基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用。

背景技术：

1968年Mebus等人发现了牛轮状病毒，而牦牛轮状病毒(Yak RV)于1986年在张敏等对牦牛的腹泻病研究中首次发现并分离得到，但是却没有进行进一步的研究(张敏，王清江，刘登薇，等.红原牦牛轮状病毒的研究[J].四川畜牧兽医,1986,3:2-4.)。1990年，李明瑞等在兰州的犊牦牛腹泻中发现牦牛轮状病毒的存在，并证明牦牛轮状病毒是引起牦牛腹泻的重要病因(李明瑞，李春玲，李浩，等.1990.牦犊牛流行性腹泻病原的调查[J].中国兽医科学(2)，12-13.)。被牦牛轮状病毒感染的犊牦牛临床症状主要是腹泻，常继发细菌感染，引起死亡，病死率高。给牦牛养殖业带来了巨大的经济损失。

引起牦牛腹泻的病原较多，包括轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、隐孢子虫以及球虫等，症状相似，较难区分，故早期的鉴别诊断尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据，是最可靠的诊断手段，PCR、荧光定量PCR是最为常用的病原学检测手段，尤其荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已经成为动物疫病诊断的主流手段。但是普通的荧光定量PCR方法由于需要大型设备、操作复杂、反应时间长等因素制约了其在现场快速检测方面的应用。

同时，由于青藏高原的特殊环境导致了牦牛轮状病毒基因发生了很大的变异，特别是常作为靶标基因的VP6基因，2016周芳等研究表明牦牛轮状病毒VP6基因的变异严重影响现有PCR方法的检出率(周芳，岳华，张斌，等.2016.牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧兽医学报，47(7)，1465-1473.)。因此针对牦牛轮状病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法迫在眉睫。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用，本发明是基于恒温隔绝式荧光PCR的一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法，可以现场对牦牛轮状病毒的检测提供科学依据，对保障牦牛养殖业健康发展具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测的引物和探针，所述引物和探针包括：牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针，其中，

所述牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。

本发明还公开了一种上述引物和探针在制备牦牛轮状病毒检测试剂盒方面的应用。

本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒，包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管；

所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物各3.5μL和牦牛轮状病毒探针0.25μL、dNTPs 4μL；

牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。

进一步地，Taq酶的终浓度为5U·μL^-1，反转录酶的终浓度为20U·μL^-1，牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μL^-1，牦牛轮状病毒探针的终浓度为10μmol·μL^-1，dNTPs的终浓度为2.5mM。

进一步地，所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到：将Taq酶、反转录酶、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量PCR反应液冻干管，所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。

进一步地，反应缓冲液由以下组分构成：500mM KCl、pH 8.3、100mM Tris-HCl、15mM MgCl₂，余量为ddH₂O，以上体积总量为3ml。

进一步地，阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将含有牦牛轮状病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成；

阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将无牦牛轮状病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成。

进一步地，该试剂盒保存于4℃下。

本发明还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)制备RNA模板：取粪便样本上清液200μL，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA，制备得到RNA模板；

2)荧光PCR反应体系的制备：荧光PCR反应体系的制备于冰上操作；取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合，制备得到阳性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阳性对照反应体系；取100μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中，制备得到阴性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阴性对照反应体系；取50μL反应缓冲液和5μL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到检测样本RNA反应体系；然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中；加样时注意避光操作；将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡；

3)扩增检测：把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内，按运行键，即开始反应；

4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明提供了一种牦牛轮状病毒的荧光PCR检测试剂盒，其优点是特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。

2)本发明能快速、准确地检测出被检样本中的牦牛轮状病毒RNA，同时也可以检出普通牛的轮状病毒RNA，用于牛轮状病毒的分子流行病学调查。

3)本发明的荧光定量PCR反应液中包括反转录酶和PCR扩增酶，使核酸的反转录和扩增在同一管中进行，简化了操作，节省了试剂同时闭管操作降低了RNA的降解和污染的可能性。

4)荧光定量PCR反应液、阳性和阴性对照品均采用冻干方式制备，降低了试剂盒的保存条件，可4℃保存一年时间，便于运输，方便储存，同时提高了试剂的稳定性。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明POCKIT Micro仪器的结构图；

图2是本发明阳性样本灵敏度检测结果，其中，1：9.66×10⁴copies/μL；2：9.66×10³copies/μL；3：9.66×10²copies/μL；4：9.66×10¹copies/μL。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒

一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒，包括以下组分：

(1)反应缓冲液：3ml，由500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂和ddH₂O(余量)组成。

(2)荧光定量PCR反应液冻干管(50管)：

荧光定量PCR反应液包括Taq酶1μL/管(5U·μL^-1)、反转录酶1.25μL/管(20U·μL^-1)、检测用上下游引物各3.5μL/管(10μmol·μL^-1)和探针0.25μL/管(10μmol·μL^-1)、dNTPs 4μL/管(2.5mM)；将以上混合物加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量PCR反应液冻干管。其中，检测牦牛轮状病毒的上下游引物和探针共3条，扩增出牦牛轮状病毒VP6基因的长度为92bp。上游引物序列:5’-GCTAACCACTTGGTATCCG-3’，SEQ ID NO:1；下游引物序列:5’-GCCATCTGAGTGATTACTCTG-3’，SEQ ID NO:2；探针序列：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1，SEQ ID NO:3。

