所以性活动也是艾滋病病毒传播的重要途径之一。不过，人体的其他排泄物如汗液、唾液、尿液、泪液和粪便等都不含有或只含有极少的艾滋病病毒，因此不会造成传播。另外，艾滋病病毒还可以侵犯人的脑部和身体其他一些部位，但是由于这些部位的病毒不太容易排出体外，所以与艾滋病病毒的传播关系不大。艾滋病病毒在一些会叮咬人的昆虫（如蚊子）体内都不能生存，所以我们不必担心这些昆虫会艾滋病病毒传给我们。

自其被发现以来,已严重威胁人类的生存,对全球人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响。伴随着多年来的研究,艾滋病在治疗上取得了很大的进展,譬如高效抗逆转录病毒治疗(highlyactiveantiretroviraltherapy,haart,又称为“鸡尾酒”疗法)的应用。鸡尾酒疗法是通过多种的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病，根据此方法的基本原理，针对hiv1的膜融合抑制剂采用分子生物学手段重组和表达并设计出组合多肽即py-24和fy-24，该两条多肽针对hiv的gp41,和gp120的靶点，在前期的实验中证明了它们可对hiv1具有非常好的抑制活性。

py-24是一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽，它的分子式是c110h170n36o28，分子量：2444.81，多肽序列为h-pro-his-ser-gly-ala-his-gly-ile-pro-lys-ile-phe-gly-ala-arg-ala-gln-pro-ala-ala-ala-arg-ala-tyr-oh。

fy-24是一种含有24个氨基酸残基的线性直链肽，它的分子式是c115h176n42o29，分子量：2610.95，多肽序列为h-phe-thr-ala-his-leu-his-thr-his-his-arg-ile-gly-gly-ala-arg-ala-gln-pro-ala-ala-ala-arg-ala-tyr-oh。

直连多肽常用方法为三氟乙酸缓冲液或者磷酸盐体系，cn101981048a涉及一种通过色谱程序包括所述肽和至少一种相关杂质的组合物中纯化环肽ide简化且优化的纯化方法。其使用缓冲盐包括柠檬酸、乙酸、高氯酸，不适合工业化制备，不利于后续处理。另外，体积排阻色谱使用局限性比较大。

cn1699407a涉及一种化学合成多肽的分离纯化方法，以凝胶离子色谱完成离子交换分离，然后以低压有机填料分离，获得高纯度的多肽产品。其弊端是分离效率差，操作复杂，不利用工业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产含有24个氨基酸残基的多肽的纯化方法，主要解决现有纯化方法不适合工业化，操作复杂、后续处理困难及分离效率较差的技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种含有24个氨基酸残基的多肽的纯化方法，包括如下步骤：

1）将含有24个氨基酸残基的多肽粗品溶液用滤膜过滤后待用，所述含有24个氨基酸残基的多肽为py-24或fy-24，流动相a相为甲酸水溶液，b相为100%乙腈，以c18反相硅胶柱进行梯度洗脱收集目标峰；

2)收集合格的目标峰利用预先处理好的阴离子树脂转醋酸盐；

3）将所得溶液减压旋蒸浓缩后冷冻干燥得到粉末状成品肽。

更为优选的方案是：所述的滤膜为孔径0.45μm滤膜。

更为优选的方案是：所述梯度洗脱：流动相b色谱乙腈溶液的体积百分浓度py-24为15-55%，fy-24为10-50%，检测波长为215nm。

更为优选的方案是：所述的流动相a中甲酸的体积百分比为0.1-0.3%。

更为优选的方案是：所述的阴离子树脂为d301、d201、d351或者d370中的一种。

本发明的有益效果是：本发明提出的一条适于产业化含有24个氨基酸残基的多肽的纯化方法，使用反相高效液相色谱法纯化含有24个氨基酸残基的多肽，并用阴离子树脂转盐，工艺简单，能得到hplc纯度大于98%的精品肽且便于工业化实施，从而达到大规模工业化生产的目的。

附图说明

图1py-24高效液相色谱检测图。

图2fy-24高效液相色谱检测图。

具体实施方式

实施例1

1.准备样品

溶解py-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：10cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.1%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：180-200ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：15-55%，60-100min

进样量为12.5-15g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d301转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率19.8%。见图1。

实施例2

1.准备样品

溶解py-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：15cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.2%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：250-300ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：15-55%，60-100min

进样量为18-25g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d351转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率20.6%。见图1。

实施例3

1.准备样品

溶解py-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：20cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.3%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：800-1000ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：15-55%，60-100min

进样量为30-35g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d201转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率22.7%。见图1。

实施例4

1.准备样品

溶解fy-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：10cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.1%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：180-200ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：10-50%，60-100min

进样量为13-15g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d201转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率16.4%。见图2。

实施例5

1.准备样品

溶解fy-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：15cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.2%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：250-300ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：10-50%，60-100min

进样量为18-22g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d301转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率17.3%。见图2。

实施例6

1.准备样品

溶解py-24粗品，使用超声波助溶。完全溶解后用0.45um滤膜过滤；

2.纯化过程

纯化条件：c18反相硅胶柱

规格为：20cm×25cm

流动相：a相：体积百分比0.3%甲酸水溶液；b相：100%乙腈溶液

流速：800-1000ml/min

检测波长：215nm

梯度洗脱：b%：10-50%，60-100min

进样量为30-35g；

3．转盐

将上述目标峰溶液ph值调节为中性，利用预先处理好的阴离子树脂d351转盐，收集过柱后的溶液；

4．将收集的溶液进行减压浓缩,然后冷冻干燥得到含有24个氨基酸残基的多肽样品，收率18.1%。见图2。