(3)阳性对照品冻干管(1管)：将含有牦牛轮状病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成；其中，牦牛轮状病毒RNA的序列如SEQ ID NO:4所示。

(4)阴性对照品冻干管(1管)：将无牦牛轮状病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成。

本试剂盒保存于4℃，运输需加冰袋。

实施例2基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒的使用方法

该方法包括以下步骤：

1)RNA模板：取粪便样本上清液200μL，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA，制备得到RNA模板；

2)荧光PCR反应体系的制备：荧光PCR反应体系的制备于冰上操作；

取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合，制备得到阳性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阳性对照反应体系；取100μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中，制备得到阴性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阴性对照反应体系；取50μL反应缓冲液和5μL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到检测样本RNA反应体系；然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中。加样时注意避光操作。将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡。

3)扩增检测：把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内(POCKIT Micro)(如图1所示)，按运行键，即开始反应；

4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

实施例3标准品制备和灵敏度的测定

取粪便样本上清液200μL，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA，然后参照宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。

用牦牛轮状病毒的引物分别对上述制备的cDNA进行PCR扩增，以相应病原cDNA为阳性对照，无模板为阴性对照。反应体系为：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH2O 8.5μL,总体积共25μL。PCR扩增条件为:95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，30次循环，72℃10min。PCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其克隆至pMD19-T载体(宝生物工程有限公司)，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养8h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物有限公司测序。测序正确的阳性质粒作为牦牛轮状病毒阳性标准品，核酸蛋白检测仪测定其浓度，按照下述公式计算核酸浓度：阳性标准品浓度(copies/μL)＝(6.02×10²³copies/mol)×(29.75ng/μl)×10^-3/(1.85*10⁶g/mol)＝9.66×10¹⁰copies/μL。将阳性标准品10倍梯度稀释(10^-1～10^-10)，对10³、10²、10¹和10⁰四个稀释度样本进行检测，各反应管放入POCKIT Micro反应孔，按“运行键”即可，42分钟后反应结束，阳性结果为“+”，阴性结果为“-”，结果如图2所示，其中10³、10²、10¹结果为“+”10⁰结果为“-”，说明本试剂盒的最低检测限为96.6copies/μL。

实施例4特异性和稳定性检验

用本发明研制的试剂盒对22份牦牛轮状病毒阳性样本、8份阴性样本以及10种相关病原牦牛冠状病毒、牦牛病毒性腹泻病毒、牦牛星状病毒、牦牛肠炎病毒、牦牛大肠杆菌、牦牛沙门氏菌、牦牛产气荚膜杆菌、牦牛空肠弯曲杆菌、牦牛隐孢子虫、牦牛球虫进行检测，并设立牦牛轮状病毒阳性标准品作为对照，以评价试剂盒的特异性，结果显示对22份牦牛轮状病毒阳性核酸样本的检测为阳性，8份阴性样本、和10种相关病原检测结果为阴性，证明该方法特异性好。

用研制的试剂盒对牦牛轮状病毒的8个稀释度的阳性标准品分别检测3次，以评价该试剂盒的稳定性，结果显示3次检测结果一致，表明试剂盒的稳定性良好。

实施例5试剂盒的临床应用及与普通荧光定量PCR方法比较

用本发明试剂盒和Rashi等(Gautam,R.,Esona,M.D.,Mijatovicrustempasic,S.,Tam,K.I.,Gentsch,J.R.,&Bowen,M.D.(2014).Real-time rt-pcr assays to differentiate wild-type group a rotavirus strains fromandvaccine strains in stool samples.Human Vaccines&Immunotherapeutics,10(3),767.)报道的荧光定量PCR方法对提取的30份牦牛轮状病毒阳性样本和8份阴性样本核酸进行检测，比较两种PCR方法的符合率。结果显示22份牦牛轮状病毒阳性样本中，本发明试剂盒检出的阳性样本数为22个，符合率为100％；而Rashi等报道的荧光定量PCR方法对总RNA检出的阳性样本数为11个，符合率为50％。两种方法对8份阴性样本检出结果均为阴性，符合率为100％。将荧光定量PCR未检出的而试剂盒检出为阳性的PCR产物测序，测序结果证实为牦牛轮状病毒VP6基因的特异序列。证明该试剂盒对于牦牛轮状病毒的检出效果优于现有的荧光定量PCR方法，同时又比现有PCR方法操作简单、便携，更适用于现场检测诊断，为牦牛轮状病毒的诊断和流行病学调查提供了一种有力便捷的工具。

由于高原上轮状病毒的变异情况，导致现有荧光定量PCR方法检出率降低，本试剂盒克服了该问题，可以检出牦牛的轮状病毒也可以检出普通牛的轮状病毒。

本试剂盒与POCKIT Micro仪器配合使用，操作简单，便携，适用于临床检出，目前还没有市售的试剂盒。

本发明对反应试剂进行了冻干，降低了试剂盒保存条件，便于运输和临床应用。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大学

<120> 基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒及应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 牦牛轮状病毒

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